专利名称：制造l-肉毒碱的微生物学方法
技术领域：
本发明涉及从甜菜碱的酯类制造L-肉毒碱的方法。本发明还涉及将甜菜碱的酯类转化为相应的甜菜碱的水解酶，以及含有所述水解酶的重组微生物。
L-肉毒碱是一种天然的、类似维生素的物质，它参与穿过线粒体膜运送脂肪酸的活动，因此能裂解脂肪酸。L-肉毒碱的用途是作为食品辅助剂。L-肉毒碱可以补偿体内自身的L-肉毒碱的严重不足，例如在大负荷的运动量时。对婴儿来说，用L-肉毒碱补充营养也是必要的。
人们已经知道采用许多生物技术方法来制造L-肉毒碱。
EP-A-0 158 194曾经描述过一种从4-丁基甜菜碱(4-butyrobetaine)出发，利用微生物制造L-肉毒碱的方法，该微生物可从4-丁基甜菜碱和/或巴豆甜菜碱出发来生产L-肉毒碱，而不使后者分解代谢。
WO-A-95/10613也描述过一种利用微生物从4-丁基甜菜碱和/或巴豆甜菜碱出发制造L-肉毒碱的方法，该微生物是由一种DNA片段转化得到的，所述片段中含有一个或多个在丁基甜菜碱/巴豆甜菜碱的新陈代谢中为L-肉毒碱生物合成的酶编码的基因bcoC、bcoA/B和bcoD。
这两种方法都是有缺点的，那就是采用的起始原料4-丁基甜菜碱和巴豆甜菜碱是很难获得的，因此这是合成L-肉毒碱时费用昂贵的一个主要因素。于是EP-B-0 360 222描述了一种从4-丁内酯(4-butyrolactone)出发制备4-丁基甜菜碱的化学方法，其中4-丁内酯首先利用HCl转化成4-氯丁基甜菜碱(4-chlorobutyrobetaine)，然后再用乙醇和三甲胺转化为4-丁基甜菜碱-乙基酯。接下来，后者通过稀释的NaOH水解为4-丁基甜菜碱，并利用电渗析法从未转化的4-丁基甜菜碱-乙基酯分离出4-丁基甜菜碱。
因此本发明的目的就是提供一种制造L-肉毒碱的方法，该方法中不必用甜菜碱作为原料。
上述目的是用生物技术方法来解决的，其中所需要的L-肉毒碱从甜菜碱的酯类出发而制造。这是因为意外地发现了一种水解酶，此酶能将甜菜碱的酯类作为底物(substrate)加以利用，并将其水解为相应的甜菜碱，然后就可进一步转化为L-肉毒碱。
本发明涉及一种制造L-肉毒碱的生物技术方法，该方法首先利用一种水解酶，或者利用一种含有此类水解酶的微生物将通式I甜菜碱的酯类转化为通式II的甜菜碱；其中，所述的水解酶可将作为底物的通式I甜菜碱的酯类转化为相应的甜菜碱；所述的通式I甜菜碱的酯类为 其中R1和R2表示氢或连接成一单键，而R3是未取代或取代的C1-10烷基、未取代或取代的芳基，或是未取代或取代的芳基烷基，并且所述的通式II甜菜碱为 式中R1和R2的含义与上相同；经过转化后，再利用一种能将通式II的甜菜碱转化为L-肉毒碱的微生物的作用，将通式II的甜菜碱转变成L-肉毒碱。
这里和下面所说的C1-10烷基，指的乃是直链和支链的烷基基团。C1-10烷基的实例有甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、特丁基、戊基及其异构体、己基及其异构体、庚基及其异构体、辛基及其异构体、壬基及其异构体以及癸基及其异构体。优选的是C1-6烷基，特别优选的是C1-4烷基。烷基基团不发生取代，或被一个或多个羟基基团和/或卤原子取代。所谓卤素在这里和下文指的是氟、氯、溴、碘。具有其中R3为非取代的C1-10烷基的通式I甜菜碱的酯类，例子有4-丁基甜菜碱甲基酯、4-丁基甜菜碱乙基酯、4-丁基甜菜碱丙基酯、4-丁基甜菜碱异丙基酯、4-丁基甜菜碱丁基酯、4-丁基甜菜碱特丁基酯和4-丁基甜菜碱异丁基酯、巴豆甜菜碱甲基酯、巴豆甜菜碱乙基酯、巴豆甜菜碱丙基酯、巴豆甜菜碱异丙基酯、巴豆甜菜碱丁基酯、巴豆甜菜碱特丁基酯和巴豆甜菜碱异丁基酯。具有其中R3为取代的C1-10烷基的通式I甜菜碱的酯类，例子有4-丁基甜菜碱2-羟乙基酯、4-丁基甜菜碱3-羟丙基酯、4-丁基甜菜碱2，3-二羟丙基酯、4-丁基甜菜碱2-氟乙基酯、巴豆甜菜碱2-羟乙基酯、巴豆甜菜碱3-羟丙基酯、巴豆甜菜碱2，3-二羟丙基酯和巴豆甜菜碱2-氯乙基酯。
所谓芳基在这里和下文中特别指的是单环或双环的芳香族基团，例如苯基、1-萘基或2-萘基，它们可为非取代的，也可为取代的，例如被一个或多个硝基和/或卤原子所取代。具有其中R3是非取代的或是取代的芳基的通式I甜菜碱的酯类，例子有4-丁基甜菜碱苯基酯、4-丁基甜菜碱4-硝基苯基酯、4-丁基甜菜碱4-氯苯基酯、4-丁基甜菜碱1-萘基酯、巴豆甜菜碱苯基酯、巴豆甜菜碱4-硝基苯基酯、巴豆甜菜碱4-氯苯基酯和巴豆甜菜碱1-萘基酯。
所谓芳烷基在这里和下文中相应地是指用芳基取代的C1-10烷基基团，尤其是C1-6烷基基团，优选的则是C1-4烷基残基，其中芳基仍具有上述意义，可为非取代的或者是取代的。优选的芳基烷基是苄基，其为未取代的，或在苯环上发生取代，例如用一个或多个硝基和/或卤原子进行取代。具有其中R3为芳基烷基的通式I甜菜碱的酯类，例子有4-丁基甜菜碱苄基酯、4-丁基甜菜碱4-硝基苄基酯、4-丁基甜菜碱4-氯苄基酯、巴豆甜菜碱苄基酯、巴豆甜菜碱4-硝基苄基酯和巴豆甜菜碱4-氯苄基酯。
优选采用的且包含在通式I之内的甜菜碱的酯类，有4-丁基甜菜碱甲基酯、巴豆甜菜碱甲基酯、4-丁基甜菜碱乙基酯、巴豆甜菜碱乙基酯、4-丁基甜菜碱丙基酯、巴豆甜菜碱丙基酯、4-丁基甜菜碱2，3-二羟基丙基酯、巴豆甜菜碱2，3-二羟基丙基酯、4-丁基甜菜碱苯基酯、巴豆甜菜碱苯基酯、4-丁基甜菜碱苄基酯和巴豆甜菜碱苄基酯。特别优选的则是4-丁基甜菜碱甲基酯、巴豆甜菜碱甲基酯、4-丁基甜菜碱乙基酯、巴豆甜菜碱乙基酯、4-丁基甜菜碱2，3-羟基丙基酯和巴豆甜菜碱2，3-二羟基丙基酯。最优选的是4-丁基甜菜碱甲基酯和巴豆甜菜碱甲基酯。
在农杆菌(Agrobacferium)/根瘤菌(Rhizobium)属的微生物中意外地发现了一类水解酶，此类水解酶能将通式I甜菜碱的酯类，尤其是4-丁基甜菜碱甲基酯和/或巴豆甜菜碱甲基酯作为底物转化为相应的甜菜碱，这在EP-A-0158 194和WO-A-95/10613中已经描述过了。新型能转变甜菜碱的酯类的水解酶未见报道，所以这也是本发明的目的。
根据本发明，例如从农杆菌/根瘤菌属的微生物中获得的水解酶，能够将作为底物的4-丁基甜菜碱甲基酯转化为4-丁基甜菜碱。它们的特征在于，等电点(PI，isoelekfrischen Pundt)为4.15±0.30；以SDS-PAGE测定的分子量为22.0±2.0Kda。
此类水解酶同分子量为33Kda的第二种水解酶一起共同存在于农杆菌/根瘤菌属的微生物中，但第二种水解酶不能转变甜菜碱。通过本领域技术人员熟知的方法，该类新的水解酶可从这些微生物中筛选出来并与33KDa的水解酶分离。
按照本发明的水解酶，除了转化4-丁基甜菜碱甲基酯以外，往往还能转化其他属于通式I甜菜碱的酯类，例如将作为底物的巴豆甜菜碱甲基酯转化为相应的甜菜碱。
按照本发明的水解酶，是优选从农杆菌/根瘤菌属的微生物中获得的，特别是从农杆菌/根瘤菌的菌株HK4(DSM2938)、HK13(DSM2903)、HK1331b(DSM3225)和HK1349(DSM3499)。HK4(DSM2939)、HK13(DSM2903)和HK1331b(DSM3225)菌株在EP-A-0158 194中已有描述。菌株HK1349(DSM3499)也在EP-B-0 543 344中有所描述。菌株HK4(DSM2938)为野生型，其他菌株则为bcoE基因的突变体，而且L-肉毒碱脱氢酶(dehydrogenas)属阴性。菌株HK4(DSM2938)、HK(DSM2903)、HK1331b(DSM3225)和HK1349(DSM3499)不仅与农杆菌属的典型代表菌高度相似，而且也和根瘤菌属的典型代表菌高度相似，但却都不能清楚地划归于这些属内。因此所谓农杆菌/根瘤菌属的微生物指的是农杆菌属的微生物、根瘤菌属的微生物以及菌株HK4(DSM2938)、HK13(DSM2903)、HK133b(DSM3225)和HK1349(DSM3499)。
根据布达佩斯条约将菌株HK4(DSM2903)于1984年4月3日、菌株HK13(DSM2903)于1984年2月23日、菌株HK1331b(DSM3225)于1985年2月8日，而菌株HK1349(DSM3499)于1991年11月1日在德国国营微生物细胞培养收集中心(Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen undZellkulturen GmbH)进行保藏，地址Mascheroder Weg lb，D-38124Braunschweig，Germany。微生物HK1349(DSM3499)的保藏期按照延期请求保证到2031年11月1日。
其次，我们意外地发现，已知的水解酶，例如某些脂肪酶、酯酶和蛋白酶能将属于通式I甜菜碱的酯类，特别是4-丁基甜菜碱甲基酯和/或巴豆甜菜碱甲基酯作为底物转化为相应的甜菜碱。本发明的方法中也能采用这些水解酶。
将4-丁基甜菜碱甲基酯转化为4-丁基甜菜碱的已知的水解酶的例子是酯酶、脂肪酶和蛋白酶，尤其是马肝酯酶(例如获自Roche氏诊断或Fluka)、猪肝酯酶(例如获自Roche氏诊断或Fluka)、ChirazymL2酯酶(例如获自Roche氏诊断或Fluka)、来自热链形芽孢杆菌(Bacillusthermocatenulatus)的脂肪酶(例如获自Roche氏诊断或Fluka)、来自南极念珠菌(Candida antartica)的脂肪酶(例如获自Roche诊断或Fluka)、枯草杆菌素(Subtilisin)A60蛋白酶(例如由Novo Nordisk获得)、来自萤光假单孢菌(Pseudomonas fluorescens)的PFE II酯酶(DSM50106，Knalameyzer等人《应用环境微生物学》，1999，65，477-482)、来自萤光假单孢菌的PFEI酯酶(Bornscheuer等人《生物工程杂志》，1998，60，105-111)以及来自淀粉酶产色链酶菌(Streptomyces diastatochromogenes)的SDE酯酶(例如由Julich精细化学制品公司获得，Bornscheuer等人《生物工程通讯集》，1999，21，101-104，Tesch等人《细菌学杂志》，1996，178，1858-1865)。
特别优选采用的水解酶是按照本发明的来自农杆菌/根瘤菌的新水解酶，来自热链形芽孢杆菌的脂肪菌，来自萤光假单孢菌的PFE II酯酶(DSM50106)以及来自淀粉酶产色链酶菌的SDE酯酶。
通过水解酶形成的通式II甜菜碱通过能够将其转化为L-肉毒碱的微生物进行转化。这种微生物已经在技术背景中提到过了。
适合微生物的例子为已经提及的农杆菌/根瘤菌属的微生物，特别是菌株HK13(DSM2903)、HK1331b(DSM3225)、HK1349(DSM3499)以及含有质粒PVK100q的HK1349(DSM8726)乃至假单孢菌属(pseudomons)、无色杆菌属(Achromobacter)或埃希氏杆菌(Escherichia)属的微生物。有利的微生物是那些不使形成的肉毒碱发生分解代谢的菌株，尤其是肉毒碱-脱氢酶(dehydrogenase)为阴性者。
将甜菜碱的酯类转化为甜菜碱不仅需要使用游离的水解酶，而且最好是利用含有和表达上述水解酶的微生物。该类微生物可为天然产生的微生物，其中为水解酶编码的基因就是基因组的天然成分，也可以是通过为此类水解酶编码的DNA转化得到的重组微生物。
如果用一种含有水解酶的微生物对甜菜碱的酯类进行转化，而这种微生物同时又能将产生的甜菜碱转化为L-肉毒碱，则这种微生物是很有益的。如此一来，含有水解酶的微生物是同时也将产生的甜菜碱转化为L-肉毒碱的微生物。从而，从预定的通式I甜菜碱的酯类出发，用单一的微生物就能实现本发明的方法。有利的微生物还是那些使形成的肉毒碱不产生分解代谢的微生物，特别是肉毒碱-脱氢酶显阴性的菌株。
若甜菜碱的酯类的转化只是朝向甜菜碱一面，则微生物不能利用形成的甜菜碱而转变成肉毒碱也是有利的。
为水解酶编码的基因天然存在于其基因组中的微生物，其实例有农杆菌/根瘤菌、芽孢杆菌、假单孢菌(Pseudomonas)或链酶菌属(Streptomyces)。优选的微生物是农杆菌/根瘤菌属的微生物，尤其是菌株HK13(DSM2903)、HK1331b(DSM3225)、HK1349(DSM3499)或包括质粒PVKI00q的HK1349(DSM8726)和热链形芽孢杆菌(Bacillusthermocatenulatus)、萤光假单孢菌(Pseudomonas flworescens)或淀粉酶产色链酶菌(Srteptomyces diastatochsowogenes)菌株。
为生产重组微生物，可根据标准方法将编码上述本发明和已知水解酶的基因进行克隆。为此，该基因可先以一般方式分离，例如通过测定需要的水解酶中N末端的氨基酸序列，并且利用这些以N末端的氨基酸序列导出的DNA-探针，使水解酶基因从相应的微生物的基因库中分离出来。然后，利用一般重组的含有分离基因的DNA，优选线型的或环状的载体DNA转化适宜的宿主生物。这样获得的重组微生物可将水解酶基因按照同源(homologous)重组而整合于基因组之中，或可作为使用染色体外成分而携带之。
转化优选使用的是自主复制的载体，例如表达载体，其含有在调节序列控制下为水解酶编码的序列，也就是说例如启动子，它位于水解酶基因的上游(upstream)，且位于一个核糖体的连接点。启动子和核糖体连接点的选择，在于在常见的宿主中它们能起作用，可以表达基因。这样一个基因的表达按启动子的选择就能达到组成性或诱导性。照一般的方式，这些载体也携带一个选择性的标志基因(Marker-Gen)，以证明实现转化后有载体存在于宿主体之中。在一种特定的实施形式中，表达载体能附带含有丁基甜菜碱/巴豆甜菜碱新陈代谢的基因，这在WO-A-95/10613中已有描述。此外，这种基因的转录可以通过自身启动子控制或其他适宜的启动子控制，自身启动子也能控制水解酶基因的转录。
适宜的启动子的例子有入噬菌体(Phagen Lambda)的PL和PR启动子(Schauter等人《基因》，1987，52，279-283)，Ptrc启动子(Amann等人《基因》，1988，69，301-315)，PNm和PS1启动子(Labes等人《基因》，1990，89，37-46)，Ptrp启动子(Amann等人《基因》，1983，25，167-178)，Plac启动子(Amann等人《基因》，1983，25，167-178)以及Ptac启动子(Russel和Bennet《基因》，1982，20，231-243)和Rhamnose启动子(Volss等人《分子微生物学》，1996，21(5)，1037-1047)。
作为大肠杆菌(Escherichia Coli)的特异表达载体的例子有pBR322(Bolivar等人《基因》，1977，2(2)，95-113)、pBLUESCRIPT-KS+和pBLUESCRIPT-SK+(Stratagene)、pUC18和pUC19(yannisch-Perron等人，《基因》，1985，33，103-119)、pK18和pK19(Pridmore《基因》，1987，56，309-312)、pRK290X(Alvarez-Morales等人《核酸研究》，14，4207-4227)和pRA95(例如来自Nycomed Pharma AS，Huidove，丹麦)和这些载体的衍生物，它们具有此类启动子、这样的核糖体的连接点和此类复制源点。
宿主类别特异性表达载体的例子，有对革兰氏阴性宿主生物特异的所谓“广谱宿主范围”载体，例如质粒pRK290(Ditta等人《PNAS》，1980，77，7347-7351)、pKT240(Bagdasarian等人《基因》，1983，26，273-282)、pGSS33(sharpe等人《基因》，1984，29，93-102)、pVK100(Knaus和Nester《质粒》，1982，8，45-54)、pME285(Haas和ItohL《基因》，1985，36，27-36)和这些载体的衍生物，它们具有启动子，核糖体连接点和复制源点。
适宜作宿主的微生物，能被编码需要的水解酶的DNA所转化，并且转化后能表达这种水解酶，于是使甜菜碱的酯类水解为甜菜碱。
优选的宿主是能从丁基甜菜碱和/或巴豆甜菜碱生产L-肉毒碱的微生物。适宜的微生物有，如天然基因组中就携带参与丁基甜菜碱/巴豆甜菜碱新陈代谢用的基因。其中特别优选使形成的肉毒碱不分解代谢的宿主。它涉及到肉毒碱-脱氢酶呈阴性的那些菌株，例如不含bco-基因或不含有完整bco-基因的菌株。
适宜的宿主的例子有农杆菌/根瘤菌、假单孢菌(Lindtstedt等人《细菌学杂志》，1970，101(3)，1094-5)、无色杆菌(Naidu等人《J.Ind.Mircrodoiol.Biotechnol》，2001，26(5)，309-315)或埃希氏杆菌属(Jung等人《高级生物化学》，英国/生物技术，1993，50，21-44)。这类特别优选的宿主是农杆菌/根瘤菌属的微生物，尤其是菌株HK13(DSM2903)、HK1331b(DSM3225)、HK1349(DSM3499或包含质粒PVK100q的HK1349(DSM8726)。
一种重组微生物，其利用为本发明的水解酶编码的DNA进行转化，该水解酶将作为底物的4-丁基甜菜碱甲基酯转化为4-丁基甜菜碱。这种重组微生物在现有技术中尚无人知道，因此这也是本发明的目的所在。
一种重组微生物，其利用编码水解酶的DNA进行转化，该水解酶将作为底物的4-丁基甜菜碱甲基酯转化为4-丁基甜菜碱，所述的重组微生物能从4-丁基甜菜碱的酯类生产L-肉毒碱，而不使L-肉毒碱发生分解代谢。该类微生物在现有技术中也是人所不清楚的，所以也是本发明的目的。
本发明突出的微生物是农杆菌/根瘤菌属的微生物，特别是农杆菌/根瘤菌菌株HK13(DSM2903)、HK1331b(DSM3225)、HK1349(DSM3499)或含有质粒PVK100q的HK1349(DSM8726)以及假单孢菌属、无色杆菌属或埃希氏杆菌属的菌株，它们都是用编码一种水解酶的DNA进行转化，并将4-丁基甜菜碱-甲基酯水解成4-丁基甜菜碱。特别地，被编码的水解酶乃是本发明的一种水解酶。
含有一种水解酶，使作为底物的4-丁基甜菜碱甲基酯转化为4-丁基甜菜碱，而且能够用于本发明的方法的优选微生物是a)农杆菌/根瘤菌属的微生物，优选的菌株为HK13(DSM2903)、HK1331b(DSM3225)、HK1349(DSM3499)或含有质粒pVK100q的HK1349(DSM8726)，以及芽孢杆菌、假单孢菌或链霉菌等属的微生物，尤其是热链形芽孢杆菌、萤光假单孢菌或淀粉酶产色链霉菌等种类。
b)农杆菌/根瘤菌属的重组微生物，优选的菌株为HK13(DSM2903)、HK1331b(DSM3225)、HK1349(DSM3499)或含有质粒pVK100q的HK1349(DSM8726)，以及假单孢杆菌、无色杆菌或埃希氏杆菌属的微生物，它们用为本发明的水解酶编码的DNA进行转化，使作为底物的4-丁基甜菜碱-甲基酯转化为4-丁基甜菜碱。
c)农杆菌/根瘤菌属的重组微生物，优选的菌株有HK13(DSM2903)、HK1331b(DSM3225)、HK1349(DSM3499)或含有质粒pVK100q的HK1349(DSM8726)，以及芽孢杆菌属，假单孢菌属或链霉菌属的微生物，特别是热链形芽孢杆菌、萤光假单孢菌或淀粉酶产色链霉菌，它们利用为一个已知的脂肪酶、酯酶或蛋白酶编码的DNA进行转化，使作为底物的4-丁基甜菜碱甲基酯转化成4-丁基甜菜碱，特别是来自热链形芽孢杆菌的脂肪酶，来自萤光假单孢菌(DSM50106)的PFE II的酯酶以及来自淀粉酶产色链霉菌的SDE酯酶。
微生物的培育可以在一种培养基中进行，该培养基必需含有适合的诱导剂以诱导丁基甜菜碱/巴豆甜菜碱新陈代谢的酶。通式I甜菜碱的酯类也可添加于培养基中以诱导水解酶。
微生物宿主可以是下列之一，例如农杆菌/根瘤菌菌株HK13(DSM2903)、HK1331b(DSM3225)、HK1349(DSM3499)和含有质粒pVK100q的HK1349(DSM8726)，在预先备好的“营养性酵母肉汤”(“NutrientYeast broth”)培养基中进行预培育，将L-肉毒碱作为4-丁基甜菜碱/L-肉毒碱新陈代谢的酶的诱导剂添加进去，然后再在含有甜菜碱，甘油和L-谷氨酸盐作为碳源的基本培养基中，继续培育。
本发明的方法优选这样实行将通式I甜菜碱的酯类导入反应混合物内，使反应混合物中的这种甜菜碱的酯类的浓度保持在10％(重量/体积)以下。
本发明两种优选的方法是在PH值位于6-8的范围内，温度位于15-50℃的范围内，如在25-35℃时进行的。
利用通式I的一个甜菜碱的酯按照本发明来制造L-肉毒碱时，既可以用生长中的微生物，也可以用静止的微生物完成。优选本发明的方法是这样进行的在制造L-肉毒碱时可用晚期对数生长期的微生物，也可以用静止的微生物。获得的L-肉毒碱按照标准方法进行加工。
按照本发明利用水解酶使4-丁基甜菜碱甲基酯转化为4-丁基甜菜碱，在制造L-肉毒碱的方法中，既可应用本发明的水解酶，也可应用具有这种性质的已知水解酶。优选的是应用本发明的水解酶以及已知的脂肪酶、酯酶和蛋白酶，使4-丁基甜菜碱甲基酯转化为4-丁基甜菜碱，例如来自热链形芽孢杆菌的脂肪酶，来自萤光假单孢菌(DSM50106)的PFEII酯酶以及来自淀粉酶产色链霉菌的酯酶SDE。
本发明使用的微生物，均含有一种水解酶，在制造L-肉毒碱的方法中，使4-丁基甜菜碱甲基酯转化为4-丁基甜菜碱，所述方法既涉及应用天然产生的微生物，又涉及应用重组的微生物。
图1是相对的水解酶比活性与pH的关系图，利用醋酸4-硝基苯基酯析定法测定该比活性，水解酶来自HK1349(DSM3499)，50mM的磷酸钠缓冲溶液，温度25℃。
图2是相对的水解酶比活性与培育温度的关系图，利用醋酸4-硝基苯基酯析定法测定该比活性，水解酶来自HK1349(DSM3499)，经16小时温育，温度5-70℃，50mM磷酸钠缓冲溶液，PH值为7.5。
图3是由HK1349(DSM3499)获得的水解酶的SDS PAGE凝胶分析，分子量为22Kda(B和C组分)和33Kda(A组分)。析测通过活性染色和考马斯亮蓝染色(coomassie-Blue plus)进行。
图4是由22Kda水解酶(C组分)和33Kda水解酶(A组分)，利用phastsystems(Amershani phasmacia)测定的等电点(PI)。析测通过活性染色和考马斯亮蓝(coomassie-Blue)染色。
培养基微量元素溶液乙二胺四醋酸(EDTA) 500mg/LFeSO4×7H2O 200mg/LZnSO4×7H2O 10mg/LMgCl2×4H2O 3mg/LH3BO330mg/LCaCl2×6H2O 20mg/LCuCl2×2H2O 1mg/LNiCl2×2H2O 2mg/LNa2MoO4×2H2O 3mg/L该溶液在121℃和1bar超压下高温蒸汽灭菌30分钟。
维生素溶液盐酸维生素B610μg/L维生素B25μg/L尼克酰胺(Nicotinamide) 5μg/L盐酸维生素B15μg/L生物素(Biotin) 2μg/LD-泛酸钙盐 5μg/L4-氨基苯甲酸 5μg/L叶酸 2μg/L维生素B125μg/L该溶液过滤消毒。
溶液BMgCl2×6H2O 16gCaCl2×2H2O 580mgFeCl3×6H2O 32mg
将上述成分溶于蒸馏水(1L)中。该溶液用浓盐酸(2~3滴)混合，然后在121℃和1bar超压下高温蒸汽灭菌30分钟。
(A+N)溶液(NH4)2SO420gNa2HPO4×2H2O 25gKH2PO410gNaCl 30g将各成分溶于蒸馏水(1L)中。溶液在121℃和1bar的超压下高温蒸汽灭菌30分钟。
基本培养基微量元素溶液 0.5mL溶液B 12.5mL将各成分用450mL的蒸馏水填满，如果需要的话添加入一种或多种碳一源，而PH值则用NaOH调整至7.0。该溶液在121℃和1bar超压下高温灭菌30分钟，冷却至45℃，并且同下列溶液混合(A+N)溶液 50.0mL维生素溶液0.5mL。
基本培养基琼脂平板微量元素溶液 0.5mL溶液B 12.5mL将各成份用蒸馏水(450mL)添满，加入琼脂(7.5克)，如果需要，可加入一种或多种碳源，PH值用NaOH调至7.0。溶液在121℃和1bar超压下高温蒸汽灭菌30分钟，冷却至45℃，并同下列溶液相混合(A+N)溶液(45℃) 50.0mL维生素溶液0.5mL。
将还热的(45℃)的溶液注入培养皿(Petrischale)(20-25mL溶液/每台培养皿)内。
分析采用HPLC测定丁基甜菜碱甲基酯(BBMe)、丁基甜菜碱乙基酯(BBEt)、丁基甜菜碱和L-肉毒碱时要具备下列条件HPLC水LC-Module I Plus；柱Hamilton PRP-X200 250×4.1mm；流速1.3mL/min；析测电导率。丁基甜菜碱和L-肉毒碱用5mM HCLO4在乙腈∶水＝1∶24(v/v)中洗脱。丁基甜菜碱(BBMe)和丁基甜菜碱乙基酯(BBEt)用5mM HCLO4在乙腈∶水＝1∶4(v/v)中洗脱。
利用膜层析分离法测定丁基甜菜碱甲基酯(BBMEe)和丁基甜菜碱时，需要具备下列条件纤维素平板；流动相∶丁醇∶醋酸∶水＝8∶4∶2(v/v/v)；析测碘蒸汽。
测定水解酶活性时需在光度上采用醋酸4-硝基苯基酯析定法。此法系将蛋白质溶液(900μL)用一个醋酸4-硝基苯基酯(二甲基亚砜中浓度为10mM；100μL)溶液在25℃下混合。当水解酶形成的4-硝基苯酚(ε＝15×103×M-1cm-1)的吸收值在410nm进行测量。1单位(U)相当于每分钟释放的4-硝基苯酚的量(μmol)。采用的蛋白质溶液的蛋白质含量按厂商指导利用二甘氨酸(BCA，Bicin choninic Acid)蛋白质检测试剂盒(Pierce)进行测定。水解酶的比活性按U/mg蛋白质估定，而且相当于每分钟释放出的mg蛋白质的4-硝基苯酚(μmol)的量。
测定水解酶的分子量是利用二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)完成的(缓冲液Tris(0.025M)，甘氨酸(0.192M)、二烷基硫酸钠(0.1％(w/v)；PH8.4，堆积凝胶10mA，分离凝胶25mA)。析测时采用考马斯亮蓝染色法和活性染色法。活性染色的步骤如下凝胶在复性溶液(Renaturierungslosung)(Triton×(0.5％(W/V))中，在Tris×HCl缓冲液(0.1M；PH7.5)内于250℃下温育30分钟。另外，将醋酸1-萘酯溶液(10mL)和速红(Fast Red)溶液(10mL)倾入。水解酶染色后大约30分钟呈现红棕色。醋酸1-萘酯溶液的制法如下将醋酸1-萘酯(4mg)溶解在丙酮(1.0mL)中，并用Tris×HCl缓冲液(0.1M；PH7.5)填满至10mL。速红溶液的制法如下将速红(10mg)溶解在Tris×HCl缓冲液(0.1M；PH7.5；10mL)内。
实施例1在含有丁基甜菜碱甲基酯(BBMe)和三丁基甜菜碱乙基酯(BBEt)分别作为唯一碳源的培养基中，HK4(DSM2938)菌株的生长反应将HK4(DSM2938)菌株放在基本培养基琼脂平板上，添加0.4％(w/v)甜菜碱作为唯一的碳源，单菌落划线接种后，在30℃下培育48-72小时。为了培养琼脂平板上获得的菌株的单个菌落，在含有丁基甜菜碱甲基酯(BBMe)和丁基甜菜碱乙基酯(BBEt)分别作为唯一碳源的基本培养基中进行接种，并在30℃和140upm下培育48-96小时。
对照试验中的HK4(DSM2938)菌株在同样条件下培育，但是加的是丁基甜菜碱，而不是丁基甜菜碱的酯类作为唯一的碳源。
表1
HK4(DSM2938)菌株在含有丁基甜菜碱甲基酯(BBMe)和丁基甜菜碱乙基酯(BBEt)分别作为唯一碳源的基本培养基中生长。然而HK4(DSM2938)菌株在以丁基甜菜碱的酯类作为唯一碳源时的生长，用以丁基甜菜碱作为唯一碳源的生长相比，显然要小很多。
实施例2利用HK13(DSM2903)和HK1349(DSM3944)菌株将丁基甜菜碱甲基酯(BBMe)和丁基甜菜碱乙基酯(BBEt)转化为丁基甜菜碱和L-肉毒碱，时间74小时将HK13(DSM2903)和HK1349(DSM3944)菌株接种在各自的营养性酵母肉汤(Nutrient yeast broth)的预培养基(10mL)中，加入L-肉毒碱(0.05％(w/v))作为L-肉毒碱新陈代谢的诱导剂，并在30℃和140upm下培育2天。预培养(0.01mL)是在基本培养基(10mL)中进行的，它另含有0.02％(w/v)甜菜碱，0.05％(v/v)的甘油，0.50％(w/v)的L-谷氨酸盐或者0.75％(w/v)的丁基甜菜碱甲基酯(BBMe)或0.75％(w/v)的丁基甜菜碱乙基酯(BBEt)，接种并在30℃和140upm下培育。40小时后，两种培养物的光密度OD650大约为9.0，而培养物则处于静止阶段。再继续34小时后取出试样。将细胞离心(11000upm，5分钟)，并利用HPLC检测丁基甜菜碱、L-肉毒碱和未转化的丁基甜菜碱的酯类的含量。结果列于表2。
作为对照试验，丁基甜菜碱甲基酯(BBMe)和丁基甜菜碱乙基酯(BBEt)在相同的培养基和相同的条件下储存，但不加细胞。在这种状态下未观察到将丁基甜菜碱的酯类转化为丁基甜菜碱的水解酶。
表2
a.0.75％(w/v)BBME＝46.9mmol/l；0.75％(w/v)BBEt＝43.1mmol/l。
b.BB＝丁基甜菜碱c.总量＝BBMe+BBEt+丁基甜菜碱+L-肉毒碱菌株HK13(DSM2903)和HK1349(DSM3944)在74小时内大约转化40％的丁基甜菜碱甲基酯(BBMe)和丁基甜菜碱乙基酯(BBEt)。在丁基甜菜碱甲基酯的转化过程中，产生丁基甜菜碱的比例高于L-肉毒碱的比例，而在丁基甜菜碱乙基酯转化的过程中，则产生的L-肉毒碱的比例高于丁基甜菜碱的比例。
实施例3利用菌株HK13(DSM1903)，含有质粒pVK100q的HK1349(DSM8726)和HL1331b(DSM3225)，将丁基甜菜碱甲基酯(BBMe)和丁基甜菜碱乙基酯(BBEt)转化为丁基甜菜碱和L-肉毒碱，时间为144小时将菌株HK13(DSM2903)，含有质粒pVK100q的HK1349(DSM8726)和HK1331b(DSM3225)，按照实施例2的类似方式进行培育，但基本培养基不是含有0.75％(w/v)，而是含有0.90％(w/v)丁基甜菜碱甲基酯(BBMe)或丁基甜菜碱乙基酯(BBEt)。含有质粒pVK100q的菌株HK1349(DSM2963)的预培养基另外还含有四环素(10ug/mL)。52小时后，培养物光密度OD650大约为10.0，而培养物也处于静止阶段。再继续92小时后，取出试样。将细胞离心处理(11000upm，5分钟)，利用HPLC检测上清液中丁基甜菜碱、L-肉毒碱和未转化的丁基甜菜碱的酯类的含量。
将HK13(DSM2903)，含有质粒pVK100q的HK1349(DSM8726)和HK1331b(DSM3225)菌株分别在144小时内转化大约50％的丁基甜菜碱甲基酯(BBMe)和丁基甜菜碱乙基酯(BBEt)形成丁基甜菜碱和L-肉毒碱。
实施例4水解酶在菌株HK1349(DSM3944)的细胞提取液中的特性4.1菌株HK1349(DSM3944)的细胞提取液的制备将菌株HK1349(DSM3499)的接种物(0.2mL)接种到另外含有0.2％(w/v)甜菜碱、1.0％(w/v)L-谷氨酸盐和0.2％(w/v)丁基甜菜碱的基本培养基(25mL)中，并在30℃和140rpm下培育至OD650nm达3.0-7.0。这样获得的预培养物(2mL)又被接种到另外含有0.2％(w/v)甜菜碱、1.0％(w/v)L-谷氨酸盐和0.2％(w/v)的丁基甜菜碱的基本培养基(1.5L)中，并在30℃和140rpm下培育至OD650nm3.0-7.0。将培养物离心处理(3500upm；30分钟；16℃)，再将细胞重悬浮于50mM磷酸钠缓冲液(150mL；PH7.5)中。这样获得的细胞悬浮液的OD650nm为37。
4.2检测细胞中存在的水解酶依照实施例4.1获得的细胞悬浮物(HK1349(DSM3944)，OD650nm37，50mM磷酸钠缓冲液，PH7.5)经过离心处理(4000rpm；10分钟；40℃)，并且利用醋酸4-硝基苯基酯对上清液(supernatant)的水解酶比活性进行析定。在第二次实验中，按照4.1获得的细胞悬浮物(HK1349(DSM3944)，OD650nm37，50mM磷酸钠缓冲液，PH7.5)，用超声波在冰浴冷却下处理10分钟进行消化，使细胞碎片离心脱出(4000rpm；10分钟；4℃)，利用醋酸4-硝基苯基酯析测法对上清液的水解酶比活性进行测定。水解酶的最高比活性(0.31U/mg蛋白质)被视为100％看待。结果列于表3。水解酶活性存在于细胞内。
表3
按照实施例4.1获得的细胞悬浮物(HK1349(DSM3944)，OD650nm37，50mM磷酸钠缓冲液，PH7.5)用超声波处理10分钟，在冰浴冷却下进行消化(digest)，利用不同的去污剂(detergent)温育(5％(v/v)去污剂，30分钟；25℃)，并将碎片离心脱去(4000rpm，10分钟；4℃)。利用醋酸4-硝基苯基酯析定法测定上清液中水解酶比活性。水解酶的最高比活性(0.30U/mg蛋白质)被视为100％看待。结果列于表4。用TritonX-114进行观察发现水解酶的最高比活性。
表4
4.3分子量测定利用SDS-PAGE析测表3列举的上清液以及表4列举的用TritonX-114或用溶菌酶(Lysozyme)处理的上清液。在所有的上清液中都发现了22Kda水解酶和33Kda水解酶。
4.4底物特异性的测定按照实施例4.1获得的细胞悬浮液(KH1349(DSM3944)，OD650nm37，50mM磷酸钠缓冲液，PH7.5)，用超声波处理10分钟后在冰浴冷却下进行消化，通过Triton X-114(5％(v/v)；30分钟；25℃)进行培育，然后离心(4000rpm；10分钟；40℃)，冻干上清液。将冻干的上清液(100mg)溶解于磷酸钠缓冲液(50mM；PH7.5；1.0mL)中，并加入37℃下的醋酸乙酯、丁酸乙酯和丁酸甲酯的乳液中(利用Uhratruax在含有2％(W/V)阿拉伯胶的蒸馏水中将5％(V/V)的酯乳化；20mL)的乳液。酯类水解释放出的酸用NaOH(0.01M)通过PH计进行滴定。1U(单位)相当于每分钟释放的酸量(μmol)。最高的水解酶比活性(0.039U/mg蛋白质)被视为100％看待。结果列于表5。
表5
4.5最佳PH值的测定将按照实例4.4获得的冻干上清液(100mg)溶解于磷酸钠缓冲液中(50mM；PH7.5；1.0mL)。这种溶液(50μL)用不同PH值(50mM；PH5.0-9.0；850μL)的磷酸钠缓冲液进行稀释，并在25℃与醋酸4-硝基苯基酯(10mM在二甲基烷基亚砜，100μL)相混合。水解产生的4-硝基苯酚(ε＝15×103×M-1cm-1)在410nm下测定。结果示于图1。最佳PH值为7.5。
4.6温度标定性的测定按照实例4.1获得的细胞悬浮物(HK1349(DSM3944)，OD650nm37，50mM磷酸钠缓冲液，PH7.5)，通过用超声波处理10分钟后在冰浴冷却下消化，再用Triton X-114(5％(v/v)30分钟；25℃)进行温育，然后离心处理(4000rpm；10分钟；4℃)。上清液在5-70℃的温度范围内温育16小时。温育后以醋酸4-硝基苯基酯析定法测定水解酶的比活性。结果示于图2。水解酶比活性随着温度的升高而降低。在30℃下经过16小时培育仍存在有大约85％的最初活性，在45℃下培育16小时大约还有50％的最初活性，在50℃下培育16小时则只存在大约35％的最初活性。
实施例5菌株HK13499(DSM3944)的水解酶的纯化按照实施例4.1获得的细胞上清液(HK1349(DSM3944)，OD650nm37，50mM磷酸钠缓冲液，PH7.5)通过用超声波处理10分钟后在冰浴冷却下进行消化，再用Triton X-114(5％(v/v)；30分钟；25℃)进行温育，然后离心处理(4000rpm；10分钟；4℃)。利用凝胶过滤(SephacrylTMS-200，100cm3；洗脱剂磷酸钠缓冲液(50mM；PH7.5)，流速1mL/分钟)对上清液的样品(10mL)进行纯化。
在单个馏分(2mL)中，水解酶比活性是利用醋酸4-硝基苯基酯析定法来测定的。利用SDS-PAGE分析具有水解酶活性的馏分。只含分子量为33Kda的水解酶馏分(馏分A)结合在一起。只含有分子量为22Kda的水解酶馏分，根据SDS-PAGE“不纯”的馏分(馏分B)结合在一起，而且含有分子量为22Kda的水解酶馏分，根据SDS-PAGE为“较纯”馏分(馏分C)也结合在一起。“较纯”馏分中异蛋白的含量低于“不纯”馏分。在馏分A、B和C中，需重新利用醋酸4-硝基苯基酯析定法测定水解酶比活性，并重新利用SDS-PAGE分析这些蛋白质溶液。结果列于表6和图3。
表6
利用超过滤法浓缩含有33Kda水解酶的馏分A和含有22Kda水解酶的馏分C。22Kda水解酶和33Kda水解酶的等电点通过PhastSystem(Amersham Pharmacia)按厂商指示测定。利用PH梯度为3-9的凝胶法来分析馏分A和馏分C。结果示于图4。馏分C另用PH梯度为4-6.5的凝胶法进行分析。析测操作类似于SDS-PPAGE。33Kda的水解酶等电点(PI)为6.58，而22Kda水解酶的等电点(PI)为4.15。
实施例6利用馏分A和馏分C将丁基甜菜碱甲基酯(BBMe)转化为丁基甜菜碱取自实施例5(1.0mL)的馏分C利用Centricons离心机(2mL，10Kda；5000rpm；60min；4℃)将最初体积浓缩至1/10。由丁基甜菜碱甲基酯(BBMe)(50μmol)和磷酸钠缓冲液(50mM；PH7.5；500μL)组成的反应溶液与浓缩的馏分C(100μL)在37℃下混合。将丁基甜菜碱甲基酯转化为丁基甜菜碱是利用薄层色层分离法定性进行的。
在1小时内，可以观测到馏分C的22Kda的水解酶能将丁基甜菜碱甲基酯(BBMe)转化为丁基甜菜碱，而在60小时内转化达大约15％(估计)。
同样地，将实施例5的馏分A浓缩，并用丁基甜菜碱甲基酯(BBMe)进行反应。馏分A的33Kda水解酶并不能将丁基甜菜碱甲基酯(BBMe)转化为丁基甜菜碱。
实施例7利用酯酶PFE I、PFE II和SDE将丁基甜菜碱甲基酯(BBMe)水解为丁基甜菜碱与实施例6的方法类似，利用来自萤光假单孢菌(Bornscheuer)等人，《生物工程杂志》，1998，60，105-111)的PFE I、来自萤光假单孢菌(DSM50106，Khalameyer等人《应用环境微生物学》，1999，65，477-482)的酯酶PFE II以及来自淀粉酶产色链酶菌(例如由Jülich FineChemicals获得的，Bornscheuer等人《生物工程通讯>1999，21，101-104，Tesch等人《细菌学杂志》1996，178，1859-1865》酯酶SDE(各约6mg)对丁基甜菜碱甲基酯(BBMe)进行转化。
所有三种酯酶均将丁基甜菜碱甲基酯(BBMe)水解，其中酯酶PFEII显示的活性最高。酯酶PFE II和SDE在1小时可以观测到丁基甜菜碱甲基酯已经转化为丁基甜菜碱。
实施例8利用可购买到的水解酶将丁基甜菜碱甲基酯(BBMe)水解为丁基甜菜碱由丁基甜菜碱甲基酯(BBMe)(1.0％(w/v))溶于由磷酸钾缓冲液(10mM；PH7.0；20ml)组成的反应溶液与不同的水解酶(10-15mg或20μL)在25℃下混合。利用一个PH探针对反应混合液的PH值追踪24小时。通过水解形成丁基甜菜碱的水解酶，PH值应降低。反应中能够观察到PH值的下降，在反应混合物中丁基甜菜碱甲基酯(BBMe)和丁基甜菜碱的含量利用HPLC测定。结果列于表7。来自热链形芽孢杆菌(Roche氏诊断)的酯肪酶、猪肝的酯酶(从Fluka和Roche氏诊断获得)将大部分丁基甜菜碱甲基酯(BBMe)转化为丁基甜菜碱。来自热链形芽孢杆菌的酯肪酶已经被克隆出来(Schmid-Dannert等人，《生物化学、生物物理学通报》1996，1301，105-114)。
表权利要求
1.可将作为底物的4-丁基甜菜碱甲基酯转化为4-丁基甜菜碱的水解酶，其特征在于a)等电点PI为4.15±0.30，b)利用SDS-PAGE测定的分子量为22.0±2.0Kda。
2.用一种DNA转化的重组微生物，其中所述的DNA编码权利要求1的水解酶。
3.由一种DNA转化的重组微生物，其中所述的DNA编码水解酶，将4-丁基甜菜碱甲基酯水解成4-丁基甜菜碱，从而该微生物能表达所述水解酶，并能从4-丁基甜菜碱甲基酯生产L-肉毒碱而不使L-肉毒碱发生分解代谢。
4.根据权利要求2或3所述的重组微生物，其中所述的DNA是一个载体，特别是一个表达载体，其包含有处于调节序列控制下的编码水解酶的DNA序列。
5.制造L-肉毒碱的方法，其中，该方法首先通过水解酶，或者通过一个含有此类水解酶的微生物，将通式I甜菜碱的酯类转化成通式II中相应的甜菜碱，所述的水解酶为可将通式I甜菜碱的酯类作为底物转化为甜菜碱的水解酶，所述的通式I化合物为 式中R1和R2表示氢或连接为一单键，而R3为非取代或取代的C1-10烷基，非取代或取代的芳基，或者是非取代或取代的芳基烷基，所述的通式II化合物为 式中R1和R2同上文的含义相同；然后，该方法通过一种微生物将这种甜菜碱转化成L-肉毒碱，所述的微生物为能将通式II中的甜菜碱转化成L-肉毒碱的微生物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中水解酶是权利要求1的水解酶。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中含有水解酶的微生物同时也是用于使所形成的通式II甜菜碱转化成L-肉毒碱的微生物。
8.根据权利要求5至7任意一项所述的方法，其中，含有水解酶的微生物是权利要求2-4其中之一的微生物。
9.制造通式II甜菜碱的方法，其中，该方法通过一个水解酶，或者通过一个含有该水解酶的微生物将通式I甜菜碱的酯类转化为通式II中相应的甜菜碱，所述的水解酶为使通式I甜菜碱的酯类发生水解的水解酶；所述的通式II甜菜碱为 式中R1和R2同权利要求5中所述的含义相同，并且所述的通式I甜菜碱的酯类为 式中R1和R2具有上文相同的含义，R3和权利要求5中所提到的含义相同。
10.根据权利要求5至9中任意一项所述的方法，其中通式I甜菜碱的酯类在反应混合物中的浓度保持在10％(w/v)以下。
11.根据权利要求5至10任意一项所述的方法，其中PH值在6-8的范围内，而温度在15-50℃的范围内。
12.根据权利要求5-11任意一项所述的方法，其中采用通式I甜菜碱的酯类 式中R1和R2表示氢或连接为一单键，而R3则表示甲基。
13.水解酶在制造L-肉毒碱的方法中用于将4-丁基甜菜碱甲基酯转化为4-丁基甜菜碱。
14.含有水解酶的微生物用于制造L-肉毒碱，其中所述的水解酶将4-丁基甜菜碱甲基酯转化为4-丁基甜菜碱。
全文摘要
本发明涉及一种基于通式I甜菜碱的酯类制造L－肉毒碱的方法，式中R
文档编号C12R1/01GK1489629SQ02804363
公开日2004年4月14日 申请日期2002年1月31日 优先权日2001年1月31日
发明者本诺·切尔瑞, 乌韦·博恩朔伊尔, 安娜·穆西德鲁斯卡, 约瑟夫·韦尔朗, 托马斯·齐默尔曼, 韦尔朗, 齐默尔曼, 博恩朔伊尔, 本诺 切尔瑞, 穆西德鲁斯卡 申请人:隆萨股份公司