专利名称：恶臭假单胞菌zwl73及其制法和应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及微生物领域，特别是一种恶臭假单胞菌ZWL73及其制法和应用。本专利用的微生物即恶臭假单胞菌ZWL73(Pseudomonas putida ZWL73)，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期是2003年4月4日，保藏号是CCTCC NOM 203021。
背景技术：
众所周知，氯代硝基苯类化合物(Chloronitrobenzenes，以下简称CNBs)作为原材料和中间体被广泛用于生产和制造各种染料、农药、医用药品，氯代硝基苯等芳香族化合物具有多种途径进入环境成为污染物，例如残留在生产过程中排放的废水、作为染料、农药等生产过程的中间体的不彻底转化而随废物排放。欧共体早已宣布氯代硝基苯是一种特别有害的化合物且在环境中难以降解(EEC，1982)，我国确定其为水中的优先污染物。氯代硝基苯还被发现会引起人体和动物的高铁血红蛋白血症(methemoglobinemia)(Linch，1974)，而且是一种诱变剂(Shimizu，1983)和致癌剂(Weisburger，1978)。因比，研究氯代硝基苯类化合物的生物降解对于环境保护及人类的健康具有重要意义。
对于氯代硝基苯类化合物的生物降解，以及微生物对此类化合物降解途径鲜有报道，有些工作者观察到了对CNBs的生物转化而不是它们的彻底无机化，例如，假单胞杆菌CBS3菌株的静止细胞以低速率将1-氯-4-硝基苯(以下简称1C4NB)转化成4-氯苯胺等物，但不能继续降解(Schackmann and Muller，1991)。Livingston(1993)用一混合培养物降解1-氯-3硝基苯，并使其彻底无机化。而Park(1999)等人用两株菌株共同作用，将1-和2-C4NBs降解并无机化。细菌LW1(属于Comamonadaceae)能够利用1C4NB作为唯一的碳源、氮源和能源生长，推测其代谢途径可能是通过2-氨基-5-氯酚作为开环底物(Katsivela et al.，1999)，这是目前国内外有关纯培养微生物菌株彻底矿化氯代硝基苯仅有的两个报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种恶臭假单胞菌ZWL73及其制法和应用，该菌以1C4NB作为唯一的碳源、氮源和能源生长，从而为生物治理这类化合物的污染提供充足的菌种资源。
本发明解决其技术问题的方案是恶臭假单胞菌ZWL73，是通过16S rDNA序列测定且与GenBank已收录的序列进行核苷酸同源性比较而确定的。
恶臭假单胞菌ZWL73，作为1-氯-4-硝基苯的降解菌，其以1-氯-4-硝基苯作为唯一的碳源、氮源和能源生长。
恶臭假单胞菌ZWL73的制备方法，包括如下步骤a.配制无机盐培养基成分为Na2HPO4·12H2O 14.3g；KH2PO43.0g；MnSO4·H2O 0.28mg；FeSO4·7H2O0.3mg；MgSO4 0.06mg；CaCL21mg；CuSO40.05mg；ZnSO40.05mg和H3BO30.05mg，将其以双蒸水定容至1000ml，调pH 7.0，高压灭菌。
b.菌种的富集从化工厂土壤中取样，将土样配制成20％悬浮液，以10％的接种量接种到含1-氯-4-硝基苯(0.5mM)的无机盐培养基中，恒温30℃，摇床培养，待菌长出后，取1％菌液接入同样培养基中，继续摇床培养。
c.分离在获得有显著降解性能的富集培养物后，利用平板培养技术，将培养物在含1-氯-4-硝基苯的无机盐培养基中反复分离和纯化，得到菌体形态一致的降解菌。
本发明具有如下优点其一.恶臭假单胞菌ZWL73可耐受较高浓度的1C4NB，并能以之为唯一C、N源生长。因此，该菌能够彻底降解对环境毒害较大的1C4NB，且其降解能力强，若按1％接种的培养物可在48小时内彻底降解6.3mM的1C4NB，同时，可将其转化为对环境无毒害的物质，或为菌体所利用。
其二.恶臭假单胞菌ZWL73的分离和获得，为今后研究微生物对1C4NB的降解代谢途径，以及从分子生物学水平揭示1C4NB的降解途径和机理，提供了材料。
其三.鉴于恶臭假单胞菌ZWL73能够彻底降解1C4NB的能力，该菌为生物治理这类化合物污染提供了菌种资源。
其四.对恶臭假单胞菌ZWL73的深入研究，可以为此类污染物引起的环境问题的生物控制和生物修复提供理论和技术基础。
其五.恶臭假单胞菌ZWL73的制备方法简单，操作方便。
图1是恶臭假单胞菌ZWL73的电镜照片(×12000)。
图2是恶臭假单胞菌ZWL73的质粒pZWL73的琼脂糖凝胶电泳图。
图3是质粒pZWL73的限制性内切酶EcoRI酶切片段的琼脂糖凝胶电泳图。
图4是恶臭假单胞菌ZWL73利用1-氯-4-硝基苯生长曲线。
图5是恶臭假单胞菌ZWL73的16S rDNA序列具体实施方式
本发明是一种恶臭假单胞菌ZWL73(Pseudomonas putida ZWL73)CCTCC 203021及其制法和应用。下面结合实施例及附图对本发明作进一步说明。
一.恶臭假单胞菌ZWL731.形态特征菌落呈白色，光滑，边缘整齐。菌体呈短杆状，极生多重鞭毛(见图1)，革兰氏染色阴性。
鞭毛观察方法接种该菌于含0.6％琼脂的LB斜面，30℃，静止培养10小时，蒸馏水洗下菌体，制样，电镜观察。
2.16S rDNA1)序列如图5所示，约1500bp片段，16s rRNA为原核生物核糖体亚基16s RNA，在原核生物中具有较高的保守性，能够提供科、属、种、等多层次的信息。
2)制备方法用E.Z.N.A.Bacterial DNA kit(Omega Bio-tek)制备细菌基因组DNA。以细菌16SrDNA通用引物1492R(5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3)和细菌的特异引物27F(5-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3)为扩增引物，细菌基因组DNA为模板，扩增降解菌的16S rDNA(约1500bp)片段，送交上海基康生物技术有限公司测序。
3)同源性比较用NCBI(natioal center for biotechnology information)BLAST程序对该菌的16SrDNA序列和GenBank已收录的序列进行核苷酸同源性比较，16S rDNA序列与GenBank中的16S rDNA序列的同源性见附表，与之序列同源性达到99.8～99.9％的菌种主要是Pseudomonas putida菌株。所以鉴定该菌为恶臭假单胞菌，并命名为恶臭假单胞菌ZWL73(Pseudomonas putida ZWL73)。
3.质粒检测通过碱裂解法提取(参照分子克隆实验指南第二版p19)，发现该菌具有一较大质粒pZWL73(见图2的73样品)。与标准的117kb的恶臭假单胞菌PaW1的TOL质粒pWWO(见图2的pWWO样品)，以及81kb的恶臭假单胞菌NCIB 9816-4的pDTG1质粒(见图2的9816样品)比较，该菌质粒pZWL73约为100kb。用限制性内切酶EcoRI酶切pZWL73质粒，经琼脂糖凝胶电泳，得到pZWL73质粒特征性的EcoRI酶切片段电泳图(见图3的2电泳孔)。
图3中的1是分子量对照λ-HindIII酶切片段，该片段由大到小分别为23kb、9.4kb、6.5kb、4.3kb、2.3kb、2.0kb和0.56kb。
二.恶臭假单胞菌ZWL73的应用恶臭假单胞菌ZWL73作为1-氯-4-硝基苯的降解菌，该菌以1-氯-4-硝基苯作为唯一的碳源、氮源和能源生长。
恶臭假单胞菌ZWL73降解1-氯-4-硝基苯的特性如下接种恶臭假单胞菌ZWL73于0.5mM 1C4NB的10ml无机盐培养基，28℃摇床培养过夜，转接于含1mM 1C4NB的100ml无机盐培养基中，28℃摇床培养过夜，离心收集菌体，用新鲜的含0.33mM 1C4NB的无机盐培养基重悬菌体，28℃摇床培养，不同时间间隔取样，用HPLC法测1C4NB浓度，OD600测定菌体浓度，离子选择电极(奥力龙)测定氯离子浓度，奈氏法测定铵离子浓度，结果见图3。
图4结果表明随着培养时间增加，1C4NB的浓度逐渐降低，菌体浓度逐渐增加，并伴随着铵离子和氯离子产生。因无机盐培养基中不含有碳，氮源，恶臭假单胞菌ZWL73细菌不能利用其生长，而补充了1C4NB的无机盐培养基可供该菌生长，表明该菌以1C4NB为唯一C、N源生长。另外铵离子的产生表明1C4NB中的硝基首先被彻底还原为氨基，然后经分解产生铵离子，氯离子也是在1C4NB分解时产生。在图4中， 曲线表示菌体浓度(OD600吸收值)， 曲线表示1C4NB的浓度， 曲线表示铵离子浓度 曲线表示氯离子浓度。
按1％接种量，将Pseudomonas putida ZWL73菌接种于6.3mM 1C4NB的100ml无机盐培养基，恒温28℃，摇床培养48小时，即可使1C4NB完全降解。
三.恶臭假单胞菌ZWL73的制备a.配制无机盐培养基成分为Na2HPO4·12H2O 14.3g；KH2PO43.0g；MnSO4·H2O 0.28mg；FeSO4·7H2O0.3mg；MgSO4 0.06mg；CaCL21mg；CuSO40.05mg；ZnSO40.05mg和H3BO30.05mg，将其以双蒸水定容至1000ml，调pH7.0，高压灭菌。
b.菌种的富集从武汉市葛店化工厂土壤中取样，将土样配制成20％悬浮液，以10％的接种量接种到含1-氯-4-硝基苯(0.5mM)的无机盐培养基中，恒温30℃，摇床培养，待菌长出后，取1％菌液接入同样培养基中，继续摇床培养。
c.分离在获得有显著降解性能的富集培养物后，利用平板培养技术，将培养物在含1-氯-4-硝基苯的无机盐培养基中反复分离和纯化，得到菌体形态一致的降解菌。
四.附表恶臭假单胞菌ZWL73的16S rDNA的BLAST分析
权利要求
1.一种恶臭假单胞菌ZWL73(Pseudomonas putida ZWL73)CCTCC 203021，其特征在于所述的恶臭假单胞菌ZWL73，其16S rDNA序列如下GTCGAGCGGATGACGGGAGCTTGCTCCTTGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGCTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTACGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGAATCCTTGAGATTTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATGCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCTCACAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGAGGACGGTTACCACGGTGTGATTCATGACTGGG
2.恶臭假单胞菌ZWL73 CCTCC 203021的应用，其特征在于恶臭假单胞菌ZWL73作为1-氯-4-硝基苯的降解菌，该菌以1-氯-4-硝基苯作为唯一的碳源、氮源和能源生长。
3.恶臭假单胞菌ZWL73 CCTCC 203021的制备方法，包括如下步骤a.配制无机盐培养基成分为Na2HPO4·12H2O 14.3g；KH2PO43.0g；MnSO4·H2O 0.28mg；FeSO4·7H2O0.3mg；MgSO4 0.06mg；CaCL21mg；CuSO40.05mg；ZnSO40.05mg和H3BO30.05mg，将其以双蒸水定容至1000ml，调pH 7.0，高压灭菌，b.菌种的富集从化工厂土壤中取样，将土样配制成20％悬浮液，以10％的接种量接种到含1-氯-4-硝基苯(0.5mM)的无机盐培养基中，恒温30℃，摇床培养，待菌长出后，取1％菌液接入同样培养基中，继续摇床培养，c.分离在获得有显著降解性能的富集培养物后，利用平板培养技术，将培养物在含1-氯-4-硝基苯的无机盐培养基中反复分离和纯化，得到菌体形态一致的降解菌。
全文摘要
本发明是一种恶臭假单胞菌ZWL73及其制法和应用。恶臭假单胞菌ZWL73，是通过16S rDNA序列测定且与GenBank已收录的序列进行核苷酸同源性比较而确定的；该菌作为1－氯－4－硝基苯的降解菌，其以1－氯－4－硝基苯作为唯一的碳源、氮源和能源生长；该菌的制备方法，包括配制无机盐培养基、菌种的富集和分离步骤，得到菌体形态一致的降解菌。本发明具有制备方法简单、操作方便和降解1－氯－4－硝基苯化合物能力强等优点，为生物治理这类化合物的污染提供了菌种资源，从而利于环境保护及人类的健康。
文档编号C12N1/20GK1513980SQ0312812
公开日2004年7月21日 申请日期2003年6月10日 优先权日2003年6月10日
发明者周宁一, 刘虹, 王淑君 申请人:中国科学院武汉病毒研究所