修饰的基因沉默rna及其用途的利记博彩app

专利名称：修饰的基因沉默rna及其用途的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及有效下调真核细胞和生物中任何目的基因表达的方法和工具。为此，本发明提供了修饰的反义和有义RNA分子，编码这种修饰的反义或有义RNA分子的嵌合基因和包含该修饰的反义和/或有义RNA分子或编码的嵌合基因的真核生物，如植物、动物或真菌、酵母或霉菌。
背景技术：
近来，已经表明也称作干扰RNA(RNAi)或发夹RNA的双链RNA(dsRNA)的导入是将基因沉默导入大量真核生物，包括动物、真菌或植物的有效触发事件。
已经证明dsRNA介导的基因沉默的定性水平(生物体内基因沉默的水平)和定量水平(群体内显示出明显水平基因沉默的生物数量)优于很多常规的反义RNA或有义RNA介导的基因沉默方法。
为了实践的目的，产生反义RNA分子和编码这种反义RNA的嵌合分子比产生dsRNA分子或其编码基因更直接。实际上，嵌合核酸dsRNA分子或其编码基因含有大的，较完美或较不完美的反转重复结构，并且这种结构倾向于阻碍这些核酸在中间原核克隆宿主中的完整维持。以下描述的增加反义RNA调节基因沉默效率的方法和工具提供了如不同于实施方案和权利要求中所述的这个问题的解决方法。
US 5,190,131和EP 0 467 349 A1描述了调节或抑制细胞中基因表达的方法和工具，其通过将非天然核酸序列合并入或结合细胞的遗传物质。所述序列转录产生的mRNA与由那个细胞的遗传物质所产生的mRNA互补并且能够与之结合。
EP 0 223 399 A1描述了在植物中引起有用的体细胞改变的方法，其通过引起实质上与目标RNA链互补的负RNA链在植物细胞中的转录。该目标RNA链可以是基因表达产生的mRNA转录物，病毒RNA，或植物细胞中存在的其它RNA。负RNA链与目标RNA链的至少一部分互补，以体内抑制其活性。
EP 0 240 208描述了调节植物细胞基因组中编码的基因的表达的方法，其通过将基因整合在宿主中有功能的启动子的转录控制下来完成。在这个方法中，转录的DNA链与从期望调节的内源基因转录的DNA链互补。
WO95/15394和US 5908779描述了通过被(小鼠)细胞中核反义RNA的抑制来调节基因表达的方法和构建体。该构建体含有启动子、反义序列和不依赖聚腺苷酸机器而产生3’的顺式或反式核酶且由此抑制该RNA分子转运到细胞质。
WO98/05770公开了具有特殊二级结构的反义RNA，如(GC)n-回文-(GC)n或(AT)n-回文-(AT)n或(CG)n-回文(CG)n等。
WO 01/12824公开了降低真核细胞中，尤其是植物细胞中感兴趣核酸表型表达的方法和工具，其通过对宿主细胞核提供异常的，优选未聚腺苷酸化的，目标特异性RNA。优选，该未聚腺苷酸化的目标特异性RNA通过嵌合基因转录来提供，该嵌合基因含有启动子，编码目标特异性RNA的DNA区域，自身剪接核酶和参与3’某端形成和聚腺苷酸化的DNA区域。
WO 02/10365提供了真核生物中基因抑制的方法，其通过用含有启动子，待抑制基因的至少一个反义和/或有义核苷酸序列的重组构建体转化，其中构建体转录产物的细胞核-质转运被抑制。在一个实施方案中，正常3’UTR的缺乏抑制细胞核-质转运。该构建体可任选包含至少一个自身切割核酶。该构建体也可以任选包含使用单一启动子同时下调的多个基因的有义和/或反义序列。也公开了含有重组构建体的载体、植物、动物、精子、配子和胚胎。
Zhao et al.，J.Gen.Virology，82，1491-1497(2001)描述了基于马铃薯病毒X的载体在全植物试验中证明马铃薯纺锤形块茎类病毒(PSTVd)的核靶向作用的用途。
WO 02/00894涉及基因沉默方法，其中核酸构建体在转录区域包含由转录链中T碱基片段组成的DNA区域。
WO 02/00904涉及基因沉默方法，其中核酸构建体包含(或编码)至少一个宿主表达的目标mRNA的同源物和在其附近的与宿主中任何内源RNA无关的两个互补RNA区域。
发明简述本发明的一个实施方案中，提供了下调真核生物细胞中目标基因表达的方法，包括步骤a)给真核生物细胞提供嵌合RNA分子，其中嵌合RNA分子包含i)一个目标基因特异性的区域和多个目标基因特异性的区域，其包含与来自目标基因核苷酸序列的19个连续核苷酸的互补序列具有至少大约94％序列等同性的至少大约19个连续核苷酸的核苷酸序列；可操作连接于ii)大部分双链化的RNA区域，其包含来自马铃薯纺锤形块茎类病毒(PSTVd)型类病毒的核定位信号，所述类病毒如马铃薯纺锤形块茎类病毒、柑橘类病毒III类、柑橘类病毒IV类、啤酒花潜伏类病毒(Hoplatent viroid)、澳大利亚葡萄树类病毒、番茄planta macho类病毒、椰子萎缩病类病毒、番茄顶矮类病毒(Tomato apical stunt viroid)、椰子死亡类病毒(coconut cadang-cadang viroid)、柑橘裂皮病类病毒、Columnea潜伏类病毒、啤酒花矮病(Hop stunt)类病毒和柑橘弯叶类病毒，或大部分双链化的RNA区域包含至少35个重复的三核苷酸CUG，CAG，GAC或GUC，如44到2000个重复的这些三核苷酸；和b)鉴定其中目标基因表达下调的那些真核生物。
嵌合RNA分子可以包含内含子序列。类病毒可以具有选自下列的基因组核苷酸序列SEQ ID N03，SEQ ID N04，SEQ ID N05，SEQ ID N06，SEQID N07和SEQ ID N08。该真核生物可以是包括选自拟南芥、苜蓿、大麦、菜豆、玉米、棉花、亚麻、豌豆、油菜、水稻、黑麦、红花、高粱、大豆、向日葵、烟草、小麦、芦笋、甜菜、椰菜、卷心菜、胡萝卜、花椰菜、芹菜、黄瓜、茄子、莴苣、洋葱、油籽油菜、辣椒、马铃薯、南瓜(pumpkin)、小萝卜、菠菜、南瓜(squash)、番茄、西葫芦、杏仁、苹果、杏、香蕉、黑莓、蓝莓、可可、樱桃、椰子、越橘、枣、葡萄、葡萄柚、番石榴、猕猴桃(kiwi)、柠檬、酸橙、芒果、甜瓜、油桃、桔子、番瓜、西番莲(passion fruit)、桃、花生、梨、菠萝、阿月浑子、李子、覆盆子、草莓、柑橘、胡桃和西瓜的植物。该真核生物也可以是真菌、酵母或霉菌或动物，如人、哺乳动物、鱼、牛、山羊、猪、绵羊、啮齿动物、仓鼠、小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、灵长目动物、线虫、甲壳类动物、对虾、螃蟹、龙虾、昆虫、果蝇、鞘翅目昆虫、双翅目昆虫、鳞翅目昆虫和同翅目(Homeopteran)昆虫。
本发明的一个目的是提供下调真核生物细胞中目标基因表达的嵌合RNA分子，其包含一个目标基因特异性的区域或多个目标基因特异性的区域，目标基因特异性区域包含与来自目标基因核苷酸序列的19个连续核苷酸的互补序列具有至少大约94％序列等同性的至少大约19个连续核苷酸的核苷酸序列；可操作连接于包含来自马铃薯纺锤形块茎类病毒(PSTVd)型的类病毒的核定位信号的大部分双链化的RNA区域，所述类病毒如马铃薯纺锤形块茎类病毒、柑橘类病毒III类、柑橘类病毒IV类、啤酒花潜伏类病毒、澳大利亚葡萄树类病毒、番茄planta macho类病毒、椰子萎缩病类病毒、番茄顶矮类病毒、椰子死亡类病毒、柑橘裂皮病类病毒、Columnea潜伏类病毒、啤酒花矮病类病毒和柑橘弯叶类病毒，或者大部分双链化的RNA区域包含至少35个重复的三核苷酸CUG，CAG，GAC或GUC，如44到2000个重复的这些三核苷酸，其中该嵌合RNA分子当提供给真核生物细胞时下调目标基因的表达。
本发明的另一个目的是提供降低真核生物细胞中目标基因表达的嵌合DNA分子，包括a)能够在真核生物细胞中被RNA聚合酶识别的启动子或启动子区域；可操作连接b)DNA区域，当转录时产生RNA分子，该RNA分子包含i)一个目标基因特异性的区域或多个目标基因特异性的区域，其包含与来自目标基因核苷酸序列的19个连续核苷酸的互补序列具有至少大约94％序列等同性的至少大约19个连续核苷酸的核苷酸序列；可操作连接于ii)大部分双链化的RNA区域，其包含来自马铃薯纺锤形块茎类病毒(PSTVd)型的类病毒的核定位信号，所述类病毒如马铃薯纺锤形块茎类病毒、柑橘类病毒III类、柑橘类病毒IV类、啤酒花潜伏类病毒、澳大利亚葡萄树类病毒、番茄planta macho类病毒、椰子萎缩病类病毒、番茄顶矮类病毒、椰子死亡类病毒、柑橘裂皮病类病毒、Columnea潜伏类病毒、啤酒花矮病类病毒和柑橘弯叶类病毒，或大部分双链化的RNA区域包含至少35个重复的三核苷酸CUG、CAG、GAC或GUC，如44到2000个重复的三核苷酸CUG、CAG、GAC或GUC；和任选iii)进一步包含与编码该RNA分子的DNA区域可操作连接的转录终止和聚腺苷酸化信号。
其中该嵌合DNA分子，当提供给真核生物细胞时降低目标基因的表达。
根据真核宿主生物，启动子或启动子区域可以是在动物中有功能的启动子，在酵母、真菌或霉菌中起作用的启动子或植物可表达的启动子。该启动子也可以是被单亚基噬菌体RNA聚合酶识别的启动子或启动子区域。
本发明也提供了来自包含根据本发明的嵌合DNA或RNA分子的真核生物的细胞，以及在其细胞中包含根据本发明的嵌合DNA或RNA分子的非人真核生物。
本发明的另一个目的是提供根据本发明的嵌合RNA或DNA分子在降低真核生物细胞中目标基因表达中的用途。
本发明也提供了制备转基因真核生物的方法，其中该生物细胞中目标基因的表达降低，该方法包括步骤a)给该生物的一个或多个细胞提供根据本发明的嵌合DNA分子而产生转基因细胞；和b)从该转基因细胞生长或再生出转基因真核生物。
本发明也提供了下调真核生物细胞中目标基因表达的方法，包括步骤a)给该真核生物的细胞提供第一和第二嵌合RNA分子，其中i)第一嵌合RNA分子，包含反义目标基因特异性RNA区域，该区域包含与来自目标基因的核苷酸序列的19个连续核苷酸的互补序列具有至少大约94％序列等同性的至少大约19个连续核苷酸的核苷酸序列；ii)第二嵌合RNA分子，包含有义目标基因特异性RNA区域，该区域包含与来自第一嵌合RNA分子的互补序列具有至少大约94％序列等同性的至少大约19个连续核苷酸的核苷酸序列；iii)第一和第二嵌合RNA分子至少在该第一嵌合RNA的19个连续核苷酸和该第二嵌合RNA的19个连续核苷酸之间能够碱基配对；和iv)其中第一或第二嵌合RNA分子包含与反义目标基因特异性RNA区域或与有义目标基因特异性RNA区域可操作连接的大部分双链化的RNA区域；和b)鉴定其中目标基因表达被下调的那些真核生物。
第一和第二嵌合RNA分子可以包含大量双链化的区域。
本发明的另一个目的是提供来自真核生物的细胞，(以及包含这种细胞的非人真核生物)，包含第一和第二嵌合RNA分子，i)第一嵌合RNA分子，包含反义目标基因特异性RNA区域，该区域包含与来自目标基因核苷酸序列的19个连续核苷酸的互补序列具有至少大约94％序列等同性的至少大约19个连续核苷酸的核苷酸序列；ii)第二嵌合RNA分子，包含有义目标基因特异性RNA区域，该区域包含与来自第一嵌合RNA分子的互补序列具有至少大约94％序列等同性的至少大约19个连续核苷酸的核苷酸序列；iii)第一和第二嵌合RNA分子至少在该第一嵌合RNA的19个连续核苷酸和该第二嵌合RNA的19个连续核苷酸之间能够碱基配对；和其中第一或第二嵌合RNA分子包含与反义目标基因特异性RNA区域或与有义目标基因特异性RNA区域可操作连接的大部分双链化的RNA区域；和本发明进一步提供了用于协同嵌合反义RNA分子以降低真核生物细胞中目标基因表达的嵌合有义RNA分子或编码这种嵌合有义RNA分子的嵌合DNA分子，其中嵌合有义RNA分子包含有义目标基因特异性RNA区域，包含与所述目标基因核苷酸具有至少大约94％序列等同性的至少大约19个连续核苷酸的核苷酸序列；可操作连接于大部分双链化的RNA区域。
附图简述

图1使用Mfold软件预测的不同PSTVd型类病毒二级结构的图解表示。A.马铃薯纺锤形块茎类病毒；B.澳大利亚葡萄树类病毒；C.椰子萎缩病类病毒；D.番茄planta macho类病毒；E.耐热突变体T229的啤酒花潜伏类病毒；F.番茄顶矮类病毒。
图2本申请的实施例1至3中使用的各种嵌合基因构建体的图解表示。35S-PCaMV 35S启动子；Pdk内含子Flaveria trinervia丙酮酸正磷酸二激酶2内含子2；cEIN2来自拟南芥的EIN2基因的cDNA拷贝(对乙烯敏感性所需的基因；Alonso et al.1999 Science 284，2148-2152)，这个区域对于启动子的方向用箭头表示；gEIN2来自拟南芥的EIN2基因的基因组拷贝；PSTVd马铃薯纺锤形块茎类病毒的cDNA拷贝；PSTVd*PSTVd的从核苷酸16至核苷酸355的部分序列，以与完整拷贝PSTVd的反方向克隆；OCS 3′根癌土壤杆菌的章鱼肉碱合成酶基因的3′区域。
图3在1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)下萌芽的EIN2沉默的植物表型。A.在黑暗中；B.光条件下。Wt野生型植物。
图4实施例4中使用的各种嵌合基因构建体的图解表示。CMV启动子巨细胞病毒启动子；SV40多聚(A)来自SV40的转录终止和聚腺苷酸化区域；PSTVd马铃薯纺锤形块茎类病毒序列；CUGrep包含60个CUG序列重复的序列；humGFP人源化的绿色荧光蛋白编码区域(修改为适于人基因的密码子使用；这个区域相对于启动子的方向用箭头表示)；图5pMBW491(A；采取几乎野生型构型)和pMBW489中pSTVd的推定的二级结构的图解表示，其中10个核苷酸缺失产生了与野生型构型不同的结构。
不同实施方案的详细描述获得增加反义RNA调节的基因表达下调的当前所述方法和工具是基于预料不到的观察-目标基因特异性RNA序列与大部分双链化的RNA区域的可操作连接，如包含马铃薯纺锤形块茎类病毒基因组的核苷酸序列的RNA区域，其包含RNA的核定位信号，当被导入宿主生物细胞时，如植物细胞，增加其中目标基因的基因表达下调的种系的数量，以及其中目标基因的基因表达显著下调或甚至消失的种系的数量。
因此，在本发明的一个实施方案中，提供了下调真核生物细胞中目标基因表达的方法，包括步骤a)给该真核生物提供嵌合RNA分子，其中RNA分子包含i)目标基因特异性RNA区域，其包含与来自目标基因核苷酸序列的19个连续核苷酸的互补序列具有至少大约94％序列等同性的至少大约19个连续核苷酸的核苷酸序列(“反义RNA”)；可操作连接于ii)大部分双链化的RNA区域；和b)鉴定其中目标基因表达下调的那些真核生物。
这里使用的“嵌合基因”或“嵌合核酸”指特定真核物种中正常不存在的任何基因或任何核酸，或者其中启动子实际上不结合该转录DNA区域部分或全部或该基因的至少一个其它调节区域的任何基因。
这里使用的“反义RNA”是指包含大部分与生物活性RNA(通常不排除从目标基因转录的mRNA)的核苷酸序列的一部分互补的核苷酸序列的RNA分子。
这里使用表达“目标基因”来指真核细胞中存在和转录为生物活性RNA的任何核酸。该目标基因可以是内源基因，它可以是通过人为干预导入该真核细胞祖先的转基因，或它可以是通过传染性生物，如土壤杆菌菌株或逆转录病毒导入该细胞基因组的基因。该目标基因也可以是病毒来源的。此外，至少19个核苷酸的片段可以选自启动子区域、5′UTR、编码区域或3′UTR。
这里使用“基因表达”或“核酸的表达”来指一种过程，其中基因或核酸，当导入合适宿主细胞时，可以转录(或复制)而产生RNA，和/或翻译而产生那个宿主细胞的多肽或蛋白。
这里使用的“基因表达下调”是指在本发明的RNA或嵌合基因存在下，真核细胞中目的目标基因或核酸的表达与不存在本发明的RNA或嵌合基因时，目的目标基因或核酸的表达的比较。本发明的嵌合RNA存在下，目标基因表达因此应该低于不存在时的表达，如仅为嵌合RNA不存在时表型表达的大约50％或25％或大约10％或大约5％。对于很多申请，为了所有实践目的，该表达应该被嵌合RNA或编码这种RNA的嵌合基因的存在完全抑制。
这里使用的“包含”解释为说明所指出的所述特征、整体、步骤或成分的存在，但是不排除一个或更多特征、整体、步骤或成分，或其组合的存在或添加。因此，如包含核苷酸或氨基酸序列的核酸或蛋白，可以包含比实际应用的那个的更多核苷酸或氨基酸，即内含于更大的核酸或蛋白中。包含功能或结构限定的DNA区域的嵌合基因，可以包含另外的DNA区域等。
因此将清楚大约19nt的目标基因特异性RNA区域的有义RNA的最小核苷酸序列可以包含在较大RNA分子内，大小从19nt至等于目标基因大小的长度变化，序列等同性总体程度具有变化。
为了本发明的目的，两个相关核苷酸或氨基序列的“序列等同性”，以百分比表示，是指两个最佳比对的序列中具有等同残基的位置数量(×100)除以相比较的位置数量。缺口，即比对中的一个位置，在这里一个序列存在一个残基，但是另一个不存在，被认为是具有不等同残基的位置。用Needleman和Wunsch算法(Needleman and Wunsch 1970)实施两个序列的比对。使用标准软件程序如GAP，它是Wisconsin软件包10.1版本(Genetics Computer Group，Madision，Wisconsin，USA)的一部分，可以方便地实施上述计算机辅助序列比对。使用缺省计分矩阵，缺口产生惩罚是50和缺口延伸惩罚是3。当这种序列具有至少大约75％的序列等同性，尤其是至少大约80％，更尤其至少大约85％，十分尤其大约90％，特别是大约95％，更特别是大约100％时，序列表示为“基本类似”，十分特别是等同。很清楚当RNA序列与DNA序列基本类似或具有某种程度的序列等同性时，认为DNA序列中的胸腺嘧啶(T)等于RNA序列中的尿嘧啶(U)。因此，当在本申请中陈述19个连续核苷酸的序列与19个核苷酸的序列具有94％序列等同性时，这意味着第一个序列的19个核苷酸中至少18个与第二个序列的19个核苷酸中的18个等同。
因此提及的反义核苷酸区域长度可以是大约21nt、50nt、100nt、200nt、300nt、500nt、1000nt、2000nt或甚至大约5000nt或更长，每一个具有大约40％或50％或60％或70％或80％或90％或100％的总体序列等同性。序列越长，总体序列等同性的要求越不严格。
此外，与目标基因的核苷酸序列的互补序列具有序列等同性的多个序列(多个目标基因特异性RNA区域)可以存在于一个RNA分子中。而且，与几个目标基因的核苷酸序列的互补序列具有序列等同性的多个序列可以存在于一个RNA分子中。
“目标基因特异性”不解释为这种意义-根据本发明的嵌合核酸仅可用于下调那个特殊目标基因。实际上，当目标基因特异性RNA区域和另一个基因之间存在足够的同源性时，或当其它基因具有相同的19个核苷酸片段(如属于所谓的基因家族的基因)时，那些其它基因的表达也可以被下调。
这里使用的“大部分双链化的RNA区域”是指通过内部碱基配对能够折叠成棒样结构的RNA分子和其中所产生的棒样结构不包含与那个RNA分子内19个其它连续核苷酸的另一个片段的互补序列具有94％序列等同性的任何19个连续核苷酸的片段，该RNA分子当折叠成棒样结构时能够形成双链区域。换言之，大部分双链化的RNA区域折叠后不含有其中最多有一个错配的至少19bp的双链RNA区域，至少不是能量最良好的棒样构象。这种结构的非限制性实施例在图1中表示。
尽管不意欲将本发明限于具体实施方式
，但是认为这种大部分双链化的RNA区域涉及它们所结合的反义RNA分子的核定位。其结果是，反义RNA分子的浓度在核中可以增加，允许通过与反义RNA对应的有义RNA碱基配对而更有效形成序列特异性dSRNA。
这里使用的关于RNA分子的术语“能够折叠成棒样结构”是指二级结构，优选RNA分子被内部碱基配对而改变和具有长棒的总体外观。棒样结构可以包括分支和凸出(在那里没有配对的核苷酸凸出到总体结构外)和可以是较大二级结构的一部分(该较大二级结构可以是或可以不是棒样)。能够折叠成棒样结构的RNA分子的实例在图1中表示。
改变的特殊二级结构将由RNA分子的自由能确定，并可以使用适当软件如FOLDRNA(Zuker和Stiegler，1981)或MFOLD结构预测软件包GCG(Genetics Computing Group；Zuker 1989，Science 244，48-52)预测不同情况。
在本发明的一个实施方案中，可操作连接反义RNA分子的大部分双链化的RNA区域是来自PSTVd型类病毒的核定位信号，如PSTVd(马铃薯纺锤形块茎类病毒)，能够在宿主细胞或植物宿主细胞的核中复制。
在本发明的一个实施方案中，大部分双链化的RNA区域包含PSTVD株RG1的全长序列，它可以通过使用具有5′-CGCAGATCTCGGAACTAAACTCGTGGTTC-3′[SEQ ID N01]和5′GCGAGATCTAGGAACCAACTGCGGTTC-3′[SEQ ID N02])的核苷酸序列的寡核苷酸引物扩增该病毒RNA基因组的cDNA拷贝而方便地获得，如SEQ IDN03所示的核苷酸序列。
人们理解对于插入RNA分子，需要另外步骤将DNA分子转变为对应的RNA分子。这种转变可以通过转录完成，如使用单亚基噬菌体RNA聚合酶体外转录。
也清楚当RNA序列被述为表示序列表的条目或基本类似于或与序列表中表示的DNA序列具有某种程度序列等同性时，RNA序列的参考对应于条目中序列，除了DNA序列中的胸腺嘧啶(T)被RNA序列中的尿嘧啶(U)取代。根据本文将立即明显清楚所指是RNA还是DNA序列。
在PSTVd型其它核复制类病毒(或根据Bussière et al.1996分类的B组)的基因组内也发现了类似的大部分双链化的RNA结构，并且这些RNA序列可以用于类似的作用。PSTVd的其它核复制类病毒组包括柑橘类病毒III类、柑橘类病毒IV类、彩叶草类病毒、啤酒花潜伏类病毒(SEQ ID N07)、澳大利亚葡萄树类病毒(SEQ ID N04)、番茄plantamacho类病毒(SEQ ID N06)、椰子萎缩病类病毒(SEQ ID N05)、番茄顶矮类病毒(SEQ ID N08)、椰子死亡类病毒、柑橘裂皮病类病毒、Columnea潜伏类病毒、啤酒花矮病类病毒和柑橘弯叶类病毒。这些类病毒的特征也是缺乏自身剪接活性，当缺乏催化基序如锤头基序(Busière et al.Nuc.Acids Res.24，1793-1798，1996)时变得明显。所有PSTVd型类病毒中完美dsRNA结构的最长片段长度是11个碱基对。错配通常分布十分平均。
这些类病毒的核苷酸序列已经汇编在通过互联网(http://www.callisto.si.usherb.ca/～jpperra或http://nt.ars-grin.gov/subviral/)可进入的数据库中并且包括下列马铃薯纺锤形块茎类病毒(PSTVd)[PSTVd.1(登记号J02287(gb)，M1 6826(gb)，V01465(emb1)；333351(gi)，333352(gi)和62283(gi))；PSTVd.2(登记号M38345(gb)，333354(gi))；PSTVd.3(登记号M36163(gb)，333356(gi))；PSTVd.4(登记号M14814(gb)，333357(gi))；PSTVd.5(株S.commersonii)(登记号M25199(gb)，333355(gi))；PSTVd.6(株番茄栽培种Rutgers，分离物KF440-2)(登记号X58388(emb1)，61 366(gi))；PSTVd.7(轻度株KF6-M)(登记号M88681(gb)，333358(gi))；PSTVd.8(株Burdock)(登记号M88678(gb)，333360(gi))；PSTVd.9(株Wisconsin(WB))(登记号M88677(gb)，333359(gi))；PSTVd.10(株PSTVd-N(Naaldwijk))(登记号X17268(emb1)，60649(gi))；PSTVd.11(轻度株变异体A，WA-M分离物)(登记号X52036(emb1)，61365(gi))；PSTVd.12(轻度株，F-M分离物)(登记号X52037(emb1)，61367(gi))；PSTVd.13(中等严重株，F-IS分离物)(登记号X52039(emb1)，61369(gi))；PSTVd.14(严重致死株，F-SL分离物)(登记号X52038(emb1)，61368(gi))；PSTVd.15(中等严重株，F88-1S分离物)如发表于Herold，T等人，Plant Mol.Biot.19，329-333(1992)；PSTVd.16(变异体F88或S88)(登记号X52040(emb1)，61370(gi))；PSTVd.17(独立分离物kf5)(登记号M93685(gb)，333353(gi))；PSTVd.18(分离物KF5)(登记号554933(gb)，265593(gi))；PSTVd.19(株S-XII，变种s27)(登记号X76845(emb1)，639994(gi))；PSTVd.20(株S-XIII，变种s23)(登记号X76846(emb1)，639993(gi))；PSTVd.21(株M(轻度))(登记号X76844(emb1)，639992(gi))；PSTVd.22(株1-818，变种14)(登记号X76848(emb1)，639991(gi))；PSTVd.23(株1-818，变种13)(登记号X76847(emb1)，639990(gi))；PSTVd.24(株PSTVd-341)(登记号Z34272(emb1)，499191(gi))；PSTVd.25(株QF B)(登记号U23060(gb)，755586(gi))PSTVd.26(株QF A)(登记号U23059(gb)，755585(gi))；PSTVd.27(株RG1)(登记号U23058(gb)，755584(gi))；PSTVd.28(登记号U51 895(gb)，1272375(gi))；PSTVd.29(马铃薯纺锤形块茎类病毒)(登记号X97387(emb1)，1769438(gi))；PSTVd.30(株S27-VI-24)(登记号Y09382(emb)，2154945(gi))；PSTVd.31(株S27-VI-19)(登记号Y09383(emb)，2154944(gi))；PSTVd.32(株SXIII)(登记号Y08852(emb)，2154943(gi))；PSTVd.33(株S27-1-8)(登记号Y09381(emb)，2154942(gi))；PSTVd.34(株PSTV M-VI-15)(登记号Y09577(emb)，2154941(gi))；PSTVd.35(株PSTV M-1-40)(登记号Y09576(emb)，2154940(gi))；PSTVd.36(株PSTV M-1-17)(登记号Y09575(emb)，2154939(gi))；PSTVd.37(株PSTV M-1-10)(登记号Y09574(emb)，2154938(gi))；PSTVd.38(变异体14-1-42)(登记号Y09889(emb)，2154937(gi))；PSTVd.39(变异体PSTVd 12-VI-27)(登记号Y09888(emb)，2154936(gi))；PSTVd.40(变异体PSTVd12-VI-25)(登记号Y09887(emb)，2154935(gi))；PSTVd.41(变异体PSTVd12-VI-16)(登记号Y09886(emb)，2154934(gi))；PSTVd.42(变异体PSTVd 14-1-10)(登记号Y09890(emb)，2154933(gi))；PSTVd.43(变异体PSTVd 12-1-14)(登记号Y09891(emb)，2154932(gi))PSTVd.44(分离物KF7)(登记号AJ007489(emb)，3367737(gi))；PSTVd.45(登记号AF369530，14133876(gi)]；柑橘类病毒III类(CVd-III)[CVd-III.1(登记号S76452(gb)，913161(gi))；CVd-III.2(澳大利亚新南威尔士分离物)(登记号S75465(gb)和S76454(gb)，914078(gi)和913162(gi))；CVd-III.3(登记号AF 123879，G17105753)；CVd-III.4(登记号AFi 23878，GI71 05752)CVd-III.5(登记号AF 123877，GI7105751)；CVd-III.6(登记号AF 123876，GI7105750)；CVd-III.7(登记号AF123875，GI7105749)；CVd-III.8(登记号AF 123874，G17105748)；CVd-III.9(登记号AF 123873，G17105747)；CVd-III.10(登记号AF 123872，GI7105746)；CVdIII.11(登记号AF123871，GI7105745)；CVd-III.12(登记号AF 123870，GI7105744)；CVd-III.13(登记号AF 123869，GI7105743)；CVd-III.14(登记号AF123868，GI7105742)；CVdIII.15(登记号AF123867，GI7105741)；CVd-III.16(登记号AF 123866，GI7105740)；CVd-III.17(登记号AF 123865，G17105739)；CVd-III.18(登记号AF 123864，G17105738)CVdIII.19(登记号AF 123863，GI7105737)；CVd-III.20(登记号AF 123860，GI7105736)；CVd-III.21(登记号AF 123859，GI71 05735)；CVd-III.22(登记号AF 123858，G17105734)；CVdIII.23(登记号AB054619，G113537479)；CVd-III.24(登记号AB054620，GI13537480)；CVd-III.25(登记号AB054621，GI13537481)；CVd-III.26(登记号AB054622，GI13537482)；CVd-III.27(登记号AB054623，GI13537483)；CVd-III.28(登记号AB054624，GI13537484)；CVd-III.29(登记号AB054625，GI13537485)；CVd-III.30(登记号AB054626，GI13537486)；CVd-III.31(登记号AB054627，GI13537487)；CVd-III.32(登记号AB054628，G113537488)；CVd-III.33(登记号AB054629，GI13537489)；CVd-III.34(登记号AB054630，GI13537490)；CVd-III.35(登记号AB054631，GI13537491)；CVd-III.36(登记号AB054632，GI13537492)；CVd-III.37(登记号AF416552，GI15811643)；CVd-III.38(登记号AF416553，GI15811644)；CVd-III.39(登记号AF416374，GI15788948)；CVdIII.40(登记号AF434680)]；柑橘类病毒IV类(CVdIV)[CVdIV.1(登记号X14638(emb1)，59042(gi))]彩叶草-1类病毒(CbVd-1)[CbVd.1(彩叶草类病毒1(CbVd1)，栽培株Bienvenue，德国分离物)(登记号X52960(emb1)，58844(gi))；CbVd.2(彩叶草黄类病毒(CYVd)，巴西分离物)(登记号X69293(emb1)，59053(gi))；CbVd.3(彩叶草类病毒1-RG茎-环RNA.)(登记号X95291(emb1)，1770104(gi))；CbVd.4(彩叶草类病毒1-RLRNA)(登记号X95366(emb1)，1770106(gi))J彩叶草-2类病毒(CbVd-2)[CbVd.1(彩叶草类病毒2-RL RNA)(登记号X95365(emb1)，1770107(gi))；CbVd.2(彩叶草类病毒CbVd 4-1RNA)(登记号X97202(emb1)，1770109(gi))]彩叶草-3类病毒(CbVd-3)[CbVd.1(彩叶草类病毒3-RL)(登记号X95364(emb1)，1770108(gi))；CbVd.2(来自彩叶草cultivar′Fairway Ruby′的彩叶草类病毒8)(登记号X57294(emb1)，780766(gi))；CbVd.3(彩叶草类病毒3-FR茎-环RNA，来自彩叶草栽培种′Fairway Ruby′)(登记号X95290(emb1)，1770105(gi))啤酒花潜伏类病毒(HLVd)[HLVd.1(登记号X07397(emb1)，60259(gi))；HLVd.2(′耐热突变体′T 15)(登记号AJ290404(gb)，13872743(gi))；HLVd.3(′耐热突变体′T40)(登记号AJ290405.1(gb)，13872744(gi))；HLVd.4(′耐热突变体′T50)(登记号AJ290406(gb)，13872745(gi))；HLVd.5(′耐热突变体′T59)(登记号AJ290406(gb)，13872746(gi))；HLVd.6(′耐热突变体′T61)(登记号AJ290408(gb)13872747(gi))；HLVd.7(′耐热突变体′T75)(登记号J290409(gb)，13872748(gi))；HLVd.8(′耐热突变体′T92)(登记号AJ290410(gb)，13872749(gi))；HLVd.9(′耐热突变体′T218)(登记号AJ290411(gb)，13872750(gi))；HLVd.10(′耐热突变体′T229)(登记号AJ290412(gb)，13872751(gi))]澳大利亚葡萄树类病毒(AGVd)[AGVd.1(登记号X17101(emb1)，58574(gi))]番茄planta macho类病毒(TPMVd)[TPMVd.1(登记号K00817(gb))]椰子萎缩病类病毒(CTiVd)[CTiVd.1(登记号M20731(gb)，323414(gi))]番茄顶矮类病毒(TASVd)[TASVd.1(登记号K00818(gb)，335155(gi))；TASVd.2(株印尼)(登记号X06390(emb1)，60650(gi))；TASVd.3(番茄顶矮类病毒-S茎-环RNA.)(登记号X95293(emb1)，1771788(gi))]椰子死亡类病毒(CCCVd)[CCCVd.1(分离物baao 54，ccRNA1快)(登记号J02049(gb)，323275(gi))；CCCVd.2(分离物baao54，ccRNA1快)(登记号J02050(gb)，323276(gi))；CCCVd.3(分离物baao 54，ccRNA 1慢)(登记号J02051(gb)，323277(gi))；CCCVd.4(分离物sLigao 14B，620C，191 D和Ti，ccRNA 1快)(Haseloff等人Nature 299，316-321(1982))CCCVd.5(分离物Ligao Ti，ccRNA 1慢)(Haseloff等人Nature 299，316-321(1982))；CCCVd.6(分离物Ligao 14B，ccRNA1慢)(Haseloff等人Nature 299，316-321(1982))；CCCVd.7(分离物San Nasciso，ccRNA 1慢)(Haseloff等人Nature 299，316-321(1982))]柑橘裂皮病类病毒(CEVd)[CEVd.1(来自三七草的cev)(登记号J02053(gb)，323302(gi))；CEVd.2(株A)(登记号M34917(gb)，323305(gi))；CEVd.3(株de25)(登记号K00964(gb)，323303(gi))；CEVd.4(株de26)(登记号K00965(gb)，323304(gi))；CEVd.5(CEV-JB)(登记号M30870(gb)，484119(gi))；CEVd.6(CEV-JA)(登记号M30869(gb)，484118(gi))；CEVd.7(登记号M30871(gb)，484117(gi))；CEVd.8(CEVA)(登记号M30868(gb)，484116(gi))；CEVd.9(Visvader，J.E.和Symons，R.H.Nucleic Acids Res.13，2907-2920(1985))CEVd.10(Visvader，J.E.和Symons，R.H.Nucleic Acids Res.13，2907-2920(1985))；CEVd.11(Visvader，J.E.和Symons，R.H.NucleicAcids Res.13，2907-2920(1985))；CEVd.12(Visvader，J.E.和Symons，R.H.Nucleic Acids Res.13，2907-2920(1985))；CEVd.13(Visvader，J.E.和Symons，R.H.Nucleic AcidsRes.13，2907-2920(1985))；CEVd.14(Visvader，J.E.和Symons，R.H.Nucleic Acids Res.13，2907-2920(1985))；CEVd.15(Visvader，J.E.和Symons，R.H.Nucleic Acids Res.13，2907-2920(1985))；CEVd.16(Visvader，J.E.和Symons，R.H.Nucleic Acids Res.13，2907-2920(1985))；CEVd.17(Visvader，J.E.和Symons，R.H.Nucleic Acids Fes.13，2907-2920(1985))；CEVd.18(Visvader，J.E.和Symons，R.H.NucleicAcids Res.13，2907-2920(1985))；CEVd.19(Visvader，J.E.和Symons，R.H.Nucleic Acids Res.13，2907-2920(1985))；CEVd.20(Visvader，J.E.和Symons，R.H.Nucleic Acids Res.13，2907-2920(1985))；CEVd.21(cev-j classe B)(Visvader，J.E.和Symons，R.H.Nucleic Acids Fes.13，2907-2920(1985))；CEVd.22(葡萄树类病毒(GV))(登记号Y00328(emb1)，60645(gi))；CEVd.23(CEVd-t)(登记号X53716(emb1)，433503(gi))；CEVd.24(CEVcIs，番茄杂种愈合组织分离物)(登记号567446(gb)，141247(gi))；CEVd.25(0EV D-92)(登记号S67442(gb)，141248(gi))；CEVd.26(CEVt，番茄杂种分离物)(登记号S67441(gb)，141246(gi))；CEVd.27(C EVt，番茄分离物)(登记号S67440(gb)，141245(gi))；CEVd.28(CEVg，三七草分离物)(登记号S67438(gb)，41244(gi))；CEVd.29(CEVc，香缘分离物)(登记号S67437(gb)，141243(gi))CEVd.30(株CEVd-225)(登记号U21126(gb)，710360(gi))；CEVd.31(大菜豆分离物，蚕豆)(登记号S79831(gb)，1 181910(gi))；CEVd.32(cevd.31接种番茄后获得的变异体)(Fagoaga等人.J.Gen.Virol.76，2271-2277(1995))；CEVd.33(Fagoaga等人J.Gen.Virol.76，2271-2277(1995))；CEVd.34(登记号AF298177，15419885(gi))；CEVd.35(登记号AF2981 78，15419886(gi))；CEVd.36(登记号AF428058)(柑橘裂皮病类病毒分离物205-E-1 Uy，完整基因组.)；CEVd.37(登记号AF428059)(柑橘裂皮病类病毒分离物205-E-2 Uy，完整基因组.)；CEVd.38(登记号AF428060)(柑橘裂皮病类病毒分离物205-E-5 Uy，完整基因组.)；CEVd.39(登记号AF428061)(相橘裂皮病类病毒分离物205-E-7 Uy，完整基因组.)；CEVd.40(登记号AF428062)(柑橘裂皮病类病毒分离物54-E-1 Uy，完整基因组.)；CEVd.41(登记号AF428063)(柑橘裂皮病类病毒分离物54-E-3 Uy，完整基因组.)；CEVd.42(登记号AF428064)(柑橘裂皮病类病毒分离物54-E-18 Uy，完整基因组.)；CEVd.43(登记号AF434678)(柑橘裂皮病类病毒，完整基因组.)]Columnea潜伏类病毒(CLVd)[CLVd.1(登记号X15663(emb1)，58886(gi))；.CLVd.2(CLVd-N，独立分离物Nematanthus)(登记号M93686(gb)，323335(gi))；CLVd.3(Columnea潜伏类病毒-B茎-环RNA)(登记号X95292(emb1)，1770174(gi))]柑橘弯叶类病毒(CBLVd)[CBLVd.1(CVd-1b)(登记号M74065(gb)，323413(gi))；CBLVd.2(株CBLVd-225)(登记号U21125(gb)，710359(gi))；CBLVd.3(类病毒Ia基因组RNA，分离物Jp)(登记号AB006734(dbj)，2815403(gi))；CBLVd.4(类病毒1b基因组RNA，分离物P2)(登记号AB006735(dbj)，2815401(gi))；CBLVd.5(类病毒Ia基因组RNA)(登记号AB006736(dbj)，2815402(gi))；CBLVd.6(柑橘类病毒Ia克隆17)(登记号AF040721(gb)，3273626(gi))；CBLVd.7(柑橘类病毒Ia克隆18)(登记号AF040722(gb)，3273627(gi))；CBLVd.8(柑橘弯叶类病毒分离物201-1-1Uy，完整基因组.)(登记号AF428052)；CBLVd.9(柑橘弯叶类病毒分离物201-1-2 Uy，完整基因组.)(登记号AF428053)；CBLVd.10(柑橘弯叶类病毒分离物201-1-5 Uy，完整基因组.)(登记号AF428054)；CBLVd.11(柑橘弯叶类病毒分离物205-1-1 Uy，完整基因组.)(登记号AF428055)；CBLVd.12(柑橘弯叶类病毒分离物205-1-3Uy，完整基因组.)(登记号AF428056)；CBLVd.13(柑橘弯叶类病毒分离物205-1-4 Uy，完整基因组.)(登记号AF428057)]啤酒花矮病类病毒(HSVd)[HSVd.h1(日本型株)(登记号X00009(emb1)，60684(gi))；HSVd.h2(日本株，变异体2)(Lee等人Nucleic Acids Res.16，8708-8708(1988))；HSVd.h3(韩国株)(登记号X12537(emb1)，60421(gi))；HSVd.g1(葡萄树类病毒(GVVd)，分离物SHV-g(GV))(登记号M35717(gb)，325405(gi))；HSVd.g2(株德国栽培种Riesling)(登记号X06873(emb1)，60422(gi))；HSVd.g3(株分离自Vitis vinifera Rootstock 5BB)(登记号X15330(emb1)，60648(gi))；HSVd.g4(葡萄树分离物(HSVdg)，变异体Ia)(登记号X87924(emb1)，897764(gi))；HSVd.g5(分葡萄树离株(HSVdg)，变异体Ib)(登记号X87923(emb1)，897765(gi))；HSVd.g6(葡萄树分离物(HSVdg)，变异体Ic)(登记号X87925(emb1)，897766(gi))；HSVd.g7(葡萄树分离物(HSVdg)，变异体1d)(登记号X87926(emb1)，897767(gi))；HSVd.g8(葡萄树分离物(HSVdg)，变异体1e)(登记号X87927(emb1)，897768(gi))；HSVd.g9(葡萄树分离物(HSVdg)，变异体IIa)(登记号X87928(emb1)，897769(gi))；HSVd.cit1(变异体1，分离物HSV-cit)(登记号X06718(emb1)，60646(gi))；HSVd.cit2(变异体2，分离物HSV-cit)(登记号X06719(emb1)，60647(gi))；HSVd.cit3(HSV.柑橘)(登记号X13838(emb1)，60418(gi))；HSVd.cit4(登记号U02527(gb)，409021(gi))；HSVd.cit5(Hsu等人Virus Genes 9，193-195(1995))；HSVd.cit6 cit5(Hsu等人VirusGenes 9，193-195(1995))；HSVd.cit7(分离物CVd-11a或E819)(登记号AF131248(gb))；HSVd.cit8(分离物CVd-11b或Ca902)(登记号AF131249(gb))；HSVd.cit9(分离物CVd-11c or Ca905)(登记号AF131250(gb))；HSVd.cit10(分离物Ca903)(登记号AF131251(gb))；HSVd.cit11(分离物CA909)(登记号AF131252(gb))；HSVd.cit12(cachexia分离物X-701-M)(登记号AF21 3483(gb)，12082502(gi))；HSVd.cit13(cachexia分离物X-701-1)(登记号AF213484(gb)，12082503(gi))；HSVd.cit14(cachexia分离物X-701-2)(登记号AF213485(gb)，12082504(gi))；HSVd.cit15(cachexia分离物X-701-3)(登记号AF213486(gb)，12082505(gi))；HSVd.cit16(cachexia分离物X-704-M)(登记号AF213487(gb)，12082506(gi))；HSVd.cit17(cachexia分离物X-704-1)(登记号AF213488(gb)，12082507(gi))；HSVd.cit18(cachexia分离物X-704-2)(登记号AF213489(gb)，12082508(gi))；HSVd.cit19(cachexia分离物X-704-3)(登记号AF213490(gb)，12082509(gi))；HSVd.cit20(cachexia分离物X-707-M)(登记号AF213491(gb)，12082510(gi))；HSVd.cit21(cachexia分离物X-707-1)(登记号AF213492(gb)，12082511(gi))；HSVd.cit22(cachexia分离物X-707-2)(登记号AF213493(gb)，12082512(gi))；HSVd.cit23(cachexia分离物X-707-3)(登记号AF213494(gb)，12082513(gi))；HSVd.cit24(cachexia分离物X-707-4)(登记号AF213495(gb)，12082514(gi))；HSVd.cit25(cachexia分离物X-712-M)(登记号AF213496(gb)，12082515(gi))；HSVd.cit26(cachexia分离物X-712-1)(登记号AF213497(gb)，12082516(gi))；HSVd.cit27(cachexia分离物X-712-2)(登记号AF213498(gb)，12082517(gi))；HSVd.cit28(cachexia分离物X-712-3)(登记号AF213499(gb)，12082518(gi))；HSVd.cit29(cachexia分离物X-715-M)(登记号AF213500(gb)，12082519(gi))；HSVd.cit30(cachexia分离物X-715-1)(登记号AF213501(gb)，12082520(gi))；HSVd.cit31(cachexia分离物X-715-2)(登记号AF213502(gb)，12082521(gi))；HSVd.cit32(CVd-lia(117))(登记号AF213503(gb)，12082522(gi))；HSVd.cit33(分离物CVd-11a 17uy)(登记号AF359276(gb)，13991644(gi))；HSVd.cit34(分离物CVd-11a 11uy)(登记号AF359275(gb)，13991643(gi))；HSVd.cit35(分离物CVd-11a 10 uy)(登记号AF359274(gb)，13991642(gi))；HSVd.cit36(分离物CVd-1b 10uy)(登记号AF359273(gb)，13991641(gi))；HSVd.cit37(分离物CVd-1b 5uy)(登记号AF359272(gb)，13991640(gi))；HSVd.cit38(分离物CVd-1b 3uy)(登记号AF359271(gb)，13991639(gi))；HSVd.cit39(分离物CVd1b 2uy)(登记号AF359270(gb)，13991638(gi))；HSVd.cit40(分离物CVd-11a)(登记号X69519(emb1)，2369773(gi))；HSVd.cit41(分离物CVd-11b)(登记号X69518(emb1)，2369774(gi))；HSVd.cit42(分离物CVd-11a54-2-1)(登记号AF416554，15811 645(gi))；HSVd.cit43(分离物CVd-11a 54-2-2)(登记号AF41 6555，15811 646(gi))；HSVd.cit44(分离物CVd-11a 205-2-4)(登记号AF416556，15811647(gi))；HSVd.cit45(分离物CVd-11a 205-2-1)(登记号AF416557，15811648(gi))；HSVd.p1(HSV-桃(A9))(登记号D13765(dbj)，221254(gi))；HSVd.p2(HSV-李子和HSV-桃(AF)分离物)(登记号D13764(dbj)，221255(gi))；HSVd.p3(来自西班牙的栽培种JeronimoJ-16)(登记号Y09352(emb1)，1684696(gi))；HSVd.apr1(来自法国的栽培种Rouge de Roussillon)(登记号Y08438(emb1)，2462494(gi))；HSVd.apr2(来自西班牙的未知栽培种)(登记号Y08437(emb1)，2462495(gi))；HSVd.apr3(来自西班牙的栽培种Bulida)(登记号Y09345(emb1)，1684690(gi))；HSVd.apr4(来自西班牙的栽培种Bulida)(登记号Y09346(emb1)，1684691(gi))；HSVd.apr5(来自西班牙的栽培种Bulida d′Arques)(登记号Y09344(emb1)，1684692(gi))；HSVd.apr6(来自西班牙的栽培种Pepito del Rubio)(登记号Y09347(emb1)，1684697(gi))；HSVd.apr7(来自西班牙的栽培种Pepitodel Rubio)(登记号09348(emb1)，1684699(gi))；HSVd.apr8(来自西班牙的栽培种Pepito del Rubio)(登记号Y09349(emb1)，684698(gi))；HSVd.apr9(来自摩洛哥的栽培种Canino)(登记号AJ297825(gb)，10944963(gi))；HSVd.aprlo(来自摩洛哥的cv.Canino)(登记号AJ297826(gb)，10944964(gi))；HSVd.apr11(来自摩洛哥的栽培种Canino)(登记号AJ297827(gb)，10944965(gi))；HSVd.apr12(来自摩洛哥的栽培种Canino)(登记号AJ297828(gb)，10944966(gi))；HSVd.apr13(来自摩洛哥的栽培种Canino)(登记号AJ297829(gb)，10944967(gi))；HSVd.apr14(来自土耳其的栽培种Septik)(登记号AJ297830(gb)，10944968(gi))；HSVd.apr15(来自塞浦路斯的栽培种Monaco bello)(登记号AJ297831(gb)，10944969(gi))；HSVd.apr16(来自塞浦路斯的栽培种Cafona)(登记号AJ297832(gb)，10944970(gi))；HSVd.apr17(来自塞浦路斯的栽培种Cafona)(登记号AJ297833(gb)，10944971(gi))；HSVd.apr18(来自塞浦路斯的栽培种Boccuccia spinosa)(登记号AJ297834(gb)，10944972(gi))；HSVd.apr19(来自塞浦路斯的栽培种Palumella)(登记号AJ297835(gb)，10944973(gi))；HSVd.apr20(来自塞浦路斯的栽培种Palumella)(登记号AJ297836(gb)，10944974(gi))；HSVd.apr21(来自塞浦路斯的栽培种Canino)(登记号AJ297837(gb)，10944975(gi))；HSVd.apr22(来自希腊的栽培种Kolioponlou)(登记号AJ297838(gb)，10944976(gi))；HSVd.apr23(来自希腊的栽培种Bebecou Paros)(登记号AJ297839(gb)，10944977(gi))；HSVd.apr24(来自希腊的栽培种Bebecou Paros)(登记号AJ297840(gb)，10944978(gi))；HSVd.c1(黄瓜白果类病毒(CPFVd)，分离物HSV-黄瓜)(登记号X00524(emb1)，60644(gi))；HSVd.c2(黄瓜白果类病毒(CPFVd))(登记号X07405(emb1)，5901 5(gi))；HSVd.alm1(登记号AJO11813(emb)，3738118(gi))；HSVd.a1m2(登记号AJO11814(emb)，3738119(gi))；HSVd.柑橘类病毒II，完整基因组(登记号AF434679)]。所有这些核苷酸序列并入这里作为参考。
如上表立刻明显，类病毒非常倾向于序列变异，这种自然变异体叶可以用于当前描述的方法和工具，特别是如果它们保留了连同任何可操作连接的RNA被转运到核的能力。
除了类病毒核苷酸序列中的天然变异，变异体可以通过特定核苷酸的置换、缺失或添加而获得，这种变异体也可适合当前描述的方法和工具，尤其是如果它们保留了连同任何可操作连接的RNA被转运到核的能力。
此外，得自类病毒核苷酸序列的较小RNA区域及其变异体可以用于本发明，它们能够连同任何可操作连接的RNA转运到核。
得自类病毒核苷酸序列的较小区域和变异体被转运到宿主细胞如植物细胞的核的能力，可以使用Zhou等人2001，J.Gen Virology，82，1491-1497所述试验来确定。简言之，该试验包括依靠在宿主细胞细胞质中复制的病毒RNA载体将标记基因编码区域中包含插入序列的标记编码区域如GFP导入宿主细胞。当导入有功能的核定位信号(方便地插于插入序列中的)时，包含标记基因的病毒RNA载体进入核中，在那里可以去除内含子并且剪接的RNA返回细胞质。可以通过翻译为GFP蛋白，以及通过RNA分析方法(如RT-PCR)检测剪接的RNA以证实剪接的RNA分子缺乏内含子。
此外，人肝炎δRNA是与PSTVd型类病毒很相似的1700nt单链环状RNA，因为位于核中，形成棒样结构，并且也可以根据本发明使用。
在本发明的另一个实施方案中，大部分双链化的RNA区域包含CUG、CAG、GAC或GUC重复。这里使用的“三核苷酸”重复或CUG、CAG、GAC或GUC重复是包含很多CUG、CAG、GAC或GUC三核苷酸的RNA分子。优选，CUG三核苷酸重复且不含插入序列，尽管在CUG三核苷酸重复之间可以偶尔存在不是由CUG三核苷酸组成的1至20-30核苷酸的短区域。优选，CUG重复包含超过35个拷贝或44个拷贝的很多CUG三核苷酸，如50和2000个拷贝之间的任何数量。方便地，CUG三联体的拷贝数量应该不超过100或150。期望CAG、GAC或GUC重复可以用于类似作用。
不意欲将本发明限于具体实施方式
，据教导这种三核苷酸重复通过不完美的碱基配对形成棒样结构，起着核保留信号的作用，可能通过空间位阻RNA通过核控输出，以及活化双链RNA依赖性蛋白激酶PKR(Daviset al，1997 Proc.NatI.Acad.Sci.94，7388-7393；Tian et al.2000RNA 6，79-87；Koch和Lefert 1998 J.Theor.Biol.192，505-514)。
当包含这种CUG重复的RNA分子可以传递到宿主细胞核时，如通过如这里所述的编码这种RNA的嵌合基因转录，CUG重复可能特别适合于增加反义调节的基因沉默效率。
尽管大部分双链化的RNA区域，如PSTVd型类病毒衍生的核定位信号或三核苷酸重复可方便地定位于目标特异性反义RNA的3′末端，预期大部分双链化的RNA的位置不很重要。因此，大部分双链化的RNA区域也可以位于RNA分子的5′末端，优选在3′末端，或甚至在这种RNA分子的中间。
也出乎意料地发现提供给宿主细胞的RNA分子中含入内含子序列可进一步增加反义调节的基因表达下调的效率，其中反义RNA可操作连接大部分双链化的RNA区域。再次，RNA分子中内含子对于目标特异性核苷酸序列以及大部分双链化的RNA区域的位置预期对效率具有微小作用。事实上，预期大部分双链化的RNA区域可以位于内含子序列中。
这里使用的“内含子“或插入序列用于指较大的被转录DNA区域内的DNA区域，它在核中转录产生，是较大RNA一部分的RNA区域，然而，当转移到细胞质时，从较大RNA中除去所述对应于内含子序列的RNA区域。相应的RNA也称作内含子或插入序列。内含子序列两侧连接剪接位点，且合成内含子可以通过将适当剪接位点连接具有适当分支点的基本上任何区域来产生。可以使用位于5′UTR、编码区或3′UTR中的内含子或插入序列。
优选插入序列或内含子能够在真核生物细胞中被剪接，尽管可能不再被剪接的插入序列的存在，如因为它们的引导序列已经改变或突变，甚至可以进一步增加嵌合RNA分子下调目标基因表达的效率。在本发明的一个实施方案中，内含子基本上与Flaveria trine的丙酮酸正磷酸二激酶2内含子2(pdk2内含子)序列等同，并且可以包含SEQ ID NO 9的序列。植物内含子的其它实例包括来自蓖麻子的过氧化氢酶内含子(登记号AF274974)，来自棉花的δ12去饱和酶(Fad2)内含子(登记号AF331 163)，来自拟南芥的δ12去饱和酶(Fad2)内含子(登记号AC 069473)，来自玉米的泛素内含子(登记号594464)，来自水稻的肌动蛋白内含子。哺乳动物病毒内含子的其它实例包括来自SV40的内含子。真菌内含子的实例包括来自曲霉属的丙糖磷酸异构酶的内含子。
也出乎意料地发现导入具有相应于真核生物细胞中已经存在的反义RNA分子的目标基因特异性区域的目标基因特异性区域的有义RNA分子，进一步增加目标基因表达的下调效率。如果提供这里所述的带有大部分双链化的RNA区域的有义RNA分子可以观察到相同的目标基因表达下调效率。有义RNA分子提供给真核宿主生物细胞，所述细胞同时具有通过与有义RNA分子碱基配对能够形成双链RNA的反义RNA分子。
因此，本发明的另一个实施方案中，提供了下调真核生物细胞中目标基因表达的方法，包括步骤a)给真核生物细胞提供第一和第二嵌合RNA分子，其中i)第一嵌合RNA分子，包含反义目标基因特异性RNA区域，该区域包含与来自目标基因核苷酸序列的19个连续核苷酸的互补序列具有至少大约94％序列等同性的至少大约19个连续核苷酸的核苷酸序列；ii)第二嵌合RNA分子，包含有义目标基因特异性RNA区域，该区域包含与来自第一嵌合RNA分子的互补序列具有至少大约94％序列等同性的至少大约19个连续核苷酸的核苷酸序列；iii)第一和第二嵌合RNA分子至少在第一嵌合RNA的19个连续核苷酸和第二嵌合RNA的19个连续核苷酸之间能够碱基配对；和iv)其中第一或第二嵌合RNA分子包含与反义目标基因特异性RNA区域或与有义目标基因特异性RNA区域可操作连接的大部分双链化的RNA区域；和b)鉴定其中目标基因表达下调的那些真核生物。
在另一个具体实施方案中，第一和第二嵌合RNA分子包含大量双链区域。该大部分双链化的RNA区域和目标基因特异性反义RNA的具体实施方案如本申请别处所述。有义RNA区域的具体实施方案类似于反义RNA区域的具体实施方案。
方便地，包含如这里所述的大部分双链化的RNA区域的反义或有义RNA分子可以通过导入和可能的整合其转录产生这种反义或有义RNA的嵌合基因而提供给真核宿主细胞或生物。因此，本发明也旨在提供这种嵌合基因，它包含-能够在目的真核生物细胞中表达的启动子或启动子区域，可操作连接于转录时产生反义RNA分子的DNA区域，该RNA包含-与来自目标基因核苷酸序列的19个连续核苷酸的互补序列具有至少大约94％序列等同性的至少大约19个连续核苷酸的目标基因特异性反义核苷酸序列；或-与来自目标基因核苷酸序列的19个连续核苷酸具有至少大约94％序列等同性的至少大约19个连续核苷酸的目标基因特异性有义核苷酸序列；可操作连接于-这里所述的大部分双链化的RNA区域；和任选-适合选择的真核细胞的转录终止和聚腺苷酸化区域。
这里使用的术语“启动子”表示转录起始过程中被DNA依赖性RNA聚合酶识别和结合(直接或间接)的任何DNA。启动子包括转录起始位点，和转录起始因子及RNA聚合酶结合位点，并且可以包含各种其它位点(如增强子)，在该位点，可以结合基因表达调节蛋白。
这里使用的术语“调节区域”是指参与驱动转录和控制(即调节)给定DNA序列，如编码蛋白或多肽的DNA的转录时间和水平的任何DNA。例如，5’调节区域(“启动子区域”)是位于编码序列上游(即5’)的DNA序列，且其包括启动子和5’非翻译引导序列。3’调节区域是位于编码序列下游(即3’)的DNA序列，且其包括合适的转录终止(和/或调节)信号，该信号包括一个或多个聚腺苷酸化信号。
在本发明的一个实施方案中，启动子是组成型启动子。在本发明的另一个实施方案中，通过外部或内部刺激物(诱导型启动子)增加启动子活性，刺激物如但不限于激素、化学化合物、机械脉冲、非生物或生物性压力条件。也可以时间或空间模式调节启动子的活性(组织特异性启动子；发育调节的启动子)。
在本发明的一个特定实施方案中，启动子是植物可表达的启动子。这里使用的术语“植物可表达的启动子”是指能够在植物细胞中控制(启动)转录的DNA序列。这包括植物来源的任何启动子，但也包括能够在植物细胞中指导转录的非植物来源的任何启动子，即某些病毒或细菌来源的启动子，如CaMV35S(Hapster et al.，1988)，地下三叶草病毒启动子4或7(WO9606932)，或T-DNA基因启动子，也包括组织特异性或器官特异性启动子，包括但不限于种子特异性启动子(如WO89/03887)，器官原基特异性启动子(An et al.，1996)，茎特异性启动子(Keller et al.，1988)，叶特异性启动子(Hudspeth et al.，1989)，叶肉特异性启动子(如光诱导型Rubisco启动子)，根特异性启动子(Keller et al.，1989)，块茎特异性启动子(Keil et al.，1989)，脉管组织特异性启动子(Pelemanet al.，1989)，雄蕊选择性启动子(WO 89/10396，WO 92/13956)，裂开带(dehiscence zone)特异性启动子(WO 97/13865)等等。
在本发明的另一个特定实施方案中，启动子是真菌表达型启动子。这里使用的术语“真菌表达型启动子”是指能够在真菌细胞中控制(启动)转录的DNA序列，例如但不限于构巢曲霉trpC基因启动子，或啤酒酵母GAL4诱导型启动子。
在本发明的另一个特定实施方案中，启动子是动物表达型启动子。这里使用的术语“动物表达型启动子”是指能够在动物细胞中控制(启动)转录的DNA序列，包括但不限于SV40晚期和早期启动子，巨细胞病毒CMV-IE启动子，RSV-LTR启动子，SCSV启动子，SCBV启动子等等。
用于本发明的反义或有义RNA分子也可以通过体外转录产生。为此，根据本发明的嵌合基因的启动子可以是噬菌体单亚基RNA聚合酶识别的启动子，噬菌体单亚基RNA聚合酶如来源于大肠杆菌噬菌体T7，T3，1，11，W31，H，Y，A1，122，cro，C21，C22和C2；恶臭假单胞菌噬菌体gh-1；鼠伤寒杆菌噬菌体SP6；粘质沙雷氏菌噬菌体IV；柠檬酸杆菌噬菌体ViIII；和克雷白氏杆菌噬菌体11的RNA聚合酶[Hausmann，CurrentTopics in Microbiology and Immunology，7577-109(1976)；Korstenet al.，J.Gen Virol.4357-73(1975)；Dunn et al.，Nature NewBiology，23094-96(1971)；Towle et al.，J.Biol.Chem.2501723-1733(1975)；Butler and Chamberlin，J.Biol.Chem.，2575772-5778(1982)]。这种启动子的实例分别是T3 RNA聚合酶特异性启动子和T7 RNA聚合酶特异性启动子。在CIG用作第一启动子的T3启动子可以是McGraw et al，NucI.Acid Res.136753-6766(1985)所述的任何T3基因启动子。或者，T3启动子可以是为了被T3 RNA聚合酶识别而在核苷酸位置-10，-11和-12被修饰的T7启动子[(Klement et al.，J.Mol.Biol.215，21-29(1990)]。优选的T3启动子是具有“一致”序列的T3启动子，如美国专利5,037,745所述。根据本发明可以与T7 RNA聚合酶联合使用的T7启动子，包含Dunn和Studier，J.Mol.Biol.166477-535(1983)所述的T7基因之一的启动子。优选的T7启动子是具有“一致”序列的T7启动子，如Dunn和Studier(前述)所述。
通过在本领域技术人员熟知的条件下，通过接受载体DNA接触适当噬菌体单亚基RNA聚合酶可大量产生反义或有义RNA。所产生的反义或有义RNA接着可以用于传递给倾向于基因沉默的细胞，如植物细胞、真菌细胞或动物细胞。反义RNA可以通过脂质体或其它转染试剂(如来自ClonTech的Clofection转染试剂或CalPhos哺乳动物转染试剂盒)导入动物细胞并可以通过使适当目标基因沉默而用于治疗包括人的动物的方法。反义或有义RNA可以以多种不同方法导入细胞。例如，可以通过显微注射、用被该反义或有义RNA包裹的微粒轰击、细胞或生物浸透于反义或有义RNA的溶液、在反义或有义RNA存在下电穿孔细胞膜、脂质体介导的反义或有义RNA传递和化学试剂如磷酸钙介导的转染、病毒感染、转化等等给予反义或有义RNA。反义或有义RNA可以连同增加细胞摄入RNA、稳定退火链或增加目标基因抑制的成分一起导入。在完整动物的情况下，通过注射或灌注到生物的体腔或间隙腔，或通过口服、局部、肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内给予)、鞘内、直肠、鼻内、眼或腹膜内系统给予可以方便地导入反义或有义RNA。也可以通过可植入的延长释放装置给予反义或有义RNA。
根据本发明的能够产生反义或有义RNA的嵌合基因也可以装配适合在特定原核宿主中表达反义或有义RNA的原核启动子。该原核宿主可以用作反义和/或有义RNA的来源，如通过将它喂给动物，如线虫或昆虫，其中通过报道基因表达降低来显现和监测目标基因的沉默。在这种情况下，将清楚目标基因和报道基因应该是目标真核生物细胞而非原核宿主生物中存在的基因。因此可以在一个宿主生物中产生根据本发明的反义或有义RNA或能够产生这种反义或有义RNA分子的嵌合基因，可以给予另一个目标生物(如饲喂作为裸DNA或RNA分子或囊包在脂质体中，病毒颗粒中或减毒病毒颗粒中，或惰性颗粒等中通过口服给予)并引起目标基因或另一个生物中基因的基因表达降低。
合适的转录终止和聚腺苷酸化区域包括但不限于SV40聚腺苷酸信号，HSV TK聚腺苷酸化信号，根癌土壤杆菌的胭脂氨酸合酶基因终止子，CaMV 35S转录物的终止子，地下三叶草病毒的终止子，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)trpC基因的终止子等等。
本发明也旨在提供反义或有义RNA，它可以通过从这些嵌合基因转录而获得，并且用于根据本发明的方法。
本发明的另一个目的是提供含有本发明的反义RNA分子，或含有能够产生本发明的反义RNA分子的嵌合基因的真核细胞，和非人真核生物。在优选实施方案中，嵌合基因稳定整合到真核生物细胞的基因组中。
提供同时含有有义和反义RNA分子，其中一个或两个RNA分子都包含大部分双链化的RNA区域，或含有编码这种RNA分子的嵌合基因的真核细胞和非人真核生物也是本发明的一个目的。
在另一个实施方案中，本发明的嵌合基因可以在能够在真核生物细胞中自主复制的DNA分子上提供，如病毒载体。该嵌合基因或有义或反义RNA也可以短暂提供给真核生物细胞。
嵌合基因(或RNA分子)导入宿主细胞可以通过各种方法来完成，包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、电穿孔、微粒轰击、显微注射到核等等。
嵌合基因导入植物细胞的方法是本领域熟知的，包括土壤杆菌介导的转染、微粒枪传递、显微注射、完整细胞电穿孔、聚乙二醇介导的原生质体转化、原生质体电穿孔、脂质体介导的转化、硅晶介导的转化等。这种方法获得的转化细胞接着可以再生为成熟的可育植物。
通过将嵌合基因注射到受精卵母细胞的原核，通过将细胞，优选未分化细胞移植到发育的胚胎中而产生嵌合胚胎，通过将来自重组细胞的核移植到去核胚胎或活化卵母细胞等等，可以产生转基因动物。本领域已经很好建立了转基因动物的产生方法，包括美国专利4,873,191；Rudolph et al.1999(Trends Biotechnology 17367-374)；Dalrympleet al.(1998)Biotechnol.Genet.Eng.Rev.1533-49；Colman(1998)Bioch.Soc.Symp.63141-147；Wilmut et al.(1997)Nature 385810-813，Wilmute et al.(1998)Reprod.Fertil.Dev.10639-643；Perry et al.(1993)Transgenic Res.2125-133；Hogan et al.Manipulating the Mouse Embryo，2nd ed.Cold Spring HarborLaboratory press，1994和这里引用的参考文献。
通过常规繁育方法产生的包含本发明嵌合基因的植物或动物的配子、种子、胚、子代、杂种也包括在本发明的范围内。
这里描述的方法和工具可以应用于其中发生基因沉默的任何真核生物，包括但不限于植物(如玉米、小麦、向日葵、草坪草、大麦、黑麦、番茄、甘蔗、红花、棉花、拟南芥、水稻、芥属植物、蔬菜、大豆、烟草、树、亚麻、棕榈树、花生、菜豆等)、无脊椎动物(如昆虫、贝类动物、软体动物、甲壳类动物如螃蟹、龙虾和对虾)、脊椎动物(鱼、鸟类动物、哺乳动物、人)、酵母和真菌和其它。
下列非限制性实施例描述了增加反义RNA调节的真核生物细胞中目标基因表达沉默或有义/反义RNA联合调节的目标基因沉默的方法和工具。
除非在实施例中反向指出，根据标准方案实施所有重组DNA技术，如Sambrook et aL(1989)Molecular CloningA Laboratoty Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY and inVolumes 1 and 2 of Ausubel et al.(1994)Current Protocols inMolecular Biology，Current Protocols，USA所述。R.D.D.Croy的PlantMolecular Biology Lab fax(1993)中描述了植物分子工作的标准材料和方法，BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和BlackwellScientific Publications联合发表，UK。标准分子生物学技术的其它参考文献包括Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning.′A′Laboratoiy Manual，Third Edition，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，NY，Volumes I and II of Brown(1998)Molecular BiologyLabFax，Second Edition，Academic Press(UK)。在Dieffenbach和Dveksler(1995)PCR PrimerA Laborato，y Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，和McPherson at al.(2000)PCR-BasicsFrom Background to Bench，First Edition，Springer Verlag，Germany中可以找到聚合酶链式反应的标准方法。
贯穿说明书和实施例，对下列序列作出参考资料SEQ ID N01扩增RG1 PSTVd的寡核苷酸引物SEQ ID N02扩增RG1 PSTVd的寡核苷酸引物SEQ ID N03PSTVd RG1基因组的核苷酸序列SEQ ID N04澳大利亚葡萄树类病毒基因组的核苷酸序列SEQ ID N05椰子萎缩病类病毒基因组的核苷酸序列SEQ ID N06番茄planta macho类病毒基因组的核苷酸序列SEQ ID N07啤酒花潜伏类病毒基因组的核苷酸序列SEQ ID N08番茄顶矮类病毒基因组的核苷酸序列SEQ ID N09pdk2内含子的核苷酸序列SEQ ID N010EIN2 cDNA的核苷酸序列SEQ ID N011基因组EIN2克隆的核苷酸序列SEQ ID N012实施例构建体中使用的扩增部分EIN2的寡核苷酸引物1SEQ ID N013实施例构建体中使用的扩增部分EIN2的寡核苷酸引物2SEQ ID N014pMBW491中pTSVd的序列SEQ ID N015pMBW489中pTSVd的序列(具有10nt缺失)实施例实施例1含有所用的不同嵌合基因的不同植物系的构建作为用各种构建体下调表达的目标基因实例，选择来自拟南芥的EIN2基因。种子在MS-ACC培养基(含有氨基环丙烷-1-羧酸(ACC))上萌芽并在黑暗或光照下培养可容易地看到EIN2基因表达的下调。在黑暗中生长培养EIN2沉默幼苗与野生型幼苗相比具有更长的下胚轴和发育更多的根系统，而在光照下生长的EIN2沉默幼苗可以通过它们更大的子叶大小与野生型幼苗区分开来。
使用具有SEQ ID N012和13表示的核苷酸序列的寡核苷酸引物，使用基因组DNA(见SEQ ID N011的核苷酸序列)或cDNA(见SEQ ID N010的核苷酸序列)作为模板DNA，通过PCR以有义或反义方向扩增不同构建体中使用的EIN2核苷酸序列。基因组EIN2序列部分(gEIN2)的扩增产生了具有SEQ ID N011的核苷酸序列从核苷酸位置538至核苷酸位置1123的PCR片段并且含有EIN2基因的两个天然内含子。
gEIN2片段作为Kpn1/Cla1片段克隆进入pART7(Gleave，1992 Plant.Mol.Biol.201203-1207)，产生pMBW313，且35S启动子-gE1N2有义-OCS3′表达盒在NotI位点克隆进入pART27(Gleave 1992前述)产生pMBW353。
使用EIN2 cDNA(SEQ ID N010)作为模板及与gEIN2相同的引物用PCR扩增类似的片段(cEIN2)。用BamH1/Clal消化cEIN2片段并在相同位点克隆进入pSHUTTLE(Wang et al.，1998 Acta Hort.461401-407)，得到pMBW310。接着用Xba1从pMBW310切出cEIN2片段并克隆进入pART7的Xba1位点，形成pMBW351。从这个中间载体切出35S-EIN2反义-OCS3’并在NotI位点克隆进入pWBVec2A(Wang et al.1998，前述)，产生pMBW360。
使用具有SEQ ID N01和SEQ ID N02的核苷酸序列的寡核苷酸从cDNA扩增PSTVd株RG1(SEQ ID N03)的全长序列。用BgIII消化所产生的PCR片段并克隆进入pMBW313的BamHI位点，产生pMBW345，从它切出35S-gEIN2-PSTVd-OCS3’表达盒并在NotI位点克隆进入pART27，产生pMBW355。
对于pMBW359，用BgIII消化PCR扩增的PSTVd序列并克隆进入pMBW310的BamHI位点，得到pMBW346，用Xba1从中切出cE1N2反义-PSTVd序列并克隆进入pHANNIBAL(Wesley et al.2001)的Xba1位点，形成pMBW349。35S-pdk2-cEIN2反义-PSTVd-OCS3’表达盒接着在NotI位点克隆进入pWBVec2a，形成pMBW359。cEIN2反义PSTVd片段也克隆进入pWBVec2a而产生pMBW357。
用EcoRV/BamH1从pMBW310切出EIN2 cDNA片段，用Pfu处理平末端化并连接进入pKANNIBAL(Wesley et al.2001)的BamHI位点(也用Pfu处理过)。回收对于35S启动子2个方向都含cEIN2的质粒并命名为pMWB401(反义)和pMBW404(有义方向)。
对于pLMW37、pLMW38、pLMW39和pLMW40，在反转重复PSTVd序列上游或下游以有义或反义方向插入cEIN2片段。为此，在pdk内含子上游以对于完整拷贝PSTVd基因组相反的方向克隆部分PSTVd序列(SEQ ID N03的从位置16的核苷酸至位置355的核苷酸)。
图2中图示了不同的构建体。
实施例2在包含实施例1的不同嵌合基因的转基因拟南芥系中分析EIN2基因的表达使用常规方法将图2中表示的嵌合构建体导入根癌土壤杆菌，所产生的土壤杆菌株用于通过浸渍方法将嵌合基因导入拟南芥生态型Landsberg erecta。在作为选择试剂的15mg/L潮霉素或50mg/L卡那霉素上选择转基因系。收集T1 opr F1种子并检测EIN2沉默。
为此，种子铺在含50μM ACC的MS培养基中。用石蜡紧紧密封该板并保持在光下或黑暗中。通过观察根和子叶的大小(光下培养)或通过观察根和下胚轴的大小(黑暗中培养)给沉默打分。在EIN2沉默系中，根或下胚轴明显长于，和子叶明显大于在相同条件下生长的野生系。
来自原代转化体的种子铺在MS-ACC培养基上，用石蜡密封，4℃保持过夜0-2次，接着移至生长室并保持在光下或黑暗中。通过检测根和子叶大小(对于在光下萌芽的那些)或下胚轴大小(对于黑暗中的那些)给EIN2基因的沉默打分。显著或强烈沉默是指根或下胚轴长，而弱沉默是指子叶较大但根或下胚轴短。表1总结了结果。
表1各种EIN2构建体转化的拟南芥植物中EIN2沉默效率的总结

实施例3包含实施例1的不同嵌合基因的转基因拟南芥系杂交获得的拟南芥系中EIN2基因表达的分析通过拟南芥系MBW353，MBW355，MBW359，MBW360之间交叉授粉，获得了同时含有有义和反义EIN2构建体的新系。以与实施例2中所述相同的方法分析这些新系。表2总结了结果。其中至少一个转基因含有PSTVd序列的植物高效沉默。
表2含有有义和反义EIN2构建体不同组合的拟南芥植物中EIN2沉默的效率总结


实施例4调节哺乳动物细胞中GFP基因沉默的不同嵌合基因的构建和CHO细胞中的分析作为在哺乳动物细胞中表达下调的目标基因实例，选择了在CMV启动子区域控制下表达，后跟随SV40聚腺苷酸化信号的人源化的GFP编码区域。
构建不同实验沉默构建体，它含有相对于CMV启动子区域有义(如pMBW493，pMBW494和pMBW497中)或反义方向(如pMBW489，pMBW491或pMBW496中)的GFP编码区域。
质粒pMBW493和pMBW489在GFP编码区域下游，但在SV40聚腺苷酸化信号上游含有相当于PSTVd序列的核苷酸序列，但含有10nt缺失(SEQ IDNo 15)。这种缺失对推定的二级结构有影响(见图5)。
质粒pMBW494和pMBW491在GFP编码区域下游，但在SV40聚腺苷酸化信号上游含有相当于SEQ ID No 14的PSTVd序列的核苷酸序列，不含有10nt缺失。
质粒pMBW497和pMBW496在GFP编码区域下游，但在SV40聚腺苷酸化信号上游含有包含60CUG三核苷酸重复的核苷酸序列。
不同的实验质粒(以不同浓度)联合包含表达GFP的嵌合基因的质粒导入CHO细胞(表3；条目1-18)。由于GFP构建体是有义构建体中的功能序列，所以含有义GFP，不含额外表达GFP的嵌合基因的实验构建体也被导入；来估计单独这些构建体的GFP表达(表3；条目19-30)。而且，以不同浓度向CHO细胞导入联合的反义和有义实验构建体(表3；条目31-42)。作为对照，嵌合GFP表达构建体(pCi-GFP)单独导入CHO细胞。
24小时或48小时后，检测细胞的GFP表达。表3表示了平均量和标准差。
携带pTSVd或CUG重复序列的反义GFP构建体pMBW491，pMBW496和pMBW489的GFP基因表达显著降低。
有趣的是，PSTVd序列含有10nt缺失的pMWB489产生了比含有完整PSTVd序列的pMWB491更慢且更低程度的GFP沉默。

表3.不同实验构建体转化的CHO细胞中GFP的表达总结。

序列表<110>Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization<120>修饰的基因沉默RNA及其用途<130>BROLGA-WO1<150>60/363851<151>2002-03-14<160>15<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>29<212>DNA<213>人工<220>
<223>PCR扩增PSTVd RG1基因组的寡核苷酸引物PSTVd RG1<400>1cgcagatctc ggaactaaac tcgtggttc 29<210>2<211>27<212>DNA<213>人工<220>
<223>PCR扩增PSTVd RG1基因组的寡核苷酸引物PSTVd RG1<400>2gcgagatcta ggaaccaact gcggttc27<210>3<211>359<212>DNA
<213>马铃薯纺锤形块茎类病毒<400>3cggaactaaa ctcgtggttc ctgtggttca cacctgacct cctgacaaga aaagaaaaaa60gaaggcggct cggaggagcg cttcagggat ccccggggaa acctggagcg aactggcaaa120aaaggacggt ggggagtgcc cagcggccga caggagtaat tcccgccgaa acagggtttt180cacccttcct ttcttcgggt gtccttcctc gcgcccgcag gaccacccct cgcccccttt240gcgctgtcgc ttcggctact acccggtgga aacaactgaa gctcccgaga accgcttttt300ctctatctta cttgctccgg ggcgagggtg tttagccctt ggaaccgcag ttggttcct 359<210>4<211>369<212>DNA<213>澳大利亚葡萄树类病毒<400>4tgggcaccaa ctagaggttc ctgtggtact caccgaaggc cgcgaacgta ggaaagaaaa 60agatagaaaa gctgggtaag actcacctgg cgactcgtcg tcgacgaagg gtcctcagca120gagcaccggc aggaggcgct atgcaggaac gctaggggtc ctccagcgga ggactgaaga180aactccggtt tcttctttca ctctgtagct ggaatccctg ttgcgcttgc tggcgaaacc240tgcagggaag ctagctgggt cccgctagtc gagcggactc gtcccagcgg tcccaaccag300ttttctttat cctatttttc ctgcgggcgc ccggtcgtgg ttaccctgga gctccctgtt360tggaggccc369<210>5<211>254<212>DNA<213>椰子萎缩病类病毒<400>5ctggggaatt cccacggctc ggcaaaataa aagcacaaga gcgactgcta gagggatccc 60cggggaaacc cctagcaacc gaggtaggga gcgtacctgg tgtcgccgat tcgtgctggt120tgggcttcgt cccttccgag cttcgatccg acgcccggcc gcttcctcgc cgaagctgct180acggagacta cccggtggat acaactcttt gcagcgccct gtgtaataaa agctcgagtc240cggtttgcgc ccct 254<210>6<211>360<212>DNA<213>番茄planta macho类病毒<400>6cgggatcttt tccttgtggt tcctgtggta cacacctgac ctcctgacca gaaaagaaaa 60
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<223>pdk2内含子的核苷酸序列<400>9aagcttggta aggaaataat tattttcttt tttcctttta gtataaaata gttaagtgat 60gttaattagt atgattataa taatatagtt gttataattg tgaaaaaata atttataaat120atattgttta cataaacaac atagtaatgt aaaaaaatat gacaagtgat gtgtaagacg180
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权利要求
1.一种下调真核生物细胞中目标基因表达的方法，包括步骤a)给真核生物细胞提供嵌合RNA分子，其中所述嵌合RNA分子包含i)目标基因特异的RNA区域，包含与来自目标基因核苷酸序列的19个连续核苷酸的互补序列具有至少大约9 4％序列等同性的至少大约19个连续核苷酸的核苷酸序列；可操作连接于ii)大部分双链化的RNA区域；和b)鉴定其中目标基因表达下调的那些真核生物。
2.根据权利要求1的方法，其中大部分双链化的RNA区域包含来自马铃薯纺锤形块茎类病毒(PSTVd)型类病毒的核定位信号。
3.根据权利要求2的方法，其中所述核定位信号来自选自马铃薯纺锤形块茎类病毒、柑橘类病毒III类、柑橘类病毒IV类、啤酒花潜伏类病毒(Hop latent viroid)、澳大利亚葡萄树类病毒、番茄planta macho类病毒、椰子萎缩病类病毒(coconut tinangaja viroid)、番茄顶矮类病毒(Toma to apical stunt viroid)、椰子死亡类病毒、柑橘裂皮病类病毒、Columnea潜伏类病毒、啤酒花矮化类病毒和柑橘弯叶类病毒的类病毒。
4.根据权利要求3的方法，其中所述类病毒具有选自SEQ ID N03，SEQ ID N04，SEQ ID N05，SEQ ID N06，SEQ ID N07和SEQ ID N08的基因组核苷酸序列。
5.根据权利要求2至4任一项的方法，其中所述的核定位信号来自马铃薯纺锤形块茎类病毒。
6.根据权利要求2至5任一项的方法，其中所述的核定位信号来自马铃薯纺锤类病毒株RG1。
7.根据权利要求2至6任一项的方法，其中所述核定位信号包含发挥选自SEQ ID N03的核苷酸序列的核定位信号的功能的核苷酸序列。
8.根据权利要求2或3的方法，其中所述大部分双链化的RNA包含类病毒基因组核苷酸序列，所述类病毒基因组核苷酸序列选自马铃薯纺锤形块茎类病毒的基因组核苷酸序列、柑橘类病毒III类的基因组核苷酸序列、柑橘类病毒IV类的基因组核苷酸序列、啤酒花潜伏类病毒的基因组核苷酸序列、澳大利亚葡萄树类病毒的基因组核苷酸序列、番茄plantamacho病类病毒的基因组核苷酸序列、椰子萎缩病类病毒的基因组核苷酸序列、番茄顶矮类病毒的基因组核苷酸序列、椰子死亡类病毒的基因组核苷酸序列、柑橘裂皮病类病毒的基因组核苷酸序列、Columnea潜伏类病毒的基因组核苷酸序列、啤酒花矮病类病毒的基因组核苷酸序列和柑橘弯叶类病毒的基因组核苷酸序列。
9.根据权利要求8的方法，其中所述类病毒基因组核苷酸序列选自SEQ ID N03，SEQ ID N04，SEQ ID N05，SEQ ID N06，SEQ ID N07和SEQ IDN08。
10.根据权利要求2至9任一项的方法，其中所述的大部分双链化的RNA区域包含马铃薯纺锤形块茎类病毒基因组核苷酸序列。
11.根据权利要求10的方法，其中所述的类病毒基因组核苷酸序列是马铃薯纺锤形块茎类病毒株RG1的基因组核苷酸序列。
12.权利要求11的方法，其中所述的基因组核苷酸序列具有SEQ IDN03的核苷酸序列。
13.根据权利要求1的方法，其中所述的大部分双链化的RNA区域包含至少35个重复的三核苷酸CUG。
14.根据权利要求13的方法，其中所述的大部分双链化的RNA区域包含44到2000个重复的三核苷酸CUG。
15.根据权利要求1至14任一项的方法，其中所述的RNA分子包含多个目标基因特异性区域。
16.根据权利要求1至15任一项的方法，其中所述的RNA分子包含内含子序列。
17.根据权利要求16的方法，其中所述的内含子序列选自pdk2内含子、来自蓖麻子的过氧化氢酶内含子、来自棉花的δ12去饱和酶内含子、来自拟南芥的δ12去饱和酶内含子、来自玉米的泛素内含子、来自水稻的肌动蛋白内含子、来自曲霉菌的丙糖磷酸异构酶内含子和来自SV40的内含子。
18.根据权利要求1至17任一项的方法，其中所述的真核生物是植物。
19.根据权利要求18的方法，其中所述的植物选自拟南芥、苜蓿、大麦、菜豆、玉米、棉花、亚麻、豌豆、油菜、水稻、黑麦、红花、高粱、大豆、向日葵、烟草、小麦、芦笋、甜菜、椰菜、卷心菜、胡萝卜、花椰菜、芹菜、黄瓜、茄子、莴苣、洋葱、油籽油菜、辣椒、马铃薯、南瓜(pumpkin)、小萝卜、菠菜、南瓜(squash)、番茄、西葫芦、杏仁、苹果、杏、香蕉、黑莓、蓝莓、可可、樱桃、椰子、越橘、枣、葡萄、葡萄柚、番石榴、猕猴桃(kiwi)、柠檬、酸橙、芒果、甜瓜、油桃、桔子、番瓜、西番莲、桃、花生、梨、菠萝、阿月浑子、李子、覆盆子、草莓、柑橘、胡桃和西瓜。
20.根据权利要求1至17任一项的方法，其中所述的真核生物是真菌、酵母或霉菌。
21.根据权利要求1至17任一项的方法，其中所述的真核生物是动物。
22.根据权利要求21的方法，其中所述的动物是人、哺乳动物、鱼、牛、山羊、猪、绵羊、啮齿动物、仓鼠、小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、灵长目动物、线虫、甲壳类动物、对虾、螃蟹、龙虾、昆虫、果蝇、鞘翅目昆虫、双翅目昆虫、鳞翅目昆虫和同翅目(homeopteran)昆虫。
23.根据权利要求1至22任一项的方法，其中所述的嵌合RNA通过从嵌合DNA分子转录产生。
24.下调真核生物细胞中目标基因表达的嵌合RNA分子，包含a)目标基因特异性的RNA区域，其包含与来自所述真核生物的所述细胞的所述目标基因核苷酸序列的19个连续核苷酸的互补序列具有至少大约94％序列等同性的至少大约19个连续核苷酸的核苷酸序列；可操作连接于b)大部分双链化的RNA区域；其中所述的嵌合RNA分子，当提供给所述真核生物的细胞时下调所述目标基因的表达。
25.根据权利要求24的嵌合RNA分子，其中大部分双链化的RNA区域包含来自马铃薯纺锤形块茎类病毒(PSTVd)型的类病毒的核定位信号。
26.根据权利要求25的嵌合RNA分子，其中所述的核定位信号来自类病毒，其选自马铃薯纺锤形块茎类病毒、柑橘类病毒III类、柑橘类病毒IV类、啤酒花潜伏类病毒、澳大利亚葡萄树类病毒、番茄planta macho类病毒、椰子萎缩病类病毒、番茄顶矮类病毒、椰子死亡类病毒、柑橘裂皮病类病毒、Columnea潜伏类病毒、啤酒花矮病类病毒和柑橘弯叶类病毒。
27.根据权利要求25或26的嵌合RNA分子，其中所述的类病毒具有选自SEQ ID N03，SEQ ID N04，SEQ ID N05，SEQ ID N06，SEQ ID N07和SEQ ID N08的基因组核苷酸序列。
28.根据权利要求25或26任一项的嵌合RNA分子，其中所述的核定位信号来自马铃薯纺锤形块茎类病毒。
29.根据权利要求25或26任一项的嵌合RNA分子，其中所述的核定位信号来自马铃薯纺锤形块茎类病毒株RG1。
30.根据25至29任一项的嵌合RNA分子，其中所述的核定位信号包含作用如选自SEQ ID N03的核定位信号的核苷酸序列。
31.根据权利要求25或26的嵌合RNA分子，其中所述的大部分双链化的RNA区域包含类病毒基因组核苷酸序列，所述类病毒基因组核苷酸序列选自马铃薯纺锤形块茎类病毒的基因组核苷酸序列、柑橘类病毒III类的基因组核苷酸序列、柑橘类病毒IV类的基因组核苷酸序列、啤酒花潜伏类病毒的基因组核苷酸序列、澳大利亚葡萄树类病毒的基因组核苷酸序列、番茄planta macho类病毒的基因组核苷酸序列、椰子萎缩病类病毒的基因组核苷酸序列、番茄顶矮类病毒的基因组核苷酸序列、椰子死亡类病毒的基因组核苷酸序列、柑橘裂皮病类病毒的基因组核苷酸序列、Columnea潜伏类病毒的基因组核苷酸序列、啤酒花矮病类病毒的基因组核苷酸序列和柑橘弯叶类病毒的基因组核苷酸序列。
32.根据权利要求31的嵌合RNA分子，其中所述的类病毒基因组核苷酸序列选自SEQ ID N03，SEQ ID N04，SEQ ID N05，SEQ ID N06，SEQID N07和SEQ ID N08。
33.根据权利要求25至32任一项的嵌合RNA分子，其中所述的大部分双链化的RNA区域包含马铃薯纺锤形块茎类病毒的基因组核苷酸序列。
34.根据权利要求33的嵌合RNA分子，其中所述的类病毒基因组核苷酸序列是马铃薯纺锤形块茎类病毒株RG1的基因组核苷酸序列。
35.根据权利要求34的嵌合RNA分子，其中所述的基因组核苷酸序列具有SEQ ID N03的核苷酸序列。
36.根据权利要求24的嵌合RNA分子，其中所述的大部分双链化的RNA区域包含至少35个重复的三核苷酸CUG。
37.根据权利要求36的嵌合RNA分子，其中所述的大部分双链化的RNA区域包含44到2000个重复的三核苷酸CUG。
38.根据权利要求24至37任一项的嵌合RNA分子，其中所述的RNA分子包含多个目标基因特异性区域。
39.根据权利要求24至38任一项的嵌合RNA分子，其中所述的RNA分子包含内含子序列。
40.根据权利要求39的嵌合RNA分子，其中所述的内含子序列选自pdk2内含子、来自蓖麻子的过氧化氢酶内含子、来自棉花的δ12去饱和酶内含子、来自拟南芥的δ12去饱和酶内含子、来自玉米的泛素内含子、来自水稻的肌动蛋白内含子、来自曲霉菌的丙糖磷酸异构酶内含子和来自SV40的内含子。
41.降低真核生物细胞中目标基因表达的嵌合RNA分子，包含a)能够被所述真核生物的所述细胞中的RNA聚合酶识别的启动子或启动子区域；可操作连接于b)DNA区域，当它被转录时产生RNA分子，所述RNA分子包含i)目标基因特异性的RNA区域，其包含与来自所述真核生物的所述细胞的所述目标基因核苷酸序列的19个连续核苷酸的互补序列具有至少大约94％序列等同性的至少大约19个连续核苷酸的核苷酸序列；可操作连接于ii)大部分双链化的RNA区域；其中所述的嵌合DNA分子，当提供给所述真核生物的细胞时降低所述目标基因的表达。
42.根据权利要求41的嵌合DNA分子，其中大部分双链化的RNA区域包含来自马铃薯纺锤形块茎类病毒型的类病毒的核定位信号。
43.根据权利要求42的嵌合DNA分子，其中所述的核定位信号来自选自马铃薯纺锤形块茎类病毒、柑橘类病毒III类、柑橘类病毒IV类、啤酒花潜伏类病毒、澳大利亚葡萄树类病毒、番茄planta macho类病毒、椰子萎缩病类病毒、番茄顶矮类病毒、椰子死亡类病毒、柑橘裂皮病类病毒、Columnea潜伏类病毒、啤酒花矮病类病毒和柑橘弯叶类病毒的类病毒。
44.根据权利要求42或43的嵌合DNA分子，其中所述的类病毒具有选自SEQ ID N03，SEQ ID N04，SEQ ID N05，SEQ ID N06，SEQ ID N07和SEQ ID N08的基因组核苷酸序列。
45.根据权利要求42至44任一项的嵌合DNA分子，其中所述的核定位信号来自马铃薯纺锤形块茎类病毒。
46.根据权利要求45的嵌合DNA分子，其中所述的核定位信号来自马铃薯纺锤形块茎类病毒株RG1。
47.根据权利要求42至46任一项的嵌合DNA分子，其中所述的核定位信号包含作用如选自SEQ ID N03的核定位信号的核苷酸序列。
48.根据权利要求42或43的嵌合DNA分子，其中所述的大部分双链化的RNA包含类病毒基因组核苷酸序列，所述类病毒基因组核苷酸序列选自马铃薯纺锤形块茎类病毒的基因组核苷酸序列、柑橘类病毒III类的基因组核苷酸序列、柑橘类病毒IV类的基因组核苷酸序列、啤酒花潜伏类病毒的基因组核苷酸序列、澳大利亚葡萄树类病毒的基因组核苷酸序列、番茄planta macho类病毒的基因组核苷酸序列、椰子萎缩病类病毒的基因组核苷酸序列、番茄顶矮类病毒的基因组核苷酸序列、椰子死亡类病毒的基因组核苷酸序列、柑橘裂皮病类病毒的基因组核苷酸序列、Columnea潜伏类病毒的基因组核苷酸序列、啤酒花矮病类病毒的基因组核苷酸序列和柑橘弯叶类病毒的基因组核苷酸序列。
49.根据权利要求48的嵌合DNA分子，其中所述的类病毒基因组核苷酸序列选自SEQ ID N03，SEQ ID N04，SEQ ID N05，SEQ ID N06，SEQID N07和SEQ ID N08。
50.根据权利要求42至49任一项的嵌合DNA分子，其中所述的大部分双链化的RNA区域包含马铃薯纺锤形块茎类病毒的基因组核苷酸序列。
51.根据权利要求50的嵌合DNA分子，其中所述的类病毒基因组核苷酸序列是马铃薯纺锤形块茎类病毒株RG1的基因组核苷酸序列。
52.根据权利要求51的嵌合DNA分子，其中所述的基因组核苷酸序列具有SEQ ID N03的核苷酸序列。
53.根据权利要求41的嵌合DNA分子，其中所述的大部分双链化的RNA区域包含至少35个重复的三核苷酸CUG。
54.根据权利要求53的嵌合DNA分子，其中所述的大部分双链化的RNA区域包含44到2000个重复的三核苷酸CUG。
55.根据权利要求41至54任一项的嵌合DNA分子，其中所述的RNA分子包含多个目标基因特异性区域。
56.根据权利要求41至55任一项的嵌合DNA分子，其中所述的RNA分子包含内含子序列。
57.根据权利要求56的嵌合DNA分子，其中所述的内含子序列选自pdk2内含子、来自蓖麻子的过氧化氢酶内含子、来自棉花的δ12去饱和酶内含子、来自拟南芥的δ12去饱和酶内含子、来自玉米的泛素内含子、来自水稻的肌动蛋白内含子、来自曲霉菌的丙糖磷酸异构酶内含子和来自SV40的内含子。
58.根据权利要求41至56任一项的嵌合DNA分子，进一步包含与编码所述RNA分子的所述DNA区域可操作连接的转录终止和聚腺苷酸化信号。
59.根据权利要求41至58任一项的嵌合DNA分子，其中所述启动子或启动子区域是植物可表达的启动子。
60.根据权利要求41至58任一项的嵌合DNA分子，其中所述启动子或启动子区域是在动物中有功能的启动子。
61.根据权利要求41至58任一项的嵌合DNA分子，其中所述的启动子或启动子区域是在酵母、真菌或霉菌中有功能的启动子。
62.根据权利要求41至58任一项的嵌合DNA分子，其中所述的启动子或启动子区域是单亚基噬菌体RNA聚合酶识别的启动子。
63.来自包含根据权利要求41至62任一项的嵌合DNA分子的真核生物的细胞。
64.包含根据权利要求24至40任一项的嵌合RNA分子的真核细胞。
65.根据权利要求63或权利要求64的细胞，其中所述的真核生物是植物。
66.根据权利要求65的细胞，其中所述植物选自拟南芥、苜蓿、大麦、菜豆、玉米、棉花、亚麻、豌豆、油菜、水稻、黑麦、红花、高粱、大豆、向日葵、烟草、小麦、芦笋、甜菜、椰菜、卷心菜、胡萝卜、花椰菜、芹菜、黄瓜、茄子、莴苣、洋葱、油籽油菜、辣椒、马铃薯、南瓜(pumpkin)、小萝卜、菠菜、南瓜(squash)、番茄、西葫芦、杏仁、苹果、杏、香蕉、黑莓、蓝莓、可可、樱桃、椰子、越橘、枣、葡萄、葡萄柚、番石榴、猕猴桃、柠檬、酸橙、芒果、甜瓜、油桃、桔子、番瓜、西番莲、桃、花生、梨、菠萝、阿月浑子、李子、覆盆子、草莓、柑橘、胡桃和西瓜。
67.根据权利要求63或权利要求64的细胞，其中所述的真核生物是真菌、酵母或霉菌。
68.根据权利要求63或权利要求64的细胞，其中所述的真核生物是动物。
69.根据权利要求68的细胞，其中所述的动物是人、哺乳动物、鱼、牛、山羊、猪、绵羊、啮齿动物、仓鼠、小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、灵长目动物、线虫、甲壳类动物、对虾、螃蟹、龙虾、昆虫、果蝇、鞘翅目昆虫、双翅目昆虫、鳞翅目昆虫和同翅目昆虫。
70.非人真核生物，在它的细胞中包含根据权利要求41至62任一项的嵌合DNA分子。
71.非人真核生物，在它的细胞中包含根据权利要求24至40任一项的嵌合RNA分子。
72.根据权利要求70或权利要求71的非人真核生物，其中所述真核生物是植物。
73.根据权利要求72的非人真核生物，其中所述的植物选自拟南芥、苜蓿、大麦、菜豆、玉米、棉花、亚麻、豌豆、油菜、水稻、黑麦、红花、高粱、大豆、向日葵、烟草、小麦、芦笋、甜菜、椰菜、卷心菜、胡萝卜、花椰菜、芹菜、黄瓜、茄子、莴苣、洋葱、油籽油菜、辣椒、马铃薯、南瓜(pumpkin)、小萝卜、菠菜、南瓜(squash)、番茄、西葫芦、杏仁、苹果、杏、香蕉、黑莓、蓝莓、可可、樱桃、椰子、越橘、枣、葡萄、葡萄柚、番石榴、猕猴桃、柠檬、酸橙、芒果、甜瓜、油桃、桔子、番瓜、西番莲、桃、花生、梨、菠萝、阿月浑子、李子、覆盆子、草莓、柑橘、胡桃和西瓜。
74.根据权利要求70或权利要求71的非人真核生物，其中所述真核生物是真菌、酵母或霉菌。
75.根据权利要求70或权利要求71的非人真核生物，其中所述真核生物是动物。
76.根据权利要求75的非人真核生物，其中所述的动物是人、哺乳动物、鱼、牛、山羊、猪、绵羊、啮齿动物、仓鼠、小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、灵长目动物、线虫、甲壳类动物、对虾、螃蟹、龙虾、昆虫、果蝇、鞘翅目昆虫、双翅目昆虫、鳞翅目昆虫和同翅目昆虫。
77.根据权利要求24至40任一项的嵌合RNA分子降低真核生物细胞中目标基因表达的用途。
78.根据权利要求41至62任一项的嵌合DNA分子降低真核生物细胞中目标基因表达的用途。
79.一种产生转基因真核生物的方法，其中所述生物的细胞中目标基因的表达被降低，所述方法包括步骤a)给所述生物的一或多个细胞提供根据权利要求41至62任一项的嵌合DNA分子而产生转基因细胞；b)由所述转基因细胞生长或再生出转基因真核生物。
80.一种下调真核生物细胞中目标基因表达的方法，包括步骤a)给真核生物细胞提供第一和第二嵌合RNA分子，i)所述第一嵌合RNA分子包含反义目标基因特异性的RNA区域，该区域包含与来自目标基因核苷酸序列的19个连续核苷酸的互补序列具有至少大约94％序列等同性的至少大约19个连续核苷酸的核苷酸序列；ii)所述第二嵌合RNA分子包含有义目标基因特异性的RNA区域，该区域包含与所述第一嵌合RNA分子的互补序列具有至少大约94％序列等同性的至少大约19个连续核苷酸的核苷酸序列；iii)所述第一和第二嵌合RNA至少在所述第一嵌合RNA的所述19个连续核苷酸和所述第二嵌合RNA的所述19个连续核苷酸之间能够碱基配对；和iv)其中所述第一或所述第二嵌合RNA分子包含与所述反义目标基因特异性RNA区域或与所述有义目标基因特异性RNA区域可操作连接的大部分双链化的RNA区域；和b)鉴定其中目标基因表达下调的那些真核生物。
81.根据权利要求80的方法，其中所述第一和所述第二嵌合RNA分子包含大部分双链化的RNA区域。
82.根据权利要求81的方法，其中所述第一和所述第二嵌合RNA分子包含相同的大部分双链化的RNA区域。
83.根据权利要求80至82任一项的方法，其中大部分双链化的RNA区域包含来自马铃薯纺锤形块茎类病毒(PSTVd)型的类病毒的核定位信号。
84.根据权利要求83的方法，其中所述的核定位信号来自类病毒，其选自马铃薯纺锤形块茎类病毒、柑橘类病毒III类、柑橘类病毒IV类、啤酒花潜伏类病毒、澳大利亚葡萄树类病毒、番茄planta macho类病毒、椰子萎缩病类病毒、番茄顶矮类病毒、椰子死亡类病毒、柑橘裂皮病类病毒、Columnea潜伏类病毒、啤酒花矮病类病毒和柑橘弯叶类病毒。
85.根据权利要求83的方法，其中所述的类病毒具有选自SEQ ID N03，SEQ ID N04，SEQ ID N05，SEQ ID N06，SEQ ID N07和SEQ ID N08组成的组的基因组核苷酸序列。
86.根据权利要求83至85任一项的方法，其中所述的核定位信号来自马铃薯纺锤形块茎类病毒。
87.根据权利要求83至86任一项的方法，其中所述的核定位信号来自马铃薯纺锤形块茎类病毒株RG1。
88.根据权利要求83至87任一项的方法，其中所述的核定位信号包含作用如选自SEQ ID N03核苷酸序列的核定位信号的核苷酸序列。
89.根据权利要求83或84的方法，其中所述的大部分双链化的RNA包含类病毒基因组核苷酸序列，所述类病毒基因组核苷酸序列选自马铃薯纺锤形块茎类病毒的基因组核苷酸序列、柑橘类病毒III类的基因组核苷酸序列、柑橘类病毒IV类的基因组核苷酸序列、啤酒花潜伏类病毒的基因组核苷酸序列、澳大利亚葡萄树类病毒的基因组核苷酸序列、番茄planta macho类病毒的基因组核苷酸序列、椰子萎缩病类病毒的基因组核苷酸序列、番茄顶矮类病毒的基因组核苷酸序列、椰子死亡类病毒的基因组核苷酸序列、柑橘裂皮病类病毒的基因组核苷酸序列、Columnea潜伏类病毒的基因组核苷酸序列、啤酒花矮病类病毒的基因组核苷酸序列和柑橘弯叶类病毒的基因组核苷酸序列。
90.根据权利要求89的方法，其中所述的类病毒基因组核苷酸序列选自SEQ ID N03，SEQ ID N04，SEQ ID N05，SEQ ID N06，SEQ ID N07和SEQ ID N08。
91.根据权利要求83至90任一项的方法，其中所述的大部分双链化的RNA区域包含马铃薯纺锤形块茎类病毒的基因组核苷酸序列。
92.根据权利要求91的方法，其中所述的类病毒基因组核苷酸序列是马铃薯纺锤形块茎类病毒株RG1的基因组核苷酸序列。
93.根据权利要求92的方法，其中所述的基因组核苷酸序列具有SEQ ID N03的核苷酸序列。
94.根据权利要求80至82任一项的方法，其中所述的大部分双链化的RNA区域包含至少35个重复的三核苷酸CUG。
95.根据权利要求94的方法，其中所述的大部分双链化的RNA区域包含44到2000个重复的三核苷酸CUG。
96.根据权利要求80至95任一项的方法，其中所述的RNA分子包含多个目标基因特异性区域。
97.根据权利要求80至96任一项的方法，其中所述的RNA分子包含内含子序列。
98.根据权利要求97的方法，其中所述的内含子序列选自pdk2内含子、来自蓖麻子的过氧化氢酶内含子、来自棉花的δ12去饱和酶内含子、来自拟南芥的δ12去饱和酶内含子、来自玉米的泛素内含子、来自水稻的肌动蛋白内含子、来自曲霉菌的丙糖磷酸异构酶内含子和来自SV40的内含子。
99.根据权利要求80至98任一项的方法，其中所述的第一和第二嵌合RNA分子从第一和第二嵌合基因转录而来。
100.包含第一和第二嵌合RNA分子的真核生物细胞，i)所述第一嵌合RNA分子包含反义目标基因特异性的RNA区域，该区域包含与来自目标基因核苷酸序列的19个连续核苷酸的互补序列具有至少大约94％序列等同性的至少大约19个连续核苷酸的核苷酸序列；ii)所述第二嵌合RNA分子包含有义目标基因特异性的RNA区域，该区域包含与所述第一嵌合RNA分子的互补序列具有至少大约94％序列等同性的至少大约19个连续核苷酸的核苷酸序列；iii)所述第一和第二嵌合RNA至少在所述第一嵌合RNA的所述19个连续核苷酸和所述第二嵌合RNA的所述19个连续核苷酸之间能够碱基配对；和iv)其中所述第一或所述第二嵌合RNA分子包含与所述反义目标基因特异性RNA区域或与所述有义目标基因特异性RNA区域可操作连接的大部分双链化的RNA区域。
101.根据权利要求100的细胞，其中所述第一和所述第二嵌合RNA分子包含大部分双链化的RNA区域。
102.权利要求101的细胞，其中所述第一和第二嵌合RNA分子包含相同的大部分双链化的RNA区域。
103.根据权利要求100至102任一项的细胞，其中大部分双链化的RNA区域包含来自马铃薯纺锤形块茎类病毒(PSTVd)型的类病毒的核定位信号。
104.根据权利要求103的细胞，其中所述的核定位信号来自类病毒，其选自马铃薯纺锤形块茎类病毒、柑橘类病毒III类、柑橘类病毒IV类、啤酒花潜伏类病毒、澳大利亚葡萄树类病毒、番茄planta macho类病毒、椰子萎缩病类病毒、番茄顶矮类病毒、椰子死亡类病毒、柑橘裂皮病类病毒、Columnea潜伏类病毒、啤酒花矮病类病毒和柑橘弯叶类病毒。
105.根据权利要求103的细胞，其中所述的类病毒具有选自SEQ IDN03，SEQ ID N04，SEQ ID N05，SEQ ID N06，SEQ ID N07和SEQ ID N08的基因组核苷酸序列。
106.根据权利要求103至105任一项的细胞，其中所述的核定位信号来自马铃薯纺锤形块茎类病毒。
107.根据权利要求103至106任一项的细胞，其中所述的核定位信号来自马铃薯纺锤形块茎类病毒株RG1。
108.根据权利要求103至107任一项的细胞，其中所述的核定位信号包含作用如选自SEQ ID N03核苷酸序列的核定位信号的核苷酸序列。
109.根据权利要求103或104的细胞，其中所述的大部分双链化的RNA包含类病毒基因组核苷酸序列，所述类病毒基因组核苷酸序列选自马铃薯纺锤形块茎类病毒的基因组核苷酸序列、柑橘类病毒III类的基因组核苷酸序列、柑橘类病毒IV类的基因组核苷酸序列、啤酒花潜伏类病毒的基因组核苷酸序列、澳大利亚葡萄树类病毒的基因组核苷酸序列、番茄planta macho类病毒的基因组核苷酸序列、椰子萎缩病类病毒的基因组核苷酸序列、番茄顶矮类病毒的基因组核苷酸序列、椰子死亡类病毒的基因组核苷酸序列、柑橘裂皮病类病毒的基因组核苷酸序列、Columnea潜伏类病毒的基因组核苷酸序列、啤酒花矮病类病毒的基因组核苷酸序列和柑橘弯叶类病毒的基因组核苷酸序列。
110.根据权利要求109的细胞，其中所述类病毒的基因组核苷酸序列选自SEQ ID N03，SEQ ID N04，SEQ ID N05，SEQ ID N06，SEQ ID N07和SEQ ID N08。
111.根据权利要求103至109任一项的细胞，其中所述的大部分双链化的RNA区域包含马铃薯纺锤形块茎类病毒的基因组核苷酸序列。
112.根据权利要求111的细胞，其中所述的类病毒基因组核苷酸序列是马铃薯纺锤形块茎类病毒株RG1的基因组核苷酸序列。
113.权利要求112的细胞，其中所述的基因组核苷酸序列具有SEQID N03的核苷酸序列。
114.根据权利要求100至102任一项的细胞，其中所述的大部分双链化的RNA区域包含至少35个重复的三核苷酸CUG。
115.根据权利要求114的细胞，其中所述的大部分双链化的RNA区域包含44到2000个重复的三核苷酸CUG。
116.根据权利要求100至115任一项的细胞，其中所述的RNA分子包含多个目标基因特异性区域。
117.根据权利要求100至116任一项的细胞，其中所述的RNA分子包含内含子序列。
118.根据权利要求117的细胞，其中所述的内含子序列选自pdk2内含子、来自蓖麻子的过氧化氢酶内含子、来自棉花的δ12去饱和酶内含子、来自拟南芥的δ12去饱和酶内含子、来自玉米的泛素内含子、来自水稻的肌动蛋白内含子、来自曲霉菌的丙糖磷酸异构酶内含子和来自SV40的内含子。
119.根据权利要求100至118任一项的细胞，其中所述的第一和第二嵌合RNA分子从第一和第二嵌合基因转录而来。
120.包含根据权利要求100至权利要求119任一项的细胞的非人真核生物。
121.嵌合有义RNA分子，其与嵌合反义RNA分子协作以降低真核生物细胞中目标基因表达，所述嵌合有义RNA分子包含a)有义目标基因特异性的RNA区域，该区域包含与所述目标基因核苷酸具有至少大约94％序列等同性的至少大约19个连续核苷酸的核苷酸序列；可操作连接于b)大部分双链化的RNA区域。
122.根据权利要求121的嵌合RNA分子，其中大部分双链化的RNA区域包含来自马铃薯纺锤形块茎类病毒(PSTVd)型的类病毒的核定位信号。
123.根据权利要求122的嵌合RNA分子，其中所述的核定位信号来自类病毒，其选自马铃薯纺锤形块茎类病毒、柑橘类病毒III类、柑橘类病毒IV类、啤酒花潜伏类病毒、澳大利亚葡萄树类病毒、番茄plantamacho类病毒、椰子萎缩病类病毒、番茄顶矮类病毒、椰子死亡类病毒、柑橘裂皮病类病毒、Columnea潜伏类病毒、啤酒花矮病类病毒和柑橘弯叶类病毒。
124.根据权利要求123的嵌合RNA分子，其中所述的类病毒具有选自SEQ ID N03，SEQ ID N04，SEQ ID N05，SEQ ID N06，SEQ ID N07和SEQ ID N08的基因组核苷酸序列。
125.根据权利要求122至124任一项的嵌合RNA分子，其中所述的核定位信号来自马铃薯纺锤形块茎类病毒。
126.根据权利要求122至125任一项的嵌合RNA分子，其中所述的核定位信号来自马铃薯纺锤形块茎类病毒株RG1。
127.根据权利要求122至126任一项的嵌合RNA分子，其中所述的核定位信号包含作用如选自SEQ ID N03核苷酸序列的核定位信号的核苷酸序列。
128.根据权利要求122或123的嵌合RNA分子，其中所述的大部分双链化的RNA包含类病毒基因组核苷酸序列，所述类病毒基因组核苷酸序列选自马铃薯纺锤形块茎类病毒的基因组核苷酸序列、柑橘类病毒III类的基因组核苷酸序列、柑橘类病毒IV类的基因组核苷酸序列、啤酒花潜伏类病毒的基因组核苷酸序列、澳大利亚葡萄树类病毒的基因组核苷酸序列、番茄planta macho类病毒的基因组核苷酸序列、椰子萎缩病类病毒的基因组核苷酸序列、番茄顶矮类病毒的基因组核苷酸序列、椰子死亡类病毒的基因组核苷酸序列、柑橘裂皮病类病毒的基因组核苷酸序列、Columnea潜伏类病毒的基因组核苷酸序列、啤酒花矮病类病毒的基因组核苷酸序列和柑橘弯叶类病毒的基因组核苷酸序列。
129.根据权利要求128的嵌合RNA分子，其中所述的类病毒基因组核苷酸序列选自SEQ ID N03，SEQ ID N04，SEQ ID N05，SEQ ID N06，SEQID N07和SEQ ID N08。
130.根据权利要求122至129任一项的嵌合RNA分子，其中所述的大部分双链化的RNA区域包含马铃薯纺锤形块茎类病毒的基因组核苷酸序列。
131.根据权利要求130的嵌合RNA分子，其中所述的类病毒基因组核苷酸序列是马铃薯纺锤形块茎类病毒株RG1的基因组核苷酸序列。
132.根据权利要求131的嵌合RNA分子，其中所述的基因组核苷酸序列具有SEQ ID N03的核苷酸序列。
133.根据权利要求121的嵌合RNA分子，其中所述的大部分双链化的RNA区域包含至少35个重复的三核苷酸CUG。
134.根据权利要求133的嵌合RNA分子，其中所述的大部分双链化的RNA区域包含44到2000个重复的三核苷酸CUG。
135.根据权利要求121至134任一项的嵌合RNA分子，其中所述的RNA分子包含多个目标基因特异性区域。
136.根据权利要求121至135任一项的嵌合RNA分子，其中所述的RNA分子包含内含子序列。
137.根据权利要求136的嵌合RNA分子，其中所述的内含子序列选自pdk2内含子、来自蓖麻子的过氧化氢酶内含子、来自棉花的δ12去饱和酶内含子、来自拟南芥的δ12去饱和酶内含子、来自玉米的泛素内含子、来自水稻的肌动蛋白内含子、来自曲霉菌的丙糖磷酸异构酶内含子和来自SV40的内含子。
138.降低真核生物细胞中目标基因表达的嵌合DNA分子，包含a)能够被所述真核生物的所述细胞中的RNA聚合酶识别的启动子或启动子区域；可操作连接于b)DNA区域，当它被转录时产生如权利要求121至137任一项所述的嵌合有义RNA分子。
全文摘要
本申请提供了有效下调真核细胞和生物中任何目的基因表达的方法和工具。为此，本发明提供了修饰的反义和有义RNA分子，编码这种修饰的反义或有义RNA分子的嵌合基因和包含该修饰的反义和/或有义RNA分子或编码的嵌合基因的真核生物，如植物、动物或真菌、酵母或霉菌。
文档编号C12N15/09GK1646687SQ03808255
公开日2005年7月27日 申请日期2003年3月12日 优先权日2002年3月14日
发明者王明波, P·沃特豪斯 申请人:联邦科学和工业研究组织