人干扰素与无裂解性的人IgGFc变体的融合蛋白及制备的利记博彩app

专利名称：人干扰素与无裂解性的人IgGFc变体的融合蛋白及制备的利记博彩app
技术领域：
本发明属生物医药技术领域。具体涉及一种人干扰素与无裂解性的人IgGFc变体的融合蛋白及制备。
背景技术：
干扰素(IFN)是一类人体内产生的蛋白，具有抵抗病毒，阻止细胞增殖以及调节免疫反应等生物活性。基于生理化学和生物的差异，共有三种干扰素IFN-alpha(IFNα)、IFN-beta(IFNβ)、和IFN-gamma(IFNγ)。其中IFNα和IFNβ统称为第一类型干扰素。第一类型干扰素靶向有反应的细胞表面上的干扰素α/β受体。与IFN结合后，被激活的受体会引起酪氨酸磷酸化。然后，发生一系列的信号转导而刺激某些基因的转录，导致特异蛋白的合成。这些由干扰素促进的蛋白常具有干扰素的生物活性(参见，如Stark等人，Annu.Rev.Biochem.，67227-264，1998)。许多这类由干扰素促生的蛋白，如2-5 OAS，neopterin，和Mx蛋白等，都是免疫反应中极为重要的媒介。
重组人干扰素-α(rHuIFNα)，包括重组干扰素-α2a(rHuIFNα2a)和干扰素-α2b(rHuIFNα2b)，在许多国家已广泛用于治疗B型肝炎、C型肝炎、与某些癌症，包括阴道瘤、多毛细胞白血病、慢性骨髓细胞白血病、黑色素瘤以及爱滋病引发的卡波西肉瘤。重组人干扰素-β(rHuIFNβ)在欧美国家已用于治疗多发性硬化症。IFNβ在临床试验中用于治疗癌症和某些病毒引起的病症。正如同其他的细胞激素经注射入人体后，干扰素的血清清除半衰期很短。因为人体内天然的干扰素只在局部产生，效用期间也短，rHuIFNα和rHuIFNβ的血清清除半衰期都只有数小时(参见，如Physician′s Desk Reference)。为了要达到相当的药效，必须要经常注射高剂量的IFN。因此治疗之中常有不良的副作用。包括显示在神经，内分泌和免疫系统的毒性。针对这些rHuIFN的缺点，我们意欲发展改良的产品，来延长血清半衰期，并保持其生物活性，从而增加药效。
已有报道说将聚乙二醇(PEG)连接于各种蛋白质(包括IFN)能得到因半衰期长而在体内效力较高的衍生物(参见，如Baker，Rev.Gastroenterol.Disord.，187-99，2001；Zalipsky等人，“PEG化学；生物技术和生物医药的应用”，第347-370页，1992)。通常PEG缀合的蛋白质比它们未经修饰的亲代蛋白质的体外生物活性低(参见，如Eliason等人，Stem Cells，1840-45，2000)。而这些经修饰的蛋白质体内效力的增加至少部分是因为按其分子量的增加而降低了肾的清除作用(参见，如Yamaoda等人，J.Pharmaceut.Sci.，83601-606，1994)。
IgG类的免疫球蛋白是人类血液中最丰富的蛋白质。它们的半衰期可高达21天。已有报道说将IgG的Fc区域与其它蛋白质(如各种细胞因子和可溶性受体)结合而形成融合蛋白(参见，如Capon等人，Nature，337525-531，1989；Chamow等人，Trends Biotechnol.，1452-60，1996；美国专利No.5,116,964和5,541,087)。原型融合蛋白是通过IgGFc绞链区中的半胱氨酸残基连接的同源二聚体蛋白质，使蛋白质类似于IgG分子但无CH1区域和轻链。由于结构上的同源，Fc融合蛋白表现出与类似同种型的人IgG相当的体内药物动力学特性。这种方法已用于一些临床上很重要的细胞因子(如IL-2，IFNβ，IFN-α2a和IFN-α2b)和可溶性受体(如TNF-Rc和IL-5-Rc)(参见，如美国专利No.5,349,053，5,723,125，5,908,626和6,224,867)。
已有人报道了促红细胞生成素(EPO)衍生物(如二聚物)。与EPO单体相比，含有2个完整的EPO区域(相隔3到7氨基酸肽接头)的融合蛋白表现出减弱的活性(参见，如Qiu等人，J.Biol.Chem.，27311173-11176，1998)。然而，当这两个EPO区域间的肽接头的长度为17个氨基酸时，二聚体EPO分子表现出提高相当多的体外和体内的活性(参见，如Sytkowski等人，J.Biol.Chem.，27424773-24778，1999；美国专利No.6,187,564)。两个EPO分子间的肽接头的长度非常重要，可能是因为其对这些分子结构的柔韧性的影响，但也不限于这个解释。
在大部分已报道的Fc融合蛋白分子中，绞链区作为Fc区域(在羧基端)与细胞因子或可溶性受体(在氨基端)间的间隔，使这分子的这两部分能分别行使功能(参见，如Ashkenazi等人，Current Opinionin Immunology，9195-200，1997)。在人IFN和人IgGFc间添加的柔性肽接头可能以两种方式提高HuIFN-L-Fc的体外生物活性(1)保持Fc区域与IFN上IFN受体结合位点的距离，和(2)保持一个IFN和另一个IFN区域的距离，从而使IFN区域能分别与细胞表面上的IFN受体反应。
人免疫球蛋白的Fc区域在消灭病原体的免疫防御中起重要作用。IgG的效应子功能由Fc介导而通过两种主要机制(1)与细胞表面Fc受体(FcγRs)的结合，导致通过依赖抗体的细胞毒性(ADCC)途径，通过吞噬作用或裂解作用而摄食病原体，或(2)与第一补体成分C1的C1q部分的结合，引发依赖于补体的细胞毒性(CDC)途径，从而裂解病原体。在四种人IgG同种型中，IgG1和IgG3能有效地结合FcγR。IgG4与FcγR的结合亲和力比IgG1或IgG3的低一个数量级，而IgG2与FcγR的结合低得难以测定。人IgG1和IgG3还能有效地结合C1q，并激活补体级联反应。人IgG2对补体的固定很弱，而IgG4似乎在激活补体级联反应的能力方面很有缺陷(参见，如Jefferis等人，Immunol.Rev.，16359-76，1998)。对应用于人的治疗而言，当HuIFN-L-Fc结合于细胞表面上的IFN受体时，融合蛋白的Fc区域必须不能有不良效应子功能，因此不会裂解或除去这些细胞。因此，HuIFN-L-Fc的Fc区域必须是非裂解性的，即结合于FcγRs和C1q从而触发效应子功能方面，Fc区域必须是无活性的。显然，没有一种天然的IgG同种型适合产生HuIFN-L-Fc融合蛋白。为了得到非裂解性的Fc，必须使天然Fc区域中的一些氨基酸突变，以减少其效应子功能。
通过比较人和鼠的IgG同种型的氨基酸序列，已显示，CH2区域氨基端附近的Fc部分在IgGFc与FcγRs的结合中起作用。已用基因工程抗体证明在234位到237位基序的重要性(参见，如Duncan等人，Nature，332563-564，1988)。氨基酸残基编号是按Kabat等人所述的EU编号体系(《SEQUENCES of PROTEINS of IMMUNOLOGICALINTEREST》，第5版，United States Department of Health and HumanServices，1991)。在四种人IgG同种型中，IgG1和IgG3与FcγRs的结合最好，且具有相同的序列Leu234-Leu-Gly-Gly237(表1仅显示了IgG1)。在以低亲和力与FcγRs结合的IgG4中，其序列含有单个氨基酸取代，即在234位上Phe取代Leu。在不结合FcγRs的IgG2中，有两个取代和一个缺失，从而形成Val234-Ala-Gly237(表1)。为了减少Fc与FcγR的结合和ADCC活性，用Ala替代IgG4中的Leu235(参见，如Hutchins等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9211980-11984，1995)。在此基序中已用IgG2序列中的Pro233-Val-Ala235替代Glu233-Leu-Leu235来改变IgG1。这种替代使IgG1变体在小鼠中失去了FcγR-介导的除去靶细胞的能力(参见，如Isaacs等人，J.Immunol.，1613862-3869，1998)。
对FcγR与C1q结合至关重要的第二部分位于人IgG的CH2区域羧基端附近(参见，如Duncan等人，Nature，332738-740，1988)。在四种人IgG同种型中，这部分中仅有一个位点显示取代IgG4中的Ser330和Ser331替换了IgG1、IgG2和IgG3中的Ala330和Pro331(表1)。Ser330的存在不影响FcγR与C1q的结合。用Ser替代Pro331使IgG1失去了与C1q的结合亲和力，而用Pro替代Ser331部分保留了IgG4的补体固定活性(参见，如Tao等人，J.Exp.Med.，178661-667，1993；Xu等人，J.Biol.Chem.，2693469-3474，1994)。

发明内容
本发明所要解决的技术问题在于延长人干扰素(HulFN)的半衰期并提高其生物活性。
本发明人发现将人IgG衍生物的Fc区域连接于HulFN的羧基端，可以延长HulFN的半衰期，并发现柔性肽接头可用于治疗性蛋白质。
并发现，可以设计至少三种Fc变体(vFc)用于产生HuIFN-L-VFc融合蛋白(如表1所示)。人IgG2不结合FcγR，但显示出弱的补体活性。具有Pro331Ser突变的Fcγ2变体应比天然Fcγ2的变体活性更低，而且仍旧不结合于FcγR。人IgG4 Fc在激活补体级联中有缺陷，且它与FcγR的结合亲和力比活性最高的同种型(IgG1)低约一个数量级。与天然Fcγ4相比，具有Leu235Ala突变的Fcγ4变体应表现出最小的效应子功能。具有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的Fcγ1也表现出比天然Fcγ1低得多的效应子功能。这些Fc变体都比天然存在的人IgGFc更适于制备IFN融合蛋白。在非裂解Fc的制备中也可引入其它替换的氨基酸，而不危及循环半衰期或导致不良的构型变化。
本发明公开了一种人干扰素与无裂解性的人IgGFc变体的融合蛋白。该融合蛋白含有人干扰素、肽接头和人IgGFc变体。
较佳地，使用约20或更小氨基酸长度的柔性肽接头，该肽接头含有2个或多个以下氨基酸甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。IgGFc变体是非裂解性的，且与天然IgGFc相比含有氨基酸突变。
本发明的另一目的是公开了上述人干扰素与无裂解性的人IgGFc变体的融合蛋白的制备方法，该方法包括下列步骤(a)生成CHO-衍生的细胞系；(b)用让重组融合蛋白在其生长培养基中每24小时期间内，每百万个细胞表达超过10μg(较佳地为30μg)的条件下培养这种细胞系；和(c)纯化步骤(b)表达的蛋白质，其中重组融合蛋白在摩尔基础上显示出与rHuIFN相似的高度的体外生物活性。
上述步骤中当较佳的人IFN和人IgGFc变体间存在柔性肽接头，而此柔性肽接头含有或由约20个或更少(但不能少于2个)氨基酸；且柔性肽接头由2个或更多选自以下的氨基酸构成甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸；且其中人IgGFc变体含有绞链区、CH2和CH3区域，它们选自具有Pro331Ser突变的人IgG2、具有Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4、和具有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的人IgG1。
本发明的融合蛋白具有下列优点血清中HuIFN-L-vFc融合蛋白增高的活性和存在时间的延长，能减低剂量以及减少注射的频率。血清中药物浓度波动的减少以意味着安全性和耐受性的改善。注射频率的减低能使患者有更好的顺应性和生活质量。因此具有非裂解Fc变体的HuIFN-L-vFc融合蛋白能显著地有助于治疗。目前用rHuIFN治疗的各种病症，包括多发性硬化症、多种癌症，以及病毒引起的疾病。
本发明的另一实施例为人IgFc，它含有人IgG如人IgG1、IgG2和IgG4的绞链区、CH2和CH3区域。这种CH2区域在228、234、235和331位(由EU编号体系确定的位置)含有氨基酸突变，从而降低Fc的效应子功能。
在本发明的另一实施例中，公开了一种从哺乳动物细胞系如CHO衍生的细胞系制备或生产这种重组融合蛋白的方法。培养转染的细胞系，使得重组融合蛋白在其生长培养基中在24小时期间以超过10(较佳地为30)μg/百万个细胞的水平下表达。这些HuIFN-L-vFc融合蛋白显示出高度的生物活性和更长的血清半衰期而无不良副作用，从而改善了药物动力学和药效，进而降低了实现类似药效所需的剂量和注射次数。
通过体外生物分析法及大鼠体内药物动力学研究进一步说明体外生物分析法此分析法可测定转染子的上清液或纯化蛋白阻止病毒致细胞病变效应的能力(参见，如Grossberg等人，在”Manual of ClinicalImmunology”书中，295-299，1985)。第一类型干扰素会保护人肺癌细胞系A549(ATCC-CCL-185)。不至于被脑心肌炎病毒(EMV，ATCC-VR-129B)感染而死。由IFN引起的保护效用与存活细胞成比例。存活细胞会还原一种叫MTT的染色化学品，可很快地得到读数。
A549细胞系可维持在含有5％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)内。将每份共1.5×104个细胞的A549样品(100μl)加到96孔组织培育板各孔中，在37℃下5％的CO2湿润培养箱中培养24小时。然后在各孔中添加100μl含有0.01至100pM各种浓度的HuIFN-L-vFc融合蛋白或rHuIFN对照的培养基。在37℃下5％的CO2湿润培养箱中经过24小时，便除去各孔中的液体，再加入100μl含有EMV的培养基。在37℃下5％的CO2湿润培养箱中培养48小时后，在各孔中添加10μl MTT(用PBS配制成5mg/ml)来染色存活的细胞。4小时后，在每孔中加入100μl含有0.01N HCl的10％SDS，以溶解细胞和Formazan。然后在550nm对该平板进行读数，其中参考光束设为690nm。OD读数相对于rHuIFN或融合蛋白的浓度作图。S形曲线的拐点表示产生50％最大效果(ED50)的浓度。因此可定量地比较HuIFN-L-vFc相对于rHuIFN的生物活性。rHuIFN的生物活性可用美国国家健康局(Bethesda，MD)供给的人IFNα或IFNβ作为标准。重组融合蛋白在摩尔基础上，应显示与rHuIFN相似的高度的生物活性。
大鼠中体内药物动力学研究通过尾静脉进行静脉注射或通过皮下注射，将105单位的rHuIFN或HuIFN-L-vFc融合蛋白注射入平均体重约为500g的Fisher大鼠(Harlan Bioproducts for Science，Indianapolis，IN)。注射相同体积的PBS作为对照。注射后，在不同时间点(0、0.2、1、4、24、48、96和168小时)通过眶后放血法采集一系列0.5ml的样品。每个时间点用3只大鼠。将全血收集在含有抗凝剂的试管中，除去细胞，并在-70℃冷冻血浆直到进行分析。
将血浆样品用于A549细胞分析，该分析测定IFN保护细胞阻止病毒感染的活性。在96孔培育板的各孔中加入每100μl总计为1.5×104细胞的样品，在37℃下5％的CO2湿润培养箱中培养24小时后，在各孔中添加100μl含有各种用培养基稀释过的血清样品。在同样的培养箱中经过24小时，便除去各孔中的液体，加入100μl含有EMV的培养基。在培养箱中再过48小时，然后在各孔中添加10μl MTT(用PBS配制成5mg/ml)来染色存活的细胞。4小时后，每孔中加入100μl含有0.01N HCl的10％SDS溶液以溶解细胞和Formazan。然后在550nm读取该平板(参考光束是690nm)。将血清样品的活性对时间点作图，以计算血清清除速率。HuIFN-L-vFc的活性比rHuIFN对照的活性降低慢许多，表明大鼠中融合蛋白的半衰期更长。
表1显示了人IgG1、IgG2、IgG4和它们变体的绞链区和CH2区域的氨基酸序列的比对。比较这三个部分氨基酸区域228、234-237和330-331。用粗斜体显示这些变体的氨基酸突变。将EU编号体系用于氨基酸残基。
表2为实施例1中所述用于克隆HuIFN-L-vFc融合蛋白的寡核苷酸序列。
序列A、B、C显示了分别在phIFP表达载体内HindIII-EcoRI片段的(A)HuIFNα2a-L-vFcγ2、(B)HuIFNα2a-L-vFcγ4，和(C)HuIFNα2a-L-vFcγ1的核苷酸序列及推导的氨基酸序列。氨基酸残基-23到-1是人IFNα2a的前导肽。成熟蛋白含有人IFNα2a(氨基酸残基1到165)、肽接头(氨基酸残基166到181)和Fc变体(vFcγ2的氨基酸残基182到409，vFcγ4的氨基酸残基182到410，和vFcγ1的氨基酸残基182到408)。在Fc区域中，粗体的核苷酸和相应的氨基酸变体还用下划线标出。
表1

表2用于克隆HuIFN-L-vFc融合蛋白的寡核苷酸序列(Sequencesof Oligonucleotides)SEQ ID NO1cccaagctta catctacaat ggccttgaccSEQ ID NO2cggatccttc cttacttctt aaactttcSEQ ID NO3
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序列A DNA and deduced amino acid sequences of HuIFNα2a-L-vFcγ2aag ctt aca tct aca atg gcc ttg acc ttt gct tta ctg gtg gcc ctc ctg gtg ctc agc 60HindIII Met Ala Leu Thr Phe Ala Leu Leu Val Ala Leu Leu Val Leu Ser-23 -20 -15 -10tgc aag tca agc tgc tct gtg ggc tgt gat ctg cct caa acc cac agc ctg ggt agc agg 120Cys Lys Ser Ser Cys Ser Val Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg-5 -1 1 5 10agg acc ttg atg ctc ctg gca cag atg agg aaa atc tct ctt ttc tcc tgc ttg aag gac 180Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp15 20 25 30aga cat gac ttt gga ttt ccc cag gag gag ttt ggc aac cag ttc caa aag gct gaa acc 240Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr35 40 45 50atc cct gtc ctc cat gag atg atc cag cag atc ttc aat ctc ttc agc aca aag gac tca 300Ile Pro Val Leu His glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser55 60 65 70tct gct gct tgg gat gag acc ctc cta gac aaa ttc tac act gaa ctc tac cag cag ctg 360Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu75 80 85 90aat gac ctg gaa gcc tgt gtg ata cag ggg gtg ggg gtg aca gag act ccc ctg atg aag 420Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys95 100 105 110gag gac tcc att ctg gct gtg agg aaa tac ttc caa aga atc act ctc tat ctg aaa gag 480Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu115 120 125 130aag aaa tac agc cct tgt gcc tgg gag gtt gtc aga gca gaa atc atg aga tct ttt tct 540Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser135 140 145 150ttg tca aca aac ttg caa gaa agt tta aga agt aag gaa gga tcc ggt ggc ggt tcc ggt 600Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly155 160 165 170gga ggc gga agc ggc ggt gga gga tca gag cgc aaa tgt tgt gtc gag tgc cca ccg tgc 660Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys175 180 185 190cca gca cca cct gtg gca gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc 720Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr195 200 205 210ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc acg tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac 780Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp215 220 225 230ccc gag gtc cag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag 840Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys235 240 245 250cca cgg gag gag cag ttc aac agc acg ttc cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtt gtg cac 900Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His255 260 265 270cag gac tgg ctg aac ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa ggc ctc cca gcc 960Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala275 280 285 290tcc atc gag aaa acc atc tcc aaa acc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc 1020Ser Ile Glu Lys hr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr295 300 305 310
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具体实施例方式
实施例1 构建编码HuIFN-L-vFcγ2融合蛋白的基因HuIFNα2a是一个例子，用来解说制备HuIFN-L-vFc融合蛋白的方法。其他编码人IFN(包括IFNα2b和IFNβ等)的基因亦可以用来制备含有人IgGFc变体的融合蛋白。编码人IFNα2b的前导肽和成熟蛋白的基因，可用含有人IFNα2a的DNA片段作模板，用聚合酶链式反应(PCR)引入一个A变G的单点突变(即序列A，B，或C的第152个碱基)。这个单点突变影响HuIFNα成熟蛋白中第23个氨基酸残基，以Arg(IFNα2b)替代了Lys(IFNα2a)。为了获得编码人IFNβ前导肽和成熟蛋白的基因，可用表达人IFNβ的细胞系制备的RNA，通过逆转录得到cDNA，再以其作为PCR的模板。编码含有Cys17Ser的人IFNβ变体的基因，则可用含有人IFNβ的DNA片段作模板，用PCR引入两个单点突变。这两个单点突变编码IFNβ成熟蛋白第17个氨基酸的第2位(G变C)与第3位(T变C)寡核苷酸，以Ser取代了Cys。
融合蛋白是用数个DNA片段装配而成的。为了获得编码人IFNα2a的前导肽和成熟蛋白的基因，可用细胞系KG-1制备的RNA，通过逆转录和PCR。为了便于克隆，将引入限制性酶内切位点(HindIII)的SEQ ID NO1用作5’寡核苷酸的引物。表2列出了用于克隆HuIFN-L-vFc融合蛋白的寡核苷酸序列。3’引物(SEQ ID NO2)除去了IFN末端密码子并引入了BamHI位点。将得到的长度约为600bp的DNA片段插入到接受载体(如pUC19)的HindIII和BamHI位点，得到pHuIFN质粒。由DNA测序验证人IFNα2a基因的序列。
用从人白细胞制备的RNA和合适的5’(SEQ ID NO3)和3’(SEQID NO4)引物，通过逆转录和PCR得到编码人IgG2的Fc区域(Fcγ2)的基因。将得到的含有IgG2的绞链、CH2和CH3区域完整序列的Fcγ2的DNA片段作为模板，产生Fcγ2Pro331Ser(vFcγ2)变体，其中Fcγ2中331位的Pro被Ser替代。为了引入此突变，产生两个片段，然后用天然Fcγ2作为模板在重叠PCR中将它们装配起来。用SEQ IDNO3作为5’引物并用SEQ ID NO5作为3’引物生成5’片段。用SEQID NO6作为5’引物并用SEQ ID NO4作为3’引物生成3’片段。然后用SEQ ID NO7作为5’引物和SEQ ID NO4作为3’引物，将这两个片段在覆盖Pro331Ser突变的区域连接起来。SEQ ID NO7引物含有编码16个氨基酸Gly-Ser肽接头(包括BamHI限制性内切酶位点)的序列。将得到的长度约为700bp的DNA片段插入接受载体(如pUC19)的BamHI和EcoRI位点，得到pL-vFcγ2质粒。用DNA测序验证该基因的序列。
为了制备HuIFN-L-vFcγ2融合基因，用HindIII和BamHI从pHuIFN质粒上切下HuIFN片段，然后用琼脂糖凝胶电泳纯化。然后将纯化的片段插入pL-vFcγ2质粒肽接头的5’末端，得到pHuIFN-L-vFcγ2质粒。该融合基因含有HuIFN、Gly-Ser肽接头和Fcγ2变体基因。
在HuIFN和Fc部分间存在的肽接头，增加了HuIFN区域的柔性，因而提高了其生物活性(参见，如Sytkowski等，J.Biol.Chem.27424773-8，1999)。对本发明而言，优选的是长度为约20个或更少氨基酸的肽接头。可使用含有2个或更多选自以下氨基酸的肽接头甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。一种肽接头的例子含有Gly-Ser肽构件，如GlyGlyGlyGlySer。序列A显示了融合基因，它含有编码HuIFN序列、16个氨基酸的肽接头(GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)和Fcγ2Pro331Ser变体的序列。
然后将编码HuIFN-L-vFc融合蛋白的完整基因插入哺乳动物表达载体如pcDNA3(Invitrogen)的HindIII和EcoRI位点。最终的表达载体质粒(称为phIFP2)含有在哺乳动物细胞中高水平表达所需的巨细胞病毒早期基因启动子-增强子。该质粒还含有可选择性标记基因，从而在细菌中赋予氨苄青霉素抗性，而在哺乳动物细胞中赋予G418抗性。另外，当宿主细胞DHFR基因表达缺陷时，phIFP2表达载体含有二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，从而能在氨甲蝶呤(MTX)存在下共扩增HuIFN-L-vFcγ2融合基因和DHFR基因(见例如美国专利No.4,399,216)。
实施例2 构建编码HuIFN-L-vFcγ4融合蛋白的基因由于绞链区域中重链间二硫键的解离，人IgG4部分会形成被视为半抗体的分子。而这种情况在其它三种人IgG同种型中却没有观察到。用Pro(在IgG1和IgG2中的该位置发现的残基)替代Ser228的单氨基酸取代，导致形成IgG4完整的抗体分子(参见，如Angal等人，Molec.Immunol.，30105-108，1993；Owens等人，Immunotechnology，3107-116，1997；美国专利No.6,204,007)。含有Leu235Ala突变以降FcR结合的Fcγ4变体，加上Ser228Pro突变，也会产生这种同型的融合蛋白制备物。
用从人白细胞制备的RNA和合适的5’引物(SEQ ID NO8)和3’引物(SEQ ID NO9)，通过逆转录和PCR得到编码人IgG4的Fc区域(Fcγ4)的基因。将得到的含有IgG4的绞链、CH2和CH3区域完整序列的Fcγ4的DNA片段作为模板，产生Ser228Pro和Leu235Ala突变的Fcγ4变体(vFcγ4)，其中Ser228和Leu235分别被Pro和Ala替代。用3’引物(SEQ ID NO9)和含有Leu235Ala突变的5’引物(SEQ IDNO10)扩增CH2和CH3区域。用SEQ ID NO12作为5’引物和SEQID NO9作为3’引物，在PCR中将这种扩增的片段与合成的长度为60个碱基且含Ser228Pro和Leu235Ala突变的寡核苷酸(SEQ IDNO11)连接起来。SEQ ID NO12引物含有编码16个氨基酸Gly-Ser肽接头(包括BamHI位点)的序列。将得到的长度约为700bp的DNA片段插入接受载体(如pUC19)的BamHI和EcoRI位点，得到pL-vFcγ4质粒。用DNA测序验证该基因的序列。
为了制备HuIFN-L-vFcγ4融合基因，用HindIII和BamHI从pHuIFN质粒上切下HuIFN片段，然后插入pL-vFcγ4质粒肽接头的5’末端，得到pHuIFN-L-vFcγ4质粒。此融合基因含有HuIFN、16个氨基酸的Gly-Ser肽接头和Fcγ4变体基因，然后将其插入哺乳动物表达载体如pcDNA3(Invitrogen)的HindIII和EcoRI位点(如HuIFN-L-vFcγ2融合蛋白所述)。将这种最终表达的载体质粒命名为phIFP4。序列B显示了融合基因，它含有编码HuIFNα2a、16个氨基酸的肽接头(GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)、和具有Ser228Pro和Leu235Ala突变的Fcγ4变体的融合基因。
实施例3 构建编码HuIFN-L-vFcγ1融合蛋白的基因人IgG1重链的绞链区域含有包括3个半胱氨酸的15个氨基酸残基(GluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCysPro)。在这3个半胱氨酸残基中，第2和第3个参与两个重链间二硫键的形成。第1个半胱氨酸残基参与IgG重链与轻链的二硫键结合。由于Fc融合蛋白分子中不存在轻链，该半胱氨酸残基可能与其它半胱氨酸残基配对，而导致非特异性二硫键结合。可以将Fcγ1的绞链区域切短，以消除第1个半胱氨酸残基(AspLysThrHisThrCysProProCysPro)。用从人白细胞制备的RNA和合适的5’引物(SEQ ID NO13)和3’引物(SEQ IDNO4)，通过逆转录和PCR得到编码Fcγ1区域的基因。将得到的含有Fcγ1截短的绞链区域和CH2及CH3完整序列的DNA片段用作模板，产生具有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的Fcγ1变体(vFcγ1)。一种引入这些突变的方法如下产生两个片段，然后用天然Fcγ1作为模板在重叠PCR中将它们装配起来。用SEQ ID NO14作为5’引物并用SEQ ID NO5作为3’引物生成5’片段。此5’引物含有Leu234Val、Leu235Ala突变，3’引物含有Pro331Ser突变。用SEQ ID NO6作为5’引物并用SEQ ID NO4作为3’引物生成3’片段。然后用SEQ IDNO14作为5’引物和SEQ ID NO4作为3’引物，将5’和3’片段在覆盖Pro331Ser突变的区域连接起来。用SEQ ID NO16作为5’引物、SEQ ID NO4作为3’引物，通过PCR将此扩增的长度约650bp的片段和合成的55碱基的寡核苷酸(SEQ ID NO15)(含有Leu234Val和Leu235Ala)连接起来。SEQ ID NO16引物含有编码16个氨基酸Gly-Ser肽接头(包括BamHI位点)的序列。将得到的长度约为700bp的DNA片段插入接受载体(如pUC19)的BamHI和EcoRI位点，得到pL-vFcγ1质粒。用DNA测序验证该基因的序列。
为了制备HuIFN-L-vFcγ1融合基因，用HindIII和BamHI从pHuIFN质粒上切下HuIFN片段，然后插入pL-vFcγ1质粒肽接头的5’末端，得到pHuIFN-L-vFcγ1质粒。此融合基因含有HuIFN，16个氨基酸Gly-Ser肽接头和Fcγ1变体基因，然后将其插入哺乳动物表达载体如pcDNA3(Invitrogen)的HindIII和EcoRI位点(如HuIFN-L-vFcγ2融合蛋白所述)。将这种最终表达的载体质粒命名为phIFP1。序列C显示了融合基因，它含有编码HuIFN、16个氨基酸肽接头(GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)、和具有Ser234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的Fcγ1变体的融合基因。
实施例4 在转染的细胞系中融合蛋白的表达及纯化和定性用于医疗有两种不同的rHuIFNβ产品从中国仓鼠卵巢细胞(CHO)产生的糖基化蛋白和从细菌细胞产生的含有Cys17Ser的无糖基化蛋白。由于碳水化合物链有稳定分子构型的作用，糖基化rHuIFNβ的体外生物活性比无糖基化的产品高(参见，如Runkel等人，Pharm.Res.，15641-649，1998)。重组糖蛋白分子中的碳水化合物链会影响到治疗用产品的生物活性，免疫原性，蛋白分子稳定性，以及血清半衰期等。已有报导说，从CHO细胞衍生的rHuIFNβ，其附于Asn残基与N-连接的糖链比其他两种哺乳动物宿主细胞系的产物都更像天然的人IFNβ(参见，如Kagawa等人，J.Biol.Chem.，26317508-17515，1998)。为了得到最适合临床使用的产品，即如下描述从CHO衍生的细胞系产生HuIFN-vFc融合蛋白。
将重组phIFP1、phIFP2或phIFP4表达载体质粒转染入哺乳动物宿主细胞系，以表达HuI FN-L-vFc融合蛋白。为了稳定高水平的表达，优选的宿主细胞系是DHFR酶缺陷的CHO细胞(参见，例如美国专利No.4,818,679)。一种优选的转染方法是电穿孔。也可以使用其它方法，包括磷酸钙共沉淀、脂转染和原生质融合。在电穿孔中，用设置为250V电场和960μFd电容的Gene Pulser Electroporator(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA)，在比色杯内的2-5×107个细胞中加入10μg用BspCI线性化的质粒DNA。在转染2天后，将培养基改成含0.2mg/ml G418的生长培养基。用抗人IgGFc ELISA，测试对选定药物具有抗性的转染子是否分泌融合蛋白。也可用抗-HuIFN试验，通过ELISA进行表达的融合蛋白的定量分析。通过在96孔板上极限稀释，亚克隆产生高水平Fc融合蛋白的孔。
为了实现融合蛋白较高水平的表达，宜用受MTX药物抑制的DHFR基因进行共扩增。在含有递增浓度MTX的生长培养基中，转染的融合蛋白基因与DHFR基因共扩增。能在高达1μg/ml MTX培养基中生长的转染子，再次通过极限稀释法进行亚克隆。通过测定分泌率，对亚克隆的细胞系进行进一步的分析。分泌率水平超过约10(较佳地约30)μg/106(即百万)个细胞/24小时的细胞系，适合使用无血清生长培养基的悬浮培养。然后用条件培养基纯化融合蛋白。
用1N NaOH将含有融合蛋白的条件培养基滴定到pH7到8，然后用0.45微米的硝酸纤维素过滤器过滤。将滤液加样到磷酸盐缓冲盐水(PBS)平衡的Prosep A柱上。待融合蛋白结合于Prosep A后，弃去流穿组分。用PBS洗涤该柱，直到280nm处的OD值低于0.01。然后用0.1M pH3.75的柠檬酸缓冲液洗脱结合的融合蛋白。用0.4体积的1M K2HPO4中和，合并含有纯化蛋白的组分，并用PBS透析。然后溶液用0.22微米的硝酸纤维素过滤器过滤，并存储在4℃。在非还原条件下，由SDS-PAGE测得纯化的HuIFN-L-vFc蛋白质的分子量范围为110到120kDa。在还原条件下，纯化的蛋白迁移至约50到60kDa。用BSA作为标准，通过BCA蛋白质分析定量该融合蛋白。
权利要求
1.一种重组HuIFN-L-vFc融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白含有人IFN、肽接头和人IgGFc变体。
2.如权利要求1所述的重组HuIFN-L-vFc融合蛋白，其特征在于，所述的人IFN含有选自人干扰素，为IFNα2a，IFNα2b，IFNβ或含有Cys17Ser变体的IFNβ。
3.如权利要求1或2所述的重组HuIFN-L-vFc融合蛋白，其特征在于，所述的肽接头含有约20个或更少的氨基酸，该肽接头存在于人IFN和人IgG Fc变体之间；且所述的肽接头含有两个或更多选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸。
4.如权利要求1或2或3所述的重组HuIFN-L-vFc融合蛋白，其特征在于，所述的人IgGFc变体为含有Pro331Ser突变的人IgG2的绞链、CH2和CH3区域。
5.如权利要求1或2或3所述的重组HuIFN-L-vFc融合蛋白，其特征在于，所述的人IgGFc变体为含有Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4的绞链、CH2和CH3区域。
6.如权利要求1或2或3所述的重组HuIFN-L-vFc融合蛋白，其特征在于，所述的人IgGFc变体为含有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的人IgG1的绞链、CH2和CH3区域。
7.一种CHO衍生的细胞系，其特征在于，所述的细胞系在其生长培养基中在每24小时期间内，产生超过10μg/百万个细胞的如权利要求1-6任一所述的HuIFN-L-vFc融合蛋白。
8.如权利要求7所述的CHO-衍生的细胞系，其特征在于，在生长培养基中，在每24小时期间内，产生超过30μg/百万个细胞的HuIFN-L-vFc融合蛋白。
9.一种制备权利要求1所述的HuIFN-L-vFc融合蛋白的CHO-衍生的细胞系的方法，其特征在于，其中人IgGFc变体含有选自IgG1、IgG2和IgG4的人IgG的绞链、CH2和CH3区域，且IgGFc含有降低效应子功能的氨基酸突变。在人IFN和人IgGFc变体间存在含有约20个或更少氨基酸的柔性肽接头，且人IFN含有选自人干扰素为IFNα2a，IFNα2b，IFNβ或含有Cys17Ser变体的IFNβ。
10.一种制备含有人IFN、柔性肽接头和人IgGFc变体的重组融合蛋白的方法，其特征在于，该方法包括下列步骤(a)生成CHO衍生的细胞系；(b)在重组融合蛋白在其生长培养基中在每24小时期间内表达超过10μg/百万个细胞的条件下，培养该细胞系；(c)纯化步骤(b)表达的蛋白质。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于其中所述在人IFN和人IgGFc变体间存在含有20或更少个氨基酸的柔性肽；且所述的柔性肽接头含有2个或多个选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于其中所述的人IgGFc变体为含有包括Pro331Ser突变的人IgG2的绞链区、CH2和CH3区域。
13.如权利要求10所述的方法，其特征在于其中所述的人IgGFc变体为含有包括Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4的绞链区、CH2和CH3区域。
14.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的人IgGFc变体为含有包括Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的人IgG1的绞链区、CH2和CH3区域。
15.如权利要求10所述的方法，其特征在于其中所述的人IFN含有选自人干扰素为IFNα2a，IFNα2b，IFNβ或含有Cys17Ser变体的IFNβ。
16.如权利要求10-15任一所述的方法，其特征在于其中所述的步骤(b)中每24小时期间内每百万细胞表达超过30μg蛋白。
17.一种制备含有人IFN、柔性肽接头和人IgGFc变体的重组融合蛋白的方法，其特征在于该方法包括下列步骤(a)生成CHO衍生的细胞系；(b)用重组融合蛋白在其生长培养基中在每24小时期间内表达超过10μg/百万个细胞的条件下，培养该细胞系；(c)纯化步骤中(b)表达的蛋白质；其中在人IFN和人IgGFc变体间存在含有20个或更少氨基酸的柔性肽接头和柔性肽接头含有2个或多个选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸；且人IFN含有选自人干扰素为如IFNα2a，IFNα2b，IFNβ或含有Cys17Ser变体的IFNβ；和人IgGFc变体含有选自以下的人IgG的绞链区、CH2和CH3区域Pro331Ser突变的人IgG2；Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4；和Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的人IgG1。
全文摘要
本发明属生物医药技术领域。本发明公开了一种人干扰素(HuIFN)与缺乏裂解性的人IgG Fc变体(vFc)的融合蛋白。该融合蛋白具有与重组人干扰素相似高度的生物活性。含有人IFN、约20个或更少氨基酸的柔性肽接头、和人IgG Fc变体。这种Fc变体无裂解性，且显示极小的不良Fc－介导的副作用。本发明公开了一种高表达水平制备或产生这类融合蛋白的方法。本发明的HuIFN－L－vFc融合蛋白表现出更长的血清半衰期和极高的生物活性，从而改善药物动力学和药效，能降低患者使用时的注射频率。
文档编号C12N5/00GK1500811SQ02145190
公开日2004年6月2日 申请日期2002年11月12日 优先权日2002年11月12日
发明者金宜慧, 孙乃超, 周若云 申请人:旭华(上海)生物研发中心有限公司