专利名称:一种中国被毛孢液体菌种发酵工艺方法
技术领域:
本发明涉及冬虫夏草的无性型中国被毛孢液体菌种的发酵工艺方法,具体地说是用从冬虫夏草上分离的中国被毛孢(Hirsutella sinensis Liu,Guo,Yu & Zeng)RCEF0273菌株进行无性型繁殖的液体菌种发酵工艺方法及保藏方法。
背景技术:
冬虫夏草(Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.)的药用价值在我国古代早有记载,为传统的名贵中药,与人参、鹿茸齐名,是著名的三大补品之一。基于冬虫夏草在医药保健方面的作用,及天然资源采集过度,濒近枯竭,现有产量难以满足需求,价格也成倍增长,70年代每500克仅卖数十元,但目前市售价已达10~33元/克,即5000~16500元/500克,普通百姓难以问津。
人工培养虫草成为解决这一难题的重要途径。但是,冬虫夏草的人工培育难度极大,尚无大规模获得成功的实例。故现代的研究纷纷走上了虫草无性型的繁殖—人工发酵菌丝体之路。大量的研究表明,人工发酵的虫草菌丝体的主要药理药化成分基本类似于虫草生药,这就为冬虫夏草的人工发酵提供了理论依据。
人工发酵冬虫夏草的首要难关就是冬虫夏草的无性型问题。随着赵锦等(1999)及李增智等(2000)采用分子生物学手段,再次验证了冬虫夏草的无性型为中国被毛孢;同时李增智等应用RAPD技术排除了其它几种相关真菌与冬虫夏草的对应关系,从而了结了冬虫夏草的无性型之争。
由于冬虫夏草的无性型中国被毛孢分离较为困难,人们先后从冬虫夏草上分离的相关菌株约10属共11个种,其中的几个菌株被当作冬虫夏草菌已经开发成药品及保健食品,如金水宝、智灵胶囊、百令胶囊等。因此几乎所有的文献(包括专利技术),研究所用的菌株是中国被毛孢或近似种的极为少见;而供试菌株不是中国被毛孢,却称作冬虫夏草菌的很常见(包括国外的一些从中国传过去的所谓冬虫夏草菌株),并且做了大量的药理及药化方面的研究。由此可知,目前多数所谓冬虫夏草的深层发酵的研究少有借鉴价值。
由于冬虫夏草常生长在高山雪线以上(海拔3000~4000米),适宜的温度较低。其无性型-中国被毛孢的生长同样需要较低的温度,而且生长十分缓慢,人工发酵非常困难,往往发酵周期长达20~40天,这无疑大大提高了工业生产的成本。故中国被毛孢的人工发酵问题一直困扰着科研人员。
与本专利较接近的两件中国专利分别为CN85101971和CN1197843,但是不同之处较明显。主要在于(1)所用的菌株不是同一个菌株;(2)培养基配方不同;(3)生产工艺不同;(4)液体菌种的保藏问题未提及。
发明内容
为了解决上述问题,在保持中国被毛孢菌种稳定的前提下,本发明提供一种采用物理方法和改变培养基配方办法实现中国被毛孢的工厂化生产工艺方法及菌种的保藏方法。
实现上述目的具体技术解决方案如下1、一种中国被毛孢液体菌种发酵工艺方法,所述菌种为自青海采集的冬虫夏草〔Cordyceps sinensis(Berk)Sacc.〕子座分离出的RCEF0273菌株(Hirsutella sinensisLiu,Guo,Yu & Zeng);它的液体菌种发酵工艺方法包括原料采集、菌株分离、菌种培养、保藏和多级发酵,其特征在于(1)所述菌种培养分为二步A、一级固体三角瓶菌种培养将分离纯化的菌种接种于50ml三角瓶培养基中,放入19℃培养箱,培养时间为20天,待菌丝长满三角瓶并产孢即可;B、二级液体摇瓶种子培养在500ml三角瓶中装入200ml培养基,用1.5pa/kg高压灭菌30分钟,待冷却至室温时,将经高速分散后的2瓶固体三角瓶的菌种接种到500ml三角瓶培养基上,并置于恒温振荡培养箱,温度19±1℃,180转/分条件下培养,培养时间为10天~12天;(2)所述菌种的发酵为三级液体菌种发酵A、一级种子罐生产在50L气升式发酵罐中装入21L液体培养基,培养基温度大于95℃、pH值为6.0~7.0,并加入食用消泡剂,加入量为0.03%,在14.7×104Pa压力下,通入蒸汽加热到121℃,并保压30~45分钟;灭菌后,冷却至20℃时将4瓶上述培养好的500ml摇瓶种子接入培养,培养温度为19-20℃,通气量为1∶0.5V/V·min,保压4.903~7.0845×104Pa,经7天通气培养,达到对数生长期后即可,最终培养体积为30L;B、二级种子罐生产在500L种子罐中装入300L液体培养基,pH值为6.0~7.0,并加入食用消泡剂,加入量为0.03%,原位加热到121℃,在14.7×104Pa压力下,保压30~45分钟;灭菌后,冷却至20℃时,将一级种子罐的30L液体种子全部接入二级种子罐培养,培养温度19-20℃,通气量为1∶0.5V/V·min,保压4.903~7.0845×104Pa,经过7天通气培养,达到对数生长期后即可,最终培养体积为300L;C、发酵罐生产在5T发酵罐中装入3T液体培养基,pH值为6.0~7.0,并加入食用消泡剂,加入量为0.03%,原位加热到121℃,保压40分钟,冷却至20℃,将二级种子罐培养好的液体种子300L全部接入发酵罐培养,培养温度为19-20℃,通气量为1∶0.4~0.5V/V·min,罐压4.903~7.0845×104Pa,培养时间5天;当发酵液中出现大量小菌球及经显微镜镜检发现大量菌丝,残糖在1%以下,发酵液较粘稠,颜色明显加深,可出罐。
2、所述的一级固体三角瓶培养基的原料重量配比为马铃薯200g煮汁、葡萄糖20g、麦芽糖10g、麦芽汁20ml、蛋白胨10g、酵母粉10g、MgSO41.5g、KH2PO43g、柠檬酸铵0.4g、琼脂20g、加水至1L,pH6.5。
3、所述的二级液体摇瓶种子培养基原料重量配比为在1000ml培养基中含葡萄糖20g、奶粉30g、蚕蛹粉30g、酵母粉20g、MgSO40.5g、KH2PO41g,各组分混合后加水补至1000ml,并用饱和NaOH调pH值为6.5。
4、所述的种子罐生产液体培养基原料重量配比为在1000ml培养基中含白砂糖20g、奶粉30g、蚕蛹粉30g、酵母粉30g、MgSO40.5g、KH2PO41g,各组分混合后加水补至1000ml,并用饱和NaOH调pH至6.5。
5、所述的发酵罐生产液体培养基包括在1000ml培养基中含白砂糖20g、奶粉20g、蚕蛹粉20g、酵母粉20g、MgSO40.5g、KH2PO41g,各组分混合后加水补至1000ml,并用饱和NaOH调pH至6.5。
6、所述的消泡剂为聚氧丙烯氧化乙烯甘油醚,用量为培养液总量的0.03%。
7、所述二级种子罐的接入过程中,可使用高速分散设备对种子进行在线分散;所述高速分散设备或为内切式高速分散器,或为在线高速分散设备,其工艺参数为转速在200-5000转/分,间歇或不间歇粉碎,非在线分散均质搅拌头直径为20-30mm。
8、液体摇瓶种子可进行保藏,具体方法是将培养好的液体菌种置于冷藏箱保存,短期保藏温度为4℃,保藏时间最多为14天,长期保藏温度为-40℃以下。
9、保藏后的液体种子转接时,需在恒温振荡培养箱中活化12-24小时,工艺条件为温度19±1℃,180转/分;之后可用高速分散器进行间隙式分散,每次分散时间不超过5秒;分散后的液体种子可转接液体或固体培养基。
本发明的工艺方法适合工业化生产,不受时间地点的局限,可根据市场的需求增加或缩减生产规模。本发明生产工艺简单、工艺稳定、易调控、成功率高;采用本发明方法生产投资少,占地小、无三废问题,尤其适于中小企业采用。
本发明优化了发酵工艺。真菌相对于动植物而言,容易发生变异和退化。变异后的菌株往往生长速率迅速加快,本所曾经分离到一株中国被毛孢的角变株,25℃条件下生长良好,3天即可满皿,而生物活性则大大低于只有在19℃左右才能生长良好的菌株(如RCEF0273)。因此,本所特别注意中国被毛孢菌株的变异退化问题。在此基础上,研究其发酵工艺并获得了成功,在不影响活性的条件下,其发酵周期比国内(如台湾)大大缩短,使产品更具市场竞争性。
本发明方法可以根据需要和现实情况采用不同的保藏方法延续保藏时间并缩短活化时间,为及时组织生产提供优质菌种。
本发明工艺生产的菌丝体具有独特的先进性一、色质较淡,菌丝体干燥后呈灰白色,易于为客户接受;二、生产的菌丝体回接固体后其培养特征与原始菌株无明显差异,即菌株未发生明显变异;三、本发明工艺生产的菌丝体在液体状态下主要不是靠分生孢子扩增,而是以断裂的菌丝片段为新生长点,在此基础上培养获得大量菌丝的;四、生产的菌丝体可用于医药保健品,发酵液可制作口服液或饮料,从而最大限度地利用资源,追求更大的经济和社会效益。
具体实施例方式
结合实施例对本发明作进一步地描述。
实施例该中国被毛孢液体菌种发酵工艺方法,包括下述生产工序A、菌种的取得RCEF0273菌株(Hirsutella sinensis Liu,Guo,Yu & Zeng),分离自青海采集的冬虫夏草〔Cordyceps sinensis(Berk)Sacc.〕子座。
B、一级固体三角瓶菌种培养
将分离纯化的菌种接种于三角瓶培养基中,放入19℃培养箱,培养20天,待菌丝长满三角瓶并产孢时,转入摇瓶培养;一级固体三角瓶培养基的原料重量配比为马铃薯200g煮汁、葡萄糖20g、麦芽糖10g、麦芽汁20ml、蛋白胨10g、酵母粉10g、MgSO41.5g、KH2PO43g、柠檬酸铵0.4g、琼脂20g、加水至1L,pH6.5。
C、液体摇瓶种子培养在500ml三角瓶中,装入200ml的液体种子培养基,1.5pa/kg高压灭菌30分钟,待冷却至室温时,将经高速分散后的菌种接种到三角瓶,接种量为液体种子培养基中每500ml三角瓶接2瓶培养好的一级小三角瓶菌种(50ml小三角瓶),并置于恒温振荡培养箱,19±1℃,180转/分条件下,培养10天即可;二级液体摇瓶种子培养基原料重量配比为在1000ml培养基中含葡萄糖20g、奶粉30g、蚕蛹粉30g、酵母粉20g、MgSO40.5g、KH2PO41g,各组分混合后加水补至1000ml,并用饱和NaOH调pH值为6.5。
D、液体发酵生产采用三级发酵(1)、一级种子罐生产在50L气升式发酵罐中装入21L液体培养基,培养基温度大于95℃,pH6.0~7.0,并加入食用消泡剂,即聚氧丙烯氧化乙烯甘油醚,加入量为0.03%,在14.7×104Pa压力下,通入蒸汽加热到121℃,并保压30~45分钟,最终培养体积为30L。灭菌后,冷却至20℃时将4瓶上述培养好的500ml摇瓶种子接入培养,19℃下培养,通气量1∶0.5,保压,4.903~7.0845×104Pa,经7天通气培养,达到对数生长期后,接入二级种子罐。该级种子罐生产液体培养基原料重量配比为在1000ml培养基中含白砂糖20g、奶粉30g、蚕蛹粉30g、酵母粉30g、MgSO40.5g、KH2PO41g,各组分混合后加水补至1000ml,并用饱和NaOH调pH至6.5。
(2)、二级种子罐生产在500L种子罐,装入300L液体培养基,pH6.0~7.0,并加入食用消泡剂,即聚氧丙烯氧化乙烯甘油醚,加入量为0.03%,原位加热到121℃,在14.7×104Pa压力下,保压30~45min。灭菌后,冷却至20℃时将一级种子罐种子30L全部接入二级种子罐培养,接入过程中,在管道中使用高速分散设备对种子进行在线分散,培养温度19℃,通气量1∶0.5V/V·min,保压4.903~7.0845×104Pa,经7天通气培养,达到对数生长期后,接入发酵罐;该级种子罐生产液体培养基原料重量配比为在1000ml培养基中含白砂糖20g、奶粉30g、蚕蛹粉30g、酵母粉30g、MgSO40.5g、KH2PO41g,各组分混合后加水补至1000ml,并用饱和NaOH调pH至6.5。
(3)、发酵罐生产在5T发酵罐,装入3T液体培养基液体,pH6.0~7.0,加入食用消泡剂,即聚氧丙烯氧化乙烯甘油醚,加入量为0.03%,原位加热到121℃,保压40分钟,冷却至20℃,将二级种子罐培养好的液体种子300L全部接入,19℃下通气培养,通气量1∶0.4~0.5V/V·min,罐压4.903~7.0845×104Pa,培养时间5天。该级发酵罐生产液体培养基包括在1000ml培养基中含白砂糖20g、奶粉20g、蚕蛹粉20g、酵母粉20g、MgSO40.5g、KH2PO41g,各组分混合后加水补至1000ml,并用饱和NaOH调pH至6.5。
当发酵液中出现大量小菌球及经显微镜镜检发现有大量菌丝,残糖在1%以下,发酵液较粘稠,颜色明显加深,即可出罐。
经连续离心后获得菌丝体在50℃下无菌鼓风干燥。之后,经超微粉碎(或粉碎过300目筛)罐装成胶囊。发酵液经试验表明无需浓缩,经改变风味后制成功能性口服液,如改善睡眠。
液体菌种可冷藏保存,具体操作方法是将培养好的液体菌种于4℃冷藏保存,最多保藏时间为14天。在此之前,均可用于接种,接种前可用高速分散器分散或不分散。若需长时间保藏可将液体菌种置于-40℃或更低的温度下。
需转接保藏的液体菌种时的具体操作方法是由液体菌种按5%接种量接种,置于恒温振荡培养箱,19±1℃,180转/分条件下,培养7天即可。
权利要求
1.一种中国被毛孢液体菌种发酵工艺方法,所述菌种为自青海采集的冬虫夏草〔Cordyceps sinensis(Berk)Sacc.〕子座分离出的RCEF0273菌株(Hirsutella sinensisLiu,Guo,Yu & Zeng);它的液体菌种发酵工艺方法包括原料采集、菌株分离、菌种培养、保藏和多级发酵,其特征在于(1)所述菌种培养分为二步A、一级固体三角瓶菌种培养将分离纯化的菌种接种于50ml三角瓶培养基中,放入19℃培养箱,培养时间为20天,待菌丝长满三角瓶并产孢即可;B、二级液体摇瓶种子培养在500ml三角瓶中装入200ml培养基,用1.5pa/kg高压灭菌30分钟,待冷却至室温时,将经高速分散后的2瓶固体三角瓶的菌种接种到500ml三角瓶培养基上,并置于恒温振荡培养箱,温度19±1℃,180转/分条件下培养,培养时间为10天~12天;(2)所述菌种的发酵为三级液体菌种发酵A、一级种子罐生产在50L气升式发酵罐中装入21L液体培养基,培养基温度大于95℃、pH值为6.0~7.0,并加入食用消泡剂,加入量为0.03%,在14.7×104Pa压力下,通入蒸汽加热到121℃,并保压30~45分钟;灭菌后,冷却至20℃时将4瓶上述培养好的500ml摇瓶种子接入培养,培养温度为19-20℃,通气量为1∶0.5V/V·min,保压4.903~7.0845×104Pa,经7天通气培养,达到对数生长期后即可,最终培养体积为30L;B、二级种子罐生产在500L种子罐中装入300L液体培养基,pH值为6.0~7.0,并加入食用消泡剂,加入量为0.03%,原位加热到121℃,在14.7×104Pa压力下,保压30~45分钟;灭菌后,冷却至20℃时,将一级种子罐的30L液体种子全部接入二级种子罐培养,培养温度19-20℃,通气量为1∶0.5V/V·min,保压4.903~7.0845×104Pa,经过7天通气培养,达到对数生长期后即可,最终培养体积为300L;C、发酵罐生产在5T发酵罐3中装入3T液体培养基,pH值为6.0~7.0,并加入食用消泡剂,加入量为0.03%,原位加热到121℃,保压40分钟,冷却至20℃,将二级种子罐培养好的液体种子300L全部接入发酵罐培养,培养温度为19-20℃,通气量为1∶0.4~0.5V/V·min,罐压4.903~7.0845×104Pa,培养时间5天;当发酵液中出现大量小菌球及经显微镜镜检发现大量菌丝,残糖在1%以下,发酵液较粘稠,颜色明显加深,可出罐。
2.根据权利要求1所述的中国被毛孢液体菌种发酵工艺方法,其特征在于所述的一级固体三角瓶培养基的原料重量配比为马铃薯200g煮汁、葡萄糖20g、麦芽糖10g、麦芽汁20ml、蛋白胨10g、酵母粉10g、MgSO41.5g、KH2PO43g、柠檬酸铵0.4g、琼脂20g、加水至1L,pH6.5。
3.根据权利要求1所述的中国被毛孢液体菌种发酵工艺方法,其特征在于所述的二级液体摇瓶种子培养基原料重量配比为在1000ml培养基中含葡萄糖20g、奶粉30g、蚕蛹粉30g、酵母粉20g、MgSO40.5g、KH2PO41g,各组分混合后加水补至1000ml,并用饱和NaOH调pH值为6.5。
4.根据权利要求1所述的中国被毛孢液体菌种发酵工艺方法,其特征在于所述的种子罐生产液体培养基原料重量配比为在1000ml培养基中含白砂糖20g、奶粉30g、蚕蛹粉30g、酵母粉30g、MgSO40.5g、KH2PO41g,各组分混合后加水补至1000ml,并用饱和NaOH调pH至6.5。
5.根据权利要求1所述的中国被毛孢液体菌种发酵工艺方法,其特征在于所述的发酵罐生产液体培养基包括在1000ml培养基中含白砂糖20g、奶粉20g、蚕蛹粉20g、酵母粉20g、MgSO40.5g、KH2PO41g,各组分混合后加水补至1000ml,并用饱和NaOH调pH至6.5。
6.根据权利要求1所述的中国被毛孢液体菌种发酵工艺方法,其特征在于所述的消泡剂为聚氧丙烯氧化乙烯甘油醚,用量为培养液总量的0.03%。
7.根据权利要求1所述的中国被毛孢液体菌种发酵工艺方法,其特征在于所述二级种子罐的接入过程中,可使用高速分散设备对种子进行在线分散;所述高速分散设备或为内切式高速分散器,或为在线高速分散设备,其工艺参数为转速在200-5000转/分,间歇或不间歇粉碎,非在线分散均质搅拌头直径为20-30mm。
8.根据权利要求1所述的中国被毛孢液体菌种发酵工艺方法,其特征在于液体摇瓶种子可进行保藏,具体方法是将培养好的液体菌种置于冷藏箱保存,短期保藏温度为4℃,保藏时间最多为14天,长期保藏温度为-40℃以下。
9.根据权利要求1所述的中国被毛孢液体菌种发酵工艺方法,其特征在于保藏后的液体种子转接时,需在恒温振荡培养箱中活化12-24小时,工艺条件为温度19±1℃,180转/分;之后可用高速分散器进行间隙式分散,每次分散时间不超过5秒;分散后的液体种子可转接液体或固体培养基。
全文摘要
本发明涉及中国被毛孢的液体菌种发酵工艺方法。该方法主要包括菌种的取得、一级固体三角瓶菌种培养、液体种子培养、液体发酵罐生产工序。本发明生产工艺简单、工艺稳定、易调控、成功率高。投资少,占地小、无三废问题。本发明工艺所用的菌株未发生明显变异。生产的菌丝体在液体状态下以断裂的菌丝片段为新生长点,在此基础上培养获得大量菌丝。生产的菌丝体可用于医药保健品,发酵液可制作口服液或饮料,从而最大限度地利用资源,追求更大的经济和社会效益。
文档编号C12N1/14GK1478886SQ0313190
公开日2004年3月3日 申请日期2003年6月14日 优先权日2003年6月14日
发明者李春如, 樊美珍, 李增智, 黄勃 申请人:安徽林苑虫草研究所