一种一管式反转录聚合酶链式反应的利记博彩app

专利名称：一种一管式反转录聚合酶链式反应的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及分子生物学技术，特别是涉及一种一管式反转录聚合酶链式反应方法及其在提高RT-PCR和多重RT-PCR反应专一性中的应用。
背景技术：
1970年Baltimore和Temin分别在鼠白血病病毒和肉瘤病毒中发现了反转录酶，又称RNA指导的DNA聚合酶或RNA依赖的DNA聚合酶，这一重要发现是生命科学研究的里程碑，也是分子生物学研究特别是离体合成cDNA建立基因文库所不可或缺的工具，两名科学家于1975年获诺贝尔生理与医学奖。八十年代中期PCR技术建立，发明人Mullis因此项成就于1993年获诺贝尔化学奖。反转录PCR可以看作是将上述发现和发明叠合起来的一项技术。反转录PCR能以RNA为原始模板扩增出特定的DNA，在基因表达检测和定量分析及基因克隆等方面正显示越来越广阔的应用前景。
RT-PCR技术建立之初通常将反转录步骤和扩增步骤先后分两管进行。反转录引物采用基因专一引物即PCR引物对中的反引物、或由不同顺序六个碱基组成的随机引物或oligo(dT)引物三种。通过调整缓冲液组成和pH值，建立和发展了更简单的一管式RT-PCR技术。一管式RT-PCR不排斥用oligo(dT)和随机引物来合成cDNA，但实际上几乎都是用基因专一引物来进行反转录并完成扩增。以oligo(dT)和随机引物进行反转录的二管式RT-PCR和以基因专一引物进行反转录的一管式RT-PCR在需要合成的cDNA的目标基因数量和长度方面有天壤之别，应用前一种方法所合成的cDNA长度越长越好，合成的cDNA基因数量越多越好，应用后一种方法则希望只合成目标基因cDNA，其长度比目标扩增产物略长。但是，在从二管式发展至一管式的进程中对反转录步骤的反应时间、酶用量和反应温度并没有作出相应的调整显然是不合理的。目前一管式RT-PCR的反转录时间通常为30-60分钟，文献报导的低限为15分钟，本发明则将反应时间缩短为30秒钟至15分钟。目前使用常温反转录酶AMV和MMLV及其变异品种的一管式RT-PCR的反转录步骤温度范围为37-50℃，本发明则可在小于37℃包括室温和大于50℃下进行。目前一管式RT-PCR反转录酶的用量与二管式相同或比二管式少几至几十倍，本发明反转录酶的用量比二管式少几十至几百倍，比现有的一管式RT-PCR试剂盒规定用量也少几至几十倍。本发明不仅能大大节约时间和资源而且有助于提高扩增的专一性。

发明内容
所要解决的技术问题本发明所要解决的技术问题是提供一种一管式反转录聚合酶链式反应方法及其在提高RT-PCR和多重RT-PCR反应专一性中的应用，以突破现有反转录聚合酶链式反应方法中反转录反应时间、温度和反转录酶用量上的限制，克服两管式反转录PCR和多重RT-PCR在反应专一上的缺陷。
技术方案本发明提供一种一管式反转录聚合酶链式反应方法，其步骤依次包括(1)在反转录酶催化下，依据RNA链合成DNA模板；(2)DNA模板变性解链；(3)引物与模板退火；(4)在DNA聚合酶催化下合成互补DNA链；(5)按步骤(2)-(4)循环进行合成反应；其中，步骤(1)的反应时间为0.5-15分钟，优选1-5分钟。
相对上述的一管式RT-PCR方法，二管式RT-PCR通常以随机引物和oligo(dT)进行反转录，它是以反应体系中所有的RNA或所有的mRNA为模板，目的是合成出尽可能多的基因和尽可能长、尽可能完整的的cDNA，所得到的cDNA库可作为基因扩增的模板。二管式RT-PCR用随机引物和oligo(dT)进行反转录的最重要优点是所得到的cDNA能用于各种目标基因的扩增。但是，正因为它是一个包罗万象的非常复杂的cDNA模板库，对于任何一个特定基因的扩增而言显然有百弊而无一利。一管式RT-PCR以基因专一引物进行反转录，目的只是得到一定长度的可作为目标扩增产物模板的cDNA。如果反转录步骤不合成非目标基因cDNA或只合成很短的片段，则扩增步骤受到非目标基因干扰就可能大大减少，PCR可以在更宽的条件下进行而仍保持其专一性。同样，如果反转录步骤合成的目标基因cDNA长度只比设计的扩增产物略长，则可避免扩增产物上游的顺序对扩增可能造成的干扰。所以，一管式RT-PCR和二管式RT-PCR在对cDNA合成的要求上可以说正好相反，说明有必要在反应时间上作相应的调整。以下事实则说明反转录步骤的反应时间有可能大大缩短。人和哺乳动物基因mRNA的平均长度约为2kb，通常长度范围为0.5-8kb，有些mRNA长度则超过10kb。目前各种二管式或一管式商品RT-PCR试剂盒都称能在通常的15-60分钟反应时间内得到完整的cDNA。Eppendorff公司的RT-PCR试剂盒则称得到了12.5kb长的扩增产物。这说明在现有的试剂和反应条件下，cDNA合成速度至少在每分钟200碱基以上。基因表达分析和临床检测对扩增产物的长度一般并没有任何限制，如果假定扩增产物为200碱基，则根据上述数据有可能在1分钟之内完成相应的cDNA合成。根据酶活力的定义和产品的比活力也可计算cDNA的合成速度。以Roche公司反转录酶产品AMV和MMLV为例，其比活力分别为50,000和40,000U/mg蛋白，其倒数分别为20和25ng酶蛋白/U。假定二种酶蛋白的分子量均为为71,000道尔登，则每一个单位酶分别含0.28和0.35pmol酶分子。Roche公司AMV和M-MMLV反转录酶产品的单位定义是指以Poly(dA)为模板以oligo(dT)为引物时，在37℃培养10分钟内，掺入到核酸中的标记核苷酸为1nmol，即每分钟有100pmol核苷酸掺入至cDNA。由此可推算二种反转录酶的合成速度分别为每分钟约360和290个碱基。假定反转录酶以天然目标基因RNA为模板的cDNA合成速度与上述以单元素的人工合成模板相仿，则每个反转录酶分子能在1分钟之内合成300碱基以上的cDNA。反转录酶是一种多功能酶，它也能以DNA为模板合成cDNA，但速度通常远小于以RNA为模板时的速度。根据文献(F.M.Ausubel等，Current Protocols in Molecularbiology，Vol1，Unit3.7，2000)AMV反转录酶以DNA为模板的合成速度可达每秒钟约5个碱基即每分钟约300个碱基，由此也可推断反转录酶以RNA为模板合成cDNA的速度至少达每分钟几百碱基。
本发明提供一种一管式反转录聚合酶链式反应方法，其步骤依次包括(1)反转录酶催化下，依据RNA链合成DNA模板；(2)DNA模板变性解链；(3)引物与模板退火；(4)在DNA聚合酶催化下合成互补DNA链；(5)按步骤(2)-(4)循环进行合成反应；其中，步骤(1)的反应温度范围为4-37℃或50-75℃，优选15-37℃或50-60℃。
常温反转录酶AMV和MMLV的最适反应温度分别为37℃和42℃左右，虽然反转录酶合成cDNA的速度随温度下降而显著下降，但在30℃、室温、甚至更低的温度下仍能在几分钟至几十分钟的时间内完成几百碱基cDNA的合成。在反应速度较低完成几百个碱基合成需要几分钟至几十分钟而不是几秒钟至几十秒钟的情况下，有可能通过控制反应时间来限制所合成的cDNA的长度，使得目标扩增产物的cDNA能完成合成，而比扩增产物更长的目标基因和非目标基因cDNA的合成受到限制。通过这种控制可降低模板的复杂性，从而提高扩增的专一性。反转录步骤的温度也可能向更高的温度扩展。目前反转录酶的最适温度和在较高温度下的半衰期都是以反应时间为一小时来进行测定的。如果以保温15分钟或更短的时间来测定，则酶的最适温度可能显著提高，半衰期可能延长，通过添加甘油和其他试剂也可能使酶的耐热性显著增强，所以反转录酶有可能在较短的时间同时又在较高的温度下完成几百碱基cDNA的合成。提高反转录温度可减少RNA二级结构，同时减少基因专一引物与非目标RNA顺序的假性结合，从而增强cDNA合成和扩增的专一性。
本发明提供一种一管式反转录聚合酶链式反应方法，其步骤依次包括(1)在反转录酶催化下，依据RNA链合成DNA模板；(2)DNA模板变性解链；(3)引物与模板退火；(4)在DNA聚合酶催化下合成互补DNA链；(5)按步骤(2)-(4)循环进行合成反应；其中，步骤(1)的反转录酶为MMLV1-200单位/μg总RNA模板或AMV1-200单位/μg总RNA模板，优选反转录酶为MMLV4-50单位/μg总RNA模板或AMV4-50单位/μg总RNA模板。
相比较于上述的一管式RT-PCR反应方法，二管式RT-PCR通常取五分之一至五十分之一的cDNA用于PCR，而一管式RT-PCR反转录所合成的cDNA被全部用于PCR。某些公司出品的一管式RT-PCR试剂盒已将反转录酶的用量比本公司的二管式试剂盒降低了几至几十倍。但是，用基因专一引物的一管式RT-PCR的反转录酶用量理论上有进一步下调的空间。人细胞内的mRNA种类多达几万种，其中99％以上是属于低丰度的，其拷贝数只占总mRNAs拷贝数的几万分之一至几十万分之一。换言之，使用基因专一引物进行反转录的一管式RT-PCR所要求合成的目标基因cDNA的量比二管式需要合成的cDNA库要少几个数量级，一管式RT-PCR的反转录酶的用量有大大降低的潜力。M.J.Roth等(Journal Biological Chemistry，1985，2609326-9335)指出cDNA产物的长度与反转录酶的加量有关，当反转录酶浓度低于一定值时不合成cDNA或只能合成几百碱基长的cDNA。这提示不能只根据所需要合成cDNA的数量将一管式RT-PCR的反转录酶用量无限制地按比例降低。但是，另一方面Roth等指出的事实却表明有可能通过降低酶用量来控制合成cDNA的长度，使其在一般扩增产物的几百碱基长度之内，从而提高扩增的专一性。
本发明同时提供上述的有关反应温度范围的反应方案在提高RT-PCR扩增专一性中的应用，其技术关键在于步骤(1)的反应温度为4-37℃，优选25-37℃，以限制比目标扩增产物长度更长的cDNA的合成。
本发明同时提供上述的有关反应温度范围的反应方法在提高RT-PCR扩增专一性中的应用，其技术关键在于步骤(1)的反应温度为50-75℃，以降低RNA二级结构提高基因专一引物合成cDNA的专一性。
本发明同时提供上述的有关反转录酶用量范围的反应方案在提高RT-PCR扩增专一性中的应用，其技术关键在于降低反转录酶用量至MMLV1-200单位/μg总RNA模板或AMV1-200单位/μg总RNA模板来限制比目标扩增产物长度更长的cDNA的合成。
有益效果上述的有关缩短反转录反应时间、扩展反转录步骤的反应温度和减少反转录酶的用量的技术方案所带来的独特的技术效果有如下几点1.将一管式RT-PCR的反转录时间从目前的15分钟至1小时缩短至半分钟至15分钟，完成整个RT-PCR的测定时间也大大缩短。
2.可在室温配制RT-PCR反应液并在室温置留若干时间来完成反转录，不必在基因扩增仪或其他仪器上进行反应使操作简化。
3.可在比37℃更低的温度下包括室温下进行反转录，从而有可能通过控制反转录步骤的时间来限制比目标扩增产物长度更长的cDNA的合成有利扩增的专一性。
4.可在比50℃更高的温度下进行反转录既快速又能降低RNA二级结构，减少引物与非模板RNA的假性结合，有利于减少非目标cDNA即非专一半扩增链的合成，促进目标基因产物的扩增。
5.反转录酶用量可是各种一管式RT-PCR试剂盒规定的用量的二分之一至百分之一。节约了较昂贵的反转录酶试剂。
6.降低反转录酶用量有可能通过控制酶用量来限制比目标扩增产物长度更长的cDNA的合成有利扩增的专一性。
具体实施例方式
实施例1.
实施例1以人肌动球蛋白基因作为目标基因。引物与目标顺序的上下游均高度匹配而且中间跨越一个内含子，基因组DNA污染导致的扩增产物比由以cDNA为模板得到的扩增产物大约100碱基能加以区别。引物的顺序和特性示于表1和表2。
表1.表实施例1引物顺序

表2.实施例1引物的特性

实施例1用ClonTech出品的人组织总RNA为原始模板并用该公司的的TITANIUM一管式试剂盒按其规定成份在室温下配制反应液。每管反应体积5微升，每50微升加人组织总RNA0.5微克，引物浓度1uM。反转录温度50℃试验时间为0-15分钟。PCR首次变性94℃4分钟，循环变性94°10秒钟，退火65℃1分钟，延伸70℃1分钟，共30循环。反转录时起动基因扩增程序当温度达到50℃后加入第一个试管，相隔一定的时间后加入其他试管使在50℃的反转录时间达到指定值。反转录结束当扩增仪温度升至94℃后加最后一个试管作为反转录时间为“0”分钟。试验结果示于表3。
表3.实施例1结果

试验结果表明反转录时间从1分钟至15分钟都得到同样强的目标产物条带。50℃“0”分钟培养也得到同样强的扩增产物，说明在室温配制反应液及随后在室温放置15分钟已能完成长约200碱基的目标cDNA的合成。
实施例2实施例2以人腺苷酸环化酶的一种亚型的基因(基因库编号XM_028817〕为目标基因，引物的顺序和特性示于表4和表5，扩增产物跨越二个内含子，基因组DNA污染导致的扩增产物能与以cDNA为模板得到的扩增产物明显区别。
表4.实施例2引物顺序

表5.实施例2引物的特性

实施例2除正反引物浓度均为0.4uM外所用试剂和方法与实施例1相同。为避免在室温条件下合成cDNA，所有试剂解冻后置于冰浴，在冰浴上配制反应液最后加反转录酶和TaqDNA聚合酶混合物，反应配成后仍保存于冰浴直至按实施例1方法加到基因扩增仪。反转录和PCR的程序也与实施例1相同，但退火与延伸合并为一步72℃1分半钟。试验结果示于表6。
表6.实施例2结果

试验结果表明在冰浴配制反应液并停留约15分钟然后直接加到温度为94℃的扩增仪上没有扩增条带出现，说明在接近零度的低温下不能合成cDNA。在50℃反转录30秒钟至15分钟都得到目标扩增产物，而且反转录1-15分钟所得到的扩增产物强度相同，表明在试验条件下1分钟反转录已能得到足量的400碱基长的目标cDNA，提示现行一管式RT-PCR的反转录时间可大大缩短。
实施例3实施例3以人甘油醛-3-磷酸-脱氢酶基因(基因库编号XM_006959)〕为目标基因，引物的顺序和特性示于表7和表8，扩增产物跨越一个内含子，基因组DNA污染导致的扩增产物能与以cDNA为模板得到的扩增产物明显区别。
表7.实施例3引物顺序

表8.实施例3引物的特性

实施例3按实施例1方法在室温配制RT-PCR反应液，并在室温放置0-30分钟作为反转录步骤，然后立即加到已加热至94℃的基因扩增仪上开始PCR。PCR程序与实施例2相同，循环数为28。试验结果示于表9。
表9.实施例3结果


试验结果说明在室温进行反转录几分钟能完成长至少为200碱基的cDNA的合成，约十分钟后目标基因的cDNA达到饱和。“0”分钟反转录也显示微弱扩增条带说明在室温配至RT-PCR反应液的短时间和试管从室温升至94℃的坡道时间内也能合成一些短的cDNA。不加RNA在室温置留不同时间的负对照试管不出现目标产物条带说明没有滞后污染现象。
实施例4实施例4也以人甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因为目标基因(基因库编号XM_006959)，试验使用二对引物，其中一对引物G1正和G1反的顺序已示于表7。另一对引物G2正和G2反的顺序和特性示于表10和表11。
表10.实施例4引物顺序

表11.实施例4引物的特性

应用非原配的G1正引物和G2反引物也能得到扩增产物长度为593碱基。如用二对引物作多重PCR则理论上应能得到185，388和593碱基长三种扩增产物。实施例4按实施例2方法在冰浴上配制RT-PCR反应液，并立即置于基因扩增仪开始RT-PCR程序，反转录步骤12分钟温度分别为15，20，25，30，35，40，45和50℃。反转录完成后立即进入PCR，PCR的程序与实施例3相同。试验结果示于表12。
表12.实施例4结果


试验结果表明当反应时间固定时，完成反转录使cDNA合成达到饱和所需的温度与扩增产物长度，即所需合成的cDNA的长度有关。产物长度为约200碱基时，15℃下即能完成cDNA合成，25℃即达饱和；扩增产物长约400碱基时35℃下能完成cDNA合成，50℃时能达饱和；扩增产物长约600碱基时45℃下能完成cDNA合成，50℃时能达饱和。多重PCR结果提示控制反转录步骤在较低的温度如25-40℃，能使较短的目标基因DNA得到充分的合成，而较长的非目标基因的cDNA不能完成合成。即通过反转录步骤可以提高RT-PCR的专一性。
实施例5实施例5试验反转录的最高允许温度，所用引物与实施例4相同，所用试剂和RT-PCR反应液的配制也与实施例4相同，每管反应体积10微升。反转录设定为60，65，70或75℃6分钟，在冰浴配制反应液然后直接加到已分别升温至60，65，70或75℃达一分钟的基因扩增仪上。反转录完成后在95℃加热3分钟并开始PCR，PCR程序与实施例4相同，退火和延伸70℃1分半钟，每一试验含一不加RNA的负对照，结果示于表13。
表13.实施例5试验结果

结果表明当反转录温度达75℃仍能形成目标扩增产物，不加RNA模板均无扩增产物条带形成，说明不存在扩增产物的滞后污染。虽然10微升反应液从冰浴升至60-75℃仅需儿秒钟，但是为了排除升温过程的坡导时间内cDNA的合成，还用G1引物对进行一个试验，在冰浴配制反应液但不加反转录酶和DNA聚合酶混合物，当含反应液试管在基因扩增仪上分别达到60，65，70或75C时再加仅0.2微升的酶混合物，使坡道时间缩短至接近零秒，结果同样均得到扩增产物，说明作为目标基因模板的cDNA确是在如此高温下合成的。
实施例6实施例5以人肌动球蛋白基因和人腺苷酸环化酶的一种亚型作为目标基因，试验反转录酶的用量对RT-PCR的影响，引物A1和引物AC正和AC反的顺序和特性示于表1，2，4和5。配制反应液的试剂和方法与实施例1相同，但每一个试验管均加相同量的ClonTech公司的Advantage-2PCR试剂盒中的50XTaqDNA聚合酶来代替TITAIUM-RT-PCR试剂盒中的50XTaqDNA聚合酶和MMLV反转录酶的混合物用于扩增。另外，每一个试验管再加不同量的50XTaqDNA聚合酶和MMLV反转录酶混合物用于反转录。每一试验管的反转录温度均为50℃时间均为5分钟。A1引物浓度1uM，退火65℃1分钟，延伸70℃1分钟，循环数30；AC引物浓度均为0.4uM，退火延伸合为一步72℃1分半钟，循环数32。试验结果示于表14。
表14.实施例6结果


*以试剂盒规定的反转录酶加量为100％***以试剂盒规定的TaqDNA聚合酶加量为100％试验结果说明对于较短的约200碱基的扩增产物，只加试剂盒规定量5％的反转录酶cDNA的合成即饱和，能得到与加标准量反转录酶的RT-PCR同样强的扩增条带；对于较长的约400碱基的扩增产物，加试剂盒规定量10％的反转录酶cDNA的合成也达到饱和，从而得到与加标准量反转录酶的RT-PCR同样强的扩增条带。
实施例7实施例7也试验反转录酶用量对RT-PCR的影响，引物AC正和AC反的顺序和特性已示于表4和表5。配制反应液用的试剂和方法与实施例5相同，但每一个试验管加不同量的ClonTech公司cDNA合成试剂盒所提供的MMLV反转录酶(每微升200单位)。反转录和PCR的条件均与实施例5相同。试验结果示于表15。
表15.实施例6结果

**以试剂盒规定的TaqDNA聚合酶加量为100％试验结果表明对于长约400碱基的扩增产物，每100微升RT-PCR反应液只加相当于0.02微升的商品反转录酶，cDNA合成即达饱和，扩增产物强度与加100倍量的反转录酶所扩增的相同，提示目前试剂盒反转录酶的用量可再降低。
实施例8实施例8以甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(基因库编号XM_006959)为例说明快速反转录和快速PCR结合的快速一管法反转录PCR。引物顺序和特性与表7和表8相同。反转录PCR用试剂和原始RNA模板与实施例1相同，引物浓度为2uM，每管体积仅2微升，反转录50℃1分钟，95℃加热2分钟后转入循环，变性89℃1秒钟，退火和延伸75℃1秒钟，30循环，完成整个反转录PCR时间仅为17分钟，电泳和染色显示得到专一目标扩增产物条带。
权利要求
1.一种一管式反转录聚合酶链式反应方法，其步骤依次包括(1)在反转录酶催化下，依据RNA链合成DNA模板；(2)DNA模板变性解链；(3)引物与模板退火；(4)在DNA聚合酶催化下合成互补DNA链；(5)按步骤(2)-(4)循环进行合成反应；其特征在于步骤(1)的反应时间为0.5-15分钟。
2.根据权利要求1所述的反应方法，其特征在于步骤(1)的反应时间为1-5分钟。
3.一种一管式反转录聚合酶链式反应方法，其步骤依次包括(1)在反转录酶催化下，依据RNA链合成DNA模板；(2)DNA模板变性解链；(3)引物与模板退火；(4)在DNA聚合酶催化下合成互补DNA链；(5)按步骤(2)-(4)循环进行合成反应；其特征在于步骤(1)的反应温度范围为4-37℃或50-75℃。
4.根据权利要求3所述的反应方法，其特征在于步骤(1)的反应温度范围为15-37℃或50-60℃。
5.一种一管式反转录聚合酶链式反应方法，其步骤依次包括(1)在反转录酶催化下，依据RNA链合成DNA模板；(2)DNA模板变性解链；(3)引物与模板退火；(4)在DNA聚合酶催化下合成互补DNA链；(5)按步骤(2)-(4)循环进行合成反应；其特征在于步骤(1)的反转录酶为MMLV1-200单位/μg总RNA模板或AMV1-200单位/μg总RNA模板。
6.根据权利要求5所述的反应方法，其特征在于步骤(1)的反转录酶为MMLV4-50单位/μg总RNA模板或AMV4-50单位/μg总RNA模板。
7.权利要求3所述的反应方法在提高RT-PCR扩增专一性中的应用，其特征在于步骤(1)的反应温度为4-37℃，限制比目标扩增产物长度更长的cDNA的合成。
8.权利要求3所述的反应方法在提高多重RT-PCR扩增专一性中的应用，其特征在于步骤(1)的反应温度为25-37℃，限制比目标扩增产物长度更长的cDNA的合成。
9.权利要求3所述的反应方法在提高RT-PCR扩增专一性中的应用，其特征在于步骤(1)的反应温度为50-75℃，以降低RNA二级结构和增强反转录及扩增产物的专一性。
10.权利要求5所述的反应方法在提高RT-PCR扩增专一性中的应用，其特征在于降低反转录酶用量至MMLV1-200单位/μg总RNA模板或AMV1-200单位/μg总RNA模板来限制比目标扩增产物长度更长的cDNA的合成。
全文摘要
本发明涉及一种一管式反转录聚合酶链式反应方法及其在提高RT－PCR和多重RT－PCR反应专一性中的应用，特别涉及缩短反转录反应时间至0.5－15分钟、扩展常温反转录酶MMLV和AMV的反转录步骤的反应温度范围为4－37℃或50－75℃和减少反转录酶的用量至MMLV4－50单位/μg总RNA模板或AMV4－50单位/μg总RNA模板的技术方案，使反应加快、反应专一性获得显著提高。本发明适用于实验室用RT－PCR试剂盒和医学核酸检测用RT－PCR试剂盒的方案设计和制备。
文档编号C12Q1/68GK1552886SQ0312889
公开日2004年12月8日 申请日期2003年5月29日 优先权日2003年5月29日
发明者徐定邦, 朱德芬, 谢文凯, 徐文慧 申请人:徐定邦, 徐文慧