专利名称：基因芯片电位扫描无标记荧光检测方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及利用一种基因芯片进行生物分子检测的方法。
背景技术：
人类基因组计划和其他基因测序计划的完成，蛋白质组计划的实施，为与生命、医学相关的研究，如基因工程、疾病的诊断和治疗、新药的开发，奠定了基础。为了这些后续的工作，同时需要发展新的生物技术，基因芯片就是其中的一个例子。
基因芯片的目的是高通量地从大量的DNA或DNA片段中识别出特定的DNA序列和分子。基因芯片的一种类型是将已知的一定序列的DNA片段(以下称作探针)固化在表面上，通过DNA杂交实验，使被测样品中与探针完全匹配的生物分子(以下称作标靶)与探针结合，同时与探针不完全匹配的生物分子(以下简称错靶)不能与探针结合，从而实现对不同生物分子的特异性识别，标靶和错靶统称为样品。在基因芯片检测中，如何将只是一个碱基有差别的两个寡聚核酸序列(即所谓单碱基多态性，SNP)区别开，是一个技术难题[J.Wang，Nucleic Acids Research 283011(2000).；F.W.Scheller，et al.，Current Opinionin Biotechnology 1235(2001)；J.Fritz，et al.，Science 288316(2000)]。
利用温度、pH、盐浓度等来控制或优化DNA杂交是经典的方法。最近，有人发明了温度控制的基因芯片，探针为线性DNA分子[T.Kajiyama，et al.，Genome Research 13467(2003)，USPTO6，428，749]。但是，线性SNP序列随温度变化的差别较小，信号的区别度仍然不能令人满意。利用电位调节、控制生物分子的分析、分离过程，也是经典的方法，大量商品化的分析、分离仪器(如电泳仪)是建立在电位控制上的。以上的电位控制方法都已经被标准化，并被写入有关的教科书。例如卢圣栋主编《现代分子生物学实验技术》(中国协和医科大学出版社，1999年版)。
近年来有人提出利用一定电位下产生的电流实现生物分子的导向和双链DNA的解聚和SNP识别[C.F.Edman，et al.，Nucleic Acids Res 254907(1997)；R.G..Sosnowski，et al.，P Natl Acad Sci USA 941119(1997)；USPTO524477，USPTO5849486，USPTO6030781，USPTO6048690，USPTO6197508]，以及在固定电位下识别完全匹配与有两个碱基错配的序列[R.J.Heaton，et al.，P NatlAcad Sci USA 983701(2001)；WO 02/055993]。但是，他们使用的探针都是线性DNA分子，并且都是利用信号强度随时间变化的性质来观测DNA杂交结果。
另一方面，无标记荧光检测方法已经是文献中的方法。这一方法利用一类称为嵌入式荧光染料的分子可以与DNA双螺旋结合发出荧光的性质，显示DNA杂交后双螺旋的存在。例如PicoGreen分子就是人们熟知的该类分子[J.A.Susan，Nucleic Acids Research 242623(1996)；USPTO 6350578]。
中国专利申请“发卡形探针基因芯片及其制备方法和检测方法”(申请号02116202.2，申请日2002年3月22日)公开了一种发卡形探针基因芯片。
将发卡结构的探针和无标记荧光检测的方法结合，利用电位扫描，通过荧光强度随电位变化的曲线特征实现SNP识别的技术和方法还没有文章或专利报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过电位扫描、进行无标记荧光检测的、实现SNP识别的基因芯片检测方法。
本发明的方法采用发卡形探针基因芯片，其步骤包括1、制作该基因芯片与标靶的电位扫描解链荧光标准曲线1)用已知是完全匹配的样品(标靶)配制溶液(以下称标准溶液)，标准溶液的浓度在1×10-9M和1×10-6M之间，推荐值为5×10-8M。将标准溶液装入荧光法测量芯片杂交的装置，与探针杂交；2)按照生产商提供的使用方法，在待测标准溶液中加入嵌入式荧光染料；3)对芯片基底施加电位和进行电位扫描，最大扫描范围从+0.5V到-1.5V。记录电位扫描下的探针与标准溶液杂交的荧光信号随表面电位变化的曲线，即为该芯片的电位扫描解链荧光标准曲线。
2、制作该基因芯片与待测样品的电位扫描解链荧光曲线1)将与标准溶液浓度接近的待测样品DNA溶液装入荧光法测量芯片杂交的装置，与探针杂交，并按照生产商提供的使用方法加入嵌入式荧光染料；2)以与获得标准曲线相同的扫描速度对芯片基底施加电位和进行电位扫描，最大扫描范围是从+0.5V到-1.5V。记录电位扫描下的探针与待测样品杂交的荧光信号随表面电位变化的曲线，即待测样品的电位扫描解链荧光曲线。
3、将待测样品曲线与标准曲线进行比较，给出识别结果1)计算待测样品曲线与标准曲线的的解链半高电位之差ΔE1/2值；2)当ΔE1/2＜0.2伏时，确认待测样品为标靶；当ΔE1/2＞0.2伏时，确认待测样品为错靶。
本发明识别错靶判据的理论依据如下由于标靶与发卡形探针形成的双螺旋结构最稳定，荧光信号在较大的电位范围内保持不变，称为高平台区，高平台区的荧光信号强度记为I1，然后在很小的电位区间内荧光信号降低到低平台区，其荧光信号强度记为I2。与之对比，由于错靶与发卡形探针形成的双螺旋结构不够稳定，荧光信号比标靶提前从高平台区降低到低平台区。分别将标靶和错靶的信号降低到I1/2＝(I1-I2)/2+I2时的电位称为标靶和错靶的解链半高电位，E1/2。根据电化学理论，电荷处于电位E下的标准摩尔自由能(G)为G＝G0+δFE(1)其中G0为没有电位时的标准摩尔自由能，δ为分子的有效电荷，F为法拉第常数。而DNA双链的解链平衡常数为[P][PS]=exp(-ΔGRT+ln[S]co)---(2)]]>其中，[P]为表面上未结合样品的发卡形探针的浓度，[PS]为表面上与样品结合的发卡形探针的浓度，[S]为溶液中样品的浓度，c0为浓度单位。由以上两式推导可得荧光信号随电位变化的关系为I=I0exp(-δFRT(E-E1/2))1+exp(-δFRT(E-E1/2))---(3)]]>上式便是识别时荧光随电位的关系式，由它拟合实验曲线便可得到解链半高电位。而由(1)、(2)得知，标靶与错靶的解链半高电位之差，ΔE1/2＝|E1/2(标靶)-E1/2(错靶)|，为ΔE1/2=ΔG0δF]]>其中ΔG0为单个碱基对结合的标准摩尔自由能。一般地，A-T对的ΔG0在8-15kJ/mol之间，C-G对的ΔG0在12-20kJ/mol之间，对于单碱基突变的错靶由此计算得到ΔE1/2的范围为0.3V＜ΔE1/2＜0.9V完全匹配的标靶从原理上讲不会有解链半高电位的移动。实验表明，确定ΔE1/2的误差一般小于±0.1V。考虑到标靶和错靶测量的各自可能的最大误差，因此给出前面的判断标准。
本发明在实施方案中采用的嵌入式荧光染料为PicoGreen。它的最佳激发波长为488nm，由于实验条件所限，本发明在实施方案中采用514nm激光激发，其结果可能是荧光信号的强度和信噪比劣于最佳波长下的结果，但是不会有本质的区别。
本发明利用电位扫描中的解链半高电位之差获得探针对于标靶和错靶的确定无疑的识别。由于DNA是带电分子，探针与标靶或者探针与错靶在芯片表面的结合能力受芯片基底电位的影响。存在着一定的表面电位范围，使得探针在与标靶有结合的时候却不能与错靶结合，反映在荧光信号中，标靶和错靶的荧光信号随电位的变化有明显不同的曲线关系。
图1显示完全匹配的标靶和单点错配的错靶与发卡形DNA探针杂交时，荧光信号随电位扫描的变化。由图看出，标靶和错靶的荧光随电位变化曲线完全不同。
图1中，ΔE1/2＝0.82V，标靶和错靶被确定无疑地识别开。图1还显示在没有外加电位(电位接近零)时，标靶和错靶与发卡形探针形成双螺旋的荧光信号接近。如果仅仅采用发卡形结构的探针，而没有适当的电位控制和扫描，无法确定无疑地获得SNP识别。
图2显示上述标靶和错靶与线性DNA探针杂交时，荧光信号随电位扫描的变化。由图看出，SNP不同的标靶和错靶的荧光随电位变化曲线相近，无法确切区分哪一个是标靶，哪一个是错靶。说明仅仅是线性探针的电位扫描同样不能提供SNP识别的准确信息。
识别标靶和错靶的传统方法是比较某种检测信号的强度差别。由于实验测量误差的起伏，该标准常常会产生假阳性和假阴性的结果。本发明以解链半高电位之差作为判断标准，该性质受实验误差的影响小，更加稳定和可重复。所以判断更加确切和可靠。
本发明利用无标记荧光检测方法，探针和样品都无需进行特殊的标记，大大降低了技术成本。同时又具有通常荧光检测的方便和灵敏的优点，可以同现有的芯片技术结合，特别是可以利用高度平行化的成像技术检测，满足基因芯片高通量检测的需要。
图1 同一个接有无标记发卡形DNA探针的生物芯片在电位扫描时对完全匹配的标靶和单点错配的错靶的荧光响应曲线11--芯片对标靶的信号响应曲线12--芯片对错靶的信号响应曲线图2 同一个接有无标记线性DNA探针的生物芯片在电位扫描时对与图1中相同的标靶和错靶的荧光响应曲线两种样品的结果在实验误差范围内难于区分，说明如果没有发卡形结构，仅仅施加电位控制或电位扫描，不能达到SNP识别的目的。
21--芯片对标靶的信号响应曲线22--芯片对错靶的信号响应曲线图3 获得图1和图2实验数据的实验装置示意3-1该装置的正视3-2该装置的上视图该装置为两电极体系的现场荧光-电池。测量时，将检测溶液加入电池，用激光激发，记录探针与样品DNA杂交产生的荧光信号。
31--接有无标记发卡形DNA探针的生物芯片，用做工作电极。
32--螺旋状铂丝，用作对电极。
33--波长为514nm的激光实施方案按照“发卡形探针基因芯片及其制备方法和检测方法”(申请号02116202.2，申请日2002年3月22日)专利申请和文献报道的方法[见物理化学学报17931(2001)“硅表面上构筑具有化学特性的图形的新方法”，吴瑞阁等]制备得到以羧基终止的单层有机膜覆盖的p-硅表面作为生物芯片的基底。选择人体脂蛋白脂肪酶基因LPL的天然序列片断为被测样品。研究表明，在LPL中有多个位点都可能因发生单点突变而引发高脂血症。这里选择的被检测的一段正常基因序列为(记为Ser 447)3’-AAT AAG AAG T A GGC TGA AAC-5’，单点突变的序列为3’-AAT AAG AAG T A GGC TGA AAC-5’，其中黑体并斜体带阴影下划线的碱基为发生突变位置的碱基。设计的无标记发卡形探针的碱基序列为5′-CCCCCGTT TCA GCC TGA CTT CTT ATTGGGGG-3′(一号探针)，其中下划线的碱基为茎杆区，探测区的碱基序列与正常基因序列完全匹配。而作为对比用的线性探针(二号探针)除了没有茎杆区外，其余部分与一号探针相同。利用无标记探针的-OH基团与有机膜的羧基之间的缩合反应形成的脂键分别将两个探针固化到硅表面有机膜上[10mM EDAC/1mM NHS(MES buffer，pH＝6.5)活化，固定反应4℃ 24小时]，分别制得接有无标记线性和发卡形探针的芯片。
在电位扫描下观察双链解开过程。利用恒电位仪(商品，ZF-3，上海)和电位扫描仪(商品，ZF-4，上海)进行电位扫描。检测溶液为含有PicoGreen(商品，Molecular Probes，美国)的1×TE缓冲溶液。测量时，用514nm的激光激发探针修饰的电极，测量PicoGreen与双链结合后产生的荧光随电位的变化。在本实施例中，图1显示，发卡形的一号探针对SNP差别的标靶和错靶的荧光-电位扫描曲线有明显差异。存在最佳电位区间，在此区间内，探针对标靶的荧光信号很强，而对错靶的荧光信号很弱。通过读取和比较解链半高电位，可以实现完全匹配与单点错配的确定无疑的识别。图2显示对照实验的结果线性的二号探针对完全匹配与单点错配的两个不同序列的响应几乎完全相同，因此不能做到SNP识别。
权利要求
1.一种基因芯片电位扫描无标记荧光检测方法，采用发卡形探针基因芯片，其步骤包括1)制作该基因芯片与标靶的电位扫描解链荧光标准曲线1-1)用已知是完全匹配的样品配制标准溶液；1-2)将标准溶液装入荧光法测量芯片杂交的装置，与探针杂交；1-3)在待测标准溶液中加入嵌入式荧光染料；1-4)对芯片基底施加电位和进行电位扫描；1-5)记录电位扫描下的探针与标准溶液杂交的荧光信号随表面电位变化的曲线，即为该芯片的电位扫描解链荧光标准曲线；2)制作该基因芯片与待测样品的电位扫描解链荧光曲线2-1)将与标准溶液浓度接近的待测样品DNA溶液装入荧光法测量芯片杂交的装置，与探针杂交，并在溶液中加入嵌入式荧光染料；2-2)以与获得标准曲线相同的扫描速度对芯片基底施加电位和进行电位扫描；2-3)记录电位扫描下的探针与待测样品杂交的荧光信号随表面电位变化的曲线，即待测样品的电位扫描解链荧光曲线；3)将待测样品曲线与标准曲线进行比较，给出识别结果3-1)计算待测样品曲线与标准曲线的的解链半高电位之差ΔE1/2值；3-2)当ΔE1/2＜0.2伏时，确认待测样品为标靶；当ΔE1/2＞0.2伏时，确认待测样品为错靶。
2.如权利要求1所述的基因芯片电位扫描无标记荧光检测方法，其特征在于所述标准溶液的浓度在1×10-9M和1×10-6M之间，扫描范围从+0.5V到-1.5V。
3.如权利要求2所述的基因芯片电位扫描无标记荧光检测方法，其特征在于所述标准溶液的浓度为5×10-8M。
4.如权利要求1或2或3所述的基因芯片电位扫描无标记荧光检测方法，其特征在于所述嵌入式荧光染料为PicoGreen。
全文摘要
本发明涉及一种基因芯片电位扫描无标记荧光检测方法，采用发卡形探针基因芯片，首先用标靶配制标准溶液，将标准溶液与探针杂交，并加入嵌入式荧光染料，对芯片基底施加电位和进行电位扫描，记录扫描下的探针与标准溶液杂交的荧光信号标准曲线；然后将待测样品DNA溶液装入荧光法测量芯片杂交的装置，与探针杂交，并加入嵌入式荧光染料；同样对芯片基底施加电位和进行电位扫描，记录扫描下的探针与待测样品杂交的荧光信号变化的曲线；将该曲线与标准曲线进行比较，给出识别结果。本发明可确切和可靠地实现SNP识别，探针和样品都无需进行特殊的标记，大大降低了成本。可广泛应用于生物芯片技术领域。
文档编号C12Q1/68GK1477210SQ0314261
公开日2004年2月25日 申请日期2003年6月3日 优先权日2003年6月3日
发明者赵新生, 魏芳 申请人:北京大学