专利名称：一种快速灵敏的定量分枝菌酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种在各种测试化合物存在的情况下在最大吸收范围介于490-500nm时鉴定和定量分枝菌酸-品红染料复合体中分枝菌酸的快速、灵敏、简单和低成本的分光光度法。此法用于筛选用于抗微生物试剂和其诊断试剂盒的分枝菌酸生物合成抑制物，所述诊断试剂盒包括浓度范围介于0.1-1.0gm/100ml的碱性品红染料、比例范围介于1∶4到2∶1(v/v)的苯酚和95％的乙醇、比例范围介于1∶14到1∶25的苯酚和蒸馏水。
背景技术：
由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)导致的结核是一公众健康难题，在最近二十年其重要性有所增加，部分是由于获得性免疫缺陷综合征(AIDS)和大量抗药菌株的出现所联合导致的病例数目的增加。其它通常难与结核杆菌区别的分枝杆菌也增加了。
目前的检测方法是从临床分离的痰液、脑脊液、支气管洗涤液、角膜溃疡、骨髓以及抗酸细菌染色涂片检查呈阳性的临床标本中测定分枝菌酸的模式。标准的分枝菌酸提取方法被用来确保最大化的提取分枝菌酸衍生物，以增加方法的灵敏度。不同的层析柱被用来鉴定分枝菌酸的种类。对含有分枝菌酸的细菌的即时检测是通过抗酸细菌染色和显微镜检查进行的。
普通染料不能渗透富含脂质的细胞壁。
由碱性染料(品红)和苯酚(一种脂溶剂)组成的染料被用于此目的。苯酚部分溶解细胞壁，从而使品红透过细胞壁与分枝菌酸结合。
品红一旦被结合甚至能抵抗暴露于酸性醇类的脱色，这是一个可以被用来表征未处理的临床标本、浓缩标本、和培养物中的分枝杆菌的特性。
这一原则被广泛用于借助显微镜鉴定产生分枝菌酸的细菌。但是目前需要基于目视检测分枝菌酸的改进系统以从大量的植物化合物中筛选可能的抑制分枝菌酸生物合成的化合物。
借助于分光光度计，检测和定量程序可以更加精确。抑制的量可以简单的通过在特定波长下的光密度测量来定量。这无需目前使用的用于检测的IR、NMR、GC光谱之类的复杂的高成本技术。
不能被抗酸细菌染色再经显微镜检测定量的分枝菌酸的量可以通过系统的提取和染料结合再用分光光度分析来定量。由此设计了用于检测和定量分枝菌酸的简单、迅速、低成本的操作试剂盒，进而获得了鉴定分枝菌酸生物合成抑制物的高效率筛选方法。
本领域具有提取、分离分枝菌酸和通过抗酸细菌染色检测产生分枝菌酸的细菌的方案。但是该系统总体而言是低效的，并需要用显微镜来检测产生分枝菌酸的细菌的存在。
通过不同的层析和IR、NMR光谱法进行了相似的分枝菌酸的提取、分离和表征。我们在此强调将产生快速、低成本的筛选大量具有潜在的抑制分枝菌酸生物合成活力的植物提取物和化合物的系统。
本发明的目的本发明的主要目的是发展快速、简单、灵敏、低成本的鉴定分枝菌酸的方法。
本发明的另一主要目的是发展快速、简单、灵敏、低成本的定量分枝菌酸的方法。
本发明进一步的目的是发展快速、简单、灵敏、低成本的鉴定和定量分枝菌酸的分光光度分析法。
而本发明另一的目的是利用石炭酸-品红染料和分枝菌酸复合体来发展快速、简单、灵敏、低成本的鉴定和定量分枝菌酸的分光光度分析法。
本发明还有一目的是发展筛选测试化合物对分枝菌酸的抑制特性的方法。
本发明还有一目的是发展由分光光度技术检测分枝菌酸的试剂盒。
发明概述本发明涉及一种在各种测试化合物存在的情况下在最大吸收范围介于490-500nm时鉴定和定量分枝菌酸-品红染料复合体中分枝菌酸的快速、灵敏、简单和低成本的分光光度分析法。此法用于筛选用于抗微生物试剂和诊断试剂盒的分枝菌酸生物合成抑制物，所述诊断试剂盒包括浓度范围介于0.1-1.0gm/100ml的碱性品红染料、比例范围介于1∶4到2∶1(v/v)的苯酚和95％的乙醇、比例范围介于1∶14到1∶25的苯酚和蒸馏水。
发明详述因此，本发明涉及一种在各种测试化合物存在的情况下在最大吸收范围介于490-500nm时鉴定和定量分枝菌酸-品红染料复合体中分枝菌酸的快速、灵敏、简单和低成本的分光光度分析法。此法用于筛选用于抗微生物试剂和诊断试剂盒的分枝菌酸生物合成抑制物，所述诊断试剂盒包括浓度范围介于0.1-1.0gm/100ml的碱性品红染料、比例范围介于1∶4到2∶1(v/v)的苯酚和95％的乙醇、比例范围介于1∶14到1∶25的苯酚和蒸馏水。
在本发明的一实施方案中，提供了在测试化合物或提取物存在和不存在的情况下，通过定量细菌产生的分枝菌酸来筛选用作抗微生物试剂的分枝菌酸生物合成抑制物的快速、简单、灵敏和低成本的方法。
在本发明的另一实施方案中，在所述化合物或提取物存在和不存在的情况下对所述细菌进行持续40-60小时的单独培养。
而在本发明的另一实施方案中，冻干沉淀的菌体。
还在本发明的另一实施方案中，通过传统的方法提取分枝菌酸。
还在本发明的另一实施方案中，将分枝菌酸溶解于己烷以获得分枝菌酸溶液。
还在本发明的另一实施方案中，以1∶4到4∶1(v/v)的比例范围将所述溶液加入到石炭酸-品红染料中。
还在本发明的另一实施方案中，强烈摇动步骤(e)的产物以获得上层粉红色的分枝菌酸-染料复合体。
还在本发明的另一实施方案中，在波长介于490-500nm的范围内用分光光度计定量所述分枝菌酸。
还在本发明的另一实施方案中，在化合物处理的细菌培养物中测定分枝菌酸生物合成的抑制程度。
还在本发明的另一实施方案中，其中用分光光度法定量分枝菌酸水平的优选波长范围介于494-496纳米。
还在本发明的另一实施方案中，其中石炭酸品红染料与所述提取物的优选比例为1∶1(v/v)。
还在本发明的另一实施方案中，其中石炭酸品红由浓度范围介于0.1-1.0gm/100ml的碱性品红染料、苯酚、95％的乙醇和蒸馏水组成，其中苯酚和乙醇的比例范围介于1∶4到2∶1(v/v)，苯酚和蒸馏水的比例范围介于1∶25到1∶14(v/v)。
还在本发明的另一实施方案中，其中所述具有抑制活性的测试化合物或提取物以最小抑制浓度(MIC)的1/25至1/2被加入。
还在本发明的另一实施方案中，其中所述抗微生物试剂被发展来抵抗分枝杆菌、棒状杆菌、诺卡氏菌之类的微生物。
还在本发明的另一实施方案中，其中所述方法被用于筛选选自合成、半合成、天然化合物和提取物的抑制物。
还在本发明的另一实施方案中，其中颜色强度随着分枝菌酸浓度的增加而增加。
还在本发明的另一实施方案中，其中所述方法适用于所有来源的分枝菌酸。
在本发明进一步的实施方案中，提供了用于鉴定抗产生分枝菌酸的微生物的潜在抗微生物药物的试剂盒，所述试剂盒包含石炭酸品红、甲醇、甲苯、己烷、浓硫酸、菌体和测试化合物或提取物，所述成分的比例为甲醇∶甲苯介于1∶3到3∶1(v/v)的范围，甲醇∶己烷介于8∶1到2∶1(v/v)的范围，浓硫酸∶己烷介于1∶8到1∶2(v/v)的范围，石炭酸品红∶己烷提取物介于1∶4到4∶1(v/v)的范围，上述比例的甲醇、甲苯和浓硫酸被加入到冻干的菌体中，最终浓度都介于0.1-3.0gm/100ml。
还在本发明的另一实施方案中，其中石炭酸品红由浓度范围介于0.1-1.0gm/100ml的碱性品红染料、苯酚、95％乙醇和蒸馏水组成，其中苯酚和乙醇的比例范围介于1∶4到2∶1(v/v)，苯酚和蒸馏水的比例范围介于1∶14到1∶25(v/v)。
还在本发明的另一实施方案中，其中所述菌体选自分枝杆菌、棒状杆菌和诺卡氏菌。
还在本发明的另一实施方案中，其中所述具有抑制活性的测试化合物或提取物以最小抑制浓度(MIC)的1/25到1/2范围被加入。
在本发明的另一实施方案中，抗酸细菌染色(分枝杆菌的特征)导致分枝菌酸与石炭酸品红染料结合使抗酸细菌呈现粉色。
而在本发明的另一实施方案中，在此原则的基础上发展了分光光度分析法，当分枝菌酸的己烷抽提物与石炭酸品红染料一起置于螺帽试管中时，己烷部分形成无色上层，染料形成粉色下层，但是当剧烈混合试管后，石炭酸品红染料与己烷层中的分枝菌酸结合，并且形成粉色上层，上层粉色强度的增加和透明下层粉色强度的降低依赖存在于己烷上层的分枝菌酸的量。
还在本发明的另一实施方案中，表明在剧烈混合染料和己烷层的过程中，染料与分枝菌酸结合并形成复合体，进入己烷层的染料的量依赖于分枝菌酸在己烷层的浓度，而不含分枝菌酸的通常的己烷不会形成赋予上层粉色特征的复合体。
还在本发明的另一实施方案中，本发明涉及筛选分枝菌酸生物合成抑制物的方法。更特别的，本发明涉及检测和定量在混合物或溶液或培养物中的分枝菌酸的相对含量，从而可以鉴定分枝菌酸生物合成抑制物，因此可作为检测抑制分枝菌酸生物合成的潜在的药物化合物的筛选方法。本发明还涉及可以被用作诊断试剂盒的分枝菌酸检测试剂盒。本发明在简化迅速检测抑制分枝菌酸生物合成的化合物的操作以及最终导致抗微生物药物方面有直接的应用。
还在本发明的另一实施方案中，分枝杆菌中的分枝菌酸与石炭酸品红结合的事实是众所周知的。事实上，利用此原则，通常在医院和诊断实验室中对临床标本测试分枝杆菌的存在，但是需要借助于显微镜，这是费力的操作。
此外，显微镜方法不能用于药物筛选之类的其它用途，在药物筛选中分枝杆菌产生的分枝菌酸的定量是必需的。
还在本发明的另一实施方案中，本专利申请中描述的方法依赖于同样的原则，但却使我们能够定量分枝杆菌中分枝菌酸的产生和/或抑制。本申请不是为了保护所述原则，而是为了保护使用诊断试剂盒和分光光度技术来检测分枝菌酸的简单、迅速的定量方法。
还在本发明的另一实施方案中，本专利申请提供了改进的定量分枝菌酸的存在并因此定量任何给定的标本中分枝杆菌的存在的方法。它也提供了改进的定量分枝菌酸合成抑制的方法，用于鉴定分枝菌酸抑制物的药物筛选程序。
附图简述
图1表示己烷中分枝菌酸(5微克/ml)的光谱扫描。
图2表示石炭酸-品红染料的光谱扫描。
图3表示己烷中分枝菌酸(5微克/ml)-石炭酸品红的光谱扫描。
图4表示当与石炭酸品红染料复合后，随着分枝菌酸浓度的增加吸收也增加。
在以下的实施例中说明了检测潜在的分枝菌酸生物合成抑制物的简单、新颖和迅速的系统。所述实施例被用来说明本发明，因此不应被理解为对本发明范围的限制。
实施例实施例1分枝菌酸的提取分枝菌酸是分枝的、β-羟基脂肪酸，它存在于棒状杆菌、诺卡氏菌和分枝杆菌的细胞壁。它们的分子大小随种属而变化，即按上述顺序为30、50、80个碳原子。因为分枝菌酸大小与种属有关，在鉴定未知放线菌的早期阶段，这一生化指标被测试。本发明中提取分枝菌酸的方法是根据Minniken等人(1975)的方法。在细菌适当生长后，培养物在5000RPM被离心5分钟，并被冻干。在一20ml的螺帽试管(Poly TetraFluoro Ethylene lined)中，干细菌(100mg)与甲醇(5ml)、甲苯(5ml)和浓硫酸(0.2ml)混合。试管的内容物被彻底混和，甲醇分解作用被允许在75℃(静置孵育)进行12-16小时。将反应混合物冷却，并加入1ml己烷抽提分枝菌酸。在剧烈混和之后静置混合物，收集含有分枝菌酸的己烷上层。己烷提取物样品被点于包被Merck硅胶H(0.5mm)的TLC，与标准分枝菌酸一同在石油醚∶二乙醚(85∶15)中层析。在喷洒铬酸溶液(5gmK2Cr2O7，溶于5ml水，用浓硫酸补到100ml，然后用水稀释10倍)后，通过在150-200℃炭化显示分离的组分的位置。
实施例2进行从200nm到1000nm的纯分枝菌酸(得自Sigma ChemicalCo.)的光谱扫描。在可见光区没有发现明显的峰(图1)。
实施例3从200nm到1000nm分析石炭酸品红(碱性品红0.3g、乙醇(95％)10.0ml、苯酚0.5ml、蒸馏水95ml)的光谱扫描，表明染料颜色的、在可见光区538.71处的明显峰被记录了(图2)。
实施例4当溶于己烷的分枝菌酸被加入石炭酸品红(1∶1比例v/v)后，石炭酸品红形成粉色下层，己烷中的分枝菌酸形成透明上层。在彻底的混和后，由于染料与分枝菌酸之间复合体的形成，己烷上层变成粉色。因为分枝菌酸可溶于己烷，并且不能进入密集的石炭酸品红层，进入己烷上层的染料将粉色带给了上层。这一简单的系统被进一步开发用于筛选潜在的分枝菌酸生物合成抑制物。从200nm到1000nm扫描己烷层中的分枝菌酸和品红复合体的UV-可见光谱，发现538.71nm的染料峰迁移到495.89nm，这表明与分枝菌酸的复合体的形成(图3)。
实施例5
为了再次确证分枝菌酸是形成这种复合体的唯一候选者，进行了来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和大肠杆菌(Escherichia coli)(不产生分枝菌酸)的己烷抽提物的量热分析，此观察被描述于本实施例。当仅仅是己烷与石炭酸品红混合时，没有观察到颜色的改变。甚至在剧烈混和后，己烷上层保持无色，染料下层为粉色。当己烷层含有枯草芽孢杆菌和大肠杆菌抽提物时，记录了相似的观察结果。但是，当己烷层含有耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmetis)抽提物和培养液时，剧烈混和后，石炭酸品红染料下层的粉色强度降低了，己烷上层变成粉色，这表明分枝菌酸的存在。
表1不同处理的石炭酸品红和己烷层的颜色
使用了以下菌株1.耻垢分枝杆菌MTCC 6(相当于ATCC 14468)＝J.Gen.Microbiol.28339(1962).
2.枯草芽孢杆菌MTCC 121(相当于ATCC 6051)＝典型菌株，噬菌体宿主，苯丙酮尿血液筛查。
3.大肠杆菌MTCC 739(相当于ATCC 10536)＝标准抗生素测试菌株，J.Bacteriol.54549(1947).
(MTCC＝Microbial type culture collection，Institute of MicrobialTechnology，Chandigarh，India)实施例6使用不同浓度的分枝菌酸详细描述了本系统的工作。不同浓度(100、250、500、1000μg/ml)的分枝菌酸被允许与先前所描述的染料形成复合体，吸收模式的增加被记录了，这表明颜色强度的增加(图4)。
实施例7通过使用本方法，我们定量了由对照和不同植物提取物和化合物处理的耻垢分枝杆菌细胞产生的分枝菌酸。一些化合物已知会抑制分枝菌酸的生物合成，其它是植物提取物和未知化合物。化合物和提取物的选择基于对耻垢分枝杆菌的抗酸细菌染色的减弱。
耻垢分枝杆菌的培养是在含有亚致死浓度(1/2MIC)的化合物/提取物的营养液中生长48小时。通过离心收获细胞并冻干沉淀。从对照和处理的细胞中取等量的细胞(100mg)，并如实施例1所描述的，用甲醇分解过夜。抽提的己烷层被干燥，普通储备液(5mg/ml)被用于TLC平板层析，通过比重计计算产生的分枝菌酸的量来确定分枝菌酸的抑制程度。
使抗酸细菌染色减弱的化合物也用于分光光度分析。表现出100％抗酸细菌染色的耻垢分枝杆菌菌株在50ml培养基中生长48小时。如先前所描述的，用亚致死浓度的不同化合物处理(进行重复试验)，也让其生长48小时。对照和不同处理的细胞被离心沉淀并冻干以获得干菌体。等重(100mg)的细胞(对照和被处理的细胞)被甲醇分解过夜。孵育18小时后抽提己烷组分并干燥。用己烷作溶剂制备对照和处理细胞的普通储备液(5μg/ml)。加入等量(v/v)石炭酸品红染料并适度混和，最初为透明的己烷上层变为粉红色，而在被处理的细胞中的粉红色强度低于对照细胞。处理的细节以及不同处理物的吸收被描述于表3。
表2
异烟肼(isoniazid)是已知的分枝菌酸合成抑制物，用它处理耻垢分枝杆菌将不产生分枝菌酸。相似的，其它以植物为基础的化合物(如蒂巴因)和提取物(如“长春花根酒精萃取物”)也不允许分枝菌酸的合成。因此，这一方法可以被用来筛选合成的、半合成的或天然的化合物和原核或真核来源的提取物。相似的，分枝菌酸生物合成的抑制不仅适合分枝杆菌，也适合其它类别，如棒状杆菌和诺卡氏菌。
本领域的技术人员可以使用不同种类的分枝菌酸和产生不同最大吸收的不同分枝菌酸染料复合体，但是本发明的实质是任何具有不同种类分枝菌酸并产生不同最大吸收的染料复合体都能在那一波长下被分析，只要该最大吸收处的光密度的变化与浓度成正比。
以上实施例的例证详细的说明了已经发明的方法和利用新颖、迅速和低成本的系统筛选潜在的分枝菌酸生物合成抑制物。这一系统可能看起来简单但是具有极大的重要性，因为有无数的化合物和提取物要被筛选，以获得无毒的潜在药物配方。本发明的商业潜力也可以开发成检测分枝菌酸的试剂盒的形式，它将立即冲击分枝杆菌检测的诊断领域。
权利要求
1.在测试化合物或提取物存在和不存在的情况下，通过定量细菌产生的分枝菌酸来筛选用作抗微生物试剂的分枝菌酸生物合成抑制物的快速、简单、灵敏和低成本的方法，所述方法包括a.在所述化合物或提取物存在和不存在的情况下对所述细菌进行持续40-60小时的单独培养，b.冻干菌体，c.用传统方法提取分枝菌酸，d.在己烷中溶解提取的分枝菌酸，以获得分枝菌酸溶液，e.以1∶4到4∶1(v/v)的比例将所述溶液加入到石炭酸-品红染料中。f.剧烈摇动步骤(e)的产物以获得上层粉红色的分枝菌酸-染料复合体。g.在波长介于490-500nm的范围内用分光光度分析法定量所述分枝菌酸。h.在所述化合物处理的细菌培养物中测定分枝菌酸生物合成的抑制程度。
2.权利要求1的方法，其中优选在介于494-496纳米的波长范围用分光光度分析法定量分枝菌酸水平。
3.权利要求1的方法，其中石炭酸品红染料与所述提取物的比例优选为1∶1(v/v)。
4.权利要求1的方法，其中石炭酸品红由浓度范围介于0.1-1.0gm/100ml的碱性品红染料、苯酚、95％的乙醇和蒸馏水组成，所述成分比例为(i)苯酚和乙醇的比例介于1∶4到2∶1(v/v)的范围，和(ii)苯酚和蒸馏水的比例介于1∶14到1∶25(v/v)的范围。
5.权利要求1的方法，其中所述具有抑制活性的测试化合物或提取物以最小抑制浓度(MIC)的1/25到1/2被加入。
6.权利要求1的方法，其中所述抗微生物试剂被发展来抵抗包括分枝杆菌、棒状杆菌和诺卡氏菌的微生物。
7.权利要求1的方法，其中所述方法被用于筛选选自合成、半合成、天然化合物和提取物的抑制物。
8.权利要求1的方法，其中颜色强度随着分枝菌酸浓度的增加而增加。
9.权利要求1的方法，其中所述方法适用于所有来源的分枝菌酸。
10.用于鉴定抗产生分枝菌酸的微生物的潜在抗微生物药物的试剂盒，所述试剂盒包含石炭酸品红、甲醇、甲苯、己烷、浓硫酸、细菌体和测试化合物或提取物，所述成分的比例为(i)甲醇∶甲苯在介于1∶3到3∶1(v/v)的范围，(ii)甲醇∶己烷在介于2∶1到8∶1(v/v)的范围，(iii)浓硫酸∶己烷在介于1∶2到1∶8(v/v)的范围，和(iv)石炭酸品红∶己烷提取物在介于1∶4到4∶1(v/v)的范围，上述比例的甲醇、甲苯和浓硫酸被加入到冻干的细菌体中，最终浓度都介于0.1-3.0gm/100ml。
11.权利要求10的试剂盒，其中石炭酸品红由浓度范围介于0.1-1.0gm/100ml的碱性品红染料、苯酚、95％的乙醇和蒸馏水组成，所述成分比例为(i)苯酚和乙醇的比例介于1∶4到2∶1(v/v)的范围，和(ii)苯酚和蒸馏水的比例介于1∶14到1∶25(v/v)的范围。
12.权利要求10的试剂盒，其中所述细菌体选自分枝杆菌、棒状杆菌和诺卡氏菌。
13.权利要求10的试剂盒，其中所述具有抑制活性的测试化合物或提取物以最小抑制浓度(MIC)的1/25到1/2被加入。
全文摘要
本发明涉及一种在各种测试化合物存在的情况下在最大吸收范围介于490－500nm时鉴定和定量分枝菌酸－品红染料复合体中分枝菌酸的快速、灵敏、简单和低成本的分光光度法。此法用于筛选用于抗微生物试剂和其诊断试剂盒的分枝菌酸生物合成抑制物，所述诊断试剂盒包括浓度范围介于0.1－1.0gm/100ml的碱性品红染料、比例范围介于1∶4到2∶1(v/v)的苯酚和95％的乙醇、比例范围介于1∶14到1∶25的苯酚和蒸馏水。
文档编号C12Q1/00GK1625600SQ02828805
公开日2005年6月8日 申请日期2002年3月25日 优先权日2002年3月22日
发明者S·P·S·卡努加, S·斯里瓦斯塔瓦, T·R·S·库马尔, A·K·夏沙尼, M·P·达罗卡, S·阿瓦斯蒂 申请人:科学与工业研究会