专利名称：编码具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质的玉米核苷酸序列及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及来自植物具有转谷氨酰胺酶活性的新蛋白质鉴定及其在食品处理、加工和转化领域以及开发具有新能力的转基因植物中的应用。
现有技术转谷氨酰胺酶(TGase；EC2.3.13)(R-谷氨酰胺酰-肽酰胺酶-γ-谷氨酰-转移酶)依靠一个中间反应在多胺或赖氨酸的伯氨基(氨基供体)与某些蛋白质的谷氨酰γ-羧酰胺基(氨基受体)之间催化形成酰胺键，其中在蛋白质的谷氨酰残基γ-羧酰胺基与酶活性中心的半胱氨酸残基sufidryl基间反应，将酶连接到底物(Serafini-Fracassini，D.，Del Duca，S.& Beninati，S.1995.Plant Transglutaminases.Phytochemistry 40355-365)转谷氨酰胺酶活性的结果是a)蛋白质自身构型修饰和b)其它更广泛的构型改变如蛋白质本身间连接和不同蛋白质间形成高分子量缀合物。
已有许多关于人和动物、植物、低等脊椎动物、某些细菌、藻类和酵母中的转谷氨酰胺酶研究(Makarova，K.S.，Aravind，L.&Koovin，E.V.1999.A superfamily of archaeal，bacterial and eukaryoticproteins homologous to animal transglutaminases Protein Science 81714-1719；Bergamini，C.M.，Dean，M.，Tanfani，F.Ferrari，C.& Scatturin.1999.Conformational stability of human erythrocyte transglutaminasePattrens of thermal unfolding at acid and alkaline pH.Eur.J.Biochem.266575-582.；Cariello，L.Ristoratore，F.& Zanitti，L.1997.A newtransglutaminase-like from ascidian Ciona intestinalis. FEBS Lett408171-176；Lorand，L.& Conrad.S.M.1984.Transglutaminases.Mol.Cell Biochem 589-35；Serafini-Fracassini，D.，Del Duca S.& Beninati S.1995.Plant Transglutaminases.Phytochemistry 40355-365；Tokunaga，F.，Muta，T.Iwanaga，S.，Ichinose，A.，Davie，EW，Kuma，K.& Miyata，T.1993.Limulus hemocyte transglutamnases.cDNA cloning，amino acidsequence and tissue localization.J Biol Chem 268262-268)。
知道最多的转谷氨酰胺酶是凝血因子XIII，它是血浆蛋白和参与表皮角质层形成的转谷氨酰胺酶K。另一方面，已经克隆一些负责某些所提到的转谷氨酰胺酶的基因，并且逐渐认识了参与重要过程例如细胞分化、组织稳定性或程序性细胞死亡的转谷氨酰胺酶(Ichinose，A.，Bottenus，R.E.& Davie E.W.1990.Structure oftransglutaminases.J.of Biol.Chemistry.265(23)13411-13414；Bergamini，C.M.，Dean，M.，Tanfani，F.，Ferrari，C.& Scatturin.1999.Dean，M.，Tanfani，F.，Ferrari，C.& Scatturin.1999.Conformationalstability of human erythrocyte transglutaminasepatterns of thermalunfolding at acid and alkaline pH.Eur.J.Biochem.266575-582；Nemes，Z.，Marekov，L.N.& Steinert，P.M.1999.Involucrin cross-linking bytransglutaminase 1.J.of Biol.Chemistry.274(16)11013-11021)。这些酶似乎也与神经变性性疾病、肿瘤、腹腔疾病等有关，因此，它们是一组临床研究中非常重要的酶。关于这些临床研究，有不同的专利涉及转谷氨酰胺酶由Orthogene，Inc.1998年申请的美国5,736,132“Method of promoting adhesion between tissue surfaces”；由OklahomaMedical Reserch Eoundation 1998年申请的美国5,726,051“Transglutaminases gene”。
虽然数年前已公开关于植物转谷氨酰胺酶存在的首次数据，但是植物转谷氨酰胺酶的功能仍知之甚少(Icekson I.& Apelbaun，A.1987.Evidences for transglutaminase activity in plant tissue.Plant Physiol.84.972-974；Serafini-Fracassini D.，Del Duca S.，& D′Orazi D.1998.Firstevidence for polyamine conjugatation mediate by an enzyme activity inplants.Plant Physiol.87757)对植物的研究已首先集中到涉及活性、相同作用底物和高丰度的组织等生物化学方面，但是其功能作用，其中关于其干涉，例如生长和发育、一般形态发生、光合作用和细胞死亡等的部分数据仍然未有研究(Margosiak，S.A.，Drama，A.，Bruce-Carver，M.R.，Gonzalez，A.P.Louie，D.& kuehn.1990.Identification of the large subunit of ribulose 1，5-biphosphatecarboxylase/oxygenase as a substrate for transglutaminase in Medicagosativa L.(Alfafa)Plant Physiol.9288-96；Del Ducca，S.，Tidu，V.，Bassi，R.Exposito，C.，& Serafini-Fracassini，D.1994，Identification ofchlorophyll-a/b proteins as substrates of transglutaminase activity inisolated chloroplasts of Helianthus tuberosus L.Planta 193283-289；DelDucca，S.，Della Mea，M.， de Rueda，P.& Serafini-Fracassini，D.2000 Factors affecting transglutaminase activity catalyzing polyamineconjugation to endogenous substrates in the entire chloroplast.PlantPhysiol Biochem 38429-439)。
此外，要强调的是，转谷氨酰胺酶具有生物技术用途的增殖价值。这种作为有用代谢物的新的附加方面来源于其在不同蛋白质问形成共价键的能力。这种特性已用于例如保持商品如鱼类和肉类的品质，减少使用盐的需要(surimi等)。用于不同密度的明胶配方等。用于制备含较少脂肪的预烹调食品(豆腐)。也可能在不同温度下保持产品的稠度、弹性、水分或粘度。同样，它也用于不同的乳制品奶酪、酸乳、冰淇淋等。到这样的程度以致，近期它在许多生物加工食品中用作“添加剂”，在美国用于这种用途的推荐剂量是65ppm。
转谷氨酰胺酶的所有这些可能性产生不同的专利创造获得方法、用途等并且已使这种物质成为商业化产品例如，Ajinomoto公司已用Activa TG_名称分销的那些产品。上市产品的这些公司是东京的Ajinomoto Co.，Inc.(也遍及美国)和美国的Rohm Enzyme(www.skidmore-sales.com/whatsnew/newsletter/summer2001.pdf)然而，在西班牙还没有发现专门生产这种转谷氨酰胺酶工业产品的公司。
如上所提到的，用于商业用途的第一种转谷氨酰胺酶已由Ajinomoto公司用细菌(链霉轮枝菌(Streptoverticillium sp.))实现过量表达，该公司取得所述方法以及后来这个最初方案不同改进的专利(美国5,156,956“Transglutaminase”(1992))。同样，该公司已取得另一相似系统，但是依靠转化牡蛎(Crassostrea gigas)(美国5,736,356“Transglutaminase originating from Crassostrea gigas(1998))和来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilus)的专利(美国5,948,662“Bacillus-derived transglutaminase”(1999))。
同样，在最近几年，本研究小组即本发明的发明人已完成生物化学水平的前期研究。关于涉及玉米愈伤组织形态发生的转谷氨酰胺酶和它们与光的关系(Bernet，E.，Claparols，I.，Dondini，L.，Santos，M.A.，Serafini-Fracassini，D.& Tomé，J.Ma.1999.Changes in polyaminecontent，arginine and omithine decarboxylases and transglutaminaseactivities during light/dark phases(of initial differentiation)in maizecalluses and their chloroplast.Plant Physio Biochem.37(12)899-909)此外，该酶在不同玉米细胞系统中，与叶绿体的发育相关的免疫定位最近已公开(Villalobos，E.Torné，J.M.，Ollés，C.，Claparols，I.& Santos，M.A.2001，Subcellular localization of a transglutaminase related to granadevelopment in different maize cell types.Protoplasma.216155-163)。然而，没有发现在植物转谷氨酰胺酶分子鉴定和功能活性方面的结果，因此，关于所述转谷氨酰胺酶的新知识是最高的商业化目标。
发明内容
概述本发明面临涉及来源于植物，在食品处理和转化领域和具有新能力的转基因植物开发中所需的转谷氨酰胺酶短缺的问题。
本发明提供的解决方案是基于本发明人已鉴定某些来源于玉米具有转谷氨酰胺酶活性(TGase；EC2.3.13)的DNA序列的事实。由所述DNA序列编码的蛋白质的转谷氨酰胺酶活性在这些蛋白质提取物的实验中已变得显而易见。
因此，本发明的一个目的是所述DNA分子。
本发明另一个附加目的是一种至少包含所述DNA分子之一的载体。
本发明另一个附加目的包括所述DNA分子或所述载体的应用，用于产生能表达具有转谷氨酰胺酶活性的重组蛋白质的转化细胞，或将具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质的所述编码序列导入植物细胞中。微生物细胞和产生的转基因植物也包括本发明的附加目的。
本发明另一个附加目的包括由所述DNA序列表达的具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白及其在食品处理及转化中的应用。
发明详述本发明提供来源于植物并且编码具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质的DNA分子，在下文称为本发明的DNA分子，所述DNA分子包含选自下列之一的核苷酸序列a)已鉴定为SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 3或其片段的核苷酸序列，和b)与a)中定义的序列相似的核苷酸序列。
从本说明书中所用的意义上说，术语“相似的”是指包括任何在SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 3中所示的核苷酸序列基础上分离或制备的DNA序列，例如，依靠引入保守或非保守的核苷酸取代，包括插入一个或多个核苷酸，在所述分子的任一末端添加一个或多个核苷酸或在所述序列的任一末端或内部缺失一个或多个核苷酸。
一般而言，相似DNA分子与鉴定为SEQ ID NO 1或SEQ ID NO3的核苷酸序列基本同源。从本说明书中所用的意义上说，术语“基本同源的”是指查询的核苷酸序列的同一性程度，在核苷酸水平至少为60％，优选至少为85％，或更优选至少为95％。
本发明的DNA分子来源于玉米并且可在高等植物的其它种属(其中包括水稻、小麦、拟南芥等)中发现相似的形式，它们可以是天然形式或在另外的情况下，它们也可以是基因转化加工的结果，其中所述转化的生物体复制所述DNA分子。本发明的DNA分子可以用常规技术，从含有它的任何植物DNA中，依靠使用本发明提供的所述DNA分子的核苷酸序列信息制备的探针或寡核苷酸分离。
本发明的DNA分子包括具有所述转谷氨酰胺酶活性的片段。
在一个具体的实施方案中，本发明的DNA分子是玉米的SEQ IDNO 1或SEQ ID NO 3的DNA分子。
本发明的DNA分子通常可以用于产生允许这些具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白在各种各样的宿主细胞中表达的表达载体，在下文称为本发明的表达载体。一般而言，本发明的表达载体至少包含一种本发明的DNA序列和至少一个与其有效连接的、指导目标基因转录的启动子以及其它必需的或适于目标基因转录和适当调节时间和位置的序列，例如起始信号和终止信号、切割位点、聚腺苷酸化信号、复制源、转录增强子、转录沉默子等。合适的表达载体的实例可根据每一具体情况的条件和要求选择下列之一质粒、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)、基于P1噬菌体的人工染色体(PAC)、粘粒或病毒，它也可以含有可以在细菌或酵母中扩增的细菌源或酵母复制源，及用于选择除一种或多种目标基因外所转染的细胞的标记。因此，本发明也涉及包含本发明DNA分子的载体。载体的选择将取决于随后将导入所述载体的宿主细胞。例如，导入所述DNA序列的载体可以是质粒，当将其导入到宿主细胞中时，它可以整合到所述细胞的基因组并与宿主细胞的染色体一起复制。
本发明的载体可以由本领域的专家通过已知的常规方法获得(Kovesdi等1997.Curr Opin Biotech 8583-589 Transgenic Res.1083-103；Coffin等1998.Retroviruses，CSHLP；Robbins等1998.TrendsBiotech.1635-40；Anderson.1998.Nature 39225-30；Schindelhauer.1999.BioEssays 2176-83)本发明的一个具体目的包括分别含有SEQID NO 1和SEQ ID NO 3的质粒pGEMT15和质粒pGEMT21。
本发明也提供包含本发明DNA分子或表达载体的细胞。可用所述表达载体转化的宿主细胞可以是例如GRAS细菌细胞和酵母。含有本发明表达载体的细胞可以用于过量产生本发明DNA分子编码的具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质。本发明的一个具体目的包括具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质，其中具有SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 4所描述的氨基酸序列。
这些结果可以创造新的可能性，以通过异源表达转化有用的GRAS(通常公认安全)细菌系统或酵母，以制备所提到的新的转谷氨酰胺酶蛋白。如上文已指出的，具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质，由于它在不同蛋白质间产生共价键的能力，可以用于多种食品处理、加工和转化过程。这一特征已用于例如保持食品如鱼类和肉类的品质、减少使用盐的需要，参见美国专利5928689“Method for treatingPSE meat with transglutaminase”，WO 0162888“Improved compositionof marine product”；有关生产不同密度的明胶；用于制备含较少脂肪的预烹调食品(豆腐)，参见美国6342256“Tofu products excellent infreeze resistance and process for producing the same”，美国6042851“Process for producing packed tofu”。它也可能在不同的温度下保持产品的稠度、弹性、水分或粘度。同样，它可用于不同的乳制品加工食物乳酪(美国6270814“Incorporation of whey into process cheese”，美国申请20010053398“Cheese whey protein having improved textureprocess for producing the same and use thereof”)、酸乳、冰淇淋、蛋黄酱、酱油，以及用于生产面条(EP 0948905“Enzyme preparationscomprising transglutaminase and process for producing noodles”，美国6106887“Process for obtaining a modified cereal flour)，巧克力(美国6063408“Process for producing chocolate”)，源自马玲薯的产品(美国申请20020004085“Methods for producing potato products”)，糖(JP200354498“Production of sugar from cereal flour material bytransglutaminase treatment”)。其中在前述专利中描述的转谷氨酰胺酶的不同用途是本发明转谷氨酰胺酶潜在用途的实例。因此，本发明的一个具体目的是具有本发明转谷氨酰胺酶活性的蛋白质即蛋白质SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 4或含有它们的溶液在食品处理、加工和转化中的应用。在下文Chiya Kuraishi等的综述，2001(TransglutaminaseIts utilization in the food industry Food ReviewsInternationa l17(2)221-246)，表示具有本发明转谷氨酰胺酶活性的蛋白质应用的一个实例。
最后，还有其它的应用，所述应用不同于以上提及的具有转谷氨酰胺酶活性的本发明蛋白质的应用方面和那些作为以下专利所述应用举例说明的方面，其中“Method for enzymatic treatment of wool”美国专利申请第161824号(1998)MacDevitt等，2000年4月；“Enzymatically protein encapsulating oil particles by complexcoacervation申请第791953号(1997).Soper，Jon C.等，2000年3月；“Cross-linked gelatin gels and method of making them”申请第641463号(1996)Bishop，P.D.等，ZymoGenetics，Inc.(Seattle，EA，USA)；Process for obtaining a modified cereal flour”申请第977575号Ajinomoto Co.Inc.(Tokyo，Japan).Yamazaki等，2000年8月；“Microbial transglutaminase，their production and use”申请第294565号(1999).NovoNordiskA/S(Bagsvaerd，DK)Bech等，2001年2月。
此外，本发明的DNA分子或表达载体可用于基础研究中植物的遗传转化过程以及依靠改变所述蛋白质的表达，通过对所述转谷氨酰胺酶特征功能(植物生长和发育、形态发生、光合作用和细胞死亡)的操作，可以开发具有新能力的转基因植物。
附图描述
图1.-对应于方法学部分描述的每一个噬溶菌产物、对应于阳性噬菌体f1和f2(含有玉米转谷氨酰胺酶的不同cDNAf1＝SEQ IDNO 1，f2＝SEQ ID NO 3)和对应于阴性噬菌体f3(不含任何转谷氨酰胺酶的cDNA)的蛋白质提取物的转谷氨酰胺酶活性(Put公司测定，以皮摩尔计)。此外，显示影响提取物转谷氨酰胺酶活性的不同因素的效果，在其它系统中所描述的所述酶促转谷氨酰胺酶活性钙＝蛋白质提取物和无钙时。GTP＝加入的1mM GTP。MDC＝加入的1mMMDC。
图2.-对应于含有这两种转谷氨酰胺酶cDNA(f1＝SEQ ID NO1；F2＝SEQ ID NO 2)的两种独立噬菌体的两种蛋白质提取物的活性，关于不含有这些cDNA的任一种噬菌体(F3)，关于所述试验的蛋白质量。如在方法学部分所描述的，包括生物素尸胺测定，所述活性以转谷氨酰胺酶毫单位(mU)计。
a＝40mg蛋白质/ml。b＝60mg蛋白质/ml。c＝80mg蛋白质/ml。
发明实施例实施例1.-通过免疫筛选分离和克隆两种编码玉米转谷氨酰胺酶家族的两种蛋白质的cDNA表达库本发明的cDNA是从温室条件下生长的两周龄Zea mays subsp.mays plantulae B73纯合子(由美国University of Oregon的Alice Barkan博士赠予)的信使RNA为原料，用EcoRI和XhoI靶制备的Lambda-ZAPII_cDNA表达库中分离。
用从菊芋(Helianthus tuberosus)叶片的叶绿体提取物纯化的58kda植物转谷氨酰胺酶作为抗原。在母鸡中获得多克隆抗体(Villalobos，E.，Tomé，J.M.，Ollés，C.，Claparols，I.& Santos，M.A.2001.Subcellularlocalization of a transglutaminases related to grana development indifferent maize cell types.Protoplasma.216155-163)。通过斑点印迹技术，使用商业化的猪肝脏转谷氨酰胺酶，以及通过纯化蛋白质的蛋白质印迹，测定所述抗体的特异性(Dondini，L.1998.“Poliammine legatee transglutaminasi nelle plante.”博士论文。University of Bologana，Italy)。通过蛋白质印迹技术进行滴定(完全的方法学在我们的研究中详细说明Villalobos，E.，Tomé，J.M.，ollés，C.-，Claparols，I.& Santos，M.A.2001.Subcellular localization of a transglutaminases related tograna development in different maize cell types.Protoplasma.216155-163)。
库的免疫筛选一旦已知使用库的名称，就可以将XL-Blue_菌株的菌落接种到含有MgSO4和20％麦芽糖的液体LB培养基中。
在细菌生长达到2.0DO(600nm)后，从加有10mM IPTG的文库取4.5×104pfu制备细菌培养混合物。在感染和接种装有LB培养基+10mM MgSO4的培养皿后，将一张10mM IPTG饱和的圆盘状硝酸纤维素膜置于菌落之上。将加有滤膜的培养皿培养4小时后，将其冷却并且用PBS洗涤滤膜。最后，一旦用脱脂奶粉或BSA封闭膜，就可用抗体显像和标记。为检测溶菌作用，已发现了抗菊芋(H.tuberosus)转谷氨酰胺酶抗体与相互作用的阳性噬菌体，可进行所述膜的蛋白质印迹分析并且用ECL试剂在感光片上显像。
体内切除pBluescript SK-中的噬菌粒并筛选阳性菌落一旦已分离和纯化含有分别编码与抗体相互作用的蛋白质的cDNA的两种噬菌体，然后就可通过“ExAssistTMInterference-ResistantHelper phage(Stratagene)”切除它们。在XL1-Blue菌株中进行共感染并且在XLOLR_进行感染。在选择性培养基中铺皿，测定使用的载体(pBluescript)。在我们的案例中，选择转化菌落的培养基是加入氨苄青霉素(50μg/ml)、1mM IPTG和其基因由于插入片段或cDNA而间断的半乳糖苷酶底物X-Gal(40μg/ml)的LB-琼脂。
小规模质粒分离(小量制备)对于每一次切除，分离含有目标cDNA的质粒DNA，可通过细菌裂解物的小规模小量制备技术进行，使用SDS和NaOH，用乙酸钾中和并且用苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合物纯化和用乙醇沉淀。然后用加有RNA酶的1X TE缓冲液重悬浮。
检查pBluescript载体中存在的cDNA在每种情况下，可通过消化质粒DNA样品，检查pBluescript中存在的插入片段，可用与制备所述库(EcoR1和Xho1)相同的内切核酸酶获得。根据每一种限制性酶的要求(缓冲液和温度)，对其进行消化。一旦进行消化，所述cDNA或插入片段就从载体中释放出来。这可用常规电泳在1X TBE或1X TAE缓冲液的0.5％琼脂糖凝胶中检查。
测序(Barcelona IBMB“CSIC”的测序服务)一旦已确定含有目标cDNA的小量制备样品，在我们的案例中是制备两个样品，就可在测序步骤前沉淀它们并用苯酚、氯仿和异戊醇混合物和纯氯仿进行纯化。用水溶解将要测序的样品。
通过RACE技术测定完全编码序列pBluescript SK-中的两种噬菌体切除物使得有可能获得两种通过RACE技术定义的完全编码序列的部分cDNA。为此目的，可从玉米叶提取的总RNA通过多聚dT柱纯化获得用作单链DNA合成模板的信使RNA。为了按此进行，从已知的cDNA序列和逆转录酶推导出特异性寡核苷酸(寡核苷酸E1，3′-5′GATTCTCCCTGATAAG，SEQ IDNO 5)。在通过末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)将多聚T尾加到单链DNA后，获得第二条DNA链。可通过PCR技术用寡核苷酸5′RACEAbrigded Anchor Primer(GIBCO BRL_)、多聚T尾DNA特异的(寡核苷酸锚5′-3′GGCCAGGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG，SEQ ID NO 6)和第二条以上说明的具有已知序列的部分cDNA的特异性寡核苷酸，以及对应于寡核苷酸E2，3′-5′GTTCTCCAGCATCTCCAG，SEQ ID NO 7)的特异性寡核苷酸完成。
随后用PCR循环扩增所述DNA。所述循环的顺序如下首先在94℃2分钟，然后34次循环的对于1号寡核苷酸为94℃30秒，但对于2号寡核苷酸为60℃30秒，接着在这两种情况下72℃7秒。最后，置于5℃几小时。
用连接酶将PCR产物克隆到合适的载体(例如pGEMT)中。然后，转化大肠杆菌DH5-α型菌株并且让其在选择性培养基中生长。质粒DNA用上述的小量制备技术提取、纯化并且测序所获得的片段。在我们的案例中，对于两条需要完成所述编码序列片段的部分cDNA序列，证实仅有四种核苷酸。完全的编码序列核苷酸，包括所述四种通过RACE技术获得的核苷酸，分别在SEQ ID NO 1和SEQ ID NO3中描述。含有SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 3序列并用于转化宿主细胞的表达载体分别是质粒pGEMT15和pGEMT21。
从核苷酸序列获得的氨基酸序列与其它非植物系统所描述的转谷氨酰胺酶类的活性中心域，在对应于氨基酸SEQ ID NO 2蛋白质的431-474(60.97kDa)和SEQ ID NO 4蛋白质的485-528(67KDa)的区域内具有同源性。在这两种情况下，在这些区域中发现描述为所述酶活性的必需氨基酸的半胱氨酸(Cys)(SEQ ID NO 2中的Cys439和SEQ ID NO 4中的Cys493)。数据库参考(www.ncbi.nlm.nih/)。此外，如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 3序列所表示的，观察到一些在SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 3两种序列中串联重复的27个核苷酸的区域，虽然量不同，分别为15-21个重复并且其中具有一些核苷酸的少量变异。应该强调的是，以前在已知的转谷氨酰胺酶中并未描述过这些提到的重复区。因此，它们是本发明DNA分子的特征。
实施例2.-检查由所述cDNA表达的蛋白质的转谷氨酰胺酶活性测定由cDNA表达的蛋白质的转谷氨酰胺酶活性2个含有目标cDNA的噬菌体克隆，用每一个克隆在加有10mMIPTG的液体LB培养基中感染大肠杆菌(XL-Blue菌株)培养物。在37℃溶菌后，提取物的总蛋白质浓度用Lowry法定量(Lowry OH，Rosebrough NJ，Farr，AL & Randall RJ.1951.Protein measurement withthe Folin phenol reagent.J.Biol.Chem.193265-275)并且为了测定转谷氨酰胺酶的活性，与不含有目标cDNA的噬菌体溶菌提取物形成对比，可用提取物进行在下文描述的实验。
1.通过测定氚标记的腐胺标记的蛋白质检测转谷氨酰胺酶活性的方法。
用每一种由两种噬菌体(含SEQ ID NO 2的转谷氨酰胺酶的f1和含SEQ ID NO 4的转谷氨酰胺酶的f2)获得的溶菌提取物制备酶提取物，总蛋白质浓度600μg并且酶实验在30℃进行30分钟。酶混合物除含有蛋白质提取物以外，还含有0.6mM腐胺、185kBq氚标记腐胺(0.85TBq/nmol)、20mM Tris-HCl*pH8和3mM CaCl2。反应用含2mM腐胺的10％三氯乙酸封闭。重复沉淀样品并且测量沉淀物的放射性(Bernet，E.，Claparols，L，Dondini，L，Santos，M.A.，Serafini-Fracassini，D.-& Tomé，J.Ma 1999)Changes in polyamide content，arginine and ornithine decarboxylases and transglutaminase activitiesduring light/dark phase(of initial differentiation)in maize calluses andtheir chloroplast.Plant Physio Biochem.37(12)899-909)。用每小时每毫克蛋白质的腐胺皮摩尔量测量转谷氨酰胺酶活性，并且从f1和f2噬菌体获得的蛋白质提取物的转谷氨酰胺酶活性大于不含有任何这些转谷氨酰胺酶cDNA的噬菌体提取物的转谷氨酰胺酶活性。
2.通过Elisa类实验，用CBZ-Gln-Gly作第一底物而用生物素尸胺作第二底物检测转谷氨酰胺酶活性的方法。
该实验包括由Covalab_公司提供的试剂盒，该试剂盒用小量总蛋白质测定样品的转谷氨酰胺酶活性，与商业化的猪肝脏转谷氨酰胺酶比较。所述方法通过比色实验，检测由样品转谷氨酰胺酶活性以肽和多胺底物形成的谷氨酰衍生物。按转谷氨酰胺酶单位测量所述活性，以450nm处的1±0.05OD吸光率对应于0.6mU的商业化转谷氨酰胺酶。
对应于两种溶菌产物的两种蛋白质提取物，与任何来自不含有这些cDNA的噬茵体提取物相比较，在检测上文所用和所描述的(f1和f2)所述活性的两种方法中显示转谷氨酰胺酶类活性。数据示于图1和图2。
此外，图1表示不同因素对提取物的转谷氨酰胺酶活性的影响，描述为天生的对所述转谷氨酰胺酶活性的影响。因此，已表达的蛋白质活性在a)无钙，b)存在1mM GTP，c)存在1mMdenodansylcadaverine(MDC)和d)所述溶菌提取物含有未携带目标cDNA的噬菌体(f3)时显著减少。
分别用含玉米cDNA的质粒(pBlueScript)和含编码玉米SEQ IDNO 2和SEQ ID NO 4序列蛋白质的基因的质粒的载体转化的一对源自大肠杆菌dH5α型的细菌培养物，鉴定为15TGZM02和21TGZM02，已于2002年5月7(？)日保藏于西班牙典型培养物保藏中心(Spanish Culture Type collection)(“Collección de CultivosTipo(CECT”)，University of Valencia，Research Building，BurjasotCampus，46100 Burjasot，Valencia，Spain。对应于它们的“CECT”保藏号分别是对于15TGZM02是5705，对于21TGZM02是5706。
序列表<110>CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICASTorné Cubiró，José MaríaSantos Lozano，María AsunciónTalavera Baro，DavidVillalobos Amador，EnriqueRigau LLoveras，Juan<120>编码具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质的玉米核苷酸序列<130>玉米转谷氨酰胺酶<160>4<170>Patent in version 3.1<210>1<211>1748<212>DNA<213>玉蜀黍(Zea mays L)<220>
<221>重复区<222>(823)..(1228)<223>重复单位(823)..(849)重复数15个重复<220>
<221>3’UTR<222>(1606)..(1729)<223>
<220>
<221>聚腺苷酸位点<222>(1730)..(1748)<223>
<220>
<221>聚腺苷酸位点<222>(1730)..(1748)<223>
<220>
<221>CDS<222>(1)..(1605)<223>
<300>
<308>AJ421525<309>2001-12-06保密直到2002-12-06<400>1atg gct cat cgt gga cat cta gat gga ctg act ggc caa gct cct gct48Met Ala His Arg Gly His Leu Asp Gly Leu Thr Gly Gln Ala Pro Ala1 5 10 15ctt atg cgc cat ggt tcc ttc gct gca ggc agc ctc tct agc cgc tca96Leu Met Arg His Gly Ser Phe Ala Ala Gly Ser Leu Ser Ser Arg Ser20 25 30cct ttg cag tct tca tcc aca ctg gag atg ctg gag aac aag ctt gcc144Pro Leu Gln Ser Ser Ser Thr Leu Glu Met Leu Glu Asn Lys Leu Ala35 40 45atg caa act aca gaa gtg gaa aag ctt atc acg gag aat cag cgg tta192Met Gln Thr Thr Glu Val Glu Lys Leu Ile Thr Glu Asn Gln Arg Leu50 55 60gca tca agc cat gtg gtc ttg agg cag gac att gtt gat acg gag aaa240Ala Ser Ser His Val Val Leu Arg Gln Asp Ile Val Asp Thr Glu Lys
65 70 75 80gag atg caa atg atc cgc acc cac cta ggt gaa gtt cag aca gag act288Glu Met Gln Met Ile Arg Thr His Leu Gly Glu Val Gln Thr Glu Thr85 90 95gat ttg cag att aga gat ttg ttg gag aga atc aga tta atg gag gta336Asp Leu Gln Ile Arg Asp Leu Leu Glu Arg Ile Arg Leu Met Glu Val100 105 110gat ata cat agt ggt aat gta gtg aac aag gag ctt cac caa atg cat384Asp Ile His Ser Gly Asn Val Val Asn Lys Glu Leu His Gln Met His115 120 125atg gag gca aag aga ctt att act gaa agg cag atg cta acc ctt gag432Met Glu Ala Lys Arg Leu Ile Thr Glu Arg Gln Met Leu Thr Leu Glu130 135 140ata gag gat gtg act aaa gaa tta cag aaa ctc tct gcc tct ggg gac480Ile Glu Asp Val Thr Lys Glu Leu Gln Lys Leu Ser Ala Ser Gly Asp145 150 155 160aat aaa agc ctt cct gaa ttg ctt tct gag cta gat agg cta cgg aaa528Asn Lys Ser Leu Pro Glu Leu Leu Ser Glu Leu Asp Arg Leu Arg Lys165 170 175gag cat cat aat tta cga tct cag ttt gaa ttt gag aaa aat aca aac576Glu His His Asn Leu Arg Ser Gln Phe Glu Phe Glu Lys Asn Thr Asn180 185 190gtc aag caa gtt gag cag atg cgg aca atg gaa atg aac ttg ata acc624Val Lys Gln Val Glu Gln Met Arg Thr Met Glu Met Asn Leu Ile Thr195 200 205atg acc aaa caa gct gag aag tta cgt gtt gat gtg gca aat gct gaa672Met Thr Lys Gln Ala Glu Lys Leu Arg Val Asp Val Ala Asn Ala Glu210 215 220aga cgg gca caa gca gct gcg gct caa gca gca gca cat gca gct ggt720Arg Arg Ala Gln Ala Ala Ala Ala Gln Ala Ala Ala His Ala Ala Gly225 230 235 240gca cag gtg aca gct tcg cag cct gga cag ctc aag cta cca cgg ttt768Ala Gln Val Thr Ala Ser Gln Pro Gly Gln Leu Lys Leu Pro Arg Phe
245 250 255cag cag cag cag cca cag act cat atg cag gtg cat ata cca gct acc816Gln Gln Gln Gln Pro Gln Thr His Met Gln Val His Ile Pro Ala Thr260 265 270ccc ctg cat atc agc agg gag ccc agg ctg ggg cat atc agc agg gtg864Pro Leu His Ile Ser Arg Glu Pro Arg Leu Gly His Ile Ser Arg Val275 280 285ctc agg ctg ggg tat atc agc agg gag ccc agg ctg ggg cat atc agc912Leu Arg Leu Gly Tyr Ile Ser Arg Glu Pro Arg Leu Gly His Ile Ser290 295 300agg gag ccc agg ctg ggg cat atc agc agg ggg gcc agg atg ggg cat960Arg Glu Pro Arg Leu Gly His Ile Ser Arg Gly Ala Arg Met Gly His305 310 315 320atc agc agg ggg ctc agg ctg ggg cat atc agc agg gag ccc agg ctg1008Ile Ser Arg Gly Leu Arg Leu Gly His Ile Ser Arg Glu Pro Arg Leu325 330 335ggg cat atc agc agg gag ccc agg ctg ggg cat atc agc agg gtg ctc1056Gly His Ile Ser Arg Glu Pro Arg Leu Gly His Ile Ser Arg Val Leu340 345 350agg ctg ggg cat atc agc agg gag ccc agg ctg ggg cat atc agc agg1104Arg Leu Gly His Ile Ser Arg Glu Pro Arg Leu Gly His Ile Ser Arg355 360 365ggg ccc agt ctg ggg cat atc agc agg ggg ccc agg ctg ggg cat atc1152Gly Pro Ser Leu Gly His Ile Ser Arg Gly Pro Arg Leu Gly His Ile370 375 380agc agg gag ccc agg atg ggg cat atc agc agg gag ccc agg atg ggg1200Ser Arg Glu Pro Arg Met Gly His Ile Ser Arg Glu Pro Arg Met Gly385 390 395 400cat atc agc agg gtg ctc agg ctg gag cat aca act atg ctt atg atg1248His Ile Ser Arg Val Leu Arg Leu Glu His Thr Thr Met Leu Met Met405 410 415ctg gca cgg ctt atg cat atg cag gtt act ctg gct atc cag ttg cag1296Leu Ala Arg Leu Met His Met Gln Val Thr Leu Ala Ile Gln Leu Gln
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Leu Met Arg His Gly Ser Phe Ala Ala Gly Ser Leu Ser Ser Arg Ser20 25 30Pro Leu Gln Ser Ser Ser Thr Leu Glu Met Leu Glu Asn Lys Leu Ala35 40 45Met Gln Thr Thr Glu Val Glu Lys Leu Ile Thr Glu Asn Gln Arg Leu50 55 60Ala Ser Ser His Val Val Leu Arg Gln Asp Ile Val Asp Thr Glu Lys65 70 75 80Glu Met Gln Met Ile Arg Thr His Leu Gly Glu Val Gln Thr Glu Thr85 90 95Asp Leu Gln Ile Arg Asp Leu Leu Glu Arg Ile Arg Leu Met Glu Val100 105 110Asp Ile His Ser Gly Asn Val Val Asn Lys Glu Leu His Gln Met His115 120 125Met Glu Ala Lys Arg Leu Ile Thr Glu Arg Gln Met Leu Thr Leu Glu130 135 140Ile Glu Asp Val Thr Lys Glu Leu Gln Lys Leu Ser Ala Ser Gly Asp145 150 155 160Asn Lys Ser Leu Pro Glu Leu Leu Ser Glu Leu Asp Arg Leu Arg Lys165 170 175Glu His His Asn Leu Arg Ser Gln Phe Glu Phe Glu Lys Asn Thr Asn180 185 190Val Lys Gln Val Glu Gln Met Arg Thr Met Glu Met Asn Leu Ile Thr195 200 205Met Thr Lys Gln Ala Glu Lys Leu Arg Val Asp Val Ala Asn Ala Glu210 215 220Arg Arg Ala Gln Ala Ala Ala Ala Gln Ala Ala Ala His Ala Ala Gly225 230 235 240Ala Gln Val Thr Ala Ser Gln Pro Gly Gln Leu Lys Leu Pro Arg Phe245 250 255Gln Gln Gln Gln Pro Gln Thr His Met Gln Val His Ile Pro Ala Thr260 265 270Pro Leu His Ile Ser Arg Glu Pro Arg Leu Gly His Ile Ser Arg Val
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<210>3<211>1910<212>DNA<213>玉蜀黍(Zea mays L)<220>
<221>重复区<222>(823)..(1389)<223>重复单位(823)..(849)重复数21个重复<220>
<221>CDS<222>(1)..(1764)<223>
<220>
<221>聚腺苷酸位点<222>(1892)..(1910)<223>
<220>
<221>3’UTR<222>(1765)..(1891)<223>
<400>3atg gct cat cgt gga cat cta gat gga ctg act ggc caa gct cct gct48Met Ala His Arg Gly His Leu Asp Gly Leu Thr Gly Gln Ala Pro Ala1 5 10 15ctt atg cgc cat ggt tcc ttc gct gca ggc agc ctc tct agc cgc tca96Leu Met Arg His Gly Ser Phe Ala Ala Gly Ser Leu Ser Ser Arg Ser20 25 30
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130 135 140Ile Glu Asp Val Thr Lys Glu Leu Gln Lys Leu Ser Ala Ser Gly Asp145 150 155 160Asn Lys Ser Leu Pro Glu Leu Leu Ser Glu Leu Asp Arg Leu Arg Lys165 170 175Glu His His Asn Leu Arg Ser Gln Phe Glu Phe Glu Lys Asn Thr Asn180 185 190Val Lys Gln Val Glu Gln Met Arg Thr Met Glu Met Asn Leu Ile Thr195 200 205Met Thr Lys Gln Ala Glu Lys Leu Arg Val Asp Val Ala Asn Ala Glu210 215 220Arg Arg Ala Gln Ala Ala Ala Ala Gln Ala Ala Ala His Ala Ala Gly225 230 235 240Ala Gln Val Thr Ala Ser Gln Pro Gly Gln Leu Lys Leu Pro Arg Phe245 250 255Gln Gln Gln Gln Pro Gln Thr His Met Gln Val His Ile Pro Ala Thr260 265 270Pro Leu His Ile Ser Arg Glu Pro Arg Leu Gly His Ile Ser Arg Val275 280 285Leu Arg Leu Gly Tyr Ile Ser Arg Glu Pro Arg Leu Gly His Ile Ser290 295 300Arg Glu Pro Arg Leu Gly His Ile Ser Arg Gly Ala Arg Met Gly His305 310 315 320Ile Ser Arg Gly Leu Arg Leu Gly His Ile Ser Arg Glu Pro Arg Leu325 330 335Gly His Ile Ser Arg Glu Pro Arg Leu Gly His Ile Ser Arg Val Leu340 345 350Arg Leu Gly His Ile Ser Arg Val Leu Arg Leu Gly Tyr Ile Ser Arg355 360 365Glu Pro Arg Leu Gly His Ile Ser Arg Glu Pro Arg Leu Gly His Ile370 375 380Ser Arg Gly Ala Arg Met Gly His Ile Ser Arg Gly Leu Arg Leu Gly385 390 395 400
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<223>寡核苷酸E1<400>5
gattctccct gataag 16<210>6<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸锚<400>6ggccaggcgt cgactagtac gggiigggii gggiig36<210>7<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸E2<400>7gttctccagc atctccag18
权利要求
1.一种编码具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列来源于玉米。
2.权利要求1的核苷酸序列，其特征为SEQ ID NO 1。
3.权利要求1的核苷酸序列，其特征为SEQ ID NO 3。
4.核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与权利要求1-3中任一项的核苷酸序列比较，在核苷酸水平的同一性程度至少为60％，优选至少为85％，或更优选至少为95％，并且其中所述核苷酸序列编码具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质。
5.表达载体，其中所述表达载体包含权利要求1-4中任一项的核苷酸序列。
6.权利要求5的表达载体，其中所述表达载体尤其属于以下的组质粒pGEMT15和pGEMT21。
7.具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质，其中所述蛋白质由权利要求1-4中任一项的核苷酸序列编码。
8.权利要求7的具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质，其中所述蛋白质尤其属于以下的组SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 4。
9.转化细胞，其中所述转化细胞包含权利要求5和6中任一项的表达载体，并且其中它尤其允许具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质在大肠杆菌(E.coli)“CECT”5705和5706菌株中的表达。
10.权利要求9的转化细胞在产生权利要求7和8中任一项的具有转谷氨酰胺酶活性的重组蛋白质的方法中的应用。
11.权利要求7和8中任一项的具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质在食品处理、加工和转化方面的应用，这一点跟其它方法一道可用来保持或改善食品例如鱼类、奶酪、酸乳、冰淇淋、蛋黄酱和肉类的品质、稠度、弹性、水分或粘度，用于形成不同密度的明胶和制备少脂的预烹调食品。
12.权利要求5和6的表达载体在开发具有新能力的转基因植物方面的应用，所述新能力由对所述转谷氨酰胺酶的特征性功能、尤其是植物的生长和发育、形态发生、光合作用和细胞死亡等操作所引起。
全文摘要
本发明涉及来源于玉米、编码具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质的DNA分子以及包含所述DNA分子的基因表达载体。本发明也涉及上述DNA分子或载体的应用，以便产生能表达具有转谷氨酰胺酶活性的重组蛋白质的转化细胞以及将编码具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质序列导入植物细胞中。另外，本发明涉及产生的转基因植物和微生物细胞。此外，由上面提到的DNA序列表达的具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质可以用于例如食品处理、加工和转化。
文档编号A23L1/03GK1671846SQ03817552
公开日2005年9月21日 申请日期2003年5月23日 优先权日2002年5月31日
发明者J·M·托内库维罗, M·A·桑托斯洛萨诺, D·塔拉韦拉巴罗, E·比利亚洛沃斯阿马多尔, J·里高略韦拉斯 申请人:康斯乔最高科学研究公司