专利名称：增效红花溶栓制剂的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种中药制剂，特别是一种通过一株芽孢杆菌，将其接种于合适的培养基并加有相应比例的红花与其共发酵，不仅可以产生具有直接纤溶能力的纤溶酶，而且可利用其自身存在的丰富酶系，用来改变中药有效成分的结构，具有较高抗氧化能力以及活血化淤功效的增效红花溶栓制剂。
而中药炮制技术是适应中医临床辩证用药的需要而发展起来了一项传统制药技术，一味中药含有多种有效成分，通过不同的炮制方法达到提高药效，改变药性，降低毒副作用等目的。
血栓性疾病尤其是急性心肌梗塞严重威胁着人类的生命和健康，目前国内外临床应用的溶栓药物主要有尿激酶，链激酶和纤溶酶原激活因子。但它们在一定程度上均存在着缺陷，如副作用大，易引起严重的出血后果，免疫原性较高，半衰期较短，来源短缺。微生物尤其是芽孢杆菌来源的纤溶酶具有直接纤溶活性，是目前一种发展很快的新一代溶栓剂。这种纤溶酶通过人工控制发酵条件可大量获得，纯酶的提取工艺也较为成熟方便，此外还具有药效时间长，免疫原性低等优点，是一种很有希望的新一代溶栓药物。
利用微生物发酵炮制中药古已有之，并且是一种相当重要的炮制加工方法之一，许多经典药物都是经微生物发酵后产生了新的药理活性，如虫草。但这些品种都是利用自然界天然的菌种发酵的，一般多为霉菌、酵母、细菌等，由于菌种不纯，针对性不强，不能定向改变药物的性能或有意识地根据药物之间的特性进行有目的的组合，同时接入的微生物种类范围受到了极大限制，也不可能根据需要将几种微生物组合接种在一起；另一方面，对那些在自然界中不占优势、生长条件要求比较严格的微生物来说，就不可能在药物上生长起来，这就大大地限制了微生物的作用。另外，是否会混入有害菌也不明确，所以微生物在药物中的潜在效能没有最大限度地发挥出来。
众所周知，微生物由于自身存在丰富的酶系而有着在温和条件下非常强大的分解转化物质的能力，并能产生丰富的代谢产物。在合适的条件下通过现代工程技术手段，由微生物的某种特定功能产生出人类需要的产品称为发酵工程。将现代发酵工程与中药炮制相结合符合中药现代化的要求。
本发明的具体技术内容如下一种增效红花溶栓制剂，其特征在于由一株产纤溶酶的芽孢杆菌C2-13与川红花共发酵制得。
本发明所述的一株产纤溶酶的芽孢杆菌C2-13的主要特征是一株地衣芽孢杆菌，细菌呈直杆状，单个菌体直径为0.5～2.5μm，常以成对或链状排列，具圆端或方端，菌落呈灰白色，较干燥，培养时间长时会产红色色素，细胞染色在幼龄培养时呈现革兰氏阳性，以周生鞭毛运动，芽孢椭圆，为中生芽孢，生孢不被氧所抑制，发酵时发酵液颜色会逐渐变深，发酵前期，菌体生长旺盛时呈丝状，发酵后期丝状菌体断裂，生长温度范围为30～55℃，产生的纤溶酶的酶活性为800-1200活力单位/毫升。
本发明所述的一株产纤溶酶的芽孢杆菌C2-13与川红花共发酵的发酵培养基包括蔗糖0.5～5％，酵母膏0.1～2％，K2HPO40.5～2％，CaCl20.1～1％，MgCl20.1～1％，玉米粉0.5～5％，川红花0.5～6％溶剂蒸馏水，pH值6～10。
本发明所述的一株产纤溶酶的芽孢杆菌C2-13与川红花共发酵的种子培养基的培养温度为37℃，培养时间14-24小时。
本发明所述的一株产纤溶酶的芽孢杆菌C2-13与川红花共发酵的发酵时间36-72小时，发酵温度35-48℃，发酵罐装量为50-66％。
本发明所述的一株产纤溶酶的芽孢杆菌C2-13与川红花共发酵的种子扩大培养的接种量为2-10％，种子接入发酵培养基的接种量为2-15％。
本发明所述的一株产纤溶酶的芽孢杆菌C2-13接种到发酵培养基中的比例为2-15％，川红花作为发酵培养基中的一种成分所占比例为0.5-6％。
本发明所述的一种增效红花溶栓口服液制剂的制备方法是一株产纤溶酶的芽孢杆菌C2-13与川红花共发酵，其中川红花在发酵培养基中的比例为0.5～6％，发酵液高速离心得到上清液，在上清液中按照1.0×105～1.2×105酶活单位/克稳定剂的比例加入酶的稳定剂进行调配，分装在121～144℃下瞬时灭菌制得。一株产纤溶酶的芽孢杆菌C2-13接种到发酵培养基中的比例为2-15％，川红花作为发酵培养基中的一种成分所占比例为0.5-6％。
本发明所述的一种增效红花溶栓口服胶囊制剂的制备方法是一株产纤溶酶的芽孢杆菌C2-13与川红花共发酵，其中川红花在发酵培养基中的比例为0.5～6％，发酵液高速离心得到上清液，在30～50℃低温和真空度为50～80Kpa的真空下浓缩，浓缩至浓度为40～70％，再喷雾干燥至粉状，按照1.0×105～1.2×105酶活单位/克稳定剂的比例加入酶的稳定剂进行调配，灭菌，分装胶囊后制得。
本发明所述的一株产纤溶酶的地衣芽孢杆菌C2-13，好氧，通常接触酶阳性。能够利用D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-木糖，D-甘露醇产酸，可以水解明胶，酪蛋白，淀粉等。此外这一株地衣芽孢杆菌与普通地衣芽孢杆菌不同之处在于1)产生纤溶酶以及其它蛋白水解酶系，其中前者的酶活性较高；2)发酵时发酵液颜色会逐渐变深，发酵前期，菌体生长旺盛时呈丝状，发酵后期丝状菌体断裂。
本发明所述的纤溶酶是一种加快血栓溶解，抑制血栓形成的生物活性物质。
本发明所述的一株产纤溶酶的芽孢杆菌C2-13中，C代表成都市，2代表第二次采样，13代表第二批样品中分离出来的第13株菌，C2-13是一株地衣芽孢杆菌，是四川大学生命科学学院微生物教研室分离自成都市红牌楼土簇村屠宰厂的土壤中。
本发明所述增效红花溶栓口服液制剂的服用方法一天三次，一次一瓶，每瓶剂量250～300酶活单位，每3-4周为一个疗程，可连续服用2-3个疗程，也可连续服用至症状好转。
本发明所述的增效红花溶栓胶囊制剂的服用方法一天三次，一次两粒，每粒剂量125～150酶活单位，每4-5周为一个疗程，可连续服用2-3个疗程，也可连续服用至症状好转。
本发明成品须饭前服用，有出血倾向者，对红花过敏者慎用，孕妇、月经过多者禁服。出血性疾病(包括活动性溃疡、肺结核空洞、血液病等)、严重肝肾功能不全者禁服。
本发明利用的菌株是一株产纤溶酶的芽孢杆菌C2-13，与川红花共发酵，一方面可以提高纤溶酶的活性，另一方面通过对红花发酵亦能提高红花活血化淤功效和清除羟自由基的能力，提高了红花的药效。这样，本发明成品制剂具有以下疗效1、扩张冠状动脉、增加冠状动脉血流量、改善微循环；2、降低血清内总胆固醇、总脂、三硝酸甘油脂的含量；3、有降低血压作用；4、适用于缺血性脑血管病中纤维蛋白原增高及血小板凝集率增高的患者。
发酵结束后10000rpm/mim离心20mim取上清→低温(30～50℃)真空(真空度在50～80Kpa为宜)浓缩，浓缩至浓度约为40～70％→喷雾干燥至粉状即得。
发酵方式为摇瓶发酵，浓缩至浓度为30～40％，转速为180～220rpm/mim，发酵时间为36～72小时。发酵温度35～48℃其中种子培养基牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，NaCl0.5％，溶剂蒸馏水，pH值7.0～7.2种子斜面琼脂粉1.6％牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，NaCl0.5％，溶剂蒸馏水，pH值7.0～7.2发酵培养基蔗糖0.5～5％，酵母膏0.1～2％，K2HPO40.5～2％，CaCl20.1～1％，MgCl20.1～1％，玉米粉0.5～5％，川红花0.5～6％，溶剂蒸馏水，pH值6～10
B、红花对C2-13产纤溶酶的芽孢杆菌，在其培养基中加入不同浓度红花可不同程度提高其纤溶酶活性，培养基中红花在0％～6％的浓度范围内，纤维蛋白平板的水解圈直径数据显示纤溶酶活性明显大于未加红花的平行对照，且有明显的量效关系，这与红花对C2-13生长的影响是一致的。
C、羟自由基清除率测定取不同浓度(0％，2％，4％，6％)红花与C2-13共发酵，并以不接C2-13的相应浓度红花为对照，比较红花经C2-13发酵炮制与否对其抗自由基活性的影响，数据显示在0％～6％浓度范围内，发酵后红花比发酵前抗羟自由基活性有较大幅度提高，且有明显的量效关系，其中在6％浓度下，抗羟自由基活性提高幅度达36％。
D、发酵液降总胆固醇测定将高脂小鼠分为5组，灌胃给药，4周后测量小鼠血清中总胆固醇含量。
(1)未加红花的发酵液
(2)加有红花的发酵液(3)未加红花的发酵液与红花浸提液的混合液(4)红花浸提液(5)生理盐水结果显示，(2)，(3)，(4)组总胆固醇含量明显下降，且下降幅度(2)＞(4)＞(3)。(1)，(5)未见明显下降，这说明起降总胆固醇作用的有效成分主要集中在红花中，(1)组胆固醇下降幅度最为明显，这说明红花中降胆固醇的有效成分经C2-13发酵炮制后，效果更加明显，这进一步说明了C2-13对红花的发酵炮制显著提高了红花活血化淤之功效。
E、发酵产物分析HPLC(高效液相色谱)法发酵液以及相应对照在11000rpm/mim，4℃下离心20min，过0.22微米滤膜，经HPLC检测，培养基中各成分除红花外在检测波长340nm下没有明显吸收，因此，对红花中有效成分的分析不构成影响。观察发酵前后的特征峰的变化，有多种物质含量有不同程度的增减，且有物质的消失以及新物质的出现。
这一结果一方面直接证明了C2-13对红花中有效成分的炮制作用，另一方面部分解释了红花经C2-13炮制发酵提高其抗羟自由基活性。
F、红花纤溶机理的证明纤维蛋白平板法制备纤维蛋白平板和加热纤维蛋白平板，二者的区别是前者含有纤维蛋白原，而后者经加热纤维蛋白原失活。配制1克生药/ml的红花浸提液，分别点10μl红花浸提液于两平板上，于37下保温9小时，结果显示纤维蛋白平板上没有水解圈出现，而加热纤维蛋白平板上则有明显的水解圈。这一结果证明了红花纤溶的机理是通过激活体内的纤溶酶原成为纤溶酶，继而起到溶解血栓的作用。
权利要求
1.一种增效红花溶栓制剂，其特征在于由一株产纤溶酶的芽孢杆菌C2-13与川红花共发酵制得。
2.根据权利要求1所述的一种增效红花溶栓制剂，其特征在于所述的一株产纤溶酶的芽孢杆菌C2-13的主要特征是一株地衣芽孢杆菌，细菌呈直杆状，单个菌体直径为0.5～2.5μm，常以成对或链状排列，具圆端或方端，菌落呈灰白色，较干燥，培养时间长时会产色素，细胞染色在幼龄培养时呈现革兰氏阳性，以周生鞭毛运动，芽孢椭圆，为中生芽孢，生孢不被氧所抑制，发酵时发酵液颜色会逐渐变深，发酵前期，菌体生长旺盛时呈丝状，发酵后期丝状菌体断裂，生长温度范围为30～55℃，产生的纤维蛋白溶解酶的酶活性为800-1200活力单位/毫升。
3.根据权利要求1所述的一种增效红花溶栓制剂，其特征在于所述的一株产纤溶酶的芽孢杆菌C2-13与川红花共发酵的发酵培养基包括蔗糖0.5～5％，酵母膏0.1～2％，K2HPO40.5～2％，CaCl20.1～1％，MgCl20.1～1％，玉米粉0.5～5％，川红花0.5～6％溶剂蒸馏水，pH值6～10。
4.根据权利要求1或3所述的一种增效红花溶栓制剂，其特征在于所述的一株产纤溶酶的芽孢杆菌C2-13与川红花共发酵的种子培养基的培养温度为37℃，培养时间14-24小时。
5.根据权利要求1或3所述的一种增效红花溶栓制剂，其特征在于所述的一株产纤溶酶的芽孢杆菌C2-13与川红花共发酵的发酵时间36-72小时，发酵温度35-48℃，发酵罐装量为50-66％。
6.根据权利要求1或3所述的一种增效红花溶栓制剂，其特征在于所述的一株产纤溶酶的芽孢杆菌C2-13与川红花共发酵的种子扩大培养的接种量为2-10％，种子接入发酵培养基的接种量为2-15％。
7.根据权利要求1所述的一种增效红花溶栓制剂，其特征在于所述的一株产纤溶酶的芽孢杆菌C2-13接种到发酵培养基中的比例为2-15％，川红花作为发酵培养基中的一种成分所占比例为0.5-6％。
8.根据权利要求1或2或3或5所述的一种增效红花溶栓制剂，其特征在于所述的一种增效红花溶栓口服液制剂的制备方法是一株产纤溶酶的芽孢杆菌C2-13与川红花共发酵，其中川红花在发酵培养基中的比例为0.5～6％发酵液高速离心得到上清液，在上清液中按照1.0×105～1.2×105酶活单位/克稳定剂的比例加入酶的稳定剂进行调配，分装在121～144℃下瞬时灭菌制得。一株产纤溶酶的芽孢杆菌C2-13接种到发酵培养基中的比例为2-15％，川红花作为发酵培养基中的一种成分所占比例为0.5-6％。
9.根据权利要求1或2或3或5所述的一种增效红花溶栓制剂，其特征在于所述的一种增效红花溶栓口服胶囊制剂的制备方法是一株产纤溶酶的芽孢杆菌C2-13与川红花共发酵，其中川红花在发酵培养基中的比例为0.5～6％，发酵液高速离心得到上清液，在30～50℃低温和真空度为50～80Kpa的真空下浓缩，浓缩至浓度为40～70％，再喷雾干燥至粉状，按照1.0×105～1.2×105酶活单位/克稳定剂的比例加入酶的稳定剂进行调配，灭菌，分装胶囊后制得。
全文摘要
本发明公开了一种通过一株芽孢杆菌，将其接种于合适的培养基并加有相应比例的红花与其共发酵，不仅可以产生具有直接纤溶能力的纤溶酶，而且可利用其自身存在的丰富酶系，用来改变中药有效成分的结构，具有较高抗氧化能力以及活血化瘀功效的增效红花溶栓制剂，其特征在于由一株产纤溶酶的芽孢杆菌C2－13与川红花共发酵制得，其共发酵的培养基包括蔗糖0.5～5％，酵母膏0.1～2％，K
文档编号C12P1/00GK1442191SQ03117590
公开日2003年9月17日 申请日期2003年4月2日 优先权日2003年4月2日
发明者孙启玲 申请人:四川大学