专利名称：一种烟草促分裂原活化蛋白激酶基因的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)；具体地说是一种来源于感病烟草品种枯斑三生烟(Nicotiana tabacum var.Samsun NN)的烟草促分裂原活化蛋白激酶基因。
背景技术：
促分裂原活化蛋白(mitogen-activated protein，MAP)激酶，又称为ERK(external-signal regulated protein kinase，外部信号调节蛋白激酶)，是普遍存在于真核生物(烟草)中的一类保守的丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶。近年来研究发现，植物MAP激酶及MAP激酶级联途径在病原反应、机械损伤、水分胁迫、激素以及细胞周期等多种信号的传递中起重要作用。在拟南芥等植物中也发现有许多MAP激酶的成员，因此在植物中肯定也存在多种MAP激酶级联途径。这些途径相互交织构成信号传递的网络，有些信号如干旱、高盐和低温信号可通过同一条MAP激酶级联途径进行传递。有些激酶如SIPK、WIPK、MMK4、ATMPK3等也可能作为多种信号的传递体。这些与多种信号传递有关的激酶可能位于不同信号途径的交叉点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种烟草促分裂原活化蛋白激酶基因，其可揭示壳寡糖诱导植物抗性反应及进行寡糖生物农药应用的研究。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种烟草促分裂原活化蛋白激酶基因，具有序列表中SEQ ID NO 1碱基序列；其编码序列表中SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
本发明具有如下优点1.对生物农药的应用指导作用明显。1)将该基因的cDNA反向插入植物表达载体中，导如根癌农杆菌中并转化烟草，鉴定该基因失活对于植物抗性反应及其他生理活动的影响；2)利用该基因获得基因的启动子，从而获得启动基因表达的转录因子，找到该基因作用的网络。
2.意义长远。我们克隆的烟草MAPK基因是烟草经过壳寡糖处理后早期在烟草叶片中出现的基因，壳寡糖作为生物农药对于植物的抗性具有重要的作用，但是其诱导植物抗病的分子机理还不清楚。根据以往的文献报道，MAPK在参与激素、环境胁迫以及细胞分化等多种信号传导中起作用，因此该基因的克隆对于揭示壳寡糖诱导植物抗性反应的分子信号通路很有价值，并在寡糖生物农药的应用方面具有重要的理论指导意义。
具体实施例方式
蛋白质磷酸化与脱磷酸化几乎涉及所有的生理过程，在细胞对外界信号的持续反应中具有重要作用，功能上具有多样性，调节过程广泛；烟草MAPK是在壳寡糖处理的条件下特异表达的，与烟草的抗性具有重要的关系，通过MAP激酶级联途径可以启动一系列与病原反应、机械损伤、水分胁迫、激素以及细胞周期等多种信号传递传递有关的基因表达；因此烟草MAPK基因是与烟草抗病反应密切相关的基因。
实施例1一种烟草促分裂原活化蛋白激酶基因，其由序列表中SEQ ID NO.1碱基序列编码而成，具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；同系基因一(1)SEQ ID NO.1的信息(参见序列表)(a)序列特征*长度1848碱基对*类型核酸*链型双链*拓朴结构线性(b)分子类型cDNA(C)假设否(d)反义否(e)最初来源枯斑三生烟草(Nicotiana tabacum var.samsun NN)(2)SEQ ID NO.2的信息(参见序列表)(a)序列特征*长度615氨基酸*类型氨基酸*链型单链*拓朴结构线性(b)分子类型蛋白质实施例2烟草促分裂原活化蛋白激酶基因具体制备过程如下1.壳寡糖(50～200mg/l)喷施烟草叶片。
2.取处理8小时后的烟草叶片提取总RNA，对照也同时取样；利用LIFE TECHNOLOGIES GIBCOBRL公司的Trizol试剂提取RNA的方法加以改进①取50～300mg烟草叶片组织，加1mlTrizol，匀浆器均匀；②室温静止5分钟，使蛋白充分变性；③加0.2ml氯仿，振荡15秒，静止2～3分钟，4℃，11000rpm/min离心15分钟；④将上清转移至一新的EP管中，加入0.5ml异丙醇，静止10分钟，4℃，11000rpm/min离心10分钟；⑤倒去上清，用1ml 75％乙醇洗RNA，4℃，7500rpm/min离心5分钟；⑥干燥RNA(不要完全干燥，否则极难溶)，溶于20ul RNase-free水中；⑦甲醛变性凝胶电泳检测总RNA的完整性。
3.利用锚定引物进行逆转录反应利用锚定引物进行逆转录反应，反应条件烟草叶片总RNA2ul(0.4ug)，锚定引物2ul(2uM)，混匀后70℃，5min，放到冰上，添加H2O4.8ul，5×buffer 4ul，dNTP(250uM each)2ul，DTT(100mM)2ul，Super ScriptTMII RT0.2ul，混匀后42℃，5min，55～60℃，50Min，70℃，15Min，4℃保存；锚定引物TMR-T7(dT12)AP6序列-5′ACGACTCACTATAGGGCT(12)CC3′4.利用荧光标记的锚定引物和随机引物进行mRNA差别显示(DDRT-PCR)反应随机引物M13r-ARP1序列5′*ACAATTTCACACAGGACGACTCCAAG3′，PCR反应体系10×buffer 1ul，MgCl2(25mM)1.5ul，dNTP(250uM)2uM，5′TMR-T7(dT12)AP6(2uM)1.75ul，3′M13r-ARP1(5uM)0.7ul，RT-Mix 1ul，TaKaRA ExTaq(5unit/ul)0.1ul，H2O 1.95ul，总反应体积10ul；反应条件95℃ 2Min；92℃ 15秒，50℃ 30秒，72℃ 2Min，4个循环；92℃ 15秒，55～60℃ 30秒，72℃ 2Min，30个循环；72℃ 10Min，4℃保存，用锡箔纸包上，-20℃备用；5.聚丙烯酰胺凝胶电泳取5ul PCR产物上样用Beckmen的genomyx LRTMDNA Sequencer电泳装置(GX100)进行电泳，电压3000V，恒功率100W，跑胶5小时；电泳结果用genomyx SCTMFluorescent Imaging Scanner(FL 100-4)进行分析6.回收差别条带，进行PCR扩增50mg/l壳寡糖处理8h的烟草叶片与对照相比，共发现差别条带22条(在聚丙烯酰胺凝胶电泳图中进行比较)，其中16条扩增后回收并连接到T-vector上测序。测序结果利用Blast软件在Genbank中进行序列比较发现1号片段与拟南芥的促分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)具有63％核苷酸同源性；因此决定要得到1号片段的cDNA全长。从凝胶中回收1号差别条带，加入50ul ddH2O中，利用二次扩增引物进行PCR扩增，引物序列为M5′AGCGGATAACAATTTCACACAGGA 3′T5′GTAATACGACTCACTATAGGGC 3′反应体系为10×Buffer 4ul，MgCl2(25mM)2.4ul，dNTP(250uM)3.2ul，引物M(2uM)4ul，引物T(2uM)4ul，TaKaRA ExTaq(5unit/ul)0.4ul，ddH2O 18.9ul，差别条带样品6ul，总反应体积40ul；反应条件为92℃ 2Min；92℃ 15秒，50℃ 30秒，72℃ 2Min，4个循环；92℃ 15秒，55～60℃ 30秒，72℃ 2Min，30个循环；72℃ 10Min，4℃保存；7.用TaKaRa的凝胶回收kit回收PCR产物(1)取10ul PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳；(2)在紫外灯下切出含有目的PCR片段的琼脂糖凝胶，切碎胶块，称取重量，大约100mg；(3)向胶块中加入300ul DR-I Buffer，均匀混合后75℃加热融化胶块6-10分钟，期间间断振荡混合；(4)向上述胶块融化液中加入150ul的DR-II Buffer，均匀混合；(5)将试剂盒中的Spin Column按置于Collection Tube上；(6)将混合液转移到Spin Column中，3,6000rpm离心1分钟，弃滤液；(7)将500ul的Rinse A加入Spin Column中，3,6000rpm离心30秒，弃滤液；(8)将700ul的Rinse B加入Spin Column中，3,6000rpm离心30秒，弃滤液；(9)重复操作步骤8，12,000rpm离心1分钟；(10)将Spin Column按置于1.5ml的新离心管中，在Spin Column膜的中央处加入25ul的ddH2O；(11)12,000rpm离心1分钟洗脱DNA；(12)取3ul电泳检测浓度。
8.利用TaKaRa公司的T-vector kit将PCR产物连接到载体上，转化大肠杆菌JM109。
连接条件2×连接Buffer 5ul，回收的PCR产物4ul，T载体1ul，16℃连接过夜。
大肠杆菌JM109的转化A.氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞(1)-20℃冷冻的大肠杆菌JM109于冰上解冻，取200μl接到3ml LB液体培养基中，37℃，200转/分，振荡过夜；(2)取500μl菌液接到50ml LB液体培养基中，继续摇床培养2～3小时，直到OD600≈0.5；(3)在无菌条件下，将菌液转移到4℃预冷的50ml离心管中，冰浴30分钟，于4℃，6000转/分，离心10分钟，以回收细胞；(4)倒出培养液，将管倒置1分钟，以使最后残留的痕量培养液流尽；用10ml 4℃预冷的0.1M CaCl2悬浮沉淀(无菌操作)，冰浴20分钟，离心，倒出培养液(同上)；
(5)用2ml 4℃预冷的0.1M CaCl2重新悬浮沉淀，用冷却的无菌吸头将感受态细胞悬液按200μl/管分装到无菌的Eppendorf管中，混匀，4℃保存24～48小时；B.转化(1)取连接产物5μl，加入预冷的200μl大肠杆菌JM109感受态细胞中，轻轻混匀，立即置冰上30分钟；(2)将离心管置42℃恒温水浴中热激90秒钟，不要摇动Eppendorf管；(3)快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却3～5分钟；(4)加入800μl无附加抗生素的LB液体培养基中，混匀，37℃，100转/分45分钟；(5)将4μl IPTG(200mg/ml)、40ul X-gal(20mg/ml)和200μl转化菌混匀，涂布于含Amp 50mg/lL的LB平板。37℃倒置培养16小时；9.挑取转化克隆，提取质粒，利用EcoRI和HindIII进行酶切，鉴定阳性克隆A.随机挑取6个阳性菌落(白色)，碱法小量制备质粒DNA。
(1)挑取单菌落，接种到Amp 50mg/lL的3ml LB培养液中，37℃，200转/分振荡培养过夜；(2)转移约1.2ml过夜培养液到1.5ml离心管中，在13000rpm离心1分钟，收集菌体，弃上清液后，再离心5秒钟，吸去剩余上清；(3)每个离心管中加入预冷的溶液I 100μl(50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA)在混和器上振荡使菌体充分悬浮、分散、混匀；(4)每管各加入200μl新配制的溶液II(0.2N NaOH，1％SDS，现用现配)，缓慢倒转几次混匀，处理5分钟，使细胞膜完全裂解；(5)每管各加150μl预冷的溶液III(3mol/L钾盐，5mol/L醋酸(pH4.8))，倒转几次混匀，冰浴10分钟；(6)在13000rpm离心10分钟，沉淀染色体DNA，及不溶的变性蛋白，取上清；(7)上清液用等体积的Tris-HCl饱和苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提1-2次；(8)上清加等体积的异丙醇，混匀后室温放置10分钟；(9)在13000rpm离心10分钟，得到质粒DNA沉淀；(10)用70％乙醇洗一次，13000rpm离心2分钟，取沉淀，干燥；(11)沉淀溶于20μlTE(pH8.0)溶液中，加入1μlRNase(DNase-free)(10mg/ml)，37℃，30分钟。-20℃放置待用。
B.酶切鉴定重组子分别将6个质粒用进行酶切鉴定；酶切反应体系(20ul)10×Buffer M 2ul，EcoRI(20u/ul)0.5ul，HindIII(12u/ul)0.5ul，质粒2ul，ddH2O 15ul；酶切反应条件37℃，2-3小时。
鉴定结果1％琼脂糖电泳检测，在6个克隆中，有2个有插入，为所需要的重组子。
10.将含有差异片段的重组质粒进行序列分析，在联合基因科技(集团)有限公司用3700，Bigdye-Terminator测序仪进行序列分析；测序结果如下CGACTCCAAGGACTAATATGACCATCACCGGGAAATTGAATCCTGAAGATGATACCATTTTAATTAAAGTGCAGATTGAGGATAAAAAAGGTGATGTTAGGAATGTGTATTTCCCGTTCGACATTGTAACTGACACCCCAACGGAGGTCGCAAATGAAATGGTGAAGGAATTAGAAATTACAGACTGGAAACCATATGAAACAGCTAATATGATTGACGGAGAGATATCTGGTTTGGTACCTCAGTGGAAGAAATGGAATCAGTTTGAATCCGCCGATTACCATGTGCTAAGCTATAAAGATGACGATAATGATCACCATAACCCTTTCCGAGGTTTCTCATCTTGCTCATCTTCCCAAGTGTCATTGTCAGGTGATATGTTTGACGACACCAGCTCCCAGAGCTCATCACACTCAGCAAATTATTCCAACTTCAATTACTTCTCTGATGATGAGAATGATCCTGTGACGACCTCTACAAAACAAAGTCAGCCAGCTACTGCAATTAACCACCATACTTCCCGGTTTTGTCCCGGGGAAAACTCAAGCACTGGGCAGTCTTTAGCAAGAATGTGCTACAAGCAGTGCAAAGATATGCTAGAATTAAAAAGAACTTCTTCCACTTCTAAAGAGAAGGGCAAAGTTGATACGCGTAGACTAACAAGGAACAAGTCCTTGGTGGATATGCGCAGCCAGTTGCTGCACAAGACATTGGTGGAGGAAGTGCACAAGAGACGATTGTTCAAGACGGTTGGCGCTGTGGAAAATATTGGGTTTCAACAACCTTATGAGGATTCAAGAAGGAGTCCTCAATCAATGAATTCTACTTATTCCATGAGATTGTGGAATGATGGGAAGGGACAAGGTCACAAACCAAGAAGACATTGATTTCTTTTCCTGAATATATATCTTAAATGTACGAGGATATATGCATATGCTAGTTTTAAGCAGGTCCGAGTTTTGAATTAGGCAGGTGTAAATGGCAATAAAAGTGTTTGTTCAAATTTTGTACATTTGTACCTTATAGCAATGTAAGAATAAACATCCCTTGCGCTTACATGCTCTCATCAACAGAATTCCAAAGGTACCTAGCGGAAAAAAAAAAAA11.测序结果利用blast软件在Genbank中进行同源比较mRNA差别显示试验获得的1号片段经测序后，利用Blast软件在Genbank中进行序列比较，发现与拟南芥的促分裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase，MAPK)具有63％核苷酸同源性。
12.利用CLONTECH公司的5′RACE试剂盒获得烟草MAPK的cDNA全长。
A.5′RACE第一链cDNA合成(5′RACE-Ready cDNA)(1)0.5ml反应管中添加下列成分1-3ul总RNA样品(1ug，用50mg/l壳寡糖喷施烟草叶片8小时后提取)1ul 5′-CDS primer1ul SMART II oligo(2)添加无菌水到每管终体积5ul，混匀反应成分(3)70℃，2min(4)放置冰上2min，Spin离心管(5)添加下列成分到反应管中2ul 5×First-Strand buffer1ul DTT(20mM)1ul dNTP Mix(10mM)1ul PowerScript Reverse Transcriptase
10ul 总反应体积(6)混匀反应成分，在空气浴保温42℃，1.5h(7)用100ul Tricine-EDTA buffer稀释反应产物(8)72℃加热反应管7min，-20℃储存B.根据3′端的核苷酸序列，设计基因特异引物，进行PCR反应GspM-5′ CGGGACAAAACCGGGAAGTATGG 3′反应体系34.5ul H2O5ul 10×Advantage 2 PCR Buffer1ul dNTP Mix(10mM)1ul 50×Advantage 2 Polymerase Mix2.5ul 5′RACE-Ready cDNA5ul UPM(10×)1ul GSPM(10uM)50ulfinal volume反应条件5cycles94℃ 5sec，72℃ 3min5cycles94℃ 5sec，60～70℃ 10sec， 72℃ 3min25cycles94℃ 5sec，60～70℃ 10sec，72℃ 3min72℃ 5min，4℃保存PCR反应结果利用引物UPM和GSPM扩增出一条大约1400C.嵌套PCR反应结果设计嵌套引物nGspM，进行PCR反应nGspM序列5′GCGACCTCCGTTGGGGTGTCAGT 3′反应体系34.5ul H2O5ul10×Advantage 2 PCR Buffer1uldNTP Mix(10mM)1ul50×Advantage 2 Polymerase Mix2.5ul GspM引物PCR扩增产物5ulUPM(10×)1ulnGSP M(10uM)50ul final volume反应条件5cycles94℃ 5sec，72℃ 3min5cycles94℃ 5sec，60～70℃ 10sec，72℃ 3min25cycles94℃ 5sec，60～70℃ 10sec，72℃ 3min72℃ 5min，4℃保存PCR反应结果利用引物UPM和nGSPM扩增出一条大约1100bp的条带，略小于引物UPM和GSPM扩增出的条带。
D.电泳并回收UPM和nGSPM扩增条带E.将回收的扩增条带连接到T载体上，转化大肠杆菌JM109，筛选并挑取阳性克隆。
E.用EcoRI和HindIII进行酶切鉴定，挑选出有插入的克隆。
G.测序分析含有插入片段的质粒测序结果AACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGGAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGGGAACTCTTTTTTAAGTAGATCATAAAAAAGATGAGTAATTAACTTCTCTTTTCAAGTTTCAACTTATACCAACTTTCTTGATTAACTGAAACTCTTGTAAGAATCAATTCAATATGTACAAGGGACGATTTTCAGAACACTGTAAAGAATCAGAGGATGATCTTAGATATGTTGAAATTGATCCTACTGCTCGTTATGGACGTTTCGAGGAAGTTTTGGGAAAAGGGGCAATGAAAACAGTGTATAGAGCAATTGATGAGTTGCTAGGTATGGAAGTGGCATGGAACCAAATTAAACTAAATGATTTGCTTCATTCACCAGAGGATATGGAGAGGCTTTACTCTGAAGTTCATCTGCTTAGCACTCTCAATCATCATTCTATCATGAGATTCTATACTTCTTGGATTGATGTTGAACACAGGACCTTTAATTTCATTACCGAGATGTTCACCTCCGGTACTCTCCGAGGATACAGAAAGAAGTATCAGCGAGTAGACATTCGAGCTATAAAGAATTGGGCGCGCCAAATACTGGAAGGTCTTGTTTATTTACACGAACATGATCCGCCAGTTATCCATCGAGACCTGAAGTGTGACAACATATTTGTTAACGGTCATCTTGGACAAGTGAAAATTGGGGACTTGGGCTTGGCAGCAATTCTTCGTGGATCACAGAGAGCGCACAGTGTTATAGGGACACCTGAGTTCATGGCACCGGAACTATACGAGGAGAACTACAATGAGCTAGTCGATGTATATTCATTTGGCATGTGCATGTTAGAGATGCTTACGGGTGAATATCCATACAGTGAATGTGTTAACCCTGCACAAATATACAAAAAAGTGACCTCTGGTAAGAGGCCTCGGGCATTTTATAAAGTTCAAGATTTGGATGCACAAAGATTTATTAGGAAATGCTTGGAGCCAGCATCAAAAAGATTATCAGCTAAAGAACTAATGGTTGATCCCTTCCTTGTATTTAATAATGTTGATGGTAAGTCGGTAACAATGATGCAACTTCAAAAGCCTTTCTTGAATGATAAAATTGCTATCGAGGACCTCCACTTGAACGAGGACGCTCCAAGGACTAATATGACCATCACCGGGAAATTGAATCCTGAAGATGATACCATTTTAATTAAAGTGCAGATTGCGGATAAAAAAGGTGATGTTAGGAATGTGTATTTCCCGTTCGACATTGTAACTGACACCCCAACGGAGGTCGCAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGTCATAH.根据测序结果和1号片段的测序结果，设计一对用于扩增MAPKcDNA全长的引物。
引物序列为MAPK3-5’＞GG CTGCAG CGGGGAACTCTTTTTTAAGTAG＜3’MAPK2-5’＞GGGGATCCGCATGTAAGCGCAAGGGATG＜3’PCR反应体系36.5ul H2O5ul 10×Buffer(Mg2+plus)1ul dNTP Mix(10mM)0.5ul TaKaRa LA Taq(5u/ul)1ul MAPK2(10uM)1ul MAPK3(10uM)5ul 5′RACE-Ready cDNA50ulfinal volumePCR反应条件94℃ 5min；94℃ 1Min，50～60℃ 1.5Min，72℃ 1.5min，30cycles；72℃10minPCR反应结果扩增出一条大约2100bp的条带；I.电泳并回收MAPK2和MAPK3的扩增条带
J.将回收的扩增条带连接到T载体上，转化大肠杆菌JM109，筛选并挑取阳性克隆。
K.用Bam HI和Pst I进行酶切鉴定，挑选出有插入的克隆。
L.测序分析含有插入片段的质粒13.烟草MAPK基因的核苷酸序列分析结果核苷酸序列(114～1961部分为cDNA编码序列)GAACTCTTTTTTAAGTAGATCATAAAAAAGATGAGTAATTAACTTCTCTTTTCAAGTTTCAACTTATACCAACTTTCTTGATTAACTGAAACTCTTGTAAGAATCAATTCAATATGTACAAGGGACGATTTTCAGAACACTGTAAAGAATCAGAGGATGATCTTAGATATGTTGAAATTGATCCTACTGCTCGTTATGGACGTTTCGAGGAAGTTTTGGGAAAAGGGGCAATGAAAACAGTGTATAGAGCAATTGATGAGTTGCTAGGTATGGAAGTGGCATGGAACCAAATTAAACTAAATGATTTGCTTCATTCACCAGAGGATATGGAGAGGCTTTACTCTGAAGTTCATCTGCTTAGCACTCTCAATCATCATTCTATCATGAGATTCTATACTTCTTGGATTGATGTTGAACACAGGACCTTTAATTTCATTACCGAGATGTTCACCTCCGGTACTCTCCGAGGATACAGAAAGAAGTATCAGCGAGTAGACATTCGAGCTATAAAGAATTGGGCGCGCCAAATACTGGAAGGTCTTGTTTATTTACACGAACATGATCCGCCAGTTATCCATCGAGACCTGAAGTGTGACAACATATTTGTTAACGGTCATCTTGGACAAGTGAAAATTGGGGACTTGGGCTTGGCAGCAATTCTTCGTGGATCACAGAGAGCGCACAGTGTTATAGGGACACCTGAGTTCATGGCACCGGAACTATACGAGGAGAACTACAATGAGCTAGTCGATGTATATTCATTTGGCATGTGCATGTTAGAGATGCTTACGGGTGAATATCCATACAGTGAATGTGTTAACCCTGCACAAATATACAAAAAAGTGACCTCTGGTAAGAGGCCTCGGGCATTTTATAAAGTTCAAGATTTGGATGCACAAAGATTTATTAGGAAATGCTTGGAGCCAGCATCAAAAAGATTATCAGCTAAAGAACTAATGGTTGATCCCTTCCTTGTATTTAATAATGTTGATGGTAAGTCGGTAACAATGATGCAACTTCAAAAGCCTTTCTTGAATGATAAAATTGCTATCGAGGACCTCCACTTGAACGAGGACGCTCCAAGGACTAATATGACCATCACCGGGAAATTGAATCCTGAAGATGATACCATTTTAATTAAAGTGCAGATTGCGGATAAAAAAGGTGATGTTAGGAATGTGTATTTCCCGTTCGACATTGTAACTGACACCCCAACGGAGGTCGCAAATGAAATGGTGAAGGAATTAGAAATTACAGACTGGAAACCATATGAAACAGCTAATATGATTGACGGAGAGATATCTGGTTTGGTACCTCAGTGGAAGAAATGGAATCAGTTTGAATCCGCCGATTACCATGTGCTAAGCTATAAAGATGACGATAATGATCACCATAACCCTTTCCGAGGTTTCTCATCTTGCTCATCTTCCCAAGTGTCATTGTCAGGTGATATGTTTGACGACACCAGCTCCCAGAGCTCATCACACTCAGCAAATTATTCCAACTTCAATTACTTCTCTGATGATGAGAATGATCCTGTGACGACCTCTACAAAACAAAGTCAGCCAGCTACTGCAATTAACCACCATACTTCCCGGTTTTGTCCCGGGGAAAACTCAAGCACTGGGCAGTCTTTAGCAAGAATGTGCTACAAGCAGTGCAAAGATATGCTAGAATTAAAAAGAACTTCTTCCACTTCTAAAGAGAAGGGCAAAGTTGATACGCGTAGACTAACAAGGAACAAGTCCTTGGTGGATATGCGCAGCCAGTTGCTGCACAAGACATTGGTGGAGGAAGTGCACAAGAGACGATTGTTCAAGACGGTTGGCGCTGTGGAAAATATTGGGTTTCAACAACCTTATGAGGATTCAAGAAGGAGTCCTCAATCAATGAATTCTACTTATTCCATGAGATTGTGGAATGATGGGAAGGGACAAGGTCACAAACCAAGAAGACATTGATTTCTTTTCCTGAATATATATCTTAAATGTACGAGGATATATGCATATGCTAGTTTTAAGCAGGTCCGAGTTTTGAATTAGGCAGGTGTAAATGGCAATAAAAGTGTTTGTTCAAATTTTGTACATTTGTACCTTATAGCAATGTAAGAATAAACATCCCTTGCGCTTACATGCTCTCATCAACAGAATTCCAAAGGTACCTAGCGGAAAAAAAAAAAA蛋白质氨基酸序列MYKGRFSEHCKESEDDLRYVEIDPTARYGRFEEVLGKGAMKTVYRAIDELLGMEVAWNQIKLNDLLHSPEDMERLYSEVHLLSTLNHHSIMRFYTSWIDVEHRTFNFITEMFTSGTLRGYRKKYQRVDIRAIKNWARQILEGLVYLHEHDPPVIHRDLKCDNIFVNGHLGQVKIGDLGLAAILRGSQRAHSVIGTPEFMAPELYEENYNELVDVYSFGMCMLEMLTGEYPYSECVNPAQIYKKVTSGKRPRAFYKVQDLDAQRFIRKCLEPASKRLSAKELMVDPFLVFNNVDGKSVTMMQLQKPFLNDKIAIEDLHLNEDAPRTNMTITGKLNPEDDTILIKVQIADKKGDVRNVYFPFDIVTDTPTEVANEMVKELEITDWKPYETANMIDGEISGLVPQWKKWNQFESADYHVLSYKDDDNDHHNPFRGFSSCSSSQVSLSGDMFDD
TSSQSSSHSANYSNFNYFSDDENDPVTTSTKQSQPATAINHHTSRFCPGENSSTGQSLARMCYKQCKDMLELKRTSSTSKEKGKVDTRRLTRNKSLVDMRSQLLHKTLVEEVHKRRLFKTVGAVENIGFQQPYEDSRRSPQSMNSTYSMRLWNDGKGQGHKPRRH*(1)烟草枯斑三生烟(Nicotiana tabacum var.samsun NN)MAPK基因的cDNA全长为1848bp，编码615个氨基酸和一个TGA终止密码子。
(2)同源分析表明，烟草MAPK基因与拟南芥的MAPK基因的氨基酸同源性为80％。
SEQUENCE LISTING<110> 中国科学院大连化学物理研究所<120> 一种烟草促分裂原活化蛋白激酶基因<130>
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<221> CDS<222> (114)..(1961)<223>
<400> 1gaactctttt ttaagtagat cataaaaaag atgagtaatt aacttctctt ttcaagtttc60aacttatacc aactttcttg attaactgaa actcttgtaa gaatcaattc aat atg 116Met1tac aag gga cga ttt tca gaa cac tgt aaa gaa tca gag gat gat ctt 164Tyr Lys Gly Arg Phe Ser Glu His Cys Lys Glu Ser Glu Asp Asp Leu5 10 15aga tat gtt gaa att gat cct act gct cgt tat gga cgt ttc gag gaa 212Arg Tyr Val Glu Ile Asp Pro Thr Ala Arg Tyr Gly Arg Phe Glu Glu20 25 30gtt ttg gga aaa ggg gca atg aaa aca gtg tat aga gca att gat gag 260Val Leu Gly Lys Gly Ala Met Lys Thr Val Tyr Arg Ala Ile Asp Glu35 40 45ttg cta ggt atg gaa gtg gca tgg aac caa att aaa cta aat gat ttg 308Leu Leu Gly Met Glu Val Ala Trp Asn Gln Ile Lys Leu Asn Asp Leu50 55 60 65ctt cat tca cca gag gat atg gag agg ctt tac tct gaa gtt cat ctg 356Leu His Ser Pro Glu Asp Met Glu Arg Leu Tyr Ser Glu Val His Leu70 75 80
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<211> 615<212> PRT<213> 枯斑三生烟草<400> 2Met Tyr Lys Gly Arg Phe Ser Glu His Cys Lys Glu Ser Glu Asp Asp1 5 10 15Leu Arg Tyr Val Glu Ile Asp Pro Thr Ala Arg Tyr Gly Arg Phe Glu20 25 30Glu Val Leu Gly Lys Gly Ala Met Lys Thr Val Tyr Arg Ala Ile Asp35 40 45Glu Leu Leu Gly Met Glu Val Ala Trp Asn Gln Ile Lys Leu Asn Asp50 55 60Leu Leu His Ser Pro Glu Asp Met Glu Arg Leu Tyr Ser Glu Val His65 70 75 80Leu Leu Ser Thr Leu Asn His His Ser Ile Met Arg Phe Tyr Thr Ser85 90 95Trp Ile Asp Val Glu His Arg Thr Phe Asn Phe Ile Thr Glu Met Phe100 105 110Thr Ser Gly Thr Leu Arg Gly Tyr Arg Lys Lys Tyr Gln Arg Val Asp115 120 125Ile Arg Ala Ile Lys Asn Trp Ala Arg Gln Ile Leu Glu Gly Leu Val130 135 140Tyr Leu His Glu His Asp Pro Pro Val Ile His Arg Asp Leu Lys Cys145 150 155 160Asp Asn Ile Phe Val Asn Gly His Leu Gly Gln Val Lys Ile Gly Asp165 170 175
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1.一种烟草促分裂原活化蛋白激酶基因，其特征在于具有序列表中SEQ ID NO 1碱基序列。
2.按照权利要求1所述的烟草促分裂原活化蛋白激酶基因，其特征在于其编码序列表中SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
全文摘要
本发明涉及促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)；具体地说是一种来源于感病烟草品种枯斑三生烟(Nicotiana tabacum var.Samsun NN)的烟草促分裂原活化蛋白激酶，其由序列表中SEQ ID NO 1碱基序列编码而成，具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。本发明优点如下对生物农药的应用指导作用明显；该基因的克隆对于揭示壳寡糖诱导植物抗性反应的分子信号通路很有价值，并在寡糖生物农药的应用方面具有重要的理论指导意义。
文档编号C12N9/12GK1603414SQ0313503
公开日2005年4月6日 申请日期2003年9月29日 优先权日2003年9月29日
发明者冯斌, 杜昱光, 白雪芳 申请人:中国科学院大连化学物理研究所