专利名称：高产的重组乙型流感病毒株及其用途的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种高产的重组乙型流感病毒株及其用途，以及重组该病毒毒株的核酸和引物，特别是经由该毒株而制备的乙型流感疫苗。
背景技术：
流行性感冒是由流感病毒引起的一种呼吸道疾病。据《科学》杂志报道，在流感高发季节，由于劳动力减少和医疗费用增加，给美国带来的经济损失超过120亿美元。另外，每年都有2万以上的美国人因为流感而丧生。
1918年席卷全球的流感风暴，共造成2000万-4000万人死亡，超过第一次世界大战中死亡人数的总和。最近一次横扫全球的流感发生在1968年，夺走了全世界近50万人的生命，其中绝大多数是老年人，但是，也有许多曾经是健康的年轻人。流感爆发是因为出现了致命的病毒变异株。而英国《自然》杂志称，这样的致命病毒变异平均每30年至40年出现一次。这种危险在1997年已经露出苗头。那一年，香港有18人被一种禽流感病毒感染，6人丧生。2001年5月，香港又发现了禽流感病毒，尽管这一次的病毒被认为不会感染人类，香港政府仍然不惜损失2.45亿港币，处死了大约1300万只家禽。
要避免流感再一次爆发，最重要的是，及时察觉病毒致命变异和准备相应疫苗。WHO自1948年启动了全球流感监测网络。每年，WHO都要汇总各国流感病毒毒株的流行情况，然后分析下一年可能流行的病毒类型，并提前6个月公布结论，各厂家则以此为依据生产疫苗。尽管许多人认为这个网络行之有效，但它目前的工作效率和研究水平并不能保证病毒致命变种一旦出现时做出准确而迅速的反应。
流感病毒在世界范围内引起人畜的发病和死亡。流感的流行常由甲和乙型流感病毒引起，流感病毒的表面抗原是流感疫苗的重要组成部分(Jackson D，CadmanA，Zurcher T，Barclay WS.A reverse genetics approach for recovery ofrecombinant influenza B viruses entirely from cDNA.J Virol.2002Nov；76(22)11744-7)。但是，流感病毒由于抗原转换或抗原漂移常导致新的变异抗原的出现，因此疫苗株需要经常被更换(Hoffmann E，Mahmood K，Yang CF，Webster RG，Greenberg HB，Kemble G.Rescue of influenza B virus from eightplasmids.Proc Natl Acad Sci U S A.2002 Aug 20；99(17)11411-6)。当前获得批准生产的是鸡胚来源的灭活疫苗，尽管采取得了有效的病毒纯化工艺，但是仍然存在着许多不足。不光需要大量的鸡胚，而且生产周期长。在组织培养中产生的疫苗在动物模型中取得了比较好的保护性(Govorkova EA，Murti G，Meignier B，de Taisne C，Webster RG.African green monkey kidney(Vero)cells provide an alternative host cell system for influenza A and B viruses.J Virol.1996 Aug；70(8)5519-24)。目前，哺乳动物细胞MDCK细胞被认为是培养甲型和乙型流感病毒最合适的细胞系(Robertson JS.Related Articles，Links An overview of host cell selection.Dev Biol Stand.1999；987-11；discussion 73-4)，此细胞系具有感染后迅速产生流感病毒，在短时间内取得高滴度的特点。另外MDCK来源的病毒经过连续传代后，保持了抗原的稳定性(Govorkova EA，Kodihalli S，Alymova IV，Fanget B，Webster RG.RelatedArticles，Links Growth and immunogenicity of influenza viruses cultivatedin Vero or MDCK cells and in embryonated chicken eggs.Dev Biol Stand.1999；9839-51；discussion 73-4)。
然而，不是所有的病毒都适合在某些细胞中生长而可以成为疫苗株的，例如一些病毒在鸡胚和/或哺乳动物细胞中产量很低。因此，要解决的问题是获得高产的重配株，目前采用的方法是将实验室的已经得到的高产毒株与流行毒株的HA和NA片段进行重配，使疫苗株既保持高产的特性，又具有流行毒株抗原性的特点(Hoffmann E，Mahmood K，Yang CF，Webster RG，Greenberg HB，Kemble G.Rescueof influenza B virus from eight plasmids.Proc Natl Acad Sci U S A.2002Aug 20；99(17)11411-6)。
反向遗传技术的发展使快速获得流感疫苗成为可能。在重组出高产母毒株的基础上获得疫苗株只需要简单的克隆，和转染技术，大约需要两周的时间，而用经典的重配方法获得重组病毒需2个月的时间，因此用反向遗传方法获得疫苗株极大地缩短了疫苗的生产时间。Neuman(Gabriele Neumann and Yoshihiro Kawaoka，1Virology 287，243±250(2001))将反义遗传技术定义为由cDNA产生负链RNA的过程，要由RNP复合物参与。这种技术的发展经历了多个阶段。1989年，帮助病毒系统产生了。Palse研究小组建立了第一个研究负链RNA病毒的系统，开创了从克隆cDNA产生重组vRNA的新纪元，创造了RNP转染方法。Hobom和Colleagues(Neumann，G.，Zobel，A.，and Hobom，G.(1994).RNA polymerase I-mediated expression of influenza viral RNAmolecules.Virology 202，477±479.)推进了一步，首次应用了RNA Polymerse1和Helper virus系统。
Polymerse1的特点表现为1，Polymerse1转录rRNA不包含5’帽子和3’尾结构，利用这一点可以转录出病毒基因组。
2，用特定长度的启动子和终止子不会延长转录区，保证病毒基因组的完整性Polymerse1系统的优点是比RNP转染方法更便利，不需要体外转录，蛋白纯化，和RNP的装配。
但是值得注意的是以上两个系统都存在着缺点即产量低，产生的大多是缺陷病毒。帮助病毒背景高，需要大量筛选工作。使得这种技术的实用性显得不足。于是在1994年，Conzelmann等人(Schnell，M.J.，Mebatsion，T.，and Conzelmann，K.K.(1994).Infectious rabies viruses from cloned cDNA.EMBO J.13，4195±4203.)用T7RNA聚合酶系统制备了狂犬病毒。1999年Neuman(Neumann，G.，Watanabe，T.，Ito，H.，Watanabe，S.，Goto，H.，Gao，P.，Hughes，M.，Perez，D.，Donis，R.，Hoffmann，E.，Hobom，G.，and Kawaoka，Y.(1999).Generationof influenza A viruses entirely from cloned cDNAs.Proc.Natl.Acad.Sci.96，9345±9350.)等人成功克隆了流感病毒，他们采用了12个质粒共转染的方法，其中8个质粒分别转录出病毒的基因组节段，4个质粒表达与病毒复制相关的蛋白，用这12个质粒共转染哺乳动物细胞，获得了重组病毒颗粒。该系统的缺点是，12个质粒共转染增加了转染的难度，限制了细胞系的使用。此后Hoffmann(HoffmannE，Stech J，Guan Y，Webster RG，Perez DR.Universal primer set for thefull-length amplification of all influenza.A viruses.Arch Virol2001；1462275-89.)在此基础上发明了8个质粒系统，不仅能转录出病毒的全部基因组，还能表达出所有的病毒蛋白，利用此系统，成功地包装出了流感病毒。
乙型流感病毒基因组的特点像甲型流感病毒一样，为正粘病毒科成员，由8个分节段的负链RNA来组成。总体上讲，乙型流感病毒编码的蛋白与甲型相似，其第六和第七片段表现出特定的特点，所述的第六节段编码NA和NB蛋白，NB蛋白的功能与M2蛋白相似，第七节段编码M1和BM2蛋白，这些遗传上的特性的不同也许有助于理解乙型流感病毒的宿主范围限制以及其它性质的不同。
乙型流感病毒根据HA1区的不同分为Yamagata系和Victoria系，他们的共同特点是在病毒基因组的3’和5’末端有9个碱基的保守区，而10，11位是相对变化的(见表)。(流感病毒的3’和5’末端9个碱基的保守区用粗黑字母表示，其中HA，NA，NS片段的5’端的第6位为T其余片段第六位为A)。
由此可见，寻找一高产的乙型流感病毒母株，获得其全部8个基因片段的克隆然后将高产毒株基因与流行毒株的HA和NA片段进行重配，使疫苗株既保持高产的特性，又具有流行毒株抗原性的特点，这样来制备乙型流感疫苗，将是流感疫苗生产的重大变革。
发明内容
为了克服现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一组新的乙型流感病毒高产株的全基因序列。
本发明的目的在于提供一组包含有本发明的新的乙型流感病毒全基因序列的质粒。
本发明的另一目的在于提供一组引物，用于扩增出乙型流感病毒的全部(8个)片段，即乙型流感病毒的全基因序列。
本发明的另一目的在于提供一种含有乙型流感病毒抗原特征的高产重组病毒株。
本发明的另一目的在于提供一种含有乙型流感病毒流行株抗原特征的高产重组病毒株。
本发明的另一目的在于提供一种由本发明所述的含有乙型流感病毒流行株抗原特征的灭活和/或减毒重组病毒组成的乙型流感疫苗。
为了完成本发明的目的，本发明提供一种新的乙型流感病毒全基因序列，该序列包括序列1，序列2，序列3，序列4，序列5，序列6，序列7，序列8。
这些序列详细记载在序列表中，其中序列1为NS序列，序列2为M序列，序列3为NA序列，序列为4 HA序列，序列5为Np序列，序列6为Pa序列，序列7为Pb2序列，序列8为Pb1序列。
本发明还提供一组包含有本发明的新的乙型流感病毒全基因序列的质粒。所述的质粒包括PCDNA3.1-BPB1，PCDNA3.1-BPB2，PCDNA3.1-BPA，PCDNA3.1-BNP，PCDNA3.1-BHA，PCDNA3.1-BNA，PCDNA3.1-BNS，PCDNA-3.1-BM，PHH21-BPB1，PHH21-BPB2，PHH21-PA，PHH21-NP，PHH21-HA，PHH21-NA，PHH21-NS，PHH21-BM，PIVVII-BNS，PIIVII-BM，PIVVII-BHA，PIVVII-BNA，PIVVII-BNP，PIVVII-BPA，PIVVII-BPB2，PIVVII-BPB1，优选的是PIVVII-BNS，PIVVII-BMPIVVII-BHA，PIVVII-BNA，PIVV2II-BNP，PIVVII-BPB1，PIVVII-BPB2，PIVV-BPA。
本发明还提供一组引物，用于扩增出乙型流感病毒的全部序列1至序列8的8个片段，即乙型流感病毒的全基因序列，该引物包括BM-NS-15’-ATCGTCTCTGGGAGCAGAAGCAGAGCA-3’BM-NS-25’-GGCGTCTCGTATTAGTAGTAACAAGAG-3’BM-U-15’-AACGTCTCTGGGAGCAGAAGC-3’BM-U-25’-GGCGTCTCGTATTAGTAGAAAC-3’BM-PA-1-5-TTCGTCTCAGGGAGCAGAAGCGGT-3BM-PB1-15-TTCGTCTCTGGGAGCAGAAGCGGAGCTTTAAG-3BM-PB2-1-5-TTGGTCTCAGGGAGCAGAAGCGGAGCGTTTTCAAG.-3本发明人经过对GENE BANK中的乙型流感病毒基因片段两端的序列，进行类比分析，设计两套引物，即BM-NS-1与BM-NS-2和BM-U-1与BM-U-2来扩增流感病毒的全部8个基因片段，
用RT-PCR方法扩增vRNA的所有8个片段，参照病毒RNA末端保守序列互补的序列作为引物。
BM-NS-15’-ATCGTCTCTGGGAGCAGAAGCAGAGCA-3’BM-NS-25’-GGCGTCTCGTATTAGTAGTAACAAGAG-3’BM-U-15’-AACGTCTCTGGGAGCAGAAGC-3’BM-U-25’-GGCGTCTCGTATTAGTAGAAAC-3’以上两套引物可以扩增出流感病毒的全部8个片段。但是因为流感病毒RNA聚合酶三个片段长度均为2.3Kb左右，所以不容易区分，又分别设计引物来扩增三个大片段BM-PA-1-5-TTCGTCTCAGGGAGCAGAAGCGGT-3BM-PB1-15-TTCGTCTCTGGGAGCAGAAGCGGAGCTTTAAG-3BM-PB2-1-5-TTGGTCTCAGGGAGCAGAAGCGGAGCGTTTTCAAG.-3本发明的引物通过RT-PCR方法可以扩增出高产毒株的全基因组，而且也可以应用于扩增绝大多数乙型流感病毒的基因片段。
本发明还提供一种含有乙型流感病毒抗原特征的高产重组病毒株，该病毒株含有上述的核酸序列1至序列8，其序列的具体情况见序列表。
经过本发明方法得到的重组乙型流感病毒毒株已经于2003年1月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，B/京科/96/2001，其保藏号为0880。
本发明还提供应用乙型流感病毒基因的8个质粒共转染哺乳动物细胞，进而获得重组病毒株的方法。
本发明还提供一种由本发明所述的含有流行乙型流感病毒抗原特征的灭活和/或减毒重组病毒组成的乙型流感疫苗。
本发明还涉及一种制备本发明的新的乙型流感病毒毒株的方法，该方法包括以下步骤用所述的引物BM-NS-1，BM-NS-2，BM-U-1，BM-U-2，BM-PA-1，BM-PB1-1，BM-PB2-1扩增出乙型流感病毒全基因组片段；将得到的基因组片段与PIVVII载体相连；将得到的含有所述基因组片段的PIVVII质粒转染293T和MDCK共培养细胞；收获转染的含有流感病毒的上清液。
以及，本发明还涉及一种制备乙型流感疫苗的方法，该方法包括以下步骤在MDCK上培养重配的病毒株；收集该细胞培养上清液；离心去除碎片；超滤得到浓缩重组病毒。所述的重配病毒株是指含有本发明序列1，序列2，序列5，序列6，序列7，序列8以及流行的流感病毒毒株的序列3(NA)，序列4(HA)。
按照本领域技术人员公知的方法，可以对浓缩重组病毒区带超速离心；用PBS洗涤，再离心。
本发明还提供一种乙型流感病毒株，其特征在于其基因序列包括本发明所述的序列1，序列2，序列5，序列6，序列7，序列8以及流行乙型流感病毒毒株的HA，NA序列。
本发明所述的流感疫苗是一种重配乙型流感病毒株毒株的灭活和/或减毒的乙型流感疫苗。
实际上，根据本发明，发明人得到的乙型流感毒株在哺乳动物细胞上具有高产的特性，它可以克服用鸡胚生产疫苗的不足。这种哺乳动物细胞，特别是MDCK细胞株可以用作为疫苗生产的细胞系，因此本发明的重组病毒株具有极高的应用价值。
另外，重组毒株除HA和NA片段外的六个基因片段的序列起到了决定高产特性的关键作用，本发明人包装出的毒株的优势在于，转染后产生病毒的时间快，仅在30小时就能产生大量(8×104PFU/ML)的病毒。
应当说明的是，本发明的重组乙型流感病毒毒株在鸡胚和哺乳动物细胞上均高产，特别适于成为疫苗生产的母株。
本发明还提供一种乙型流感病毒株，其基因序列包括本发明所述的序列1，序列2，序列5，序列6，序列7，序列8以及流行乙型流感病毒毒株的HA，NA序列。
图1为用BM-U引物分别在1.1Kb，I.8Kb和2.3Kb处有条带，测序结果分别为M片段，NP片段，和3个大片段。
图2为用NS引物扩增的结果在1.1Kb，1.5Kb，1.8Kb处有条带，，测序结果证实分别为NS，HA，NA片段。
图3为3个大片段的特异性引物扩增的结果可在2.3KB处分别见到条带。
图4，酶切NS片段。
图5，右1NA-PIVV2Nco1酶切，右2HA-PIVV2Hind3酶切，左1，2，3，PB2 Sca1酶切。
图6 SCA1酶切M片段。
图7，NDE1酶切PB2。
图8，Pvu2与HIind3酶切PA。
图9，左1PB2(PB1)SCA1酶切，Sca1量不足。左2，3Nco1酶切，NP-PIVV2。右1，2Hind3酶切HA-PIVV2。
图10为质粒构建图。
图11为实验原理图。
图12为流行毒株和高产毒株重配原理图。
具体实施例方式
实施例1 乙型流感病毒全部基因组的获得毒株B/京科/96/01来源于国家流感中心，B/四川/379/99和B/HongKong/330/01来源于美国CDC。
RT-PCR将筛选到的毒株B/京科/96/01进行倍比稀释，接种MDCK细胞，72小时后收获病毒，使用Rneasy KIT(Qiagen)提取病毒RNA，溶于30ul水稀释。
RT-PCR反应体系在94℃变性3分钟，55℃延伸1小时，逆转录酶为Invitrogen公司提供，然后PCR体系为94℃ 45Sec 50℃ 45Sec 72℃ 420Sec，PFU酶购自(Promega)公司。
扩增B/京科/96/01的全部基因组，使用BM-NS-1 BM-NS-2引物扩增出流行毒株的HA和NA片段，将PCR产物连接到PGEM-T载体(Promega公司)上。
经过本发明的方法得到的结果是参见图1，用NS引物扩增的结果在1.1Kb，1.5Kb，1.8Kb处有条带，测序结果证实分别为NS，HA，NA片段。参见图2，为用BM-U引物分别在1.1Kb，I.8Kb和2.3Kb处有条带，测序结果分别为M片段，NP片段，和3个大片段。参见图3，为3个大片段的特异性引物扩增的结果可在2.3KB处分别见到条带。其测序结果见序列表。
由此可见采用本发明设计的几组引物，克隆到乙型流感病毒B/京科/96/01株全部8个完整的基因片段，并克隆到PGEM-T载体上，应用荧光标记法测定了全部cDNA序列。从而得到以下8个基因片段。
本发明得到的乙型流感病毒的非编码区和及其片段大小基因 正向保守区 反向保守区大小PB1BM-PB1-1 BM-PB12397AGCAGAAGCGGAGCTTTAAG AGTAGAAACACGPB2BM-PB2-2381BM-PB2-2381AGCAGAAGCGGAGCGTTTTC AGTAGAAACACGPABM-PA-1 BM-PB2-23812309AGCAGAAGCGGTGCGTTTG AGTAGAAACACG BM-NS-1 BM-NS-10991885AGCAGAAGCAGA(GTT) AGTAGTAACAAGNPBM-NS-1 BM-NP-18441844AGCAGAAGCAGA(ACA) AGTAGAAACAGC BM-NS-1 BM-NS-10991559AGCAGAAGCAGA(GCC) AGTAGTAACAAGM BM-M-1 BM-M-11911191AGCAGAAGCAGGC(ACGG) AGTAGAAACAACNSBM-NS-1 BM-NS-10991099AGCAGAAGCAGA AGTAGTAACAAG在本发明中，应用了8个质粒系统，优选的质粒分别为PIVVII-BPB1，PIVVII-BNS，PIVVII-BM，PIVVII-BHA，PIVVII-BNA，PIVVII-BNP，PIVVII-BPB2，PIVVII-BPA共转染哺乳动物细胞后包装出了一株乙型流感病毒，并对包装出的毒株进行了毒力检测，得到在哺乳动物细胞和鸡胚上均高产的病毒株。
实施例2 PIVVII质粒的构建一PIVVII质粒的构建参见图10和图11示出的质粒图和实验原理。
1PIVVII质粒的特点发明人构建了PIVVII质粒。该质粒的特点是同时具有聚合酶I和聚合酶II的启动子和终止子序列，聚合酶I和聚合酶II的启动子方向相反。将病毒基因组插入到聚合酶1的启动子和终止子序列的BSMB1位点之间，在聚合酶1启动子的作用下转录出病毒的基因组，在聚合酶II启动子的作用下转录出病毒的mRNA，翻译出病毒的蛋白，2PIVVII质粒的构建方法将PHH21质粒(Neumann G馈赠)的启动子和终止子序列扩增，用引物上游5’ATCCCTAGGGCGGCCGGGAGGGCGTCCCCGGCC3’下游5’GTGAAGCTTCGGAGTACCGGTCGACCTCCGAAG3’然后用AvuII和HindHI双酶切后，连接到PcDNA3.1上，然后经测序证实插入的序列为目标序列。
实施例3 病毒基因组的片段分别与PIVVII载体相连将实施例2得到的PIVVII质粒载体用BSMB1酶切线性化，然后用Qiagen回收试剂盒回收线形化的PIVVII片段。同样，将连接到PGEM-T载体的目标片段用BSMB1酶切，然后，回收目标片段。将序列1-8所述的片段分别连接到PIVVII载体上，体系为3ul目标片段，1ul载体，1ulT4DNA连接酶(Promega)15ulddH2O，从而得到连接产物PIVVII-BX。
实施例4 转化将实施例3得到的连接产物转化到感受态菌(Sure菌)中，42℃热休克60秒，冰浴5分钟，再在37℃震荡45分钟，离心，取沉淀涂平板，37℃孵箱中过夜，次日挑单菌落接种于5mlLB培养基中，37℃震荡过夜后小提质粒。
实施例5 酶切鉴定用相应的本领域技术人员公知的方法对内切酶鉴定目标序列是否与载体相连。其中PIVVII-BNS Nde1 Pst1双酶切，片段大小为1.1Kb 3.5Kb 1.5Kb。
PIVVII-BNP Nco1酶切，500bp 700bp 900bp 1.8Kb。
PIVVII-BM Sca1酶切，片段大小为500bp 300bp 1.1Kb 1.7Kb 3.4Kb。
PIVVII-BHA Nco1酶切，片段大小为1.7Kb 1.5Kb 700bp。
PIVVII-BNA Nco1酶切，片段大小为1.6Kb(2)700bp。
PIVVII-BPB2 Nde1酶切，片段大小为1.3Kb 900bp 6.7Kb。
PIVVII-BPB1 Nde1酶切，片段大小为500bp，700bp，900bp，1.5Kb，3.7Kb。
PIVVII PA酶切，片段大小为1.0Kb，1.6Kb，4.7Kb。
其中酶切的结果是参见以下各个对附图的说明。
图4，酶切NS片段。
图5，右1NA-PIVV2Nco1酶切，右2HA-PIVV2Hind3酶切，左1，2，3，PB2 Sca1酶切。
图6 SCA1酶切M片段。
图7，NDE1酶切PB2。
图8，Pvu2与HIind3酶切PA。
图9，左1PB2(PB1)SCA1酶切，Sca1量不足。左2，3Nco1酶切，NP-PIVV2。右1，2Hind3酶切HA-PIVV2。
实施例6 转染将293T和MDCK细胞共培养在12.5CM2的细胞培养瓶中待细胞80％成片后，将1ug/DNA Per与2ulLF2000混合在室温放置45分钟，然后加入到细胞瓶内，在6小时后，用optim-MEM维持液在33℃孵箱中继续孵育，在转染的30小时后加入TPCK-Trypsin至终浓度1ug/ml，分别收获24小时，48小时和72小时的病毒悬液接种MDCK细胞。
实施例7 重组病毒的连续传代在接种重组病毒的前一天将细胞接种于培养瓶，第二天使细胞数达到3-4×106，接种病毒的MOI值为1×10-4TCID50/，1×10-5CID50/每细胞，维持液包含TPCK-Trypsin，在感染后的24，48小时再分别加入使TPCK-Trypsin的终浓度达到1ug/ml，在33℃培养72或96小时收获病毒。
实施例8 重组病毒产量的检测将重组病毒接种MDCK细胞后的第一代，第五代，第十代和第十五代分别做TCID50和PFU的检测。
TCID50检测将细胞在24孔板上培养成单层，将病毒进行倍比稀释，接种细胞到24孔板上，每个稀释度平行加入4个孔，每孔加入200UL，33℃孵育1小时后用HANK’S洗，然后加入包含TPCK-Trypsin的维持液。在感染后的24，48，72小时分别加入TPCK-Trypsin，在感染后的的72小时收获病毒，冻存于-70℃冰箱过夜，第二天根据HAU计算出TCID50。
PFU检测将病毒进行倍比稀释，接种于小方瓶，每小方瓶加入500UL病毒稀释液，33℃孵育1小时后，用HANKS液冲洗，然后加入第一层覆盖液，33℃孵育72小时后加入第二层覆盖液，24小时后计数空斑。
测序将感染后的第一代和第十五代病毒悬液提取病毒RNA测定HA片段的DNA序列。
结果显示重组病毒株的特征应用反向遗传学将8个质粒共转染真核细胞后，获得了重组病毒，为在MDCK细胞上高产的毒株，在鸡胚上产量也非常高证据为重组病毒在鸡胚上传代，其中转染后24小时上清接种MDCK细胞1代后的悬液再接种鸡胚的HAU最高达到1280，在MDCK细胞上传15代。在MDCK细胞上第一代HAU为1∶40到第15代的1∶640，感染病毒的滴度从第一代的8×104PFU，6.5Log10TCID50到第十五代的2×109PFU，8.5Log10TCID50，可以看出15代后病毒的毒力有增加的趋势，高产特性得到保持和提高。对HA进行测序后经比较第15代病毒的HA的序列与转染24小时收获病毒的HA的序列完全一致。
实施例9 构建含有流行毒株抗原特征的乙型流感重组病毒参见图12，流行毒株的HA，NA片段与高产毒株其余的本发明所述的序列1，序列2，序列5，序列6，序列7，序列8等6个片段共转染哺乳动物细胞可获得重配病毒作为疫苗株。
参照本领域技术人员公知的方法构建含有流行毒株抗原特征的重组病毒(Eight-plasmid system for rapid generation of influenza virus vaccines.Vaccine.2002 Aug 19；20(25-26)3165-70.)。
换言之，实验方法同实施例6，不同的是将V系与Y系B/HongKong/330/01 B/四川/379/99的HA与NA片段与B/京科/96/01的PB2，PB1，PA，M，NS，NP重配，产生6+2的重配病毒，转染MDCK细胞和接种鸡胚后，仍然保持高产的特性，由此产生的重配病毒可以作为疫苗株。
实施例10 制备乙型流感疫苗在转瓶机上培养含有重配的病毒株的MDCK细胞；培养温度33摄氏度，72-96小时，然后收集该细胞培养上清液；离心12000-15000RPM去除碎片；超滤得到浓缩重组病毒，其中所述的重配病毒株是指含有本发明序列1，序列2，序列5，序列6，序列7，序列8以及流行的流感病毒毒株的HA，NA序列。
对得到的病毒采用本领域技术人员公知的方法灭活后，加入适当的佐剂制成可以使用的乙型流感病毒疫苗。
序列表<110>中国疾病预防控制中心病毒病控制所<120>高产的重组乙型流感病毒株及其用途<130>
<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1099<212>DNA<213>乙型流感病毒(influenza B virus)<400>1agcagaagca gagcatttgt ttagtcactg gcaaacgaaa aaatggagga caacatgatc 60acaacacaaa ttgaggtggg tccgggagca accaatgcca ccataaactt tgaagcagga120attttggagt gctatgaaag gctttcatgg caaagagccc ttgactaccc tggtcaagac180cgcctaaaca ggctaaagag aaaattggaa tcaagaataa agactcacaa caaaagtgag240cctgaaagta aaaggatgtc tcttgaagag agaaaagcta ttggggtaaa aatgatgaaa300gtgctcctat ttatgaaccc atctgctgga gttgaagggt ttgagccata ttgtacgaaa360aatccctcca atagcaactg tccgaactgc aattggtctg attaccctcc aacaccagga420aagtaccttg atgacataga agaagaagaa ccggagaatg ttggtgaccc aactgaaata480gtattaaggg acatgaacaa cagagatgca aggcaaaaga taaaagagga agtaaacact540cagaaagaag ggaaattccg tttaacgata aaaagggata tacgtaatgt gttgtccttg600agagtgttgg taaacggaac attcatcaag caccctaatg gatacaagtc cttatcaact660ctgcatagat tgaatgcata tgaccagagt ggaagacttg ttgctaaact tgttgctact720gatgatctta cagtggagga tgaagaagat ggccatcgga tcctcaactc actcttcgag780
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权利要求
1.一种新的具有哺乳动物细胞高产特征的乙型流感病毒全基因序列，其特征在于该序列包括序列1，序列2，序列3，序列4，序列5，序列6，序列7，序列8。
2.一种包含有权利要求1所述的乙型流感病毒基因序列的质粒。
3.根据权利要求1所述的质粒，其特征在于所述的质粒包括PCDNA3.1-BPB1，PCDNA3.1-BPB2，PCDNA3.1-BPA，PCDNA3.1-BNP，PCDNA3.1-BHA，PCDNA3.1-BNA，PCDNA3.1-BNS，PCDNA-3.1-BM，PHH21-BPB1，PHH21-BPB2，PHH21-PA，PHH21-NP，PHH21-HA，PHH21-NA，PHH21-NS，PHH21-BM，PIVVII-BNS，PIIV II-BM，PIVV II-BHA，PIVV II-BNA，PIVV II-BNP，PIVV II-BPA，PIVV II-BPB2，PIVV II-BPB1。
4.根据权利要求3所述的质粒，其特征在于所述的质粒包括PIVV II-BNS，PIVVII-BM，PIVV II-BHA，PIVV II-BNA，PIVV2 II-BNP，PIVV II-BPB1，PIVVII-BPB2和PIVV-BPA。
5.一组引物，用于扩增乙型流感病毒的基因片段，其特征在于该引物包括BM-NS-1 5’-ATCGTCTCTGGGAGCAGAAGCAGAGCA-3’BM-NS-2 5’-GGCGTCTCGTATTAGTAGTAACAAGAG-3’BM-U-1 5’-AACGTCTCTGGGAGCAGAAGC-3’BM-U-2 5’-GGCGTCTCGTATTAGTAGAAAC-3’BM-PA-1-5-TTCGTCTCAGGGAGCAGAAGCGGT-3BM-PB2-15-TTCGTCTCTGGGAGCAGAAGCGGAGCGTTTTTCAAG-3BM-PB1-1-5-TTGGTCTCAGGGAGCAGAAGCGGAGCG TTTTAAG-3
6.一种含有乙型流感病毒高产株抗原特征的重组病毒毒株，其特征在于该毒株含有如权利要求1上述的基因序列。
7.一种重组乙型流感病毒毒株，其特征在于该毒株已经于2003年1月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，B/京科/96/2001，其保藏号为0880。
8.一种如权利要求6所述的重组乙型流感病毒毒株，其特征在于它适合在哺乳动物细胞上生长。
9.根据权利要求8所述的重组乙型流感病毒毒株，其特征在于所述的哺乳动物细胞是MDCK细胞、和/或人胚肾上皮细胞293T细胞。
10.一种乙型流感病毒株，其特征在于其基因序列包括权利要求1中的序列1，序列2，序列5，序列6，序列7，序列8以及流行乙型流感病毒毒株的HA，NA序列。
11.一种含有如权利要求10所述的乙型流感病毒株的灭活和/或减毒的乙型流感疫苗。
12.一种制备新的乙型流感病毒毒株的方法，该方法包括以下步骤用引物BM-NS-1，BM-NS-2，BM-U-1，BM-U-2，BM-PA-1，BM-PB1-1和BM-PB2-1扩增出乙型流感病毒全基因组片段；将基因组片段与PIVV II载体相连；将得到的含有所述基因组片段的PIVV II质粒转染293T和MDCK共培养细胞；收获转染的含有流感病毒的上清液。
13.一种制备乙型流感疫苗的方法，该方法包括以下步骤在MDCK上培养重配的病毒株；收集该细胞培养上清液；离心去除碎片；超滤得到浓缩重组病毒，其中所述的重配病毒株是指含有本发明序列1，序列2，序列5，序列6，序列7，序列8以及流行的流感病毒毒株的HA，NA序列。
全文摘要
本发明涉及一种新的具有哺乳动物细胞高产特征的乙型流感病毒全基因序列，以及含有该序列的载体和毒株。本发明还涉及采用所述的毒株制备的乙型流感疫苗。
文档编号C12N15/44GK1536077SQ0312180
公开日2004年10月13日 申请日期2003年4月10日 优先权日2003年4月10日
发明者张智清, 齐立, 董婕, 徐红 申请人:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所, 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制