专利名称：一种调控非复制型腺病毒复制的方法
技术领域：
本发明属生物医学领域，涉及一种组合式腺病毒肿瘤基因治疗方法，具体涉及一种复制型腺病毒调控非复制型腺病毒复制的方法。
近年来科学家在肿瘤细胞生物学和分子生物学研究方面所取得的进展与成就为建立新的肿瘤基因治疗方法奠定了基础。基因治疗被认为是很有希望的新方法，其最大的优势在于利用正常与肿瘤细胞间在分子水平方面的差异，可以有效地、选择性地攻击肿瘤细胞，拓宽了肿瘤的“治疗窗”，在增强治疗效果的同时减少副作用。不过，现有的各种基因治疗方法在临床应用方面仍然面临着许多困难和障碍。其中最关键的问.题是缺乏针对肿瘤细胞的、高效的基因传递载体或系统。已有研究设计高特异性的、并能够高效地在肿瘤细胞复制的腺病毒载体设计方法以及建立在其基础上的肿瘤基因治疗新方法。这种方法使腺病毒能够选择性地在肿瘤中复制，并能够携带和表达各种治疗基因，从而达到有效治疗肿瘤而无副作用的目的。
腺病毒是一种毒性较小的感冒病毒，对人体危害不大。它的最突出的优点，是能够以非常高的效率感染各种人类细胞。重组腺病毒是目前世界各国肿瘤基因治疗研究人员的首选基因导入工具。在过去15年的研究中，主要从生物安全性的角度出发，人们均采用复制缺陷型腺病毒作为基因传递的载体。但是，在实际应用中发现复制缺陷型腺病毒传递基因的效率和治疗效果仍然不理想。有文献报道肿瘤局部注射复制缺陷型腺病毒，即使在最优化的状态下也仅仅只有10-15％的病毒能感染肿瘤细胞。因此，应用复制缺陷型腺病毒作肿瘤基因治疗，不仅要求病毒用量很大，而且并非所有的肿瘤细胞均能被同时感染，故难以达到治疗目的。采用具有“旁观者效应”的治疗基因，可以改善或增强治疗效果，但仍然不能完全克服复制缺陷型病毒固有的弱点。
随着非复制型腺病毒的大量应用，人们对腺病毒在人体内的分布特点和安全性有了更深入的了解和认识。为了提高治疗基因在肿瘤局部的传递效率和表达水平，研究人员开始使用具有复制能力的腺病毒作为基因传递载体。采用复制型腺病毒必须解决的关键问题是使病毒的复制严格限制在肿瘤细胞内。目前，为了获得肿瘤特异性的复制已有许多不同的方案或策略。典型实例如onyx-015病毒，它能够选择性地在p53基因功能已丧失的肿瘤细胞内复制。由于50％以上的肿瘤均有p53基因失活，理论上讲onyx-015病毒可用于治疗一半以上的肿瘤。不过，目前对onyx015病毒肿瘤特异性问题存在争议，有人观察到onyx-015病毒在p53基因完整的肿瘤细胞内也有复制。另一个典型的例子是CN706病毒，该病毒利用前列腺特异抗原(PSA)基因启动子驱使E1A基因表达，这一病毒已被证实具有前列腺细胞选择毒性。
早期的复制型病毒杀伤肿瘤的主要机制，在于通过病毒在肿瘤细胞中大量繁殖，使宿主细胞裂解，但是，在许多体内实验的结果并不理想。因此，研究人员尝试在复制型病毒内加入各种各样的治疗基因，以加强其治疗效果。使病毒既可以通过复制裂解细胞，也可以通过各种治疗基因杀死肿瘤细胞，而不是只通过裂解这一单一机制。然而，要在复制型病毒里插入治疗基因有障碍。主要的障碍在于复制型病毒携带外源性基因的能力极为有限，因为复制型腺病毒的基因组内加入了与腺病毒复制有关的E1A或E1B或E4基因，其容纳外源DNA的能力大大下降，通常只有2kb。这样，只有较小的基因才能被插入到病毒里，使治疗基因的选择受到较大的限制。
本发明具有以下优点1)简化了复制型腺病毒的构建。
无需针对每一种肿瘤治疗基因单独构建相应的组织特异性复制型腺病毒。
2)可以继续使用原经过实践证实有效的各种非复制型腺病毒。
3)可以任意地组合多种病毒和治疗基因，方便且灵活。
本发明方法的最终目的，是最大限度地发挥抗肿瘤效果并同时尽可能减少毒、副作用，真正实现个体化的肿瘤基因治疗方案。它的核心在于利用复制型腺病毒调控并带动非复制型腺病毒进行复制，使以复制型腺病毒为基础的肿瘤基因治疗方法更加灵活和特异。
通过以下步骤构建肿瘤特异性复制型腺病毒。A.分离肿瘤特异性启动子。
A1.端粒酶5’端调控顺序在自然的DNA复制过程中，染色体的末端将随着每一次细胞分裂而缩短。位于染色体末端的一个特殊结构称为端粒。端粒的完整对染色体的稳定性至关重要。而端粒的完整是靠端粒酶来维持的。端粒酶在超过99％的正常细胞里没有活性，而在超过90％的肿瘤细胞里被重新激活。实验证明，端粒酶活性是由它的启动子控制的。因此，端粒酶(TERT)的启动子就成为有效调控目的基因仅在肿瘤里表达、而在正常细胞里不表达的一个启动子。本发明通过PCR技术，以人类细胞DNA为模板，扩增启动子序列一，把它插入质粒pEGFP-1(购自Clontech公司)中，构建了pTERT-EGFP表达质粒。利用脂质体把pTERT-EGFP转入到各种肿瘤细胞中，可以观察到EGFP仅在肿瘤细胞中表达，而在正常细胞中则不表达。
A2.E2F1基因启动子在绝大多数的肿瘤细胞中，抑癌基因Rb及其相关的信号通路上的其它基因都处于失活状态。这些变化使转录因子E2F1得以激活。因此，E2F1基因的启动子在大多数的肿瘤中都处于活化状态，而在大多数的正常细胞中却没有活性。因此，可以通过E2F1基因的启动子控制腺病毒的复制，使腺病毒的复制局限在肿瘤细胞中。本发明通过PCR技术，以人类细胞DNA为模板，扩增出启动子序列二，把这段顺序克隆入pEGFP-1中，得到质粒pE2F1-EGFP。利用脂质体将该质粒导入细胞中。实验结果表明，EGFP主要在肿瘤细胞中表达，而在正常成纤维细胞中表达量很低。表明所得启动子有较高的肿瘤细胞特异性。
A3.缺氧诱导性启动子。
氧气分压降低已被确定为各种实体肿瘤的统一特征。其产生的主要原因是由于肿瘤细胞快速生长，而新生血管的生长速度跟不上肿瘤。因此，肿瘤组织内的各种营养成分，如氧气、葡萄糖等都处于长期或间歇性的短缺状态。处于这种微环境状况下的肿瘤细胞，会激活一系列的基因的表达。而这些基因的激活都由缺氧诱导因子(HIF-1α)的转录因子调控。其激活机制，主要是通过其下游基因的5’端调控顺序中的所谓缺氧反应单元(HRE)。这一单元的存在，使这些基因具有在缺氧状况下被激活的特点。而这些基因在绝大多数的正常细胞中，都处于低表达状态。这样，缺氧诱导性基因的启动子主要在肿瘤细胞内选择性激活。本发明通过PCR技术，分离缺氧诱导性的启动子，以人类细胞DNA为模板，扩增出血管通透性因子(VEGF)的5’的启动子序列三。实验证明，所述血管通透性因子是能被缺氧微环境所诱导的最强烈的基因。它的启动子，也被证实在肿瘤中选择性地被激活。本发明把上述顺序克隆到质粒pEGFP-1中，得到pHRP-EGFP-1。在随后的实验中证明，所述启动子在缺氧的肿瘤细胞中被选择性激活，在正常氧气分压下活性很低。B.构建肿瘤特异性的复制型腺病毒载体通过本领域常规基因工程技术将上述分离到的启动子嵌入腺病毒的DNA中，构建下述腺病毒载体，使之控制早期基因E1A的表达，如
图1所示。
1)AdHRP-E1a-dsRed2，其E1a基因由缺氧诱导性因子启动子HRP控制。
2)AdTERT-E1a-dsRed2，其E1a基因由端粒酶基因启动子TERT控制。
3)AdE2F1-E1a-dsRed2，其E1a基因由E2F1基因启动子控制。
上述病毒载体的基因组中加入红色荧光蛋白报告基因dsRed2。所述报告基因来自海洋生物，能够自发红色荧光，并有CMV启动子及SV40多聚腺苷尾，使上述病毒对细胞的感染及其在细胞内的复制等均可通过荧光显微镜和流式细胞仪进行观察和评估。C.包装、扩增、纯化病毒，以及感染和复制鉴定。
采用人胚肾293细胞对上述构建好的病毒DNA进行包装。经过噬菌斑(plaque purification)筛选后再进行扩增。病毒纯化采用氯化铯密度梯度离心及透析。纯化的病毒滴度均可达3~5×1010pfu/ml。病毒在各种肿瘤和正常细胞中的复制情况，观测结果如下1)AdTERT-E1a-dsRed2能够感染下述肿瘤细胞，如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、结肠癌等细胞，并在这些细胞中大量复制。感染后3~5天出现明显的细胞病变，然后细胞裂解并继续感染周围的肿瘤细胞，3~7天之内，所有的肿瘤细胞几乎都被杀死。该病毒也可以感染人的成纤维细胞和正常的上皮细胞，但不复制或只有极少量的复制。被感染的细胞存活状态良好，证明几乎没有毒性。将病毒在肿瘤细胞和纤维细胞中的滴度进行测量，其差异可达1000-8000倍。
2)AdHRP-E1a-TERT-E4-dsRed2能有效的感染各种肿瘤细胞。但是在正常生长情况下，病毒的复制量很小。在缺氧的情况下，病毒的复制量迅速增加，是前者的500倍。
3)AdE2F1-E1a-dsRed2能感染所有检验过的肿瘤细胞，并在其中复制并杀死宿主细胞。尽管它能够有效地感染正常的成纤维细胞或上皮细胞，但在这些细胞中却极少复制。对肿瘤细胞和成纤维细胞中的腺病毒滴度进行测量，前者可以达是后者的1500-3000倍。
实施例2构建非复制型腺病毒，检测复制型病毒调控并带动非复制型病毒复制的能力。
本发明构建并扩增了下述非复制型病毒AdCMV-GFP，它携带来自海洋生物的绿色荧光蛋白(GFP)。
AdCMV-TNFα，它携带肿瘤坏死因子TNFα编码基因。
上述病毒的构建与扩增方法同上述复制型病毒。
扩增后的非复制型病毒的滴度，达到3-5×107pfu/ml。所述非复制型病毒还携带下述各种不同肿瘤治疗基因细胞凋亡诱导基因(如TNF-α，TRAIL等)；抗新生血管形成基因(如endostatin，angiostatin，ex-flk1，ex-Tie2，ex-flt1，PL4，thrombospondin-1等)；自杀基因(如Hsv-tk，cytosine deaminase，)；细菌毒素基因(如diphthera toxinA等)；
肿瘤抑制基因(如p53，Rb，PTEN，p16，p21等)；免疫调节因子(如Flt3，CD40 ligand，IFN-α，IFN-β，IL2，IL12，IL15，IL18等)；放射线增敏基因(如ku70，ku80，or DNA-PK，ATM等基因的反义基因)。
实施例3非复制型病毒在复制型病毒的调控并带动下在肿瘤细胞中有效复制。
按1∶1~20的比例混合上述复制型和非复制型病毒，感染各种肿瘤细胞和正常细胞。然后对病毒的复制和治疗基因蛋白的产生进行测量。
AdTERT-E1a-dsRed与AdCMV-GFP混合后感染肿瘤细胞。通过观察荧光蛋白的表达，了解两种病毒对肿瘤细胞感染和在肿瘤细胞内复制等情况。结果为，不仅观察到带红色荧光的腺病毒在肿瘤细胞中大量复制，也观察到带绿色荧光的腺病毒也在肿瘤细胞中复制。而且绿色荧光蛋白(GFP)的分布与红色荧光蛋白的分布完全相同。表明非复制型病毒在复制型病毒的调控下，其复制完全依赖于复制型病毒，只有在有复制型病毒复制的细胞里，非复制型病毒才能复制，而在没有红色荧光蛋白的细胞里，几乎没有绿色荧光蛋白的表达。表明后者的复制依赖于前者的特性。
AdTERT-E1a-dsRed和AdCMV-TNFα混合后感染肿瘤细胞，三天后取细胞培养液，ELISA定量测量TNFα的含量。实验结果表明，TNFα的浓度，达到120μg/ml，而仅用AdCMV-TNFα单独感染的细胞培养液中，TNFα的浓度只有0.5μg/ml，说明AdCMV-TNFα大量复制。
AdE2F1-E1a-dsRed和AdCMV-GFP混合后感染肿瘤细胞，获得的结果与上述结果相同，既非复制型病毒的复制依附于复制型病毒的复制，而且复制的效率非常高。AdE2F1-E1a-dsRed和AdCMV-TNFα混合后感染肿瘤细胞。三天后取细胞培养液，ELISA定量测量TNFα的含量。TNF-α的浓度可达110μg/ml，远远超过单独用AdCMV-TNFα感染(0.5μg/ml)。
本发明将一种肿瘤选择性复制型腺病毒和一种或多种携带治疗基因的非复制型腺病毒组合或混合，综合治疗实体肿瘤。可分别将腺病毒直接注射到肿瘤内部；将腺病毒通过血管(动脉或静脉)，注射到患者体内进行基因治疗；可用于与肿瘤的放射线治疗相结合，对肿瘤进行综和治疗，腺病毒可以在放射治疗前、放射治疗期间、或放射治疗后直接注射；可用于与肿瘤的光动力学治疗(photodynamic therapy)结合，对肿瘤进行综和治疗，腺病毒可以在光动力学治疗前、治疗期间、或治疗后直接注射；可用于与肿瘤的自杀基因化学治疗(suicide gene chemotherapy)结合，对肿瘤进行综合治疗，所述自杀基因包括细菌或及酵母的cytosine deaminase基因；疱疹病毒的thymidine kinase基因；以及p450基因等，相关的化疗药物分别是5-fluorocytidine(5-FC)，gancyclovir，cyclophosphamide。
其中所显示的是一种肿瘤特异性的复制型病毒(AdTERT-E1a-dsRed)带动另一种非复制型病毒(AdCMV-GFP)在结肠癌肿瘤细胞(HCT116)中复制，AdTERT-E1a-dsRed携带红色荧光蛋白(dsRFP)，AdCMV-GFP则携带绿色荧光蛋白(GFP)。其中A所显示的是透射光下的HCT116细胞，其生长密度大约90％融合。B，C和D所显示的则是两种病毒混合感染后不同时间点荧光显微镜观察结果。感染时病毒的用量为平均每个细胞1个病毒。荧光显微镜观察时间为感染后24小时(B)、72小时(C)和96小时(D)。从图中可以清楚地看出绿色荧光蛋白的表达与红色荧光蛋白的表达密切相关。有红色荧光蛋白的地方就有绿色荧光蛋白，反之亦然。表明AdTERT-E1a-dsRed的复制可以有效的带动AdCMV-EGFP的复制。
SEQUENCE LISTING<110>川源，李倩，黄<120>一种调控非复制型腺病毒复制的方法<130><160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>454<212>DNA<213>Human<400>1tcatggcccc tccctcgggt taccccacag cctaggccga ttcgacctct ctccgctggg60gccctcgctg gcgtccctgc accctgggag cgtgagcggt gcgcgggcgg ggaaacgcgg120cccagaaccc cgggtccgcc cggagcagct gcgctgtcgg gccaggccgg gctcccagtg180gattcgcggg cacagacgcc caggaccgcg cttccacgtg gcggaggact gggacccggg240caccgtcctg cccccttcac cttccagttc cgcttcttcc gcgcggaccc cgccccgtcc300cgacccttcc cgggtccccg gcccagcccc ttccgggccc tcccagccct tccccttcct360ttccgcggcc ccgccctctc ctcgcggcgc gagtttcagg cagcgctgcg tcctgctgcg420cacgtgggaa gccctggccc cggccacccc cgcg454<210>2<211>265<212>DNA<213>Human<400>2ccgttgttcc cgtcacggcc ggggcagcca attgtggcgg cgccggcggc tcgtggctct60ttcgcggcaa aaaggatttg gcgcgtaaaa gtggccggga cttgcaggca gcggcggccg120ggggcggagc gggatcgagc cctcgccgag gcctgccgcc agggcccgcg ccgccgccgc180cgcctgtcac ccgggccgcg cgggccgtga gcgtcatggc tggccggggc ccctgcgggc240ggcccatgcg cgccggcgct ggagg265<210>3<211>2024<212>DNA<213>Human<400>3ggggtgctag aggcgcacaa ggaggaaagt tagtggcttc ccttccatat cccgttcata60gcctagagca tggagcccag gtgaggaggc ctgcctggga gggggccctg agccaggaat120aaacatttac taactgtaca aagaccttgt ccctgctgct ggggagcctg ccaagtgtgg180agacaggact agtgcacgaa tgatggaaag ggagggttgg ggtgggtggg agccagcttt240tcctcataag ggccttagga caccataccg atggaactgg gggtactggg gaggaaccta306gcacctccac caaaccacag caacatgtgc tgaggatggg gctgactagg taactccctg360gagcgttttg gttaaattga gggaaattgc tgcattccca ttctcagtcc atcctccaca420gaggctatgc cagctgtagg ccagaccctg gcaagatctg ggtggataat cgactgactg480gcctcagagc cccaactttg ttccctgggg cagcctggaa atagccaggt agaaaccagc540caggaatttt tccaagctgc ttcctatatg caagaatggg atgggggcct tgggagcact600tagggaagat gtggagagtt ggaggaaaag ggggcttgga ggtaaggggg ggactggggg660aaggataggg gagaagctgt gagcctggag aagtagccaa gggatccgag ggaatggggg720agctgagacg aaacccccat ttctattcag aagatgagct atgagttggg cttgggctga780tagaagcctt ggcccctggc ctggtgggag ctctgggcag ctggctacag acgttcctta840gtgctggcgg gtaggtttga atcatcacgc aggccctggc ctcccccgcc cccaccagcc900ccctggcctc agttccctgg caacatctgg ggttgggggg gcacaggaac aagggcctct960gtctgcccag ctgcctcccc ctttgggttt tgccagactc caagtgcata cgtgggctcc1020aacaggtcct cttccctccc agtcactgactaaccccgga aacacagctt cccgttctca1080gctccacaaa cttggtgcca aattcttctc ccctgggaac atccctggac acttcccaaa1140ggaccccagt cactccagcc tgttggctgc cgctcactga tgtctgcagg ccagatgagg1200gctccagatg gcacattgtc agagggacac actgtgcccc tgtgcccagc cctgggctct1260ctgtacatga agcaactcca gtcccaaata tgtagtgttt gggaggtcag aaataggggg1320tccaggagca aactcccccc accccctttc caaagcccat tccctcttta gccagagccg1380gggtgtgcag acggcagtca ctagggggcg ctcgccacca cagggaagct gggtgaatgg1440agcgagcagc gtcttcgaga gtgaggacgt gtggtctgtg tgggtgagtg agtgtgtgcg1500tgtggggttg agggtgttgg agcggggaga agccaggggt cactccagga ttccaacaga1560tctgtgtgtc cctctcccca cccgtccctg tcggctctcc gccttcccct gcccccttca1620atattcctag caaagaggga acggctctca gccctgtccg cacgtaacct cactttcctg1680ctccctcctc gccaatgccc cgcgggcgct gtctctggac agagtttccg ggggcggatg1740ggtaattttc aggctgtgaa ccttggtggg gtcgagcttc cccttcattg cggcgggctg1800cgggccaggc ttcactgggc gtccgcaagc ccgggcccga gccgcgtgtg gaggggctga1860ggctcgcctg tccccgcccc ccgggggggc cgggggcggg gtcccggcgg ggcggagcca1920tgcgcccccc cctttttttt ttaaagtcgg ctggtagcgg ggaggatcgc ggaggcttgg1980ggcagccggg tagctcggag gtcgtggcgc tgggggctag cacc202权利要求
1.一种调控非复制型腺病毒复制的方法，其特征是用复制型病毒调控并带动非复制型病毒复制。
2.根据权利要求1的调控非复制型腺病毒复制的方法，其特征是用肿瘤细胞特异性复制型腺病毒调控并带动非复制型腺病毒选择性地在肿瘤细胞内复制。
3.根据权利要求2的调控非复制型腺病毒复制的方法，其特征是所述的选择性地在肿瘤细胞内复制型腺病毒，其复制所必需的早期基因被一个或多个肿瘤特异性的启动子调控。
4.根据权利要求3的调控非复制型腺病毒复制的方法，其特征是所述的早期基因包括E1a，E1b，E2a，E2b和E4，所述的肿瘤特异性的启动子包括肿瘤细胞或微环境特异性的启动子，低氧诱导性基因的启动子，E2F1基因启动子，Midikin基因启动子，端粒酶基因启动子，热休克蛋白基因启动子，肿瘤组织特异性启动子，前列腺组织特异性抗原基因启动子，MUC1基因启动子，肺细胞表面蛋白基因启动子，α-胚胎蛋白，甲状腺球蛋白基因启动子，Tyrosinase基因启动子，神经鞘基础蛋白基因启动子，乳球白蛋白基因启动子，癌胚抗原蛋白基因启动子和GFAP。
5.根据权利要求1和2的调控非复制型腺病毒复制的方法，其特征是所述的非复制型腺病毒携带各种不同肿瘤治疗基因，包括细胞凋亡诱导基因，抗新生血管形成基因，自杀基因，细菌毒素基因，肿瘤抑制基因，免疫调节因子和放射线增敏基因的反义基因。
6.根据权利要求1的调控非复制型腺病毒复制的方法，其特征是将一种肿瘤选择性复制型腺病毒和一种或多种携带治疗基因的非复制型腺病毒组合或混合。
7.根据权利要求6的调控非复制型腺病毒复制的方法，其特征是所述肿瘤选择性复制型腺病毒和携带治疗基因的非复制型腺病毒混合比例是1∶1~20。
8.权利要求1和2的调控非复制型腺病毒复制的方法在制备基因治疗实体肿瘤药物中的用途。
全文摘要
本发明属生物医学领域，涉及一种组合式腺病毒肿瘤基因治疗方法，具体涉及一种复制型腺病毒调控非复制型腺病毒复制的方法。本发明利用能够高度选择性地在肿瘤细胞内复制的腺病毒与携带各种治疗基因的非复制型腺病毒相结合，进行肿瘤基因治疗。本发明能够有效利用两种病毒的优点，克服各自的弱点，使建立在腺病毒基础上的肿瘤基因治疗更灵活和更有靶向性。
文档编号C12N7/01GK1425467SQ0311475
公开日2003年6月25日 申请日期2003年1月6日 优先权日2003年1月6日
发明者李川源, 黄倩 申请人:李川源, 黄倩