专利名称：一种血管紧张素Ⅱ相关基因及其编码蛋白与应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及生物工程领域中血管紧张素II的相关基因及其编码蛋白与应用。
背景技术：
血管紧张素II(Angiotensin II，AngII)是肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin system，RAS)的主要效应因子，可以影响肾小管的水、钠重吸收，刺激肾上腺释放醛固酮，同时也是引起心肌肥厚、血管壁增厚、动脉粥样硬化和人类肾小球硬化的生物活性物质。血管紧张素转换酶抑制剂(Angiotensin-converting enzyme inhibitor，ACEI)和AngII1型受体(AngiotensinII type I receptor，AT1R)拮抗剂能够阻断AngII的作用，减轻肾脏组织病理学改变，延缓肾小球疾病的进展，提示AngII与慢性肾小球疾病的进行性发展密切相关。肾小球系膜细胞(Mesangial cell，MsC)是重要的肾小球固有细胞，在肾小球炎症与硬化过程中起关键作用。AngII可刺激培养的肾小球系膜细胞肥大，上调细胞外基质成分及TGF-β、PAI-I等基因的mRNA和蛋白表达，提示AngII在肾小球增生和硬化过程中的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种血管紧张素II相关基因及其编码的蛋白质。
本发明所提供的血管紧张素II相关基因名称为AngRem104，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中的序列1由1690个核苷酸组成，SEQ ID №1的编码框为自5’端第90位碱基到第1130位碱基，编码序列表中序列2的蛋白质，序列1来源于人肾小球系膜细胞。
AngRem104基因编码的蛋白质，是序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列或将SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白质。
序列2的蛋白质由347个氨基酸残基组成。蛋白的分子量为37.2kDa，为核蛋白，蛋白N端无信号肽，无跨膜区，C-端无核定位信号。
本发明的第二个目的是提供一种扩增血管紧张素II相关基因AngRem104的引物。
一种扩增血管紧张素II相关基因AngRem104的引物上游引物5’-ATG TCA GAT TAT AAT CCT GAT G-3’下游引物5’-ACT GTA GAG GAG TCC TAG G-3’。
含有AngRem104基因的表达载体及细胞系均属本发明所要求保护的范围。
本发明提供了血管紧张素II相关基因AngRem104(angiotensin II related genesin mesangial cells)。AngRem104基因是血管紧张素II(AngII)刺激系膜细胞后上调表达的基因。AngRem104蛋白质是在正常人组织内广泛表达的核蛋白，可调控AngII诱导的纤粘连蛋白(fibronectin，FN)的上调表达，而纤粘连蛋白是系膜细胞分泌的早期主要细胞外基质成分之一。提示本发明的血管紧张素II相关基因AngRem104在肾小球疾病的治疗及患病机理研究中将会起到重要作用。
本发明为研究肾小球增生硬化可能的分子机制奠定了基础，为揭示AngII参与肾小球疾病进展的可能分子机制提供了新的线索。
图1为显示AngII上调人MsC FN mRNA表达的电泳图谱。
图2为显示AngRem104在正常人不同组织表达分布的Northern杂交图谱。
图3为显示MC在AngII作用下AngRem104 mRNA表达的时间关系及AngII阻断实验的Northern杂交图谱。
图4为鉴定AngRem104 mRNA表达的RT-PCR电泳图谱。
图5为鉴定AngRem104重组融合蛋白表达的Western Blot图谱(转染48h)。
图6为检测FN mRNA表达的RT-PCR图谱。
具体实施例方式
本发明中所用的材料及实验方法1、主要材料和试剂人AngII购自Sigma公司；EcoR I、T4DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、pGEM-TeasyVector、PolyATtractmRNA Isolation system、各种限制性内切酶、DNA连接酶、反转录试剂盒和随机引物标记试剂盒购自Promega公司；d(A，T，C，G)TP、RPMI 1640和胎牛血清、Trizol Reagent、SuperScript II逆转录酶、脂质体(LipofectAMINETM)购自GibcoBRL公司；PCR-Select cDNA Subtraction Kit、SMART RACE cDNAAmplification Kit、Advantage Polymerase Mix、Multiple Tissue Northern Blot尼龙膜、CHROMA SPIN-100 DNA纯化柱、Advantage2 PCR试剂盒、CHROMA SPIN-100柱和正常人多组织mRNA尼龙膜购自Clontech公司。DNA纯化试剂盒购自QIAGEN公司。质粒pcDNA3.1/V5-His-TOPO和小鼠抗人V5单克隆抗体购自美国Invitrogen公司。大肠杆菌DH5α由本室保存。引物的合成及DNA序列测定均由上海博雅公司完成。
2、实验方法2.1细胞培养及细胞总RNA、mRNA的提取人肾小球系膜细胞按常规传代培养至亚融合状态。无血清培养24小时后，实验组给予AngII(10-6mol/L)刺激，对照组除不给予AngII外，其余条件同实验组。采用Gibco BRL公司的Trizol试剂，按说明书操作方法进行总RNA提取；采用Promega公司的小规模磁珠法提取mRNA。
2.2抑制性消减杂交(Suppression subtractive hybridization，SSH)采用CLONTECH公司的PCR-SelectTMcDNA Subtraction Kit提供的试剂和酶，分别以对照组(Driver)和AngII刺激组(Tester)人MsC mRNA为模板进行SSH。按照说明进行SSH得到差异表达的cDNA片段。回收片段克隆到pGEM-Teasy Vector中，连接产物转化感受态DH5α菌，挑选白色克隆进行质粒扩增、提取、纯化和酶切鉴定。
2.3测序、序列拼接和同源性比较SSH片段和RACE产物由上海博雅生物工程公司应用ABI Prism377型自动测序仪完成测序。测序结果以GENETYX for Windows V4.0软件包进行拼接，所得到的序列通过http//www.ncbi.nlm.nih.gov进行序列同源性比较。
2.4差异表达产物的筛选采用反向Northern杂交法。取上述质粒酶切产物1μg，1％琼脂糖凝胶电泳、变性、转膜。分别取tester和driver cDNA 50ng采用随机引物试剂盒(购自Promega公司)以[α-32P]dCTP进行探针标记。并经CHROMA SPIN-100柱(购自CLONTECH公司)方法纯化，在42℃甲酰胺杂交体系中杂交。
2.5基因的序列分析采用GENETYX for Windows V4.0软件包进行新基因的序列分析，包括寻找开放阅读框、加尾信号、Kozak序列和所翻译的氨基酸序列分析。
3、统计学处理实验均重复3次，结果经灰度扫描后，应用统计软件包“SPSS for Windows 8.0”进行t检验和方差分析，以P＜0.05认为有显著性。
实施例1、本发明AngRem104基因的发现本发明AngRem104基因的发现始于对纤粘连蛋白(Fibronectin，FN)和AngII关系的研究。首先进行纤粘连蛋白mRNA和其编码蛋白的表达检测，具体步骤是分别于AngII刺激后6、12、18和24h提取细胞总RNA，收集培养上清，测FN的蛋白浓度(ELISA法)，并以培养细胞总蛋白进行校正。利用Promega公司逆转录试剂盒方法将总RNA反转录成cDNA第一链。随后以GAPDH作为内参照进行PCR扩增。引物序列分别为FN(sense)5′-TGG AAC TTC TAC CAG TGC GAC-3′，(antisense)5′-TGT CTTCCC ATC ATC GTA ACA C-3′，片段大小为451bp；GAPDH(sense)5′-CGT CTT CAC CACCAT GGA GA-3′，(antisense)5′-CGG CCA TCA CGC CAC AGT TT-3′，片段大小为300bp。PCR扩增条件为94℃预变性1min，94℃变性30sec，59℃退火30sec，72℃延伸1min，共28个循环。
结果表明，人MsC经AngII(10-6mol/L)刺激后，FN mRNA和蛋白呈时间依赖性表达上调，其RNA在刺激后12h即明显升高，FN蛋白在刺激后24h达高峰。结果如图1所示，图中d对照组t实验组。
取20μg实验组(T)及对照组(D)的总RNA经变性后，在1.2％甲醛变性琼脂糖凝胶上电泳。电泳结束后，转膜，固定。采用随机引物法标记经反向Northern筛选出的表达有上调的cDNA片段，并按上述方法纯化探针。在42℃甲酰胺杂交体系中杂交24小时。杂交结束后严格洗膜后放射自显影。结果显示培养的人MsC经AngII刺激24h后，被检测的18个基因mRNA的表达分别有1-3倍上调。
以FN为硬化指标参照物，选择AngII刺激24h后的MsC进行抑制性消减杂交(Suppression subtractive hybridization，SSH)。SSH产物经琼脂糖凝胶电泳呈现smear状，但较未杂交标本分布趋于集中(大约0.5-1.2Kb)，为实验组中(Tester)特异表达或高表达的cDNA片段。SSH产物经分离、纯化、克隆后，随机挑选120个阳性克隆，经反向Northern杂交筛选差异表达cDNA片段，有55个克隆在AngII刺激后表达明显上调。在上调表达的克隆中，挑选20个进行序列测定。将测序所得到的序列通过http//www.ncbi.nlm.nih.gov进行序列同源性比较(2001/3/10)。结果显示20个克隆代表18个独立的基因片段序列(有两个序列为双拷贝)。克隆104与已知序列没有明显同源性，确认为新基因。
实施例2、新基因的全长cDNA的分离、克隆及鉴定1〕、快速cDNA末端扩增(rapid amplication of cDNA ends，RACE)采用CLONTECH公司的SMART RACE cDNA Amplification Kit提供的试剂和GibcoBRL公司的SuperScript II逆转录酶，以AngII刺激24h的人MsC细胞mRNA 2μg为模板，分别反转录合成5’-和3’-RACE-Ready cDNA。按照试剂盒提供的方法进行PCR扩增。PCR产物采用NucleoTrap Gel Extraction kit(购自CLONTECH公司)方法纯化。纯化产物采用Promega公司的pGEM-Teasy Vector System进行T/A克隆。然后将质粒转化感受态大肠杆菌，IPTG/X-Gal和氨苄青霉素筛选，挑取阳性克隆扩增并测序。
2〕、全长cDNA扩增根据RACE产物序列测定和拼接结果设计5’和3’端引物，以5’-RACE-ReadycDNA为模板进行PCR扩增。PCR产物纯化、克隆、测序。序列结果通过http//www.ncbi.nlm.nih.gov进行同源性比较。
采用5’-和3’-RACE及长距离PCR的方法分别获得了新基因的全长cDNA，命名为AngRem104(Angiotensin II related gene in mesangial cells)。
AngRem104 cDNA全长为1690bp，3’-端含有polyA及ACTAAA加尾信号，5’-端从90位碱基开始为编码347个氨基酸的完整开放读码框，ATG起始的周边序列符合Kozak规律(CTGATGT)。同源性比较发现与已知基因序列无明显同源性，为新基因，见序列表中的序列1。
实施例3、Northern blot分析AngRem104在人正常组织中的表达分布取30ng AngRem104 cDNA以[α-32P]dCTP进行随机引物法标记成探针，并经CHROMASPIN-100柱纯化后，以42℃在甲酰胺杂交体系(5×SSC，0.05M Na2HPO4，1×Denhart’sSolution，100μg/ml ss鲑精DNA，50％去离子甲酰胺)与正常人多组织mRNA尼龙膜(Clontech)杂交24小时。杂交结束严格洗膜，然后放射自显影。
如图2所示，Northern blot结果显示AngRem104 mRNA在正常人心脏、胎盘、肝脏、骨骼肌、肾脏和胰腺组织广泛表达，但在脑和肺组织没有表达，转录体为1.7Kb，与得到的全长序列相符。
实施例4、MsC在AngII作用下AngRem104 mRNA表达的时间曲线及AngII的阻断实验系膜细胞常规传代培养至亚融合状态后给予AngII(10-6mol/L，Sigma)刺激。分别在AngII刺激6h、12h、24h和48h提取细胞的总RNA，以Northern blot的方法观察AngRem104的mRNA表达。当AngII刺激6h后，以AngIII型受体拮抗剂Losartan(10-6～10-4mol/L，Merck & Co Inc)作用于人系膜细胞，培养24h后，提取细胞总RNA，Northern blot观察Losartan对AngII刺激的AngRem104 mRNA表达的影响。
如图3所示，Northern blot的结果表明，在AngII刺激人系膜细胞后6h，AngRem104表达明显上调，并可持续至48h；但是AngRem104 mRNA的上调表达可以剂量依赖地被Losartan阻断，提示AngII可以特异性调节新基因AngRem104的表达。此调节作用是通过AngIII型受体(angiotensin II type I receptor，AT1R)，提示AngRem104是AngII下游特异的靶基因之一。
实施例5、带有AngRem104融合表达载体的构建根据AngRem104 cDNA的全长序列设计AngRem104开放阅读框(AngRem104 ORF)的引物。上游引物5’-ATG TCA GAT TAT AAT CCT GAT G-3’，下游引物5’-ACT GTAGAG GAG TCC TAG G-3’，以含有AngRem104 cDNA全长的质粒pGEM-T-AngRem104为模板，采用Advantage 2 PCR试剂盒进行PCR，反应条件是94℃预变性1min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸3min，共28个循环，最后72℃ 10min，然后行1％琼脂糖凝胶电泳分析结果。将PCR产物纯化后定向克隆到pcDNA3.1/V5-His-TOPO载体中，连接产物转化感受态DH5α菌，以氨苄青霉素筛选白色克隆进行质粒扩增、提取和酶切鉴定。重组的阳性克隆进行序列测定，并得到正义和反义融合表达载体AngRem104-pcDNA3.1/V5-His-TOPO。
实施例6、质粒的转染体外培养的人肾小球系膜细胞在转染前24h传代，细胞密度为1×105/35mm培养皿，共分4组，分别是AngRem104-pcDNA3.1/V5-His-TOPO重组正义质粒转染组、重组反义质粒转染组、空载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO组和空白对照组。系膜细胞在质粒转染前用无血清培养基洗2-3次。各组质粒均经大量制备并纯化后每组取2μg分别与10μl脂质体混合，室温静止30min，分别加入相应的培养皿中，用无血清培养基培养15h后换含10％血清的培养基继续培养。
实施例7、RT-PCR和Western blot检测AngRem104 mRNA及重组融合蛋白的表达系膜细胞被转染24h和48h后分别提取细胞总RNA。总RNA的提取采用Gibco BRL公司的Trizol试剂，按说明书操作方法进行，经琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA无降解，紫外分光光度计定量后用于反转录。利用Promega公司逆转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA第一链。随后以GAPDH作为内参照进行AngRem104 PCR扩增(引物序列同前)。GAPDH的上游引物为5’-ACC ACA GTC CAT CAT GCC ATC AC-3’，下游引物为5’-TCCACC ACC CTG TTG CTG TA-3’，片段大小为500bp。PCR扩增条件为94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共28个循环，最后72℃ 10min，然后行1％琼脂糖凝胶电泳分析结果。结果发现转染24h后，重组正义AngRem104转染组中AngRem104 mRNA的表达量明显高于空载体转染组和空白对照组，重组反义AngRem104质粒转染组中AngRem104 mRNA的表达量与空载体组和空白对照组相比无差别。质粒转染48h后上述结果更加明显。结果如图4所示，图中MMarker；1、5阴性对照；2、6AngRem104 sense转染组；3、7AngRem104 antisense转染组；4、8空载体转染组。
采用Western blot的方法，利用抗V5单克隆抗体(抗载体上的V5蛋白)检测正义和反义AngRem104重组融合蛋白的表达。实施例5中得到的质粒转染系膜细胞48h后，提取AngRem104-pcDNA3.1/V5-His-TOPO重组正义质粒组、重组反义质粒组、空载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO组和空白对照组细胞的总蛋白。培养细胞用冰预冷的PBS洗2次后加入裂解液，冰浴5min，将裂解物12000r/min离心10min后收集上清。在10％SDS-PAGE上进行分离后，电转移至硝酸纤维素膜上。经5％脱脂奶粉封闭后，与小鼠抗人V5单克隆抗体室温孵育1h，再经洗膜、发光反应曝光于X光片上。结果如图5所示，显示，在系膜细胞中可表达正义AngRem104重组融合蛋白，融合蛋白在42kDa处显带，阳性对照的空载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO蛋白于5kD.a处显带，AngRem104反义转染组和空白对照组无特异条带。图中1阴性对照；2AngRem104 sense转染组；3AngRem104 antisense转染组；4空载体转染组。
RT-PCR和Western blot检测结果证明AngRem104-pcDNA3.1/V5-His-TOPO正义质粒转染组中AngRem104基因过量表达，而在反义质粒转染组中AngRem104基因的表达被成功阻断。
实施例8、AngRem104过表达时纤粘连蛋白(fibronectin，FN)mRNA的表达实验共分6组，分别是AngRem104-pcDNA3.1/V5-His-TOPO重组正义质粒转染组、重组反义质粒转染组、空载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO转染组、重组反义质粒转染加AngII(10-6mol/L)刺激组、单纯AngII(10-5mol/L)刺激组和空白对照组。采用GibcoBRL公司的Trizol试剂提取各组细胞总RNA，利用Promega公司逆转录试剂盒方法将总RNA反转录成cDNA第一链。随后以GAPDH作为内参照进行PCR扩增。引物序列分别为FN(sense)5’-TGG AAC TTC TAC CAG TGC GAC-3’，(antisense)5’-TGTCTT CCC ATC ATC GTA ACA C-3’，片段大小为500bp；GAPDH(sense)5’-CGT CTTCAC CAC CAT GGA GA-3’，(antisense)5’-CGG CCA TCA CGC CAC AGT TT-3’，片段大小为300bp。PCR扩增条件为94℃预变性1min，94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min，共28个循环。
如图6的RT-PCR结果显示在正义AngRem104转染组中FN mRNA的表达量明显高于空载体转染组和空白对照组，而反义AngRem104转染组中FN mRNA的表达量与空载体组和空白对照组相比无差别。单纯用AngII(10-6mol/L)刺激时FN的表达明显上调；而反义AngRem104转染后加AngII(10-6mol/L)刺激组中FN的表达并不增加，表明AngII诱导的FN的表达升高是通过AngRem104基因来调控的。图中MMarker；1阴性对照；2AngRem104 sense转染组；3AngRem104 antisense转染组；4AngRem104antisense+AngII；5AngII；6空载体转染组。
序列表<160>2<210>1<211>1690<212>DNA<213>人属人(Homosapiens)<400>1acgcggggag gaacaaggtt ccttcaagtt gggtctattt tcttctaagt ttatcactgc60tccatagcag ttataattag attaccctga tgtcagatta taatcctgat gtcctccagc120agcttgtcaa ggatggaatc aagactatcg agcttttaca gcagagtccg gaagactttc180agaagacgta cggcagaagt gccatccagg agccgtcgac aagagccaga atccaaagtt240gggagtcccg caatcccgat catgattaca ccggtaataa aaatcagaga agcgagggag300ctaaagagag agcaaacaag agcgagagcg cgggaactgc ttcagctgat ggaggacatg360gagataaacc ctcaaataac gggggtgact cccaaaacga gtaccaaggg tcagatcaac420aggtatggga tgctgcgtat aatgatggga atagtggcgg agcttgggga ggtcccacag480gtggacttcc cacggctgga gaaagagggt atcctatcac aacaggaaat caagaatttg540agggatacca tcccgacggt ccagttgatg ctcgagagta taatcagata agctccatgg600atcatgagat gtctgctgca gaaactttgg gctcgtctac tcagctaact actatgagaa660acgcaacaac tgatgatttt gcgaaaattt ttgaggaggg gacacctaaa gtgcaccgac720ggctgagggg gataactgct gttgtgccgg ctcaaaagca accaggggca gtcggtggac780ctgttaaaaa aggcaccgac gggagtactg catcgacact tttgggggac gtaccattat840ccgggagtgg tgcaatcccc aatgtgcacc cctcactgtt acaccaaccc aaaaagaatg900ctcatgcgga gaatgcccaa ggcagtgtgc aagatgtatc gacgaccggg gctattggcc960aaagtgacga ggctgcacac tttgatcagg agattgaagg aaaactcaat cttgtgctta1020aggaattaga tctgatcagt aagaagctag actatctacc ggagatcaaa gaggagatca1080ggaatattaa taagaaaata accaatctta gcctaggact cctctacagt tgaaaactta1140tatcaaatcc atgatgatca ttatccctag ctcaggaaag cctgatgtga atgacacggc1200tgaggtgaat ccagatctga aggcagtaat tgggagagat aaaactaggg ggttgaagga1260agttacaaca cacaggagtg atctagaaag tttagacctc ctaagcccag caacatcaga1320aatagaccct aaatacctga ctcaagacct ggatttcact aagtctaatg ccgccaattt1380tgtcccaggc aatgatgcca gctcatttta taccattgtg gctatgatca agggtgaagt1440aactgatgtc aaacgtcagc aagagttgat caagtgggtg tctgactcca tgaacaaaca1500ccccatggga cagatctacc gtgtcgtgag ggaggctctg gatgctgaaa gtgacagctc1560ctcaagctca gatagtgatt agatgctaag gcaaccagct tacacattat acaattattg1620ttgttattgt aacactggct ttgaattaat ctactaaatt gcccaaaaaa aaaaaaaaaa1680aaaaaaaaaa 1690<210>2
<211>347<212>PRT<213>人属人(Homosapiens)<400>2Met Ser Asp Tyr Asn Pro Asp Val Leu Gln Gln Leu Val Lys Asp15 10 15Gly Ile Lys Thr Ile Glu Leu Leu Gln Gln Ser Pro Glu Asp Phe20 25 30Gln Lys Thr Tyr Gly Arg Ser Ala Ile Gln Glu Pro Ser Thr Arg35 40 45Ala Arg Ile Gln Ser Trp Glu Ser Arg Asn Pro Asp His Asp Tyr50 55 60Thr Gly Asn Lys Asn Gln Arg Ser Glu Gly Ala Lys Glu Arg Ala65 70 75Asn Lys Ser Glu Ser Ala Gly Thr Ala Ser Ala Asp Gly Gly His80 85 90Gly Asp Lys Pro Ser Asn Asn Gly Gly Asp Ser Gln Asn Glu Tyr95 100 105Gln Gly Ser Asp Gln Gln Val Trp Asp Ala Ala Tyr Asn Asp Gly110 115 120Asn Ser Gly Gly Ala Trp Gly Gly Pro Thr Gly Gly Leu Pro Thr125 130 135Ala Gly Glu Arg Gly Tyr Pro Ile Thr Thr Gly Asn Gln Glu Phe140 145 150Glu Gly Tyr His Pro Asp Gly Pro Val Asp Ala Arg Glu Tyr Asn155 160 165Gln Ile Ser Ser Met Asp His Glu Met Ser Ala Ala Glu Thr Leu170 175 180Gly Ser Ser Thr Gln Leu Thr Thr Met Arg Asn Ala Thr Thr Asp185 190 195Asp Phe Ala Lys Ile Phe Glu Glu Gly Thr Pro Lys Val His Arg200 205 210Arg Leu Arg Gly Ile Thr Ala Val Val Pro Ala Gln Lys Gln Pro215 220 225
Gly Ala Val Gly Gly Pro Val Lys Lys Gly Thr Asp Gly Ser Thr230 235 240Ala Ser Thr Leu Leu Gly Asp Val Pro Leu Ser Gly Ser Gly Ala245 250 255Ile Pro Asn Val His Pro Ser Leu Leu His Gln Pro Lys Lys Asn260 265 270Ala His Ala Glu Asn Ala Gln Gly Ser Val Gln Asp Val Ser Thr275 280 285Thr Gly Ala Ile Gly Gln Ser Asp Glu Ala Ala His Phe Asp Gln290 295 300Glu Ile Glu Gly Lys Leu Asn Leu Val Leu Lys Glu Leu Asp Leu305 310 315Ile Ser Lys Lys Leu Asp Tyr Leu Pro Glu Ile Lys Glu Glu Ile320 325 330Arg Asn Ile Asn Lys Lys Ile Thr Asn Leu Ser Leu Gly Leu Leu335 340 345Tyr Ser34权利要求
1.一种血管紧张素II相关基因AngRem104，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
2.根据权利要求1所述血管紧张素II相关基因，其特征在于所述血管紧张素II相关基因为SEQ ID №1。
3.根据权利要求2所述血管紧张素II相关基因，其特征在于所述SEQ ID №1的编码框为自5’端第90位碱基到第1130位碱基。
4.血管紧张素II相关的蛋白质AngRem104，它是序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列或将SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白质。
5.根据权利要求2所述的蛋白质，其特征在于所述蛋白是序列表中SEQ ID №2。
6.含有权利要求1所述血管紧张素II相关基因的表达载体。
7.含有权利要求1所述血管紧张素II相关基因的细胞系。
8.一种扩增血管紧张素II相关基因AngRem104的引物上游引物5’-ATG TCA GAT TAT AAT CCT GAT G-3’下游引物5’-ACT GTA GAG GAG TCC TAG G-3’。
9.血管紧张素II相关基因AngRem104及其编码蛋白在制备治疗肾小球疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种血管紧张素II的相关基因及其编码蛋白质与应用。本发明的血管紧张素II的相关基因是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。本发明血管紧张素II相关基因编码的蛋白质，是序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列或将SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №2相同活性的由SEQID №2衍生的蛋白质。本发明为揭示AngII参与肾小球疾病进展的可能分子机制提供了新的线索。
文档编号C12N15/12GK1524958SQ03105028
公开日2004年9月1日 申请日期2003年2月27日 优先权日2003年2月27日
发明者王海燕, 张宏, 梁秀彬, 周安宁 申请人:北京大学第一医院