专利名称：一种提高pcr技术检测植物病原细菌灵敏度的方法
技术领域：
本发明“一种提高PCR技术检测植物病原细菌灵敏度的方法”，属于生物技术领域。专用于对病原细菌进行检测，提高传统PCR技术检测病原细菌的灵敏度。
在植物病原细菌检测和鉴定中应用最多、也是最重要的是专化性引物PCR技术。所谓PCR检测技术是利用相应的引物，在DNA聚合酶催化下对目标DNA进行体外扩增，根据预期DNA条带的有无来判断检测结果。PCR技术发展至今，无论从理论和实际应用方面都有长足的发展。然而，PCR技术也有其不可否认的局限性，使得其灵敏度往往不高。尤其是检测无症状植物材料上的病原细菌，由于细菌含量低，样品液中存在大量PCR反应抑制物质，实际检测灵敏度往往比较低，限制了其在植物病原检测中的实际应用。原因在于1)直接对样品进行扩增，由于植物组织中含有大量酚类物质、碳水化合物等PCR反应抑制物，严重影响了PCR反应的灵敏度。2)加入PCR反应体系中的样品体积非常小，通常只有1-5ul，如果用cell/ml表示，该数字将会很大。
虽然已经有报道，利用免疫磁珠吸附植物病原细菌，然后利用一定的装置，对吸附有病原细菌的磁珠进行回收，进行PCR反应，可以提高利用PCR技术检测植物病原细菌的灵敏度。但该方法需要一定的设备，操作较为复杂，而且成本较高。
技术方案一种提高PCR技术检测植物病原细菌灵敏度的方法，包括1)病原细菌特异性抗血清的制备利用传统的抗血清制备方法，用戊二醛固定的细菌全菌体或提取并纯化的细菌脂多糖，免疫家兔，制备抗植物病原细菌全菌体或脂多糖(LPS)的专化性抗血清(技术方法成熟，可参考相关文献)，琼脂双扩散方法(ODD)测定效价，选择效价达到或超过1∶32的抗血清；2)PCR反应管的包被配制包被缓冲液Na2CO31.59g；NaHCO32.93g，加蒸馏水至1000ml，pH9.6
选取没有经过硅烷化的薄壁PCR反应管(普通PCR管)，用包被缓冲液将抗血清稀释500倍，每管加入50μl稀释抗血清，37℃孵育2小时或4℃过夜；3)PCR反应管的洗涤配制0.01M PBST溶液NaCl 8.0g；Na2HPO42.9g；KH2PO40.2g；KCl 0.2g；Tween-20 0.5ml；加蒸馏水定容至1000ml用灭菌的0.01MPBST溶液洗管三次，每次加入100μl，每次五分钟，最后一次加入100μl的灭菌水，甩干；4)样品中目标细菌的吸附配制0.01M PBS溶液NaCl 8.0g；Na2HP042.9g；KH2PO40.2g；KCl 0.2g；定容至1000ml每克植物材料加2ml灭菌的0.01M PBS溶液，制备待测样品悬液；将制备的样品悬液加入包被过的PCR反应管中，每管50μl，37℃孵育2小时或4℃过夜，用灭菌的0.01M PBST洗管二次，每次加入100μl，每次五分钟，最后一次加入100μl的灭菌水，甩干，直接用于免疫吸附PCR扩增。
本发明提高PCR技术检测植物病原细菌灵敏度的方法，其特征在于，将上述包被过的PCR反应管直接用于梨火疫病菌的免疫吸附PCR扩增方法为梨火疫病菌的特异性引物引物A(5’-CGGTTTTTAACGCTGGG-3’)引物B(5’-GGGCAAATACTCGGATT-3’)免疫吸附PCR扩增采用上述包被过的PCR反应管，50μl反应体系，其中10×PCR buffer 5μl；5mM MgCl23μl；10mM dNTPs0.5μl；20pmol/μl的上、下游引物各0.5μl；Taq酶0.25μl；25μg/ml的BSA 2.5μl；Twen-20 0.5μl；超纯无菌水37.25μl；PCR扩增程序为93℃预变性5min，93℃变性1min；53℃退火1min；72℃延伸2min；37个循环，最后72℃延伸3min。
有益效果 本发明所提供的一种提高PCR技术检测植物病原细菌灵敏度的方法，根据抗体与抗原的特异性反应原理，利用植物病原细菌的特异性抗血清直接包被PCR反应管，然后将检测样品加入PCR管中，包被于管壁的抗血清就可以特异性吸附目标细菌，经洗涤后，除去了所有PCR反应的抑制物质，只保留了被吸附的目标细菌，在反应管中加入相应的PCR反应成分，按照常规的PCR反应条件，就可以对植物细菌病害样品直接进行检测。具体优点表现在灵敏、快速、准确、简便(1)免疫-吸附PCR技术，将血清学和PCR技术结合起来，可以完全消除样品中的PCR反应抑制物质，同时由于加样量的增加(传统的PCR反应中样品最大加样量为10μl，而该技术的加样量可达50μl)，从而大大提高了对样品实施检测的灵敏度，克服了常规PCR技术直接检测样品的低灵敏度的缺点。
(2)应用该技术，结合传统PCR技术，可在1天之内达到对植物病原细菌的检测。可以使PCR检测细菌病害样品的灵敏度提高1000倍；检测纯菌的灵敏度提高10倍。
(3)原位免疫吸附PCR技术的信号强度比标准PCR技术要强很多，原位免疫吸附PCR技术的检测结果更加准确。
(4)病原细菌的抗血清制备方法成熟、简单，不需复杂的设备和条件。大多数实验室可以自行制备。由于不需要对样品中的病原菌进行分离和纯化；步骤简单易操作，这对于该项技术的推广和应用有重要意义。用免疫吸PCR技术植物细菌病害样品具重要的实际应用价值。该技术稳定、有效、成本低廉、可以在我国口岸大规模推广。
5)PCR扩增本发明以梨火疫病菌为靶标细菌，利用已经发表的扩增梨火疫病菌的特异性引物进行了该项试验引物A(5’-CGGTTTTTAACGCTGGG-3’)引物B(5’-GGGCAAATACTCGGATT-3’)a.免疫吸附PCR扩增采用50μl反应体系，其中10×PCR buffer 5μl；MgCl2(5mM)3μl；dNTPs(10mM)0.5μl；上、下游引物(20pmol/μl)各0.5μl；Taq酶0.25μl；25μg/ml的BSA 2.5μl；Twen-20 0.5μl；超纯无菌水37.25μl。
b.作为对照比较的常规PCR扩增采用50μl反应体系，PCR反应管不进行包被，其中加入10μl样品，超纯无菌水27.25μl，其余成分用量相同。
PCR扩增程序为93℃预变性5min，93℃变性1min；53℃退火1min；72℃延伸2min；37个循环，最后72℃延伸3min。
实施结果1)标准PCR和原位免疫吸附PCR反应检测模拟样品灵敏度的分析用新鲜的梨枝条样品的PBS浸出液系列稀释的菌液经PCR反应管作免疫吸附技术处理检测梨火疫病菌的灵敏度比直接将用新鲜的梨枝条样品无菌水浸出液系列稀释的菌液加入PCR反应管检测梨火疫病菌的灵敏度提高了1000倍，[传统PCR方法在第7泳道(5×103cfu/ml)就没有信号，而免疫吸附PCR在第9’泳道(5×101cfu/ml)仍有可见条带]。见
图1。2)标准PCR和原位免疫吸附PCR反应检测纯菌灵敏度的分析用0.01M PBS系列稀释的菌液经PCR反应管作免疫吸附技术处理，检测梨火疫病菌的灵敏度比直接将用无菌水系列稀释的菌液加入PCR反应管检测梨火疫病菌的灵敏度提高了10倍，[传统PCR方法在第8泳道(5×102cfu/ml)就没有信号，而免疫吸附PCR在第8’泳道(5×102cfu/ml)仍有可见条带]。见图2。3)原位免疫吸附PCR技术从混合细菌液中和发病样品中检测梨火疫病菌的试验将梨火疫病菌和相关参试菌株(见表1)分别配制成约5×108cfu/ml的细菌悬液(分别用0.01M PBS和无菌水配制)，各取50μl制备混合菌液；将人工接种发病的梨树枝条分别用0.01M PBS和无菌水制备了样品浸出液；进行原位免疫吸附PCR检测，并与标准的PCR技术进行了比较，结果见图3。
由实验结果可以看出，无论是标准PCR技术还是原位免疫吸附PCR技术，其专化性均很好，没有目标细菌的混合菌液和健康枝条中均未扩增出信号，对含有目标细菌的混合菌液和人工接种的梨树枝条样品，两者均有信号，但原位免疫吸附PCR技术的信号强度比标准PCR技术要强很多。
本发明以PCR技术和免疫吸附技术相结合的方法，以梨火疫病菌为靶标细菌进行了实施，即利用梨火疫病菌特异抗血清包被PCR管，吸附靶标细菌，可除去样品中PCR反应抑制因子，同时增加了检测样品体积，大大提高了PCR扩增的灵敏度。
由于这种方法具有简便、快速和成本低廉的特点，在植物检疫和植物病原细菌检测中有广泛的应用前景。表1.参试菌株*细菌种名或试样 菌株代号或样品部位 来源Curtobacteriun flaccumfaciens BR10 本系陈永芳E.coli S17-1本研究室Erwinia amylovora 0056(NCPPB1605) 植物检疫实验所 张乐Erwinia carotovora ssp.carotovora Ecc 本系分子植病研究室Erwinia chrysanthemi Ech 本研究室Erwinia herbicola Eh 河北农科院Pseudomonas fluorescence Pf 本研究室Pseudomonas syringae pv.syringae Pssy 中国农科院 何礼远Ralstonia solanacearum ZH6 本研究室X.axonopodis pv.citri Xac 本研究室X.oryzae pv.oryzae OS14 本研究室人工接种梨火疫病菌(0056)发病 枯死部位下0-10cm 本研究室枝条(接种后30天)健康梨枝条 一年生枝条 本研究室*所有菌株均为标准菌株或实验室经过验证的常用参试菌株
权利要求
1.一种提高PCR技术检测植物病原细菌灵敏度的方法，包括1)病原细菌特异性抗血清的制备利用传统的抗血清制备方法，用戊二醛固定的细菌全菌体或提取并纯化的细菌脂多糖，免疫家兔，制备抗植物病原细菌全菌体或脂多糖(LPS)的专化性抗血清(技术方法成熟，可参考相关文献)，琼脂双扩散方法(ODD)测定效价，选择效价达到或超过1∶32的抗血清；2)PCR反应管的包被配制包被缓冲液Na2CO31.59g；NaHCO32.93g，加蒸馏水至1000ml，pH9.6选取没有经过硅烷化的薄壁PCR反应管(普通PCR管)，用包被缓冲液将抗血清稀释500倍，每管加入50μl稀释抗血清，37℃孵育2小时或4℃过夜；3)PCR反应管的洗涤配制0.01M PBST溶液NaCl 8.0g；Na2HPO42.9g；KH2PO40.2g；KCl 0.2g；Tween-20 0.5ml；加蒸馏水定容至1000ml用灭菌的0.01MPBST溶液洗管三次，每次加入100μl，每次五分钟，最后一次加入100μl的灭菌水，甩干；4)样品中目标细菌的吸附配制0.01M PBS溶液NaCl 8.0g；Na2HPO42.9g；KH2PO40.2g；KCl 0.2g；定容至1000ml每克植物材料加2ml灭菌的0.01M PBS溶液，制备待测样品悬液；将制备的样品悬液加入包被过的PCR反应管中，每管50μl，37℃孵育2小时或4℃过夜，用灭菌的0.01M PBST洗管二次，每次加入100μl，每次五分钟，最后一次加入100μl的灭菌水，甩干，直接用于免疫吸附PCR扩增。
2.根据权利要求1所述的提高PCR技术检测植物病原细菌灵敏度的方法，其特征在于，将上述包被过的PCR反应管直接用于梨火疫病菌的免疫吸附PCR扩增方法为梨火疫病菌的特异性引物引物A(5’-CGGTTTTTAACGCTGGG-3’)引物B(5’-GGGCAAATACTCGGATT-3’)免疫吸附PCR扩增采用上述包被过的PCR反应管，50μl反应体系，其中10×PCR buffer 5μl；5mM MgCl23μl；10mM dNTPs 0.5μl；20pmol/μl的上、下游引物各0.5μl；Taq酶0.25μl；25μg/ml的BSA 2.5μl；Twen-20 0.5μl；超纯无菌水37.25μl；PCR扩增程序为93℃预变性5min，93℃变性1min；53℃退火1min；72℃延伸2min；37个循环，最后72℃延伸3min。
全文摘要
本发明“一种提高PCR技术检测植物病原细菌灵敏度的方法”，属于生物技术领域。专用于对病原细菌进行检测。以梨火疫病菌为靶标细菌，包括病植物原细菌特异性抗血清的制备；PCR反应管的包被；PCR反应管的洗涤；样品中目标细菌的吸附；PCR扩增程序。该技术可以稳定地从纯菌、混合菌液和发病样品中扩增出病原细菌的目标片段，排除了样品中PCR抑制物质的干扰，使检测灵敏度(直接检测样品)提高了1000倍。为提高PCR技术检测病原细菌的灵敏度提供了简便、廉价和高效的技术方法。
文档编号C12Q1/04GK1456686SQ0313764
公开日2003年11月19日 申请日期2003年6月19日 优先权日2003年6月19日
发明者胡白石, 许志刚, 卢玲, 刘凤权 申请人:南京农业大学