专利名称：马立克氏病毒疫苗毒cv1988株vp22基因的利记博彩app
技术领域：
本发明属于生物技术制药工业中的基因工程生产药物的技术领域。
背景技术：
过去无论是核酸疫苗还是蛋白质免疫一个明显的缺陷是不能像病毒性载体疫苗那样在体内扩增和扩散，人们很难将基因引入细胞，更难将它们定向地导入特定类型的细胞。即便被导入，它们也很难长久滞留和受控表达，且会产生毒副作用。Green M等(1988)和Frankel A等(1988)在分别研究人I型获得性免疫缺陷症(HIV-1)的TAT蛋白时，惊喜地发现在体外培养细胞的培养基中加入TAT以后，该蛋白可迅速进入细胞，并定位于核内，且无任何毒副作用。随后，一些天然和人工合成的蛋白质或多肽相继被发现具有传导作用，并迅速应用于人类疾病的基础研究和治疗领域，尤其在恶性肿瘤治疗方面，大量抑癌蛋白已被成功传导，在诱导恶性肿瘤细胞凋亡中卓有成效。
现在已经发现三种高效的PTDs，分别来自果蝇的同源异型转录因子Antp、单纯疱疹病毒(HSV-1)的被膜蛋白VP22和HIV-1转录激活因子TAT。由于它们能够引导其所承载的物质通过浆膜，并在细胞内积累，所以将它们统称为蛋白质传导域(PTDs)。
由于通过PTDs带入细胞的分子基本上保留了它们各自原有的性质，从而使PTDs的研究价值更为广泛。如在蛋白质结构与功能研究和应用中，通过将信号转导分子引入细胞，观察它们对细胞内信号过程的作用，有助于了解信号传递的机制；而将癌基因抑制蛋白引入肿瘤细胞，能够进一步了解细胞癌变的分子机理，以找到在分子水平治疗肿瘤的方法。同样，将基因调节因子、转录调节因子等引入细胞，可以更深入地揭示细胞分子机理。
马立克氏病(Marek’s disease virus，MDV)是一种导致鸡免疫抑制、神经麻痹、T细胞肿瘤为特征的疱疹病毒，在基因组结构、核酸序列的分类上属于α疱疹病毒。MDV的基因序列分析结果表明，MDV存在与组成α疱疹病毒代表株HSV-1被膜蛋白的主要基因UL46～UL49相应的同源序列。MDV血清I型(MDV-1)GA病毒的UL49h基因编码249个氨基酸残基的病毒被膜蛋白(tegument viral protein 22，VP22)，分子量约27.6kD，为MDV-1增殖所必需。最早由Yanagida N等(1993)从MDV-1GA株的一段长为8.4kb的BamHI-EcoRI片段DNA中得到。Fabien D等(2000)指出，MDV-1 VP22存在PTD，大致范围在N’端38-188aa处。VP22介导的传导过程不会破坏细胞膜的结构，因为它们在让融合蛋白穿越的同时并没有促进同时存在于培养液中的其他非VP22融合分子穿越。且在VP22介导治疗性分子穿越细胞膜时，也避免不让其他无关分子进入或离开细胞。目前，利用VP22传导的蛋白有p53、p27、GFP、YFP、EGFP、流感病毒的NA、BH3、EBV的EBNV-1和胸苷激酶(Tk)、胞嘧啶脱氨基酶(CD)等。现已有利用MDV-1的VP22来传导目的分子的报道，且被证实可增强DNA疫苗的细胞免疫反应。如Hung CF等(2002)发现将人16型乳头瘤病毒E7抗原与VP22融合表达的DNA疫苗免疫，可增强E7特异性的CD8+T细胞活性。
发明内容
本发明目的在于研究获得一种能在人或动物体内扩增、扩散，并令其定向地导入特定类型细胞的蛋白质传导域基因，以及与目的基因融合表达。
本发明用PCR法从CVI988/Rispens弱毒疫苗株感染的鸭胚或鸡胚成纤维细胞(DEF)基因组DNA扩增UL49h基因片段，获得VP22基因，大小为732bp。
马立克氏病毒疫苗毒CVI988株VP22基因的核苷酸序列是ATGGGGGATTCTGAAAGGCGGAAATCGGAACGGCGTCGTTCCCTTGGATATCCCTCTGCATATGATGACGTCTCGATTCCTGCTCGCAGACCATCAACACGTACTCAGCGAAATTTAAACCAGGATGATTTGTCAAAACATGGACCATTTACCGACCATCCAACACAAAAATACAAATCGGCGAAAGCCGTATCGGAAGACGTTTCGTCTACCACCCGGGGTGGCTTTACAAACAAACCCCGTGCCAAGCCCGGGGTCAGAGCTGTACAAAGTAATAAATTCGCTTTCAGTACGGCTCCTTCATCAGCATCTAGCACTTGGAGATCAAATACAGTGGCATTTAATCAGCGTATGTTTTGCGGAGCGGTTGCAACTGTGGCTCAATATCACGCATACCAAGGCGCGCTCGCCCTTTGGCGTCAAGATCCTCCGCGAACAAATGAAGAATTAGATGCATTTCTTTCCAGAGCTGTCATTAAAATTACCATTCAAGAGGGTCCAAATTTGATGGGGGAAGCCGAAACCTGTGCCCGCAAACTATTGGAAGAGTCTGGATTAT
CCCAGGGGAACGAGAACGTAAAGTCCAAATCTGAACGTACAAGACGCGGCGGTGAAATTGAAATCAAATCGCCAGATCCGGGATCTCATCGTACACATAACCCTCGCACTCCCGCAACTTCGCGTCGCCATCATTCATCCGCCCGCGGATATCGTGGCAGTGATAGCGAATAA将上述VP22基因测序分析，与经典MDV强毒GA株比较，确定弱毒株CVI988的UL49h存在3个定点突变(第172、244和733位bp)和一个缺失性突变，缺失的氨基酸为200TTKSER205，该位点亲水性强，用Jarmeson-Wolf法分析，该位点位于VP22主要的抗原决定簇区，有利于CVI988 VP22基因的开发与利用。利用CVI988 VP22基因或部分基因序列开发传导人或动物病原体主要保护性抗原、传导人或动物治疗性药物、提高目的蛋白的免疫保护效果或增强药物的疗效。
本发明还在于所述核苷酸序列的马立克氏病毒疫苗毒CVI988株VP22基因与目的基因融合表达、基因的蛋白传导域传导人或动物病原体主要保护性抗原的应用、基因的蛋白传导域传导人或动物治疗性药物的应用、基因提高目的蛋白的免疫保护效果的应用以及基因增强药物的疗效的应用。
发明实施例1.MDV VP22基因的克隆1.1提取基因组DNA用洁净鸭胚制备的DEF扩增MDV GA株、Md5、Md11、RB1B、CVI988、FC126、Z4、648A，待细胞90％以上皆出现CPE时，0.25％胰酶消化，0.01MPBS(pH7.2)洗涤一次，将其悬浮于500μl消化液(100mM NaCl，25mM EDTA，10mM Tris～Cl pH8.0，0.5％SDS，0.1mg/ml proteinase K)中，37℃消化4hr或过夜。消化结束后，用等量的TE饱和苯酚/氯仿-异戊醇混匀，充分振荡，离心抽提2次，并再次经氯仿抽提1次。抽提完后，用2倍体积的无水乙醇-20℃沉淀30min或过夜，以12000rpm离心20min，将沉淀以70％乙醇洗涤，空气中自然干燥后，悬浮于50μl双蒸H2O中，-20℃冻存。
1.2 VP22(ULA9基因的扩增)针对MDV homologue of UL49 of HSV-1(VP22)的基因序列特点，设计上游和下游引物上游引物VP22F(P1)5’-GCC GGA TCC ATG GGG GAT TCT G-3’；下游引物VP22RI(P2)5’-GCC GAA TTC GCT ATC ACT GCT A-3’。
常规PCR扩增。
反应组成5μl 10 PCR buffer，25mM dNTP 1μl，25mM MgCl210μl，Taq DNA聚合酶(4U)1μl，50pM primers 1μl 2，模板DNA(0.1ng)1μl，加水至50μl，滴加一滴矿物油(液体石蜡)防蒸发。
反应条件95℃变性5min，以下步骤30个循环(94℃变性1min，55℃退火2min，72℃延伸3min)，随后经72℃延长10min，产物置4℃或-20℃。取5μl PCR产物，1.0％琼脂糖凝胶电泳(55V，1.5hr)，Marker是1kbλDNA Ladder。
权利要求
1.马立克氏病毒疫苗毒CVI988株VP22基因，其特征在于核苷酸序列为ATGGGGGATTCTGAAAGGCGGAAATCGGAACGGCGTCGTTCCCTTGGATATCCCTCTGCATATGATGACGTCTCGATTCCTGCTCGCAGACCATCAACACGTACTCAGCGAAATTTAAACCAGGATGATTTGTCAAAACATGGACCATTTACCGACCATCCAACACAAAAATACAAATCGGCGAAAGCCGTATCGGAAGACGTTTCGTCTACCACCCGGGGTGGCTTTACAAACAAACCCCGTGCCAAGCCCGGGGTCAGAGCTGTACAAAGTAATAAATTCGCTTTCAGTACGGCTCCTTCATCAGCATCTAGCACTTGGAGATCAAATACAGTGGCATTTAATCAGCGTATGTTTTGCGGAGCGGTTGCAACTGTGGCTCAATATCACGCATACCAAGGCGCGCTCGCCCTTTGGCGTCAAGATCCTCCGCGAACAAATGAAGAATTAGATGCATTTCTTTCCAGAGCTGTCATTAAAATTACCATTCAAGAGGGTCCAAATTTGATGGGGGAAGCCGAAACCTGTGCCCGCAAACTATTGGAAGAGTCTGGATTATCCCAGGGGAACGAGAACGTAAAGTCCAAATCTGAACGTACAAGACGCGGCGGTGAAATTGAAATCAAATCGCCAGATCCGGGATCTCATCGTACACATAACCCTCGCACTCCCGCAACTTCGCGTCGCCATCATTCATCCGCCCGCGGATATCGTGGCAGTGATAGCGAATAA
2.如权利要求1所述核苷酸序列的马立克氏病毒疫苗毒CVI988株VP22基因的制取方法，其特征在于包括以下步骤1)用PCR法从CVI988/Rispens弱毒疫苗株感染的鸭胚或鸡胚成纤维细胞(DEF或CEF)中提取基因组DNA；2)将提取的基因组DNA扩增UL49h基因片段。
3.如权利要求1所述核苷酸序列的马立克氏病毒疫苗毒CVI988株VP22基因与目的基因融合表达。
4.如权利要求1所述核苷酸序列的马立克氏病毒疫苗毒CVI988株VP22基因的蛋自传导域传导人或动物病原体主要保护性抗原的应用。
5.如权利要求1所述核苷酸序列的马立克氏病毒疫苗毒CVI988株VP22基因的蛋白传导域传导人或动物治疗性药物的应用。
6.如权利要求1所述核苷酸序列的马立克氏病毒疫苗毒CVI988株VP22基因提高目的蛋白的免疫保护效果的应用。
7.如权利要求1所述核苷酸序列的马立克氏病毒疫苗毒CVI988株VP22基因增强药物的疗效的应用。
全文摘要
本发明属于生物技术制药工业中的基因工程生产药物的技术领域，用PCR法从CVI988/Rispens弱毒疫苗株感染的鸭胚或鸡胚成纤维细胞(DEF)基因组DNA扩增UL49h基因片段，获得大小为732bp的PCR产物。将PCR产物克隆并测序分析，与经典MDV强毒GA株比较，确定弱毒株CVI988的UL49h存在3个定点突变(第172、244和733位bp)和一个缺失性突变，缺失的氨基酸为
文档编号C12Q1/68GK1513996SQ0313192
公开日2004年7月21日 申请日期2003年6月16日 优先权日2003年6月16日
发明者秦爱建, 陈鸿军, 金文杰, 刘岳龙 申请人:扬州大学