专利名称：一种抗凝蛋白及其编码基因与它的高效表达方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域中的一种抗凝蛋白及其编码基因与该基因的高效表达方法。
背景技术：
血栓是血管腔内血液发生凝固或血液中的某些有形成分互相凝集形成的固体凝块。影响血栓形成的因素可分为血管和血液两大类。血管因素主要与血管内膜的完整性受破坏有关。血液因素则包含多种凝血因子和血小板的互相作用，导致血液内纤维蛋白的形成与聚集的血小板和其它有形成分共同形成血栓。血液内的凝血因子包括因子I至因子XII等多种，其中最常见的对抗凝药物影响的是因子II、VII、IX和X。
干扰血液凝固过程的药物，称为抗凝药，已被临床上广泛用于血栓塞性疾病的预防与治疗。目前在临床上使用的抗凝剂，如肝素，水蛭素，双香豆素，抗凝血酶III等，使用过程中均显示拌有一些不良反应，如肝素所致的血小板减少性紫癜。因此，寻找新的有效的，且不良反应少的抗凝剂具有重要意义。
从狗线虫中提取的抗凝蛋白C2具有明显的抗凝作用(见美国专利5866543)，其作用与抑制活化的因子VIIa有关，但对因子IIa(凝血酶)的活性无影响。该蛋白的功能部位是由84个氨基酸残基组成的多肽，可延长凝血时间，活性优于肝素，其蛋白序列及其编码基因见序列表中的序列2及序列1。在线虫抗凝蛋白C2的结构中包含有10个半胱氨酸，分别是它的功能结构区。如何有效地对抗抗凝药物的抗凝血作用，降低出血事件的发生率，是目前抗凝和抗血栓类药物关注的重点。抗凝蛋白C2具有显著的抗凝活性，但其体内降解仍以非特异性的蛋白酶作用为主，影响其在使用过量情况下的抗凝活性的快速逆转过程，因此，开发一种既具有抗凝蛋白C2样作用，同时其作用可在需要的情况下迅速逆转的产品，在心脑血管疾病的防治方面，具有重要的临床意义。
毕赤酵母表达系统是用于表达外源蛋白的最成功的表达系统之一，近年来发展非常迅速，目前已有几百种蛋白在该表达系统中得以表达。毕赤酵母是一种甲醇营养型酵母菌，其生长迅速，培养条件简单，可以高密度连续培养，遗传操作与酿酒酵母相似，技术已相当成熟，是工业生产中常用的高表达菌种。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的人工合成的抗凝蛋白及其编码基因，该抗凝蛋白既具有抗凝蛋白C2样作用，同时在需要的情况下可迅速逆转。
一种抗凝蛋白，是将线虫抗凝蛋白C2中1个或多个半胱氨酰功能结构区中的部分或全部氨基酸残基用凝血酶切位点取代，或者是在线虫抗凝蛋白C2的1个或多个半胱氨酰功能结构区中插入凝血酶切位点得到的蛋白质。
所述半胱氨酰功能结构区是与半胱氨酸残基羧基端相连的2-6个氨基酸残基组成的肽。
所述凝血酶切位点为包含有自氨基向羧基端为精氨酸-甘氨酸的由2-6个氨基酸残基组成的短肽。该凝血酶切位点优选的是自氨基端起依次由亮氨酸—缬氨酸—脯氨酸—精氨酸—甘氨酸—丝氨酸6个氨基酸残基组成的肽链。
编码上述蛋白质的基因也属于本发明的保护范围。
本发明的第二个目的是提供一种上述编码抗凝蛋白基因的高效表达方法，使其适应规模化生产的需要。
抗凝蛋白基因的高效表达方法，是将编码抗凝蛋白的基因导入到毕赤酵母菌中，表达获得线虫抗凝蛋白。
具体地说，该方法包括以下步骤1)合成线虫抗凝蛋白基因序列；2)将合成的基因片段与载体pPIC9K连接，得到表达质粒，转化毕赤酵母菌后获得表达工程菌；3)培养工程菌，表达产物分泌到培养液中，获得目标蛋白。
为了获得更好的效果，毕赤酵母菌的表达过程中用甲醇进行诱导。诱导过程中的甲醇终浓度优选为1％-5％。
本发明十分巧妙地将线虫抗凝蛋白C2进行了彻底改造，从根本上解决了在需要的时候线虫抗凝蛋白C2不能快速逆转的缺陷，可在必要的情况下迅速将抗凝作用逆转，避免大出血的发生，在心脑血管疾病的防治方面，具有重要意义，以本发明为活性成分的药物是一种安全保障系数更高的抗凝药物。
图1为PCR法合成的基因片段。
图2为本发明完整基因组装示意3为表达质粒的构建图谱图4为表达质粒的酶切签定图5为诱导表达的SDS-PAGE分析图6为诱导表达产物的活性鉴定
具体实施例方式
实施例1、表达基因的合成1、设计抗凝蛋白基因序列SEQ ID №3，在第一和第二个半胱氨酸区间设计一个凝血酶切位点；SEQ ID №5，在第四和第五个半胱氨酸区间设计一个凝血酶切位点；SEQ ID №7，在第一和第二个半胱氨酸区间以及第五和第六个半胱氨酸区间各设计一个凝血酶切位点；SEQ ID №9，在第八和第九个半胱氨酸区间设计一个凝血酶切位点；SEQ ID №11，在第九和第十个半胱氨酸区间设计一个凝血酶切位点。
2、小片段的人工合成将SEQ ID №3、5、7、 9、11抗凝蛋白基因分别分为两段，第一段序列为cDNA正链，第二段序列为cDNA互补链。在第一段的3’端外加8个与第二段3’互补的碱基，总长150个碱基，分别为序列表中的序列SEQ ID №13、15、17、19、21，将其分别命名为序列A、B、C、D、E，在第二段的3’端外加12个与第一段3’端互补的碱基，为序列表中的SEQ ID №14、16、18、20，总长分别为147、147、153、147、150个碱基。在两片段5’端分别加上SnaBI和NotI酶切位点，用DNA合成仪合成。
将DNA合成仪合成的片段，用单一循环的PCR反应分别连接合成序列A、B、C、D、E的全序列新抗凝蛋白基因，结果如图1所示，其中A、B、C、D、E泳道分别为序列A、B、C、D、E，表明得到的序列正确。
实施例2、本发明抗凝蛋白体外表达1、切取实施例1中的PCR片段，装入pGEM-T-EASY质粒内，构建pGEM-ACPA、pGEM-ACPB、pGEM-ACPC、pGEM-ACPD、pGEM-ACPE克隆载体，其结构图谱如图2所示。
2、pGEM-ACP表达质粒的构建采用购自美国Invitrogen公司的高效表达质粒pPIC9K，用SnaBI和NotI分别酶切pGEM-ACP质粒和pPIC9K质粒，凝胶电泳收集目标片段，用T4连接酶16℃过夜连接。经常规方法的转化，挑菌，扩增获得表达质粒pPIC-ACPA、pPIC-ACPB、pPIC-ACPC、pPIC-ACPD、pPIC-ACPE，其结构图谱如图3所示。
酶切鉴定，证明表达质粒的结构正确，图4所示为pPIC-ACPA不同克隆的酶切电泳结果。
3、将质粒pPIC-ACP用SacI线性化.采用浙江新芝公司电基因导入仪，将线性化的pPIC-ACP导入GS115毕赤酵母菌(购自Invitrogen公司)内，经培养，挑选，筛选等过程，获得抗G418mg/ml的单克隆菌。
4、挑选单克隆菌，接种于5ml培养基中，30℃过夜，然后转入250ml培养基中，继续培养至OD600＝10-20，收集菌体，用无碳源培养基稀释至OD600＝50，继续培养24小时，加入甲醇至终浓度为1％诱导表达，每隔24小时加甲醇一次，至96小时。离心取上清液，进行凝胶电泳分析和功能测定。取10ml上清液，用12％SDS-PAGE电泳，并经考马斯亮兰染色。结果可见，在18KD的位置，有诱导的蛋白表达，并根据BSA对照，估测表达量为100-150mg/L。
在本实施例中，培养单克隆菌体时用甲醇进行诱导意义很大，在没有诱导之前，培养液中目标蛋白的含量很低，如图5所示，诱导后的培养液中有显著的目标蛋白带，而诱导前的培养液中没有显著的目标蛋白带。
实施例3、本发明抗凝蛋白的功能测定取6支试管，分别标为生理盐水、甲醇诱导后上清A、上清B、上清C、上清D、上清E，加入对应液体10ul/管，然后加入新鲜采集的兔动脉血40ul/管，混匀，记录血液凝固时间，结果如图6所示，其中血凝抑制率的计算公式为反应1小时时测定组血液凝固管数/生理盐水组血液凝固管数，盐水(NS)于1.82分形成血凝块，所有诱导后上清于12小时后仍无血凝块形成。诱导后上清兔动脉血为1∶4时，血凝抑制率均为100％，表明表达产物均具有良好的抗凝活性。
实施例4、本发明抗凝蛋白的凝血酶切反应后的功能测定取6支试管，分别标为生理盐水、甲醇诱导后上清A、上清B、上清C、上清D、上清E，加入对应液体10ul/管，加入0.1单位的牛凝血酶，37℃孵育30分钟，然后加入新鲜采集的兔动脉血50ul/管，混匀，记录血液凝固时间，结果盐水(NS)于1.90分形成血凝块，上清A、上清B、上清C、上清D、上清E分别于13分、14.5分、5分、8分和25分形成血凝块、表明表达产物可及时地被凝血酶降解。
序列表<160>22<210>1<211>255<212>DNA<213>线虫属狗线虫(ancylostoma caninum)<220>
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<400>1aaggctacca tgcagtgtgg tgagaatgag aagtacgact cctgcggtag caaggagtgt 60gacaagaagt gtaagtacga cggtgttgag gaggaggacg acgaggagcc aaatgtccca120tgcctagttc gtgtctgtca ccaagactgc gtttgcgagg agggtttcta cagaaacaag180gacgacaagt gtgtttctgc tgaggactgc gagcttgaca atatggactt catttaccca240ggtactcgaa actga 255<210>2<211>84<212>PRT<213>线虫属狗线虫(ancylostoma caninum)<220>
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<400>2Lys Ala Thr Met Gln Cys Gly Glu Asn Glu Lys Tyr Asp Ser Cys1 5 10 15Gly Ser Lys Glu Cys Asp Lys Lys Cys Lys Tyr Asp Gly Val Glu20 25 30Glu Glu Asp Asp Glu Glu Pro Asn Val Pro Cys Leu Val Arg Val35 40 45Cys His Gln Asp Cys Val Cys Glu Glu Gly Phe Tyr Arg Asn Lys50 55 60Asp Asp Lys Cys Val Ser Ala Glu Asp Cys Glu Leu Asp Asn Met65 70 75Asp Phe Ile Tyr Pro Gly Thr Arg Asn80 84
<210>3<211>255<212>DNA<213>人工序列<220>
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<400>22attcgcggcc gctcagtttc gagtacctgg gtaaatgaag tccatattgt caagctcgca 60gcaacctctt ggaaccaaac acttgtcgtc cttgtttctg tagaaaccct cctcgcaaac120gcagtcttgg tgacagacac gaac 14权利要求
1.一种抗凝蛋白，是将线虫抗凝蛋白C2中1个或多个半胱氨酰功能结构区中的部分或全部氨基酸残基用凝血酶切位点取代，或者是在线虫抗凝蛋白C2的1个或多个半胱氨酰功能结构区中插入凝血酶切位点得到的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的抗凝蛋白，其特征在于所述半胱氨酰功能结构区是指线虫抗凝蛋白C2两相邻半胱氨酸残基间的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的抗凝蛋白，其特征在于所述凝血酶切位点为包含有自氨基端起为精氨酸-甘氨酸的由2-6个氨基酸残基组成的短肽。
4.根据权利要求1所述的抗凝蛋白，其特征在于所述凝血酶切位点为自氨基端起依次由亮氨酸-缬氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-丝氨酸6个氨基酸残基组成的肽链。
5.编码权利要求1-4所述蛋白质的基因。
6.抗凝蛋白基因的高效表达方法，是将权利要求5的基因导入到毕赤酵母菌中，表达获得线虫抗凝蛋白。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于该方法包括以下步骤1)合成线虫抗凝蛋白基因序列；2)将合成的基因片段与载体pPIC9K连接，得到表达质粒，转化毕赤酵母菌后获得表达工程菌；3)培养工程菌，表达产物分泌到培养液中，获得目标蛋白。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于毕赤酵母菌的表达过程中用甲醇进行诱导。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于诱导过程中的甲醇终浓度为1％-5％。
全文摘要
本发明公开了一种抗凝蛋白及其编码基因与它的高效表达方法，目的是提供一种新的人工合成的抗凝蛋白及其编码基因，该抗凝蛋白既具有抗凝蛋白C2样作用，同时在需要的情况下可迅速逆转。一种抗凝蛋白，是将线虫抗凝蛋白C2中1个或多个半胱氨酰功能结构区中的部分或全部氨基酸残基用凝血酶切位点取代，或者是在线虫抗凝蛋白C2的1个或多个半胱氨酰功能结构区中插入凝血酶切位点得到的蛋白质。本发明十分巧妙地将线虫抗凝蛋白C2进行了彻底改造，从根本上解决了在需要的时候线虫抗凝蛋白C2不能快速逆转的缺陷，可在必要的情况下迅速将抗凝作用逆转，避免大出血的发生，在心脑血管疾病的防治方面，具有重要意义。
文档编号C12N15/81GK1523036SQ0310466
公开日2004年8月25日 申请日期2003年2月20日 优先权日2003年2月20日
发明者刘凤鸣 申请人:刘凤鸣