专利名称：用体细胞核移植技术制备移核胚胎干细胞的方法
技术领域：
本发明是关于应用体细胞核移植技术制备细胞的一种方法，产生的细胞可用于移植治疗等细胞工程。
背景技术：
长期以来中枢神经系统的损伤和疾病严重地危害着人类健康，虽然传统药物治疗和手术干预在一定时期取得了有限的进展，但是目前在药物作用的效果、手术的时机、部位等方面仍然存在着难以克服的问题。因此，人们尝试用一种新的治疗方法——细胞治疗来解决这个问题。中枢神经系统的细胞治疗指的是将自体的、同种的或异种的活细胞经过加工、处理(改变或不改变它们的生物学特性)后移植入患者的脑内或脊髓内的特定区域，从而治疗某种中枢神经系统疾病。适合神经系统细胞治疗的细胞应具有以下特点①易于体外培养、增殖，并建立细胞株；②能够定向分化为神经细胞或来源于神经系统；③可以被克隆或定向诱导；④调控基因能够转染细胞，具有特征选择性；⑤移植后能够长期存活，并可与受体整合而发挥功能。胚胎干细胞(stem cells)的发现和研究进展为中枢神经系统损伤和疾病的细胞治疗提供了新的细胞来源，给中枢神经系统损伤修复带来一定的希望。
人们从胚胎发育早期——胚泡(受精后约5～7天)的内细胞群中和位于胚胎生殖腺或生殖嵴及其周围组织内的原始生殖细胞中获取胚胎干细胞，在体外培养、诱导发育成各种细胞的前体细胞用于细胞治疗。
但是由于免疫排斥和伦理道德等问题的存在，限制了胚胎干细胞的应用。
发明内容
1、技术问题本发明的目的是提供一种不但解决了胚胎干细胞在医学上应用的伦理问题，也解决了免疫排斥问题的用体细胞核移植技术制备移核胚胎干细胞的方法。
2、技术方案本发明的用体细胞核移植技术制备移核胚胎干细胞的方法为，用显微操作仪将成年动物的神经细胞核移植入动物胚胎的去核胚胎干细胞胞质体内，重新组成具全新基因型移核胚胎干细胞，并培养移核胚胎干细胞使其分裂、增殖到28个，胚胎干细胞和神经细胞属同种异体细胞，所制备的细胞为具核供体细胞-神经细胞基因型的移核胚胎干细胞，制备细胞的方法由以下步骤组成1)分离和克隆动物生殖腺嵴源胚胎干细胞，建立动物胚胎干细胞系；2)从动物脑组织中分离出神经细胞，并进行纯化；3)胚胎干细胞去核和从神经细胞内取核；4)将动物神经细胞核移植入去核胚胎干细胞胞质体内，重新组成移核胚胎干细胞；5)培养动物移核胚胎干细胞，使其增殖、分化并进行鉴定。
胚胎干细胞取自经分离获得的非人类哺乳动物胚胎生殖腺或生殖嵴及其周围组织内的原始生殖细胞。神经细胞核取自经分离获得的成年的非人类哺乳动物神经组织内的神经细胞。胚胎干细胞在体外经显微操作技术去核。非人类哺乳动物是小鼠或猪。
3、有益效果本发明的有益效果是，不但解决了胚胎干细胞在医学上应用的伦理问题，也解决了细胞移植时出现的免疫排斥问题。还解决了进行体细胞核移植时，核供体细胞与核受体细胞的细胞周期同步以及核受体细胞的来源问题，这无疑将加快人胚胎干细胞包括从中得到发展的细胞工程和组织工程的发展。
具体实施例方式
本发明的用体细胞核移植技术制备移核胚胎干细胞的方法是用显微操作仪将成年动物的神经细胞核移植入动物胚胎的去核胚胎干细胞胞质体内，重新组成具全新基因型移核胚胎干细胞，并培养移核胚胎干细胞使其分裂、增殖到28个，胚胎干细胞和神经细胞属同种异体细胞，所制备的细胞为具核供体细胞-神经细胞基因型的移核胚胎干细胞，制备细胞的方法由以下步骤组成1)分离和克隆小鼠生殖腺嵴源胚胎干细胞，建立动物胚胎干细胞系；2)从动物脑组织中分离出神经细胞，并进行纯化；
3)胚胎干细胞去核和从神经细胞内取核；4)将动物神经细胞核移植入去核胚胎干细胞胞质体内，重新组成移核胚胎干细胞；5)培养动物移核胚胎干细胞，使其增殖、分化并进行鉴定。
胚胎干细胞取自经分离获得的非人类哺乳动物胚胎生殖腺或生殖嵴及其周围组织内的原始生殖细胞。神经细胞核取自经分离获得的成熟的非人类哺乳动物神经组织内的神经细胞。胚胎干细胞在体外经显微操作技术去核。非人类哺乳动物是小鼠或猪。
本发明为了实现以上的技术方案所采用的具体实施方式
是先分离和克隆动物生殖腺嵴源胚胎干细胞，建立动物胚胎干细胞系。由于受体细胞取自动物早期胎儿生殖腺嵴上的原始生殖细胞。在人可从流产胎儿生殖腺嵴上获得原始生殖细胞，材料易得，比靠女性提供卵母细胞来源要广泛。再从动物脑组织中获取神经细胞。将动物神经细胞核移植入去核胚胎干细胞胞质体内，重新组成移核胚胎干细胞。之所以选择神经细胞作为核供体细胞其一是解决了使核供体细胞与核受体细胞的细胞周期同步。因为以S期核移入M期卵母细胞时，发生非均质染色体超前凝聚(premature chromosome condensation，PCC)，染色体异常，胚胎通常不能存活。胚胎早期细胞大多停留在S期或G2期，卵细胞大多停留在二倍体的中期，体细胞大多停留在G0期，如卵丘细胞、睾丸支持细胞、神经细胞等。其二如果用于细胞疗法，由于新形成的移核胚胎干细胞与病人的基因型完全相同(病人核染色体中含有病人的全部基因信息)，所以不会产生通常细胞或器官移植中的免疫排斥反应，修复的组织和器官将良好地履行职责，无需使用免疫抑制剂。最后对动物移核胚胎干细胞进行培养、诱导其分化为所需细胞。
权利要求
1.一种用体细胞核移植技术制备移核胚胎干细胞的方法，其特征是用显微操作仪将成年动物的神经细胞核移植入动物胚胎的去核胚胎干细胞胞质体内，重新组成具全新基因型移核胚胎干细胞，并培养移核胚胎干细胞使其分裂、增殖到28个，胚胎干细胞和神经细胞属同种异体细胞，所制备的细胞为具核供体细胞-神经细胞基因型的移核胚胎干细胞，制备细胞的方法由以下步骤组成1)分离和克隆动物生殖腺嵴源胚胎干细胞，建立动物胚胎干细胞系；2)从动物脑组织中分离出神经细胞，并进行纯化；3)胚胎干细胞去核和从神经细胞内取核；4)将动物神经细胞核移植入去核胚胎干细胞胞质体内，重新组成移核胚胎干细胞；5)培养动物移核胚胎干细胞，使其增殖、分化并进行鉴定。
2.根据权利要求1所述的用体细胞核移植技术制备移核胚胎干细胞的方法，其特征是胚胎干细胞取自经分离获得的非人类哺乳动物胚胎生殖腺或生殖嵴及其周围组织内的原始生殖细胞。
3.根据权利要求1所述的用体细胞核移植技术制备移核胚胎干细胞的方法，其特征是神经细胞核取自经分离获得的成年的非人类哺乳动物神经组织内的神经细胞。
4.根据权利要求1所述的用体细胞核移植技术制备移核胚胎干细胞的方法，其特征是胚胎干细胞在体外经显微操作技术去核。
5 根据权利要求1所述的用体细胞核移植技术制备移核胚胎干细胞的方法，其特征是非人类哺乳动物是小鼠或猪。
全文摘要
用体细胞核移植技术制备移核胚胎干细胞的方法是关于应用体细胞核移植技术制备细胞的一种方法，该方法用显微操作仪将成年动物的神经细胞核移植入动物胚胎的去核胚胎干细胞胞质体内，重新组成具全新基因型移核胚胎干细胞，并培养移核胚胎干细胞使其分裂、增殖到文档编号C12N15/877GK1683524SQ0311313
公开日2005年10月19日 申请日期2003年4月8日 优先权日2003年4月8日
发明者毛曦, 储成林, 浦跃朴, 林萍华, 毛钊 申请人:东南大学