专利名称：极端酶基因在假单胞菌和密切相关细菌中的过度表达的利记博彩app
背景很长时间就已发现酶类在工业和家庭加工中用作生物催化剂，最近还用于医学中。例如，酶通常用于传统工业生物技术加工如玉米淀粉的催化液化(如，通过淀粉酶类)，在家用加工中如催化去污(如，通过枯草杆菌蛋白酶和其他蛋白酶)，在医学应用中如体内溶解血凝块的催化性血栓溶解(如，通过尿激酶)。已广泛的认识到，在要使用的条件下稳定性增加的酶类，较那些稳定性较差者有更大的满意度，该特性典型地描述为术语在这些条件下酶活性的半衰期。也已广泛地认识到，酶在使用的条件下需要发挥最大程度的催化活性，该特性指酶的“最佳状态”(表示为复数以反映酶催化活性的最大可能水平可依不同的环境参数而改变，如温度、盐度、pH等)。这意味着，酶在所要使用的条件下同时具有高稳定性和催化最佳状态都是最需要的。
已经提议许多酶特意用于以下环境条件，包括高或低温、高或低pH、高盐度、和其他实质上偏离维持更普通生物的环境参数的条件；其中这种“更普通”的生物条件为，例如大约20-60℃的温度，大约6.0-7.5的pH，和低于大约3.5％(w/v)的盐度。为了试图满足这些建议的用途，推荐使用“极端酶(extremozyme)”。极端酶通常被认为是在极端环境条件下具有明显催化活性的酶类，典型地是在这种极端的条件下经常具有很高的稳定性和催化最佳状态。
所提议的极端酶能够提供特定优势的应用实例包括，如在M.W.W.Adams & R.M.Kelly，发现和使用嗜高温酶类，TIBTECH 16329-332(1998)的表2中所列举的。这种提议的应用预期将极端酶用于1.分子生物学，例如在聚合酶链式反应(PCR)中使用嗜高温DNA聚合酶；在基因工程中使用嗜极端条件的DNA连接酶；在研究中使用嗜极端条件的蛋白酶；2.淀粉水解和加工，例如使用α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、α-糖苷酶、支链淀粉酶、淀粉支链淀粉酶、环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶、葡萄糖异构酶和木糖异构酶来产生如寡糖、麦芽糖、葡萄糖糖浆、高果糖糖浆的产物；3.化学合成，例如乙醇的生产；通过嗜热菌蛋白酶产生天冬酰苯丙氨酸甲酯；产生合成药学活性成分的手性中间体；使用在高温或在有机溶剂中具有很高稳定性的其他蛋白酶、脂肪酶和糖苷酶；4.纤维素和树胶降解和加工，例如木聚糖酶对纸和纸浆的脱色；纤维生物水解酶、β-糖苷酶和β-葡聚糖酶进行纤维素水解；热稳定性纤维素酶和葡聚糖酶对用于回收油的生物树胶进行降解；5.食物和饲料加工，例如果胶酶、纤维素酶和壳多糖酶；半乳糖苷酶进行乳糖水解；和肌醇六磷酸酶用于在动物饲料高温加工过程中对肌醇六磷酸盐脱磷酸化；6.医学治疗和诊断装置和试剂盒，例如过氧化物酶，磷酸酶，氧化酶，羧化酶和脱氢酶；7.去垢剂和家用制品，例如嗜热蛋白酶，嗜碱蛋白酶；和碱性淀粉酶；和8.其他工业应用，例如生物采矿和矿物质的生物浸提，生物补救，补救放射性废物，抗氧化系统。
极端酶主要公认的来源是各种已知为嗜极端条件类的生物体。嗜极端条件类是已发现在极端环境条件下茂盛生长的生物体，例如在或接近深海温泉口、热泉、高盐湖、暴露的沙漠表面、冰川和流冰群。这族生物体的成员包括下列每个类别中的代表，如原核生物包括原始生物和细菌，和真核生物包括真菌和酵母，苔藓，原生生物和原虫，藻类和藓类，缓步类和鱼。因为这族生物体天然地在极端环境下旺盛生长，它们被认为是天然存在的极端酶的来源。因此，许多来自嗜极端条件类的极端酶已经被分离和检测，并被发现在所提议的极端应用条件下具有所需的高稳定性和催化最佳状态的优势特性。但，工业上焦急地等待着期望的极端酶的大规模商业化，这个时刻尚未来临。
问题是嗜极端条件类已经发现不可能被培养，或至少很难以商业上有意义的足够规模进行培养，以有成本效益的分离足够量的销售目的的极端酶。结果，已尝试使用基因工程将从嗜极端条件类分离的极端酶基因转化和表达在普通的表达宿主生物体中。在这些表达宿主生物体中，主要的是大肠杆菌和枯草芽胞杆菌。然而，这些在商业量生产非极端酶蛋白中已发现是可靠的表达宿主，至今在商业量极端酶的生产中是不可靠的，或不能生产。因此，尽管极端酶的潜在应用丰富，但其应用至多限于专门地、小规模的应用如用于研究的热稳定DNA聚合酶；因为缺少商业上可行的、工业级极端酶表达系统，仍不能达到显著的工业规模应用。
在大肠杆菌宿主中尝试表达异源极端酶基因的许多实例已有报道，偶尔见到在杆菌宿主中进行，表达水平通常很低，即少于5％总细胞蛋白。代表性的实例包括，例如G.Dong等人，Appl.Envir.Microbiol.63(9)3569-3576(1997年9月)(激烈热球菌淀粉支链淀粉酶在大肠杆菌中以10-28mg/L，即大约1.4％总细胞蛋白(tcp)表达)；E.Leveque等人，FEMSMicrobiol.Lett.186(1)67-71(2000年5月1日)(Thermococcushydrothermalis α-淀粉酶在大肠杆菌中以低于5％tcp表达，由SDS-PAGE测定)；A.Linden等人，J.Chromatog.B Biomed.Sci.Appl.737(1-2)253-9(2000年1月14日)(火球菌woesei α-淀粉酶在大肠杆菌中以0.4％tcp表达，从在此提供的数据计算)；和C Pire等人，FEMS Microbiol.Lett.200(2)221-27(2001年6月25日)(在大肠杆菌中表达的嗜盐葡萄糖脱氢酶的产量为25-40mg/L)。
极端酶低表达规律有两个例外报道，都是在大肠杆菌中表达的嗜高温脱氢酶，水平分别为50％tcp和15％tcp。见H.Connaris等人，Biotech.Bioeng.64(1)38-45(1999年7月5日)(以50％tcp在大肠杆菌中表达的Haloferax volcanii二氢脂肪胺脱氢酶)；和J.Diruggiero & F.T.Robb，Appl.Environ.Microbiol.61(1)159-164(1995年1月)(以15％tcp在大肠杆菌中表达的激烈热球菌谷氨酸盐脱氢酶)。但，即使是这些实例也由于下面的原因不能提供商业上可行的、工业规模的极端酶表达系统。
首先，在Connaris和Diruggiero报道的表达系统中所用的大肠杆菌宿主细胞生长在富集营养培养基中，可维持的最大细胞密度为大约2g/L(以干细胞量表示的最大生物质量累积量)。在这种低细胞密度下，即使表达水平达到50％tcp(总细胞蛋白)，得到的产量也远低于工业规模生产。例如，以2g/L的最大生物质量，总细胞蛋白含量大约为1g/L；因此，以50％tcp的表达水平，仅可表达大约0.5g/L的极端酶。提供总生产率仅大约0.5g/L极端酶的表达系统远低于认为能够作为工业规模的生产。当考虑能够市场供给大多数建议的工业加工和家用制品应用所需的巨大批量极端酶(大多数以大规模、批量生产为前提)时，此问题特别突出。
第二，Connaris和Diruggiero文献中报道的大规模发酵都是1升(1L)发酵，太低而不能考虑为“工业规模”发酵。通常，任何可认识的工业规模发酵的最低限是大约10L，尽管对于大多数目的，这仍然被认为是小型“种子级”发酵罐。但，如果表达系统的总生产率足够高，5L或10L发酵可供给一些小规模的商业用途。普通的“种子级”发酵罐也包括20L和40L发酵罐；普通的“中间工厂规模”发酵罐可以从大约50L至200L、250L和甚至500L的体积。典型的工业规模生产在具有1,000L和以上的发酵罐中进行；甚至10,000L和50,000L发酵罐也并非罕见。
因此，扩大1L发酵规模的表达系统至工业规模的发酵并不是无价值的事情。把其扩大至工业规模的酶生产通常是相当的挑战，特别是当始于如Connaris和Diruggiero文献中所报道的低生产率表达系统时。用他们所描述的表达系统如何尝试或实现这种放大，这些文献没有提供任何建议，也没有指导。
第三，使用富营养培养基，如LB培养基和其他培养基，需要昂贵的添加物如蛋白胨和酵母提取物，这事实上明显使工业规模生产在成本上不利。实际上，对于极端酶可能代替现有工业酶的大多数提议的用途中，此成本劣势可能使其过于昂贵而不能向市场上提供工业用极端酶。
因此，生物技术工业继续缺乏商业可行的、工业规模的极端酶表达系统。
发明的概述本发明提供了以商业规模过度表达嗜极端条件生物体天然的极端酶的新方法。在一个更特殊的方面，本发明教授了通过在选自假单胞菌及其密切相关的细菌的宿主细胞种属中过度表达而商业规模生产这些极端酶。
根据本发明的这些极端酶表达系统能够高水平的过度表达极端酶，以高于5％总细胞蛋白，高于30％总细胞蛋白和更高的水平。根据本发明的这些极端酶表达系统能够获得高细胞密度，干重生物质量大于20g/L，甚至高于80g/L，并能够在这些高细胞密度下维持高水平的极端酶表达，因此提供了高水平的极端酶总生产率。根据本发明的这些极端酶表达系统还能够以10升或以上的规模进行工业规模的发酵，同时维持高水平的总生产率。另外，当在简单的便宜培养基如添加碳源的天然盐类培养基中生长时，根据本发明的极端酶表达系统保留了这些能力。
本发明还提供了基因工程改造的重组细菌宿主细胞使其含有可在其中工作的表达载体，表达载体包括含外源性极端酶编码序列的核酸，该序列可操作地连接于控制序列，所述的宿主细胞能够过度表达所述的编码序列，使得当在允许表达的条件下生长于培养基中时以至少1g/L的总生产率产生所述的极端酶，其特征是细菌宿主细胞选自假单胞菌及其紧密相关的细菌。
极端酶过度表达系统包括重组细菌宿主细胞，可在所述宿主细胞中工作的表达载体，表达载体中含有的核酸包括可操作地与控制序列相连的外源性极端酶编码序列，当在允许表达的条件下生长于培养基中时，所述的表达系统能够过度表达所述的编码序列以便以至少1g/L的总生产率产生所述的极端酶，其特征是细菌宿主细胞选自假单胞菌及其密切相关的细菌。
以至少1g/L的总生产率过度表达极端酶的方法，包括以下步骤提供(a)选自假单胞菌及其密切相关细菌的细菌宿主细胞，(b)在所述宿主细胞中工作的表达载体，其含有的核酸包括可操作地连接于控制序列的外源性极端酶编码序列，和(c)培养基；将所述的表达载体转化进所述的细菌宿主细胞中形成重组的细菌宿主细胞；使所述的重组细菌宿主细胞在允许表达的条件下在培养基中生长；和任选地溶解宿主细胞，并从中分隔、游离或纯化极端酶。
以至少1g/L的总生产率过度表达极端酶的方法，包括(1)将表达载体转化进入选自假单胞菌及其密切相关细菌的细菌宿主细胞中以产生重组的细菌宿主细胞，该表达载体含有的核酸包括可操作地连接于控制序列的外源性极端酶编码序列；和(2)在允许表达的条件下在培养基中培养所述的重组细菌宿主细胞；和任选地溶解宿主细胞，并从中分隔，游离或纯化极端酶。
从在允许表达的条件下在培养基中生长的重组细菌宿主细胞中以至少1g/L的总生产率过度表达极端酶的方法中使用选自假单胞菌及其密切相关细菌的重组细菌宿主细胞。
以至少1g/L的总生产率过度表达极端酶的商用试剂盒，包括一定量的选自假单胞菌及其密切相关细菌的一些细菌宿主细胞；可在所述细菌宿主细胞中工作、并含有控制序列的一定量的表达载体；将含有外源极端酶编码序列的核酸插入所述表达载体的说明书，以便将编码序列与控制序列可操作地连接，由此制备表达载体；随后将所述表达载体转化进入所述细菌宿主细胞中以形成重组细菌宿主细胞的说明书；以及在允许表达的条件下在培养基中培养所述重组细菌宿主细胞的说明书；和任选地一定量的所述的培养基；和任选地一定量的调节的启动子的诱导剂，其中所述的控制序列使用所述的调节启动子。
以至少1g/L的总生产率过度表达一种极端酶的商用试剂盒，包括选自假单胞菌及其密切相关细菌的一定量的细菌宿主细胞；可在所述细菌宿主细胞中工作、并含有控制序列和可操作地与其连接的外源极端酶编码序列的一定量的表达载体；将所述表达载体转化进入所述细菌宿主细胞中以形成重组细菌宿主细胞的说明书；和在允许表达的条件下在培养基中培养所述重组细菌宿主细胞的说明书；和任选地一定量的所述的培养基；和任选地一定量的调节的启动子的诱导剂，其中所述的控制序列使用所述的调节启动子。
上述任何一条中的极端酶是水解酶。上述任何一条中的极端酶是纤维素酶或淀粉酶；或肽酶。上述任何一条中的极端酶是淀粉酶；或丝氨酸内肽酶或天冬氨酸内肽酶。上述任何一条中的极端酶是α-淀粉酶；或热分解素(pyrolysin)或thermopsin.。根据上述任何一条表达的极端酶。在生物催化过程中使用根据上述任何一条表达的极端酶。
上述任何一条中的宿主细胞是假单胞菌属。上述任何一条中的宿主细胞是荧光假单胞菌属。上述任何一条中的宿主细胞是荧光假单胞菌。
上述任何一条中的表达载体是RSF1010或其衍生物。上述任何一条中的异种极端酶启动子是Ptac。
上述任何一条中的极端酶在宿主细胞中的包含体中表达，包含体是被溶解的。上述任何一条中的极端酶是使用再折叠步骤被再折叠的。
图表的简要描述
图1代表了根据本发明可用于表达极端酶基因的一种RSF1010为基础的表达载体的质粒图谱。
优选实施例的详细描述本发明提供了极端酶的商品规模生产系统，其中假单胞菌及其密切相关细菌被用作宿主细胞以过度表达极端酶。
假单胞菌属以前已经被用作表达系统。见，例如Gilroy的美国专利No.5,055,294和Gilroy等人的美国专利No.5,128,130；Rammler等人的美国专利No.5,281,532；Thompson等人的美国专利Nos.5,527,883和5,840,554；Barnes等人的美国专利Nos.4,695,455和4,861,595；Gray等人的美国专利No.4,755,465；和Wilcox的美国专利No.5,169,760。但在这些文献中没有一个说明假单胞菌及其密切相关细菌在以商品数量级过度表达极端酶时是特别有优势的，如本发明所明确的那样。
词汇表A和An如在此所使用的和在附录的权利要求书中，“一个”，“一个”和“该”的单数形式包括所指对象的单数和复数，如果文中没有清晰地表明。因此，例如，提到“一种宿主细胞”，从文字上是指仅使用一种单一的宿主细胞的实施例，和应用大量的这种宿主细胞的实施例。
In和On如在此所使用的，关于使用一种生长培养基培养生物体，生物体可以说是生长在培养基“中”或“上”。在本发明的表达系统中，培养基是一种液体培养基。因此，在文中，术语“in”和“on”的使用是同义的，相互都是指宿主细胞的生长与培养基接触，通常在一定体积的培养基内，尽管也考虑到偶然有些细胞的生长是在培养基内或表面上。
包含如在此所使用的，术语“包含”的意义是主体含有在术语“包含”后所列举的元素，以及任何其他没有列举的元素。在此，术语“包含”可被解释为很宽范围和无限制的术语；因此，对主体“包含”的列举元素的权利要求的解释是范围很广的，即解释为不限于所列举的元素。因此，术语“包含”被认为与如“具有”，“含有”或“包括”等术语是同义的。
如在此所描述的，发明提到了使用术语“包含”和“其特征是”。但，在更狭义的描述，定义或对发明进行要求时，较这些更狭义的字和短语也用来代替这些无限制的术语。例如，在此所使用的，短语“包括”的意思是主体含有所列举元素，没有其他的元素。在此，短语“包括”可被解释为狭义的和有范围的术语。因此，术语“包括”可被认为与如“仅含有”或“只具有”是同义的。
保藏机构ACAM-南极微生物澳大利亚保藏中心，南极和南大洋环境协作研究中心，塔斯马尼亚大学，GPO Box 252C，霍巴特，塔斯马尼亚7001，澳大利亚。
ATCC-美国典型培养物保藏中心，10801大学林荫道，马纳萨斯，VA20110-2209，美国。
NCIMB-国家工业和海生细菌保藏中心，国家工业，食物和海生细菌保藏所，23 Machar Drive，阿伯丁，AB24 3RY，苏格兰。
UQM-培养物保藏中心，微生物系，昆士兰大学，St.Lucia，昆士兰4067，澳大利亚。
一般材料&方法如果没有其他的注明，在分子生物学领域中已知的标准技术，载体，控制序列元件，和其他表达系统元件用来进行核酸操作，转化和表达。这些标准的技术，载体，和元件可见于，例如Ausubel等人(主编)，分子生物学现代方法(1995)(John Wiley & Sons)；Sambrook，Fritsch，& Maniatis(主编)，分子克隆(1989)(Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY)；Berger &Kimmel，酶学方法152分子克隆技术的指南(1987)(Academic Press)；和Bukhari等人(主编)，DNA插入元件，质粒和游离体(1977)(Cold SpringHarbor Laboratory Press，NY)。
X-gal是指5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷IPTG是指异丙硫基-β-D-半乳糖苷ORF是指开放可读框架tcp和％tcp如在此所使用的，术语“tcp”是指“总细胞蛋白”，是每升培养物中所表达的细胞蛋白的近似质量的测量指标。如在此所使用的，术语“％tcp”是指“总细胞蛋白的百分比”，是总细胞蛋白馏分的测量指标，代表细胞表达的给定蛋白的相对量。
外源和异种术语“外源”是指来自指定细胞或分子“以外来源的”。术语“异种”是指与指定细胞或分子“不同的来源”。在本申请中，如在本领域中通常使用的，这两个术语可交替使用，作为同义词。在此使用的这些术语都是指指定对象是细胞或分子以外的，即未在天然的细胞中发现或在天然的分子中未发现或与分子无关。
极端条件“极端条件”的定义是在表1中所列举参数范围内的任何条件。
*-嗜旱性是通过一种称为“水势”的无量纲量来定义的aw＝[(水溶液中水的蒸气压)/(纯水的蒸气压)]，其中“水溶液”是指任何水介质或水相环境，无论是细胞内或细胞外。
因此极端条件类生物被定义为那些很容易在这些所列举参数范围内的细胞外环境条件中生存或生长的生物体。极端条件酶，或极端酶因此可根据表1中所确定的条件来进行定义，这些条件可以是细胞内或细胞外的条件。
在某些情况下，在本领域中化学条件(如代谢条件)和放射条件也可被认为是极端条件的类别，尽管它们要依赖于化学物质的类型(如，一种特殊的金属或有机化合物)和放射线的类型，因此在现在对“极端条件”的定义中没有包含统一的定义。
酶如在此所使用的，术语“酶”包括1.氧化还原酶(IUBMB EC1包括，例如单加氧酶，细胞色素类，加双氧酶，脱氢酶，金属还原酶，铁氧化还原蛋白，硫氧还蛋白)；2.转移酶(IUBMB EC2包括，例如糖基转移酶，烷基转移酶，酰基转移酶，羧基转移酶，脂肪酰合酶，激酶，RNA和DNA聚合酶，逆转录酶，核苷酸整合酶)；3.水解酶(IUBMB EC 3包括，例如糖基化酶，糖苷酶，葡萄糖水解酶，葡聚糖酶，淀粉酶，纤维素酶，肽酶和蛋白酶，核酸酶，磷酸酶，脂肪酶，核酸重组酶)；4.裂解酶(IUBMB EC 4包括，例如脱羧酶，核酮糖二磷酸羟化酶，腺苷酸环化酶)；5.异构酶(IUBMB EC 5包括，例如消旋酶，表异构酶，变位酶，拓扑异构酶，促旋酶，foldases)；和6.连接酶(IUBMB EC 6包括，例如羧化酶，酰基合成酶，肽合成酶，核酸连接酶)。
极端酶在本领域中已知有很大范围的极端酶，见，如文献11-20。如在此所使用的，术语“极端酶”是指在表1中所定义的至少一种极端条件下能最佳的发挥至少一种催化特性的酶，可由下列的其中一种编码1)从嗜极端条件生物体中获得的核酸；或2)从一种嗜极端条件生物体中获得的核酸，然后进一步通过诱变和/或以下所述的重组被改变。在一个优选的实施例中，嗜极端条件生物体是一种嗜极端条件太古细菌，嗜极端条件细菌，或嗜极端条件真核生物。特别优选的嗜极端条件真核生物包括嗜极端条件真菌和嗜极端条件酵母。在一个特别优选的实施例中，生物体是一种嗜极端条件太古细菌或嗜极端条件细菌。
不管极端酶编码核酸是天然的或改变的，核酸编码序列的密码子可根据要表达它的宿主细胞中的密码子选择频率来优化。要最佳发挥的催化特性，可以是例如，本身的催化活性或酶的生产量；一种计量单位如Km，kcat，ki，kii，或Vmax；或在建议的应用或使用的条件下的稳定性(催化半衰期)。另外，术语“极端酶”，如在此根据本发明的极端酶表达系统，被限制于那些与已选择的用来表达它的宿主细胞异种的极端酶。
编码极端酶的核酸，例如可采用本领域通用的技术从环境标本中直接获得，例如在Short的美国专利Nos.5,958,672，6,057,103，和6,280,926；Handelsman等人的美国专利NO.6,261,842和WO 01/81567；Fleming &Sayler的美国专利No.6,090,593；或L.Diels等人，使用DNA探针和质粒俘获搜寻新的目标环境基因，Sci.of the Total Environ.139-140471-8(1993年11月1日)。另外，也可使用在下面文献中所述的技术。S.Jorgensen等人，J.Biol.Chem.272(26)16335-42(1997年6月27日)；Laderman &Anfmsen的EP专利No.577257B1；Asada等人的EP专利No.579360B1；Taguchi等人的EP 648843A1；Zeikus等人的WO 98/45417；Deweer &Amory的美国专利No.6,100,073；和G.Dong等人，Appl.Environ.Microbiol.63(9)3577-84(1997年9月)中所述的技术。
一旦获得，极端酶编码核酸就可被改变，并表达获得可改善或接近所需的催化特性。这种改变可通过使用一次或多次核酸诱变和/或重组来完成，形成含有改变的核酸的文库，随后表达文库，筛选得到的酶(或，如果需要，有规律地或间断地交替进行多次)。选择的核酸诱变和重组技术可以是体外技术或体内或细胞内技术，可以是随机技术(随机诱变，随机重组)或定向技术(如，寡核苷酸定向诱变，位点定向重组)。许多这样的诱变和重组技术在本领域中是普遍熟知的。例如，可使用在Short的美国专利Nos.5,830,696，5,965,408或6,171,820；Stemmer等人的美国专利Nos.5,605,793和5,811,238；和Amold等人的WO 98/42832中所述的任何技术；另外，可通过使用差错倾向PCR技术(也指低精度PCR)来进行诱变。
在一个优选的实施方案中，极端酶可选自IUBMB EC 1-6中的任何一种类型。在一个优选的实施方案中，极端酶可选自IUBMB EC 2-6中的任何一种类型。在一个优选的实施方案中，极端酶可选自IUBMB EC 2-5中的任何一种类型。在一个优选的实施方案中，极端酶可选自IUBMB EC 2-3中的任何一种类型。在一个优选的实施方案中，极端酶可选自IUBMB EC3中的任何一种类型，即嗜极端条件水解酶。在一个优选的实施方案中，极端酶可选自IUBMB EC 3.1-3.8中的任何一种酶。在一个优选的实施方案中，极端酶可选自IUBMB EC 3.1-3.2中的任何一种酶。在一个优选的实施方案中，极端酶可选自IUBMB EC 3.2中的任何一种酶，即嗜极端条件的糖基化酶。在一个优选的实施方案中，极端酶可选自IUBMB EC 3.2.1中的任何一种酶，即嗜极端条件糖苷酶。在一个优选的实施方案中，极端酶可选自IUBMB EC 3.2.1中的下列酶中的任何一种淀粉酶，淀粉葡萄糖苷酶和葡糖淀粉酶；纤维素酶，纤维素生物水解酶，内切葡聚糖酶和半纤维素酶，和β-葡萄糖苷酶。在一个优选的实施方案中，极端酶可选自IUBMB EC 3.2.1中下列酶中的任何一种淀粉酶和纤维素酶。在一个优选的实施方案中，极端酶可选自IUBMB EC 3.2.1中的任何一种淀粉酶，即嗜极端条件淀粉酶。在一个优选的实施方案中，极端酶可选自IUBMBEC 3.2.1中的任何一种α-淀粉酶(即，IUBMB EC 3.2.1.1中的酶)，因此就是嗜极端条件α-淀粉酶。
在一个优选的实施方案中，极端酶可选自IUBMB EC 3.4中的任何一种酶。在一个优选的实施方案中，极端酶可选自IUBMB EC 3.4.21或3.4.23中的任何一种酶，即嗜极端条件丝氨酸肽酶和嗜极端条件天冬氨酸肽链内切酶。在一个优选的实施方案中，极端酶可选自IUBMB EC 3.4.21和3.4.23中下列酶中的任何一种热解素(pyrolysin)和耐热素(thermopsins)。
在一个优选的实施方案中，极端酶是至少下列中的一种嗜高温性，嗜寒性，嗜酸性，嗜碱性和嗜盐性。在一个优选的实例中，极端酶是至少下列中的一种嗜高温性，嗜寒性，嗜酸性和嗜碱性。在一个优选的实施方案中，极端酶是至少下列中的一种嗜高温性，嗜酸性和嗜碱性。在一个优选的实施方案中，极端酶至少是嗜高温性的。特别优选的至少是嗜高温性极端酶。
在本发明的极端酶表达系统中，极端酶编码核酸将可操作性的与一条控制序列，以及选择性的其他元件连接，形成一种表达构建物(也称为“表达基因盒”)，得到的表达构建物将被插入进一个表达载体中；可选择地，表达基因盒可以任何其他系列的步骤通过将表达基因盒的元件插入进载体中而在载体中被构建。然后表达载体被转化进根据本发明的一种细菌宿主细胞中，随后表达极端酶。
载体已知在本领域中有大量细菌载体可用来在革兰氏阴性变形菌纲中表达蛋白，并可用来表达根据本发明的极端酶。这载体包括，例如质粒，粘粒和噬菌体表达载体。可使用的质粒载体的实例包括表达质粒pMB9，pBR312，pBR322，pML122，RK2，RK6，和RSF1010。这些有用的载体的其他实例包括下列所述的，例如N Hayase，Appl.Envir.Microbiol.60(9)3336-42(1994年9月)；AA Lushnikov等人，Basic Life Sci.30657-62(1985)；S Graupner & W Wackernagel，Biomolec.Eng.17(1)11-16.(2000年10月)；HP Schweizer，Curr.Opin.Biotech.12(5)439-45(2001年10月)；MBagdasarian & KN Timmis，Curr.Topics Microbiol.Immunol.9647-67(1982)；T Ishii等人，FEMS Microbiol.Lett.116(3)307-13(1994年3月1日)；IN Olekhnovich & YK Fomichev，Gene 140(1)63-65(1994年3月11日)；M Tsuda & T Nakazawa，Gene 136(1-2)257-62(1993年12月22日)；C Nieto等人，Gene 87(1)145-49(1990年3月1日)；JD Jones & N Gutterson，Gene61(3)299-306(1987)；M Bagdasarian等人，Gene 16(1-3)237-47(1981年12月)；HP Schweizer等人，Genet.Eng.(NY)2369-81(2001)；P Mukhopadhyay等人，J.Bact.172(1)477-80(1990月1月)；DO Wood等人，J.Bact.145(3)1448-51(1981年3月)；和R Holtwick等人，Mcrobiology 147(Pt 2)337-44(2001年2月)。
可使用的假单胞菌表达载体的进一步实例包括表2中所列举的那些。
表达质粒RSF1010的描述见，例如F Heffron等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72(9)3623-27(1975年9月)，和K Nagahari & K Sakaguchi，J.Bact.133(3)1527-29(1978年3月)。质粒RSF1010及其衍生物在本发明中是特别有用的载体。在本领域中已知的RSF1010的可用衍生物的实例包括，例如pKT212，pKT214，pKT231和相关质粒，pMYClO5O和相关质粒(见，例如，Thompson等人的美国专利Nos.5,527,883和5,840,554)，其中一种，例如pMYC1803。其他特别有用的载体包括在Puhler等人的美国专利No.4,680,264中所述的那些。
在一个优选的实施方案中，表达质粒可用作表达载体。在一个优选的实例中，RSF1010或其衍生物可用作表达载体。在一个优选的实施方案中，pMYClO5O或其衍生物，或pMYC1803或其衍生物可用作表达载体。
控制序列术语“控制序列”在此的定义是一组必须的所有元件，和可选择地在根据本发明的宿主细胞中对极端酶的表达有利的其他元件。每种控制序列元件是天然的或外源性的编码极端酶的核酸，可以是宿主细胞天然的或外源的。这些控制序列元件包括但不限于启动子，转录增强子；核糖体结合位点(也称为“Shine Delgarno序列”)；翻译增强子(见，如Olins的美国专利No.5,232,840)；引导肽编码序列，如靶向肽或分泌信号肽，原-肽编码序列；转录和翻译起始和终止信号，多腺苷酸化信号；和转录终止子。
最小，控制序列包括一个启动子，核糖体结合位点，以及转录和翻译起始和终止信号，和转录终止子。控制序列元件，载体和极端酶编码序列可贴附于，或添加延伸于连接子或尾部，目的是导入特殊的序列(如，限制性位点)，可加速控制序列元件与编码极端酶的核酸编码序列，以及与载体的组装(如通过连接反应，重组，或PCR交叉延伸)。如在此所使用的，术语“可操作地连接”是指任何构型，其中以这种排列方式控制序列元件可与编码序列共价附着，相对于编码序列，在宿主细胞的作用下和通过其作用，控制序列可引导编码序列的表达。
启动子启动子可以是任何在选择的宿主细胞中发挥转录活性的核酸序列，可以是天然的，突变的，截断的或杂交的启动子；天然的启动子可从编码多肽的基因中获得，该基因对于宿主细胞可以是天然的或异种的。如果需要，含有启动子的核酸可仍然保持与核糖体结合位点的连接，该位点发现是与其附着的，并可选择性地与控制的编码序列的至少一部分连接，发现是其天然的构型。(这种天然的编码序列或其部分，如果被保留，将与极端酶的编码序列附着，最终引起极端酶融合蛋白的表达。)本领域已知的能在本发明的宿主细胞中引导转录的多种启动子的任何一个都可选择在此使用。见，例如Sambrook等人，(1989)，见前。选择的启动子可以是结构性的启动子或调节性的启动子，只要极端酶在细胞内表达(即，它不被分泌或被递送至宿主细胞胞浆外的某一地点)。优选不使用结构性启动子。
当选择调节性启动子时，可以是正性或负性调节的启动子。正性调节启动子是一种通过一个激活物蛋白的转录激活作用而被调节的启动子，在诱导作用下开始转录mRNA。负性调节启动子是一种通过一个抑制蛋白而被抑制的启动子，在诱导作用脱抑制下可允许mRNA的转录。可选择可逆性诱导或不可逆性诱导的调节启动子。
当使用正性调节启动子，表达系统中也含有，或通过基因工程改造含有，编码一种激活物蛋白的基因，该基因优选是在宿主细胞中结构性表达的。激活物蛋白编码基因优选包含在宿主细胞染色体中，或可包含在相同的载体中，或不同的载体中(含有极端酶编码核酸的载体)。在本领域中已知有许多这样的正性调节启动子和正性调节启动子-激活物蛋白的组合。例如，见Gaffhey等人的美国专利Nos.5,670,350，5,686,283，和5,710,031；Lam等人的美国专利No.5,686,282；Albright等人，Annual Rev.Genet.23311-336(1989)；Bourret等人，Annual Rev.Biochem.60401-441(1991)；和Mekalanos，J.Bact.1741-7(1992)。
正性调节启动子的实例包括，例如来自假单胞菌属putida的甲苯分解通路编码质粒pWW0的间位操纵子“间位启动子”(Pm)(见NHugouvieux-Cotte-Pattat等人，J.Bact.172(12)6651-60(Dec 1990))；和araB启动子，通过添加与激活物(araC基因产物)相互作用的L-阿拉伯糖，是可诱导的，如在美国专利No.5,028,530中所述。
当使用负性调节启动子时，表达系统中也含有，或通过基因工程改造含有，编码一种抑制物蛋白的基因，该基因优选在宿主细胞中结构性表达。抑制物蛋白编码基因可被包含在与含极端酶编码核酸的载体相同的载体，或不同的载体中(或可被包含在宿主细胞染色体中)。可用的抑制物的实例，和编码它们的基因包括在Roller的美国专利Nos.5,210,025和5,356,796中所述的那些。
在本领域中已知有许多负性调节的启动子和负性调节启动子抑制物的组合。优选的负性调节启动子的实例包括大肠杆菌色氨酸启动子(Ptrp)，大肠杆菌乳糖启动子(P)及其衍生物(如，在Deboer的美国专利No.4,551,433中描述的tac，tacII，和trc启动子，Ptac，PtacII和Ptrc)，噬菌体T7启动子(PT7)，λ噬菌体启动子(如，λpL，λPR)，和来自Rhodobactercapsulatus的recA启动子。所有的Plac，Ptac，PtacII，Ptrc和PT7启动子被表示为lac抑制物(lacI)。
当使用调节性启动子时，在宿主细胞生长周期的合适时间时，可加入诱导物以激活调节性启动子或脱抑制。在本领域已知有许多正性调节启动子激活物蛋白诱导物组合和许多负性调节启动子抑制蛋白诱导物组合，可在本发明中的宿主细胞中发挥作用。例如，对于Pm，苯甲酸盐可作为诱导物；对于Plac，Ptac，PtacII，Ptrc，和PT7，一个优选的诱导物是IPTG。也可见表2。当极端酶在俗称细胞的细胞内表达时，优选可在达到最大的宿主细胞增殖，即最大“细胞密度”时，或之前很短时间加入调节性启动子的诱导物。特别优选的是在大约细胞增殖的中位对数期时加入诱导物。
在本发明的一个优选实施方案中，选择调节性启动子。在一个优选的实施方案中，选择正性调节性启动子，优选Pm。在一个优选的实施方案中，选择负性调节性启动子，优选Ptac。在一个优选的实施方案中，选择负性调节性启动子用于根据本发明的一种细胞内极端酶表达系统中。在一个优选的实施方案中，负性调节性启动子是Ptac，其中使用调节性启动子的启动子-抑制-诱导物组合是Ptac-lacI-IPTG。
分泌蛋白表达系统可以是结构性或调节性启动子。在一个分泌蛋白表达系统中，极端酶或极端酶融合蛋白从宿主细胞中分泌。分泌蛋白表达系统的调节启动子可选自，例如上述的调节性启动子的任何一个。分泌蛋白表达系统的结构性启动子可选自本领域已知的大量结构性启动子中的任何一个可在本发明的宿主细胞中有效进行蛋白表达的启动子。一个特别有用的结构性启动子是从转座子Tn5获得的新霉素磷酸转移酶II启动子(PnptII)。见，如DW Bauer & A Collmer，Mol.Plant Microbe Interact.10(3)369-79(1997年4月)；和C Casavant等人，一种在天然环境中引导程序化，高水平基因表达的新的遗传系统，美国微生物学协会99届general会议摘要(于1999年5月30-6月3日在美国芝加哥，IL举行)。在分泌蛋白表达系统的一个优选实施方案中，使用一种结构性启动子；在分泌蛋白表达系统的一个优选实施方案中，使用PnptII作为极端酶编码核酸的启动子。
其他元件和方法其他元件也包括在根据本发明的表达系统中。例如，可帮助鉴定，分离，纯化或分离作为融合蛋白表达的极端酶的一条标记序列可由与极端酶编码序列附着的一条编码序列所编码。在本发明的一个优选实施方案中，其中需要使用一条标记序列，标记序列是六-组氨酸肽，极端酶编码序列与六-组氨酸编码序列融合。同样，极端酶可作为融合蛋白和整个或部分病毒结构蛋白一起被表达，如病毒(或噬菌体)包衣蛋白，病毒包衣蛋白编码序列的全部或部分与极端酶的编码序列附着在一起。
此外，可在表达系统中使用一个或多个标记物基因或报告子基因来确定极端酶的表达。许多这样的可用的标记物或报告子基因在本领域中是已知的。见，例如Hemming等人的美国专利No.4,753,876，和DL Day等人，J.Bad.157(3)937-39(1984年3月)。在一个优选的实施方案中，标记物基因选自赋予抗生素抗性的标记物基因。在一个优选的实施方案中，标记物基因选自四环素和卡那霉素抗性基因。在一个优选的实施方案中，报告子基因选自下面的编码基因(1)荧光蛋白(如，GFP)；(2)有色蛋白；和(3)荧光或有色促进或诱导蛋白，后者一类(3)包括，例如luminases和β-半乳糖苷酶基因。β-半乳糖苷酶水解X-gal产生蓝色的衍生物。
方法的进一步实例，载体，翻译和转录元件，可用于本发明中的其他元件可见，如Gilroy等人的美国专利No.5,128,130；Rammler等人的美国专利No.5,281,532；Barnes等人的美国专利Nos.4,695,455和4,861,595；Gray等人的美国专利No.4,755,465；和Wilcox的美国专利No.5,169,760。
宿主细胞无论是以天然的或改变的形式，根据本发明，极端酶编码核酸在选自假单胞菌及其密切相关细菌的细菌宿主细胞中都是过度表达的。如在此所使用的，“假单胞菌及其密切相关细菌”与在此所定义的一族“革兰氏阴性变形菌纲亚族1”都是很广泛的。“革兰氏阴性变形菌纲亚族1”更特别地定义为属于所述的家族和/或类别的变形菌纲族别，归于由R.E.Buchanan和N.E.Gibbons(主编)，鉴定细菌学Bergey手册，217-289页(第8版，1974)(The Williams & Wilkins Co.，Baltimore，MD，USA)(此后称为“Bergey(1974)”)命名为“革兰氏阴性需氧杆状和球菌”的分类学“部分”之内。表1显示了在这个分类学“部分”中列举的生物体家族和类别。
“革兰氏阴性亚族1”含有所有在其下面分类的变形菌纲，以及根据形成分类学“部分”所使用的标准进行分类的所有变形菌纲。结果，“革兰氏阴性变形菌纲亚族1”排除了，例如所有革兰氏阳性细菌；革兰氏阴性细菌，如肠杆菌属，归入Bergey(1974)分类学中19“部分”；Bergey(1974)“部分中的整个“家族V.Halobacteriaceae”，该家族已经被认为是原始生物的一种非细菌家族；在Bergey(1974)“部分”中列举的嗜热类，该类已经被认为是细菌的一种非变形菌纲1类别。
根据这种定义，“革兰氏阴性变形菌纲亚族1”也进一步包括那些属于Bergey(1974)所定义的类别和家族(以前称为属)的变形菌纲，以及此后给予其他变形菌纲1分类命名的“部分”。在某些情况下，这些重新命名产生了完全新的变形菌纲1类。例如，嗜酸菌属类，短波单胞菌属类，伯克菌属类，嗜氢菌属类，Oceanimonas类，罗尔斯通氏菌属类，和寡养单胞菌属类，是由属于Bergey(1974)所定义的假单胞菌类(以前称为种属)生物体重新分组建立的。同样，例如，鞘氨醇单胞菌属类(和来源于它的芽单胞菌属类)是由属于Bergey(1974)所定义的黄单胞菌类(以前称为种属)的生物体重新分组建立的。同样，例如酸单胞菌属类是由属于Bergey(1974)所定义的醋酸杆菌类(以前称为种属)的生物体重新分组建立的。如在此所定义的，随后重新分配的种属也包括在“革兰氏阴性变形菌纲亚族1”中。
在其他情况下，归于Bergey(1974)“部分”中定义的类别和家族的变形菌纲1种属可以很简单的在已存在的变形菌纲类下重新分类。例如，在假单胞菌类中，假单胞菌enalia(ATCC 14393)，假单胞菌nigrifaciens(ATCC19375)，和腐败假单胞菌(ATCC 8071)已经被分别重新归类为交替单胞菌属haloplanktis，交替单胞菌属nigrifaciens，和交替单胞菌属putrefaciens。同样，例如，食酸假单胞菌(ATCC 15668)和睾丸酮假单胞菌(ATCC 11996)已经被分别重新归类为食酸丛毛单胞菌和睾丸酮丛毛单胞菌；假单胞菌nigrifaciens(ATCC 19375)和假单胞菌piscicida(ATCC 15057)已经分别被重新归类为Pseudo交替单胞菌属nigrifaciens和Pseudo交替单胞菌属piscicida。如在此所定义的，随后重新分配的变形菌纲1种属也包括在“革兰氏阴性变形菌纲亚族1”中。
而且根据这个定义，“革兰氏阴性变形菌纲亚族1”进一步包括已经被发现的变形菌纲1种属，或已经被重新归类于属于Bergey(1974)“部分”中的变形菌纲1家族和/或类别中的种属。关于变形菌纲1家族，“革兰氏阴性变形菌纲亚族1”也包括分类属于下列家族中的任何一个的变形菌纲极毛杆菌科，固氮菌(现在经常以其同义词，极毛杆菌科的“固氮菌族”来称呼)，根瘤菌科，和甲基单胞菌科(现在经常以其同义词，“甲基球菌科”来称呼)。因此，除了在此所述的这些类别，进一步归类于“革兰氏阴性变形菌纲亚族1”的变形菌纲1类别包括1)固氮嗜根菌属类的固氮菌族细菌；2)纤维弧菌属，寡源杆菌，和Teredinibacter类的极毛杆菌科家族细菌；3)鳌合杆菌属，剑菌属，Liberibacter(也称为“CandidatesLiberibacter”)，和中华根瘤菌属类的根瘤菌科家族细菌；和4)甲基杆菌属，喜热嗜甲基菌属，甲基微菌属，Methylosarcina和甲基球菌属类的甲基球菌科家族细菌。
在一个优选的实施方案中，如上所定义的，宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌纲亚族1”。
在一个优选的实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌纲亚族2”。“革兰氏阴性变形菌纲亚族2”定义为下列类的一组变形菌纲(如果没有指明，目录列出的，公共可获得的，已存放菌株的总数标明在括号中，所有都存放于ATCC)酸单胞菌属(2)；醋酸杆菌(93)；葡糖杆菌(37)；短波单胞菌属(23)；贝氏固氮菌(13)；Derxia(2)；布氏杆菌(4)；土壤杆菌(79)；鳌合杆菌属(2)；剑菌属(3)；根瘤菌(144)；中华根瘤菌属(24)；芽单胞菌属(1)；鞘氨醇单胞菌属(27)；产碱菌(88)；博代菌(43)；伯克菌属(73)；罗尔斯通氏菌属(33)；嗜酸菌属(20)；嗜氢菌属(9)；菌胶团(9)；甲基杆菌属(2)；喜热嗜甲基菌属(1个在NCIMB)；甲基球菌科(2)；甲基微菌属(2)；甲基单胞菌属(9)；Methylosarcina(1)；甲基球菌属；氮单胞菌(9)；固氮嗜根菌属(5)；固氮菌(64)；纤维弧菌属(3)；寡源杆菌(5)；假单胞菌(1139)；弗朗西斯菌(4)；黄单胞菌(229)；寡养单胞菌属(50)；和Oceanimonas(4)。
“革兰氏阴性变形菌纲亚族2”的实例宿主细胞种属包括但不限于下列的细菌(ATCC或其他存放实例菌株的数量显示在括号中)甲醇酸单胞菌(ATCC 43581)；醋化醋杆菌(ATCC 15973)；氧化葡糖杆菌(ATCC19357)；缺陷短波单胞菌(ATCC 11568)；模式种(ATCC 9039和ATCC19361)；胶德克斯氏菌(ATCC 15994)；马尔他布氏杆菌(ATCC 23456)，流产布氏杆菌(ATCC 23448)；根癌土壤杆菌(ATCC 23308)，放射形土壤杆菌(ATCC 19358)，发根土壤杆菌(ATCC 11325)；何氏鳌合杆菌属(ATCC29600)；粘着剑菌(ATCC 33212)；根瘤菌属leguminosarum(ATCC 10004)；弗氏中华根瘤菌(ATCC 35423)；泳池芽单胞菌属(ATCC 35951)；少动鞘氨醇单胞菌属(ATCC 29837)；粪产碱菌(ATCC 8750)；百日咳博德特氏菌(ATCC 9797)；洋葱伯克菌属(ATCC 25416)；皮氏罗尔斯通氏菌属(ATCC 27511)；敏捷嗜酸菌(ATCC 11228)；黄色嗜氢菌(ATCC 33667)；生枝动胶菌(ATCC 19544)；甲基杆菌属luteus(ATCC 49878)；喜热嗜甲基菌属gracile(NCIMB 11912)；荚膜甲基球菌(ATCC 19069)；敏捷甲基微菌属(ATCC 35068)；甲烷甲基单胞属(ATCC 35067)；Methylosarcinafibrata(ATCC 700909)；汉氏甲基球菌属(ACAM 549)；敏捷氮单胞菌(ATCC 7494)；雀稗固氮嗜根菌属(ATCC 23S33)；褐球固氮菌(ATCC9043)；混合纤维弧菌(UQM 2601)；尿道寡源杆菌(ATCC 17960)；铜绿假单胞菌(ATCC 10145)，荧光假单胞菌(ATCC 35858)；土拉热弗朗西斯菌(ATCC 6223)；嗜麦芽寡养单胞菌属(ATCC 13637)；野油菜黄单胞菌(ATCC 33913)；和Oceanimonas doudoroffii(ATCC 27123)。在一个优选的实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌纲亚族3”。“革兰氏阴性变形菌纲亚族3”定义为下列类的一组变形菌纲短波单胞菌属；土壤杆菌；根瘤菌，中华根瘤菌属；芽单胞菌属；鞘氨醇单胞菌属；产碱菌；伯克菌属；罗尔斯通氏菌属；嗜酸菌属；嗜氢菌属；甲基杆菌属；喜热嗜甲基菌属；甲基球菌科；甲基微菌属；甲基单胞菌属；Methylosarcina；甲基球菌属；氮单胞菌；固氮嗜根菌属；固氮菌；纤维弧菌属；寡源杆菌；假单胞菌；Teredinibacter；弗朗西斯菌；寡养单胞菌属；黄单胞菌；和Oceanimonas。
在一个优选的实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌纲亚族4”。“革兰氏阴性变形菌纲亚族4”定义为下列类的一组变形菌纲短波单胞菌属；芽单胞菌属；鞘氨醇单胞菌属；伯克菌属；罗尔斯通氏菌属；嗜酸菌属；嗜氢菌属；甲基杆菌属；喜热嗜甲基菌属；甲基球菌科；甲基微菌属；甲基单胞菌属；Methylosarcina；甲基球菌属；氮单胞菌；固氮嗜根菌属；固氮菌；纤维弧菌属；氮源杆菌；假单胞菌；Teredinibacter；弗朗西斯菌；寡养单胞菌属；黄单胞菌和Oceanimonas。
在一个优选的实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌纲亚族5”。“革兰氏阴性变形菌纲亚族5”定义为下列类的一组变形菌纲甲基杆菌属；喜热嗜甲基菌属；甲基球菌科；甲基微菌属；甲基单胞菌属；Methylosarcina；甲基球菌属；氮单胞菌；固氮嗜根菌属；固氮菌；纤维弧菌属；寡源杆菌；假单胞菌；Teredinibacter；弗朗西斯菌；寡养单胞菌属；黄单胞菌；和Oceanimonas。
在一个优选的实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌纲亚族6”。“革兰氏阳性变形菌纲亚族6”定义为下列类的一组变形菌纲短波单胞菌属；芽单胞菌属；鞘氨醇单胞菌属；伯克菌属；罗尔斯通氏菌属；嗜酸菌属；嗜氢菌属；氮单胞菌；固氮嗜根菌属；固氮菌；纤维弧菌属；寡源杆菌；假单胞菌；Teredinibacter；寡养单胞菌属；黄单胞菌；和Oceanimonas。
在一个优选的实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌纲亚族7”。“革兰氏阴性变形菌纲亚族7”定义为下列类的一组变形菌纲氮单胞菌；固氮嗜根菌属；固氮菌；纤维弧菌属；寡源杆菌；假单胞菌；Teredinibacter；寡养单胞菌属；黄单胞菌和Oceanimonas。
在一个优选的实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌纲亚族8”。“革兰氏阴性变形菌纲亚族8”定义为下列类的一组变形菌纲短波单胞菌属；芽单胞菌属；鞘氨醇单胞菌属；伯克菌属；罗尔斯通氏菌属；嗜酸菌属；嗜氢菌属；假单胞菌；寡养单胞菌属；黄单胞菌和Oceanimonas。
在一个优选的实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌纲亚族9”。“革兰氏阴性变形菌纲亚族9”定义为下列类的一组变形菌纲短波单胞菌属；伯克菌属；罗尔斯通氏菌属；嗜酸菌属；嗜氢菌属；假单胞菌；寡养单胞菌属；和Oceanimonas。
在一个优选的实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌纲亚族10”。“革兰氏阴性变形菌纲亚族10”定义为下列类的一组变形菌纲伯克菌属；罗尔斯通氏菌属；假单胞菌；寡养单胞菌属；和黄单胞菌。
在一个优选的实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌纲亚族11”。“革兰氏阴性变形菌纲亚族11”定义为下列类的一组变形菌纲假单胞菌；寡养单胞菌属；和黄单胞菌。
在一个优选的实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌纲亚族12”。“革兰氏阴性变形菌纲亚族12”定义为下列类的一组变形菌纲伯克菌属；罗尔斯通氏菌属；假单胞菌。
在一个优选的实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌纲亚族13”。“革兰氏阴性变形菌纲亚族13”定义为下列类的一组变形菌纲伯克菌属；罗尔斯通氏菌属；假单胞菌和黄单胞菌。
在一个优选的实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌纲亚族14”。“革兰氏阴性变形菌纲亚族14”定义为下列类的一组变形菌纲假单胞菌和黄单胞菌。
在一个优选的实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌纲亚族15”。“革兰氏阴性变形菌纲亚族15”定义为假单胞菌类的一组变形菌纲。
在一个优选的实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌纲亚族16”。“革兰氏阴性变形菌纲亚族16”定义为下列类的一组变形菌纲(ATCC或其他存放实例菌株的数量显示在括号中)假单胞菌属abietaniphila(ATCC 700689)；铜绿假单胞菌(ATCC 10145)；产碱假单胞菌(ATCC 14909)；病膳假单胞菌(ATCC 33660)；香茅醇假单胞菌(ATCC13674)；假单胞菌属flavescens(ATCC 51555)；门多萨假单胞菌(ATCC25411)；硝基还原假单胞菌(ATCC 33634)；食油假单胞菌(ATCC 8062)；类产碱假单胞菌(ATCC 17440)；食树脂假单胞菌(ATCC 14235)；稻草假单胞菌(ATCC 33636)；伞菊假单胞菌(ATCC 25941)；假单胞菌属alcaliphila；产碱假单胞菌；假单胞菌属andersonii；铁角蕨假单胞菌(ATCC 23835)；假单胞菌属azelaica(ATCC 27162)；拜氏假单胞菌(ATCC 19372)；假单胞菌属borealis；北城假单胞菌(ATCC 33662)；假单胞菌属brassicacearum；假单胞菌属butanovora(ATCC 43655)；假单胞菌属cellulosa(ATCC 55703)；枯黄假单胞菌(ATCC 33663)；绿针假单胞菌(ATCC 9446，ATCC 13985，ATCC 17418，ATCC 17461)；莓实假单胞菌(ATCC 4973)；海雀假单胞菌(ATCC 49968)；腐臭假单胞菌(ATCC 4683)；青紫菖假单胞菌(ATCC33616)；晕斑假单胞菌；假单胞菌属diterpeniphila；伸长假单胞菌(ATCC10144)；弯曲假单胞菌属(ATCC 12775)；生氮假单胞菌；假单胞菌属brenneri；假单胞菌属cedrella；起皱假单胞菌(ATCC 29736)；假单胞菌属extremorientalis；荧光假单胞菌(ATCC 35858)；假单胞菌属gessardii；假单胞菌属libanensis；假单胞菌属mandelii(ATCC 700871)；边缘假单胞菌(ATCC 10844)；假单胞菌属migulae；霉味假单胞菌(ATCC 4685)；假单胞菌属orientalise；罗氏假单胞菌属；类黄假单胞菌(ATCC 9890)；托拉假单胞菌(ATCC 33618)；韦龙氏假单胞菌属(ATCC 700474)；假单胞菌属frederiksbergensis；膝形假单胞菌属(ATCC 19374)；假单胞菌属gingeri；假单胞菌属graminis；栖木槿假单胞菌；假单胞菌属halodenitrificans；嗜盐假单胞菌；栖木槿假单胞菌(ATCC 19867)；赫替假单胞菌(ATCC14670)；假单胞菌属hydrogenovora；假单胞菌属jessenii(ATCC 700870)；假单胞菌属kilonensis；柳叶刀假单胞菌(ATCC 14669)；假单胞菌属lini；划界假单胞菌(ATCC 25417)；臭味假单胞菌(ATCC 33665)；假单胞菌属denitrificans(ATCC 19244)；穿孔假单胞菌(ATCC 190)；皮克特假单胞菌(ATCC 23328)；假单胞菌属psychrophila；黄褐假单胞菌(ATCC 31418)；蒙氏假单胞菌属(ATCC 700476)；假单胞菌属mosselii；稻皮假单胞菌(ATCC 43272)；假单胞菌属plecoglossicida(ATCC 700383)；假单胞菌属putida(ATCC 12633)；假单胞菌属reactans；多刺假单胞菌(ATCC 14606)；假单胞菌属balearica；浅黄假单胞菌(ATCC 43273)；施氏假单胞菌(ATCC17588)；扁桃假单胞菌(ATCC 33614)；假单胞菌属avellanae(ATCC700331)；番木瓜假单胞菌(ATCC 33615)；菊苣假单胞菌(ATCC 10857)；天仙果假单胞菌(ATCC 35104)；褐鞘假单胞菌；苦楝假单胞菌(ATCC 33050)；假单胞菌属syringae(ATCC 19310)；绿黄假单胞菌(ATCC 13223)；假单胞菌属thermocarboxydovorans(ATCC 35961)；假单胞菌属thermotolerans；假单胞菌属thivervalensis；假单胞菌属Vancouverensis(ATCC 700688)；假单胞菌属wisconsinensis；和假单胞菌属xiamenensis。
在一个优选的实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌纲亚族17”。“革兰氏阴性变形菌纲亚族17”定义为本领域已知为荧光假单胞菌的一组变形菌纲，包括例如属于下列假单胞菌属的菌属生氮假单胞菌；假单胞菌属brenneri；假单胞菌属cedrella；起皱假单胞菌；假单胞菌属extremorientalis；荧光假单胞菌；假单胞菌属gessardii；假单胞菌属libanensis；假单胞菌属mandelii；假单胞菌属marginalise；假单胞菌属migulae；霉味假单胞菌；假单胞菌属orientalis；罗氏假单胞菌属；类黄假单胞菌；托拉假单胞菌，和韦龙氏假单胞菌属.
在一个优选的实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌纲亚族18”。“革兰氏阴性变形菌纲亚族18”定义为荧光假单胞菌属的所有亚属，种类，菌株和其他亚特殊单位，包括例如属于下列的那些菌属(ATCC或其他存放实例菌株的数量显示在括号中)荧光假单胞菌生物型A，也称为生物变型1或生物变型I(ATCC 13525)；荧光假单胞菌生物型B，也称为生物变型2或生物变型II(ATCC 17816)；荧光假单胞菌生物型C，也称为生物变型3或生物变型III(ATCC 17400)；荧光假单胞菌生物型F，也称为生物变型4或生物变型IV(ATCC 12983)；荧光假单胞菌生物型G，也称为生物变型5或生物变型V(ATCC 17518)；和荧光假单胞菌亚属cellulosa(NCIMB 10462)。
在一个优选的实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌纲亚族19”。“革兰氏阴性变形菌纲亚族19”定义为荧光假单胞菌生物型A的所有菌株。这种生物型的一个特别优选的菌株是荧光假单胞菌株MB 101(见Wilcox的美国专利No.5,169,760)，及其衍生物。
在一个特别优选的实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌纲亚族1”。在一个特别优选的实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌纲亚族2”。在一个特别优选的实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌纲亚族3”。在一个特别优选的实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌纲亚族5”。在一个特别优选的实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌纲亚族7”。在一个特别优选的实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌纲亚族12”。在一个特别优选的实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌纲亚族15”。在一个特别优选的实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌纲亚族17”。在一个特别优选的实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌纲亚族18”。在一个特别优选的实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌纲亚族19”。
转化可采用本领域已知的任何转化方法来用载体转化宿主细胞，细菌宿主细胞可被当作完整的细胞或原生质体(即包括胞质体)而被转化。实例的转化方法包括穿孔方法，例如电穿孔，原生质体融合，细菌结合，和二价阳离子处理，例如氯化钙处理或CaCl/Mg2+处理。
发酵如在此所使用的，术语“发酵”包括两种实施例，即使用常规发酵的实施例和使用其他的非发酵培养模式的实施例。发酵可在任何规模进行。在一个优选的实施例中，发酵培养基可选自富营养培养基，最小培养基和矿物质盐类培养基；可使用一种富营养培养基，但优选避免使用。在一个优选的实施例中，选择最小培养基或矿物质盐类培养基。在一个优选的实施例中，选择矿物质盐类培养基。特别优选矿物质盐类培养基。
矿物质盐类培养基含有矿物质盐类和碳源，如葡萄糖，蔗糖或甘油。矿物质盐类培养基的实例包括，例如，M9培养基，假单胞菌培养基(ATCC179)，Davis and Mingioli培养基(见，BD Davis & ES Mingioli，J.Bact.6017-28(1950))。用来制备矿物质盐类培养基的矿物质盐类包括选自下列的盐类，例如磷酸钾，硫酸铵或氯化铵，硫酸镁或氯化镁，以及痕量的矿物质如氯化钙，硼酸盐和硫酸铁，铜，锰和锌。矿物质盐类培养基中不含有有机氮源，如蛋白胨，胰胨，氨基酸，或酵母提取物。相反，可以使用无机氮源，可选自铵盐，氨水，和氨气。一种优选的矿物质盐类培养基将含有葡萄糖作为碳源。与矿物质盐类培养基相比，最小培养基也含有矿物质盐类和碳源，但进一步添加了，例如低水平的氨基酸，维生素，蛋白胨或其他成分，尽管添加的水平非常低。
根据本发明极端酶表达系统可以任何发酵形式进行培养。例如，在此可应用批量，fed-batch，半连续性，和连续性发酵模式。
根据本发明的表达系统可用于以任何发酵的规模(即体积)进行极端酶的表达。因此，例如，可使用微升级，厘升级，和分升级发酵体积；可使用1升级和更高的发酵体积。在一个优选的实施例中，发酵体积可为1升或以上。在一个优选的实施例中，发酵体积可为5升或以上。在一个优选的实施例中，发酵体积可为10升或以上。在一个优选的实施例中，发酵体积可为15升或以上。在一个优选的实施例中，发酵体积可为20升或以上。在一个优选的实施例中，发酵体积可为25升或以上。在一个优选的实施例中，发酵体积可为50升或以上。在一个优选的实施例中，发酵体积可为75升或以上。在一个优选的实施例中，发酵体积可为100升或以上。在一个优选的实施例中，发酵体积可为150升或以上。在一个优选的实施例中，发酵体积可为200升或以上。在一个优选的实施例中，发酵体积可为250升或以上。在一个优选的实施例中，发酵体积可为500升或以上。在一个优选的实施例中，发酵体积可为750升或以上。在一个优选的实施例中，发酵体积可为1,000升或以上。在一个优选的实施例中，发酵体积可为2,000升或以上。在一个优选的实施例中，发酵体积可为2,500升或以上。在一个优选的实施例中，发酵体积可为5,000升或以上。在一个优选的实施例中，发酵体积可为10,000升或以上。在一个优选的实施例中，发酵体积可为50,000升或以上。在一个特别优选的实施例中，发酵体积可为10升或以上。
在本发明中，宿主细胞的生长，培养和/或发酵可在大约4℃至大约55℃的温度范围内进行(含4℃和55℃)。因此，例如如在此所使用的就本发明的宿主细胞而言，术语“生长”(和“grow”，“growing”)，“培养”(和“culture”)，和发酵(和“ferment”，“fermenting”)，其固有的和必要地含义是在大约4℃至大约55℃的温度范围内(含4℃和55℃)“生长”，“培养”和“发酵”。另外，“生长”是用来表示活细胞分裂的生物学状态和/或扩增，以及非分裂和/或非扩增细胞维持代谢的生物学状态，对于后者术语“生长”的使用与术语“维持”是同义词。
另外，当用于本发明的重组细菌宿主细胞和表达系统时，在“允许表达的条件下”生长，在此的定义是(1)重组细菌宿主细胞本身的生长，其中使用的在控制序列中可操作地与极端酶编码序列连接的启动子是一种结构性启动子；和(2)其中使用的在控制序列中可操作地与极端酶编码序列连接的启动子是调节性启动子；(a)在其诱导物存在(即，与其接触)时重组细菌宿主细胞的生长，和(b)在缺乏其诱导物时重组细菌宿主细胞的生长，随后添加这种诱导物至系统中，使细胞与诱导物接触。
生物催化剂的制备一旦被表达，采用本领域已知的任何蛋白回收和/或蛋白纯化方法，极端酶被分隔，分离，和/或纯化。例如，极端酶在细胞内表达，宿主细胞通过标准的物理，化学或酶学方法被溶解，见，例如P.Prave等人(主编)，生物技术学基本原理(1987)(VCH Publishers，New York)(特别是章节8.3)，随后分离蛋白，例如通过任何一种或多种微量过滤法，超滤法，凝胶过滤法，凝胶纯化法(例如，通过PAGE)，亲和纯化，层析(例如，LC，HPLC，FPLC)，等等。可选择地，利用这些酶的特殊特性，这些通常已知的蛋白回收和蛋白纯化方法可变化使用。例如，已报道嗜高温酶可很容易的通过加热从细胞物质中分离出来，重新悬浮极端酶，同时使其他的细胞蛋白和物质沉淀；这种方法特别优选用于在此的嗜高温酶。
当极端酶从宿主细胞中分泌出来，可直接从培养基中分隔，分离和/或纯化。当极端酶在宿主细胞中表达为不溶的包含体或包含体的一部分时，可溶解包含体以回收功能酶。例如，宿主细胞可被裂解以获得这样的包含体，然后溶解；可选择地是，一些极端酶包含体可直接从宿主细胞中通过细胞内溶解作用而直接提取，不需要细胞裂解步骤。在其中一个实施例中，这样的溶解作用可引起表达的极端酶一定程度的解折叠，优选在溶解步骤后进行一次再折叠步骤。
在本领域中已知优很多技术可溶解和再折叠在包含体中表达的酶和其他蛋白。见，例如E De Bernardez Clark，工业加工中的蛋白再折叠，Curr.Opin.in Biotechnol.12(2)202-07(2001年4月1日)；MM Carrio & AVillaverde，蛋白聚集成为细菌包含体是可逆的，FEES Lett.489(1)29-33(2001年1月26日)；R Rudolph & HLilie，包含体蛋白的体外折叠，FASEBJ.1049-56(1996)；B Fischer等人，Biotechnol.Bioeng.413-13(1993)(大肠杆菌中表达的真核生物蛋白的再折叠)；G.Dong等人，Appl.Envir.Microbiol.63(9)3569-3576(Sep 1997)(嗜极端条件淀粉酶的再折叠)；A Yamagata等人，Nucl.Acids Res.，29(22)4617-24(2001年11月15日)(尿素变性溶解异种的，嗜热的RecJ核酸外切酶，然后再折叠获得活性的酶)；和C Pire等人，FEMS Microbiol.Lett.200(2)221-27(2001年6月25日)(大肠杆菌中表达的archaeal嗜盐葡糖脱氢酶的再折叠)。
根据本发明表达的极端酶可用于生物催化过程，如上所述。优选的生物催化过程是工业生物催化过程。一旦被分隔，分离或纯化，极端酶就可用于进行生物催化，例如，在游离酶或固定酶的生物反应器中，例如，代替目前的工业酶。可选择地，一旦极端酶被宿主细胞表达(或正在表达)，它可在细胞中用于生物催化。例如细胞可用作生物催化单位，例如，在全细胞生物反应器中，无论是游离细胞或固定细胞生物反应器，以这种形式，极端酶可在细胞内表达或在细胞表面表达或可被分泌或从细胞中运输出来。在一个优选的采用这种形式的实施例中，极端酶在细胞内或在细胞表面上表达。得到的酶或全细胞生物反应器本身是一种批量，fed-batch，半连续性，或连续的生物反应器。
表达水平根据本发明表达系统可以5％tcp或之上的水平表达极端酶。在一个优选的实施例中，表达水平在8％tcp或之上。在一个优选的实施例中，表达水平在10％tcp或之上。在一个优选的实施例中，表达水平在15％tcp或之上。在一个优选的实施例中，表达水平在20％tcp或之上。在一个优选的实施例中，表达水平在25％tcp或之上。在一个优选的实施例中，表达水平在30％tcp或之上。在一个优选的实施例中，表达水平在40％tcp或之上。在一个优选的实施例中，表达水平在50％tcp或之上。
在一个优选的实施例中，表达水平在35％或之下。在一个优选的实施例中，表达水平在40％或之下。在一个优选的实施例中，表达水平在45％或之下。在一个优选的实施例中，表达水平在50％或之下。在一个优选的实施例中，表达水平在60％或之下。在一个优选的实施例中，表达水平在70％或之下在一个优选的实施例中，表达水平在80％或之下。
在一个优选的实施例中，表达水平在5％tcp和80％tcp之间。在一个优选的实施例中，表达水平在8％tcp和70％tcp之间，含8％和70％。在一个优选的实施例中，表达水平在10％tcp和70％tcp之间，含10％和70％。在一个优选的实施例中，表达水平在15％tcp和70％tcp之间，含15％和70％。在一个优选的实施例中，表达水平在20％tcp和70％tcp之间，含20％和70％。
细胞密度根据本发明的表达系统提供了的细胞密度，即最大细胞密度，至少大约20g/L(即使在矿物质盐类培养基中生长时)；根据本发明的表达系统同样提供了至少大约70g/L的细胞密度，是以每体积的生物质量来表示的，生物质量是以细胞干重来测量的。
在一个优选的实施例中，细胞密度至少为20g/L。在一个优选的实施例中，细胞密度至少为25g/L。在一个优选的实施例中，细胞密度至少为30g/L。在一个优选的实施例中，细胞密度至少为35g/L。在一个优选的实施例中，细胞密度至少为40g/L。在一个优选的实施例中，细胞密度至少为45g/L。在一个优选的实施例中，细胞密度至少为50g/L。在一个优选的实施例中，细胞密度至少为60g/L。在一个优选的实施例中，细胞密度至少为70g/L。在一个优选的实施例中，细胞密度至少为80g/L。在一个优选的实施例中，细胞密度至少为90g/L。在一个优选的实施例中，细胞密度至少为100g/L。在一个优选的实施例中，细胞密度至少为110g/L。在一个优选的实施例中，细胞密度至少为120g/L。在一个优选的实施例中，细胞密度至少为130g/L。在一个优选的实施例中，细胞密度至少为140g/L。在一个优选的实施例中，细胞密度至少为150g/L。
在一个优选的实施例中，细胞密度为150g/L或之下。在一个优选的实施例中，细胞密度为140g/L或之下。在一个优选的实施例中，细胞密度为130g/L或之下在一个优选的实施例中，细胞密度为120g/L或之下。在一个优选的实施例中，细胞密度为110g/L或之下。在一个优选的实施例中，细胞密度为100g/L或之下。在一个优选的实施例中，细胞密度为90g/L或之下。在一个优选的实施例中，细胞密度为80g/L或之下。在一个优选的实施例中，细胞密度为75g/L或之下。在一个优选的实施例中，细胞密度为70g/L或之下。
在一个优选的实施例中，细胞密度在20g/L和150g/L之间，含20g/L和150g/L。在一个优选的实施例中，细胞密度在20g/L和120g/L之间，含20g/L和120g/L。在一个优选的实施例中，细胞密度在20g/L和80g/L之间，含20g/L和80g/L。在一个优选的实施例中，细胞密度在25g/L和80g/L之间，含25g/L和80g/L。在一个优选的实施例中，细胞密度在30g/L和80g/L之间，含30g/L和80g/L。在一个优选的实施例中，细胞密度在35g/L和80g/L之间，含35g/L和80g/L。在一个优选的实施例中，细胞密度在40g/L和80g/L之间，含40g/L和80g/L。在一个优选的实施例中，细胞密度在45g/L和80g/L之间，含45g/L和80g/L。在一个优选的实施例中，细胞密度在50g/L和80g/L之间，含50g/L和80g/L。在一个优选的实施例中，细胞密度在50g/L和75g/L之间，含50g/L和75g/L。在一个优选的实施例中，细胞密度在50g/L和70g/L之间，含50g/L和70g/L。在一个特别优选的实施例中，细胞密度至少为40g/L。在一个特别优选的实施例中，细胞密度在40g/L和80g/L之间。
总生产率在根据本发明的表达系统中，总生产率，即总的极端酶生产率，至少是1g/L。因此细胞密度和表达水平的因素是可以选择的。在一个优选的实施例中，总生产率至少是2g/L。在一个优选的实施例中，总生产率至少是3g/L。在一个优选的实施例中，总生产率至少是4g/L。在一个优选的实施例中，总生产率至少是5g/L。在一个优选的实施例中，总生产率至少是6g/L。在一个优选的实施例中，总生产率至少是7g/L。在一个优选的实施例中，总生产率至少是8g/L。在一个优选的实施例中，总生产率至少是9g/L。在一个优选的实施例中，总生产率至少是10g/L。
在一个特别优选的实施例中，当在一种矿物质盐类培养基中生长时(即，在温度为大约4℃至大约55℃的范围，含4℃和55℃)，表达系统的极端酶表达水平为至少5％tcp，细胞密度至少为40g/L。在一个特别优选的实施例中，当在至少10升发酵规模的一种矿物质盐类培养基中生长时(即，在温度为大约4℃至大约55℃的范围，含4℃和55℃)，表达系统的极端酶表达水平至少为5％tcp，细胞密度至少为40g/L。
实施例实例1.嗜极端条件纤维素酶实例1A.构建表达Thermotoga maritima和激烈热球菌纤维素酶的荧光假单胞菌菌株。
方法分子生物学技术的描述见Ausubel等人(主编)，分子生物学现代方法(1995)(John Wiley & Sons)；Sambrook，Fritsch，& Maniatis(主编)，分子克隆(1989)(Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY)。
表达基因盒亲代质粒pMYC1803是pTJS260的衍生体(见Wilcox的美国专利No.5,169,760)，携带了一个可调节的四环素抗性标记物，来自RSF1010质粒的复制和活动位点(pMYC1803是可用于根据本发明的极端酶表达的衍生质粒的来源。大多数这些衍生体与pMYC1803不同，主要是在ORF周围，是为了导入合适的限制性位点以克隆不同的外源基因。)Thermotoga maritima纤维素酶基因(0.94kb编码314aa，38kD的纤维素酶)和激烈热球菌葡聚糖内切酶基因(0.90kb编码300aa，34kD葡聚糖内切酶)是PCR扩增的，采用的引物是设计用来在基因编码序列N末端导入Spel位点，以及pMYC1803中ORF的翻译起始位点和C末端导入Xhol位点。各自PCR产物的Spel-Xhol片段在相应的位点被单独地插入进pMYC1803，这样酶基因可代替已经存在于此的外源基因，其表达可由tac启动子发动。得到的在大肠杆菌JM109中的构建物pMYC1954和pDOW2408通过限制性消化和定性酶测定进行筛选，然后正确构建物的碱性分解miniprep质粒DNA被电穿孔进入荧光假单胞菌MB214中。
宿主菌株荧光假单胞菌MB214MB214是MB101(一种野生型的原养型荧光假单胞菌菌株)的衍生体，是通过一些加工获得的，其中lacIZYA操纵子(删除了lacZ启动子区)已经被整合进染色体中，提供了一种宿主环境，其中lac启动子的衍生物可被乳糖或IPTG调节。MB101是Lac-的，而MB214是Lac+的。但，MB101可通过将大肠杆菌lacI基因导入进菌株中成为Lac+。
实例1B.表达嗜极端条件纤维素酶种子培养如下进行。荧光假单胞菌MB214转化体接种至2-5mLLuria-Bertani肉汤(“LB”)中，添加15μg/mL四环素HCl，在15ml Falcon管中，32℃，300rpm生长16-20h。1mL种子培养物(LB中)置于50mLTerrific肉汤(TB)培养基中(见表4)，添加15μg/mL四环素HCl，在250ml底部带隔板的摇瓶中32℃，300rpm孵育5h。添加IPTG至0.5mM的终浓度进行诱导。诱导后16-24小时获取标本。
摇瓶规模的结果见表5。
10升规模的结果见表6。
在摇瓶和高细胞密度发酵培养中纤维素酶的表达水平高于8％tcp。分离纤维素酶，检测其活性，发现它是有活性的。
实例2.嗜极端条件淀粉酶来自Thermococcal和硫磺矿硫化叶菌的α淀粉酶是PCR扩增的，并如实例1被克隆进pMYC1803中，以便能够可操作地与一条控制序列连接，所述控制序列包括也携带四环素抗性标记物的以RSF1010为基础的载体中的Ptac启动子，如图1所示。得到的构建物转化进LacI+荧光假单胞菌MB101中。得到的重组宿主细胞在10L发酵罐中培养，生长在矿物质盐类培养基中(添加四环素，用葡萄糖或甘油饲养)。转化体生长在fed-batch发酵培养系统中，最终达到的细胞密度所提供的生物质量的范围在大约20g/L至70g/L以上(细胞干重)。加入Ptac启动子的安慰诱导物，IPTG诱导表达。因此，表达淀粉酶(即，过度表达)的水平为大约5％tcp至30％tcp以上的范围。因此，总产量的范围是大约2g/L至超过10g/L，从单一10升批次中提供的极端酶产量超过100g。细胞裂解后，极端酶通过微量过滤纯化，然后进行超滤。得到的酶被定性，进一步被检测其淀粉液化活性，发现是有活性的，嗜高温的和嗜酸性的。
实例3.嗜极端条件的蛋白酶激烈热球菌和嗜酸热硫化叶菌蛋白酶基因分别编码热分解素(pyrolysin)(IUBMB EC 3.4.21.-)，一种丝氨酸蛋白酶，在115℃和pH6.5-10.5下有活性，以及thermopsin(IUBMB EC 3.4.23.42)，一种酸性蛋白酶最佳工作环境为90℃和pH2.0。这些基因是PCR扩增的，如实例1被克隆进pMYC1803，以便与一条控制序列可操作地连接，所述控制序列包括也携带四环素抗性标记物的以RSF1010为基础的载体中的Ptac启动子，如图1所示。得到的构建物被转化进LacI+荧光假单胞菌MB214。得到的重组宿主细胞被培养在10L发酵罐中，生长在矿物质盐类培养基中(添加了四环素，用葡萄糖或甘油饲养)。转化体生长在fed-batch发酵培养系统中，最终达到的细胞密度提供的生物质量范围为大约20g/L至70g/L以上(细胞干重)。在用IPTG诱导的过程中，蛋白酶表达的水平范围是大约5％tcp至30％tcp以上。因此总产量的范围是大约1g/L至10g/L以上，在单一10L批次中提供的极端酶的产量在100g以上。
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要理解的是在上面所述的优选的实施例仅是本发明的实例，在此所使用的术语的目的仅是为了说明这些优选的实施例；因此，为上述描述所选择的优选实施例并不是要限制本发明的范围。因此被描述的发明，其他实施例，对于本领域专业技术人员来说，采用常规的试验，选择，变化和明显的改变是很显然的，视为是那些优选的实施例，方法，步骤，载体，试剂，元件和特别是在此所述的各种组合一样的等价物。这些等价物是被认为在本发明的范围内的，并不认为偏离本发明的精神和范围。所有的这些等价物被认为包括在下列权利要求的范围内，发明的真正范围通过下列的权利要求被限定，是在此权限中可应用的等价原则和相似原则下进行分析的。
权利要求
1.一种被基因工程改造以在其中含有可工作的表达载体的重组细菌宿主细胞，表达载体包括含外源性极端酶编码序列的核酸，该序列可操作地连接于控制序列，所述的宿主细胞能够过度表达所述的编码序列，使得当在允许表达的条件下生长于培养基中时以至少1g/L的总生产率产生所述的极端酶，其特征是细菌宿主细胞选自假单胞菌及其紧密相关的细菌。
2.一种极端酶过度表达系统，具有重组的细菌宿主细胞，可在所述宿主细胞中工作的表达载体，表达载体中含有包含外源性极端酶编码序列的核酸，该序列可操作地连接于控制序列，当在允许表达的条件下生长于培养基中时，所述的过度表达系统能够过度表达所述的编码序列以便以至少1g/L的总生产率产生所述的极端酶，其特征是细菌宿主细胞选自假单胞菌及其密切相关的细菌。
3.以至少1g/L的总生产率过度表达极端酶的方法，包括以下步骤(1)提供(a)选自假单胞菌及其密切相关细菌的细菌宿主细胞，(b)可在所述宿主细胞中工作、含有包含外源性极端酶编码序列的核酸的表达载体，该序列可操作地连接于控制序列，和(c)培养基；(2)将所述的表达载体转化进所述的细菌宿主细胞中形成重组的细菌宿主细胞；和(3)在允许表达的条件下在培养基中培养所述的重组细菌宿主细胞。
4.一种以至少1g/L的总生产率过度表达极端酶的方法，包括(1)将表达载体转化进入选自假单胞菌及其密切相关细菌的细菌宿主细胞中以产生重组的细菌宿主细胞，该表达载体含有包含外源性极端酶编码序列的核酸，该序列可操作地连接于控制序列，和(2)在允许表达的条件下在培养基中培养所述的重组细菌宿主细胞。
5.选自假单胞菌及其密切相关细菌的重组细菌宿主细胞在允许表达的条件下从生长在培养基中的重组细菌宿主细胞中以至少1g/L的总生产率过度表达极端酶的方法中的用途。
6.以至少1g/L的总生产率过度表达极端酶的商用试剂盒，包括(1)选自假单胞菌及其密切相关细菌的一定量的细菌宿主细胞；(2)在所述细菌宿主细胞中工作、并含有控制序列的一定量的表达载体；(3)将含有外源极端酶编码序列的核酸插入所述表达载体的说明书，以便将编码序列与控制序列可操作地连接，由此制备表达载体；(4)随后将所述表达载体转化进入所述细菌宿主细胞中以形成重组细菌宿主细胞的说明书；和(5)在允许表达的条件下在培养基中培养所述重组细菌宿主细胞的说明书；和(6)任选地，一定量所述的培养基；和(7)任选地，一定量调节的启动子的诱导剂，其中所述的控制序列使用所述的调节启动子。
7.以至少1g/L的总生产率过度表达一种极端酶的商用试剂盒，包括(1)选自假单胞菌及其密切相关细菌的一定量的细菌宿主细胞，(2)可在所述细菌宿主细胞中工作、并含有控制序列和可操作地与其连接的外源极端酶编码序列的一定量表达载体，(3)将所述表达载体转化进所述的细菌宿主细胞形成重组细菌宿主细胞的说明书，和(4)在允许表达的条件下将所述的重组细菌宿主细胞生长在一种培养基中的说明书；和(5)可选择地，一定量所述的培养基；和(6)可选择地，一定量的可调节启动子的诱导物，其中所述的控制序列使用所述的调节启动子。
8.权利要求1-7中任意一项中的极端酶，其中所述的极端酶选自IUBMB EC 2-6任何类型中的一个。
9.权利要求8中的极端酶，选自IUBMB EC 2-5任何类型中的任何一种嗜极端条件的酶类。
10.权利要求9中的极端酶，选自IUBMB EC 2-3任何类型中的任何一种嗜极端条件的酶类。
11.权利要求10中的极端酶，选自IUBMB EC 3中的任何一种嗜极端条件的酶类。
12.权利要求11中的极端酶，选自IUBMB EC 3.1-3.8中的任何一种嗜极端条件的酶类。
13.权利要求12中的极端酶，选自IUBMB EC 3.1-3.2或3.4中的任何一种嗜极端条件的酶类。
14.权利要求13中的极端酶，选自IUBMB EC 3.2或3.4中的任何一种嗜极端条件的酶类。
15.权利要求14中的极端酶，选自IUBMB EC 3.2.1.，3.4.21，或3.4.23中的任何一种嗜极端条件的酶类。
16.权利要求15中的极端酶，选自纤维素酶、淀粉酶、丝氨酸肽链内切酶和天冬氨酸肽链内切酶。
17.权利要求16中的极端酶，选自淀粉酶、丝氨酸肽链内切酶和天冬氨酸肽链内切酶。
18.权利要求17中的极端酶，选自α-淀粉酶、热分解素和耐热素。
19.权利要求1-7中任意一项中的细菌宿主细胞，其中所述的细菌宿主细胞选自革兰氏阴性变形菌纲 亚群1。
20.权利要求1-7中任意一项中的细菌宿主细胞，其中所述的细菌宿主细胞选自革兰氏阴性变形菌纲 亚群2。
21.权利要求1-7中任意一项中的细菌宿主细胞，其中所述的细菌宿主细胞选自革兰氏阴性变形菌纲 亚群3。
22.权利要求1-7中任意一项中的细菌宿主细胞，其中所述的细菌宿主细胞选自革兰氏阴性变形菌纲 亚群5。
23.权利要求1-7中任意一项中的细菌宿主细胞，其中所述的细菌宿主细胞选自革兰氏阴性变形菌纲 亚群7。
24.权利要求1-7中任意一项中的细菌宿主细胞，其中所述的细菌宿主细胞选自革兰氏阴性变形菌纲 亚群12。
25.权利要求1-7、16、18中任意一项中的细菌宿主细胞，其中所述的细菌宿主细胞选自革兰氏阴性变形菌纲 亚群15。
26.权利要求1-7中任意一项中的细菌宿主细胞，其中所述的细菌宿主细胞选自革兰氏阴性变形菌纲 亚群17。
27.权利要求1-7、16、18中任意一项中的细菌宿主细胞，其中所述的细菌宿主细胞选自革兰氏阴性变形菌纲 亚群18。
28.权利要求1-7中任意一项中的表达载体，其中所述的表达载体选自RSF1010及其衍生物。
29.权利要求1-7中任意一项中的控制序列，其中所述的控制序列含有调节启动子。
30.权利要求29中的调节启动子，它是负性调节启动子。
31.权利要求30中的负性调节启动子，它是Ptac。
32.权利要求1-7中任意一项中的培养，其中所述的培养在10升或以上的规模进行。
33.权利要求1-7中任意一项中的培养，其中所述的在允许表达的条件下的培养包括在缺少其诱导物的情况下培养重组细菌宿主细胞，所述的细胞含有与极端酶编码序列可操作连接的调节启动子，然后在系统中添加这样的诱导物。
34.权利要求1-7中任意一项中的培养基，其中所述的培养基选自最小培养基和补充碳源的矿物盐类培养基。
35.权利要求34中的培养基，它是添加碳源的矿物盐类培养基。
36.权利要求3-4中的任意一项进一步包括分隔、游离或纯化其中的极端酶。
37.根据权利要求1-7中任意一项表达的极端酶。
38.根据权利要求1-7中任意一项表达的极端酶在生物催化过程中的应用。
39.权利要求1-7中任意一项中的极端酶，其中所述的极端酶在细菌宿主细胞中的包含体中表达，所述的包含体随后被溶解。
40.权利要求1-7和39任意一项中的极端酶，其中所述的再折叠步骤用来再折叠极端酶。
全文摘要
一种极端酶过度表达系统，其中假单胞菌和密切相关细菌被用作宿主细胞，其使用方法和试剂盒，以及从中表达的极端酶。
文档编号C12P21/00GK1646694SQ03808240
公开日2005年7月27日 申请日期2003年2月13日 优先权日2002年2月13日
发明者L·C·谢乌, H·W·塔尔博特, S·L·李 申请人:陶氏环球技术公司