专利名称：沙蚕蛋白酶及其分离提取纯化方法和应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种溶血栓纤溶酶，特别是提供了一种沙蚕蛋白酶及其分离提取纯化方法和应用，涉及纤溶酶的分离提取纯化方法的生物化学技术领域。
背景技术：
血栓栓塞性是临床最常见的也是最严重的一种血液循环障碍疾病。治疗上述疾病，特别是在发病初期使用溶栓剂，降低纤维蛋白及纤维蛋白原含量、减少血小板凝集、溶解血栓、恢复血管再通，是最重要的治疗方法，能降低死亡率、减少后遗症。目前，国内外在临床上多用尿激酶和克栓酶、蛇毒降纤酶等溶栓性药物。这些药物价格都很昂贵，也有不同优缺点，如选择性差，半寿期长，抗原性强，毒性大，易引起继发出血性疾病。因此、发现研制新型溶栓类药物仍是制药工业非常有重要意义的科研项目，具有极大社会效益和经济效益。
发明内容
本发明提供一种沙蚕蛋白酶，同时提供了该酶的分离提取纯化方法和应用，克服了常规溶栓剂药物价格昂贵，选择性差、半寿期短、抗原性强等缺点，并可以实现工业化生产。
沙蚕蛋白酶，英文名称N-V proteinase(下文减称N-V蛋白酶)此酶在Swiss prot中的登录名为N-V proteinase，登录号为P83433。其分子量在27000-35000之间，等电点在5-7.5之间，最适温度为45℃，最适pH为8-9。
该酶分子内部5个肽段的氨基酸残基的序列，其特征是(1)AVYLAGMK(2)NFPNYYINLY(3)VYLAANPTASS(4)QTFNSDTL(5)VYILDTGI沙蚕蛋白酶是一种蛋白水解酶，在体内体外都能强烈地水解纤维蛋白原和纤维蛋白，可做为溶栓药物和抗凝血药物，预防和治疗心肌梗塞、脑动脉血栓形成等疾病的应用。
沙蚕蛋白酶系直接水解于纤维蛋白、不具有激酶性质的蛋白水解酶，是从环节动物门Phylum Annelida毛虫钢Class Chaetopoda，多毛目polychaeta，沙蚕科Nereidae，分离纯化获得。
本发明提供五种沙蚕蛋白酶的分离提纯方法(一)纯化工艺1，包括以下步骤1)取沙蚕，洗净后绞碎，加入1-10倍体积的pH4.0-9.0，0.01-0.4mol/L磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液制成匀浆；0-10℃，3000-9000转/分离心15-60分钟，取上清液即N-V蛋白酶粗提液；2)取N-V蛋白酶粗提液，置冰浴中冷却至0-10℃，在搅拌条件下，加入-20～0℃预冷的无水乙醇，使乙醇的浓度达5～15％，保持在冰浴中使其产生沉淀；-10～10℃，3000～9000转/分离心15～60分钟，弃沉淀；上清液边搅拌边加入预冷的无水乙醇，终浓度为25-45％，同样在冰浴中使其充分沉淀；-10～0℃，3000～9000转/分离心15～60分钟，弃上清液，沉淀尽可能抽干。保存方法，将沉淀溶于适量pH4.0～9.0，0.01-0.4mol/L磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液中，分装，-20℃保存，或将沉淀冷冻干燥，-20℃保存，取保存液用pH4.0～9.0，0.01～0.4mol/L磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液稀释10-50倍，在截留值100000～10000之间超滤，获得超滤液；3)分别用含5-10％乙醇的pH6.5-8.0、0.02～0.1mol/L磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液充分平衡N-V蛋白酶超滤液和DEAESepharose Fast Flow层析介质。平衡液上柱，采用线性梯度洗脱法洗脱(NaCl，KCl等中性盐浓度从0～0.5mol/L)，收集活性峰并冻干；4)分别用含10-15％乙醇的pH4.0-6.5、0.02-0.1mol/L磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液充分平衡经上一步DEAE SepharoseFast Flow层析柱纯化获得的冻干活性样品和CM Sepharose FastFlow层析介质。平衡液上样，采用线性梯度洗脱法洗脱(NaCl，KCl等中性盐浓度浓度从0-0.5mol/L)，收集活性峰并冻干，鉴定活性和纯度，进行蛋白定量，获得N-V蛋白酶产率为0.2-0.7‰。
(二)纯化工艺2，包括以下步骤1)超滤分离和浓缩取沙蚕，洗净后绞碎，加入1-10倍体积的pH4.0-9.0，0.01-0.4mol/L磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液制成匀浆；0-10℃，3000-9000转/分离心15-60分钟，取上清液即N-V蛋白酶粗提液；N-V蛋白酶粗提液用300000MW膜超滤，滤出液由10000MW膜截留浓缩，得浓缩液，分别测定A260和A280值，PAGE鉴定纯度；2)CM-52纤维素柱层析分别用pH3-4.6 0.01-0.05mol/L乙酸盐、柠檬酸盐缓冲液充分平衡浓缩液和CM-52纤维素层析介质；平衡液浓缩上柱，采用常液洗脱法洗脱；用300000MW膜超滤，滤出液由10000MW膜截留浓缩，分别测定A260和A280值，PAGE鉴定纯度；3)QAE Sephadex A50柱层析用pH3-4.6 0.01-0.05mol/L乙酸盐、柠檬酸盐缓冲液充分平衡QAE Sephadex A50层析介质；将浓缩液用这种缓冲液充分透析平衡，平衡液上柱，采用常液洗脱法洗脱，收集活性峰，分别测定A260和A280值，用300000MW膜超滤，滤出液由10000MW膜截留浓缩，PAGE鉴定纯度；4)Phenyl-Sepharose CL-4B柱层析将活性峰浓缩液用pH5.0-8.0 0.01-0.025mol/L磷酸盐、Tris等缓冲液充分平衡；用pH5.0-8.0 0.01-0.025mol/L磷酸盐、Tris等缓冲液充分平衡Phenyl-Sepharose CL-4B层析介质；平衡液浓缩上样，采用线性梯度洗脱法洗脱(NaCl浓度从1.5～0.05mol/L)；收集活性峰，分别测定A260和A280值，用300000MW膜超滤，滤出液由10000MW膜截留浓缩，PAGE鉴定纯度，获得N-V蛋白酶产率为0.2-0.7‰。
(三)纯化工艺3，包括以下步骤1)超滤分离和浓缩取沙蚕，洗净后绞碎，加入1-10倍体积的pH4.0-9.0，0.01-0.4mol/L磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液制成匀浆；0-10℃，3000-9000转/分离心15-60分钟，取上清液即N-V蛋白酶粗提液；N-V蛋白酶粗提液用300000MW膜超滤，滤出液由10000MW膜截留浓缩，得浓缩液，分别测定A260和A280值，PAGE鉴定纯度；2)采用pH 7.0-8.0，0.02-0.04mol/L磷酸盐、Tris等缓冲液，以常液洗脱方法，进行DEAE Sepharose Fast Flow层析，收集活性峰并超滤浓缩，分别测定A260和A280值，PAGE鉴定纯度；3)采用pH梯度洗脱(pH 4.0-6.5，0.01-0.02mol/L乙酸盐、柠檬酸盐缓冲液)与盐梯度洗脱方法(pH5.5-6.5，0.01-0.02mol/L乙酸盐、柠檬酸盐缓冲液，NaCl浓度为0-0.5mol/L)组合，进行CMSepharose Fast Flow层析，超滤浓缩，分别测定A260和A280值，PAGE鉴定纯度，获得N-V蛋白酶产率为0.2-0.7‰。
(四)纯化工艺4，包括以下步骤1)取沙蚕洗净后绞碎，加入1～5倍体积的pH6.0～8.0，0.1mol/LNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液制成匀浆；离心，取上清液即溶栓素粗提液；粗提液经15-60％(NH4)2SO4盐析沉淀；2)重新溶解沉淀，经Sephacryl S-100层析柱层析分离，收集活性峰；活性峰冻干浓缩；3)Phenyl-Sepharose CL-4B柱层析用pH6.0～8.0，0.025mol/LNa2HPO4-NaH2PO4+1mol/L(NH4)2SO4缓冲液充分平衡上述样品、Phenyl-Sepharose CL-4B层析介质；平衡液上样，采用线性梯度洗脱法洗脱((NH4)2SO4浓度从1-0.05mol/L)，收集活性峰，超滤浓缩，分别测定A260和A280值，PAGE鉴定纯度。
(五)制备性分离提取纯化方法，包括以下步骤用Epoxy-activated Sepharose 6B为介质，制成介质悬液；将纯化的兔抗沙蚕蛋白酶抗体溶解于偶联缓冲液中，与凝胶颗粒悬液混合，于摇床中作用过夜后装柱；用偶联缓冲液、蒸馏水等依次冲洗过量的抗体；用乙醇胺过夜处理凝胶，以封闭残余活性基团；用偶联缓冲液彻底冲洗亲和柱，用上样缓冲液洗脱亲和介质；收集洗脱液进行蛋白定量，计算偶联率；将制备好的亲和介质装柱，以沙蚕蛋白酶超滤液为上样样品，以阶段洗脱方法，收集活性峰并冻干。
本发明沙蚕蛋白酶在用于制备血栓性疾病的预防和治疗药物。
本发明的药物组合物优选重量比为0.1％～99.5％活性成分。
本发明药物优选含有1％～99％的沙蚕蛋白酶和99％～1％的赋形剂。
本发明药物优选含有10％～90％的沙蚕蛋白酶和90％～10％的药用赋形剂。
本发明药物优选含有30％～80％的沙蚕蛋白酶和70％～20％的药用赋形剂。
本发明药物最好含有60％～70％的沙蚕蛋白酶和40％～30％的赋形剂。
本发明的药物含有治疗有效量的提取物为活性成分，以及含有一种或多种药学上可接受的载体。
本发明可以组合物的形式通过静脉、肌肉注射、口服、直肠等给药方式施用于这种治疗的患者。按照药学领域的常规生产方法制备各种剂型如注射剂、片剂、颗粒剂、冲剂、胶囊、栓剂、喷雾剂、缓释剂、口服液体剂型。也可使其活性成分与一种或多种载体或药物混合，制成所需剂型。
上文的载体是指药学领域常规的药物载体，包括如防腐剂、色素、稀释剂、赋形剂，填充剂，粘合剂，矫味剂，湿润剂，崩解剂，吸收促进剂，表面活性剂，吸附载体。
沙蚕蛋白酶的药物作用药效学实验1.体内血栓形成时间实验根据国家新药(西药)临床前研究指导原则汇编，溶血栓药体内血栓溶解实验——颈动脉血栓形成法，以尿激酶为阳性对照药，以生理盐水为阴性对照，静脉给药后，用电刺激损伤大鼠颈动脉以形成血栓，观察血栓形成时间，同时测定凝血时间。
N-V蛋白酶的体内血栓实验研究表明N-V蛋白酶和尿激酶在同等剂量的前提下，N-V蛋白酶的体内血栓形成时间长于尿激酶。
2.体外血栓形成●体外血栓形成实验根据国家新药(西药)临床前研究指导原则汇编，以尿激酶为阳性对照药，以生理盐水为阴性对照，大鼠静脉给药后，腹腔主动脉取血，置于体外血栓形成仪中旋转，测定血栓长度、湿重、干重。结果表明N-V蛋白酶的体内抗血栓形成效果优于尿激酶。
3.凝血相关生化检验参考N-V蛋白酶半数致死量，选择大、中、小三个剂量组静脉给药，时间、方法同步骤2。
●纤维蛋白原mg/dL对照组266，小剂量207，中剂量142，大剂量132，尿激酶153，差异显著；●PT 对照组19.6，小剂量19.2，中剂量18.1，大剂量20.1，尿激酶19.3，差异不显著；●APTT 对照组20.7，小剂量16.8，中剂量16.8，大剂量19.0，尿激酶19.9，差异不显著；4.凝血时间实验小鼠尾静脉注射N-V蛋白酶后摘出眼球，取血。
●玻片法 单位秒对照组131，小剂量194，中剂量233，大剂量183秒；●毛细管法单位秒对照组124，小剂量180，中剂量329，大剂量211秒；5.体内溶血实验●大鼠法体内注射小、中、大三个剂量的N-V蛋白酶，不同时间后取腹主动脉血，柠檬酸钠抗凝，在试管中，离心3000转/秒，5分钟，血液分上下两层，上为清亮血浆，无溶血；●家兔法无溶血制剂的热源实验用鲎试剂检测无热源。
定性鉴定实验N-V蛋白酶为抗原免疫家兔，分离抗血清。在琼脂板上做抗原抗体反应。N-V蛋白酶产生免疫沉淀线，其他蛋白质均无反应。
N-V蛋白酶的体外活性测定方法——纤维蛋白平板1.材料人血纤维蛋白原(中国生物制品检定所)人血凝血酶(中国生物制品检定所)人尿激酶 (中国生物制品检定所)其它药品均为国产分析纯2.方法(1)制备0.5％的纤维蛋白原溶液100mg纤维蛋白原粉末溶于0.1MpH7.4 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液。
(2)制备20U/ml的凝血酶溶液按标定单位，将凝血酶溶于0.1MpH7.4Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液。
(3)制备纤维蛋白平板在用水平仪校正过的平面上放置直径9cm的平皿，加入9ml的0.5％的纤维蛋白原溶液和1.0ml 20u/ml的凝血酶溶液，混匀后静置15分钟。
(4)测定活性取阴性对照药(生理盐水)、阳性对照药(尿激酶)和N-V蛋白酶各10ul，在纤维蛋白平板上点样，37℃下放置15分钟。
用卡尺测量溶斑的长短径，计算溶斑面积。
结果
根据溶斑面积的大小，判断N-V蛋白酶活性的高低。溶斑面积越大，N-V蛋白酶的活性越高。
N-V蛋白酶的蛋白定量方法1.方法(1)标准试剂的配制精称100mg的考马斯亮蓝G-250，溶于95％的乙醇中，再与100mlw/v的磷酸混合，0.01M pH7.0的磷酸盐缓冲液定容于1000ml的容量瓶中。
(2)分析方法常规分析法取5ml标准试剂，加入0.1ml 0.01M pH7.0的磷酸盐缓冲液溶解的蛋白样品液中，充分混合，放置5分钟后，在595nm处测定吸光度。
微量分析法取0.2ml标准试剂，加入0.8ml 0.01M pH7.0的磷酸盐溶解的蛋白样品液中，充分混合，放置5分钟后，在595nm处测定吸光度。
(3)备注常规分析法的蛋白含量线性范围0.2～1.4mg/ml微量分析法的蛋白含量线性范围5～100ug/ml(4)标准定量曲线在常规分析法和微量分析法蛋白含量线性范围内均匀取浓度点，以蛋白浓度为横坐标、595nm处的吸光度为纵坐标，分别绘制常规和微量标准定量曲线，并做直线相关检验。
2结果在规定蛋白浓度范围内蛋白浓度与A595呈直线正相关(P＜0.001)。
N-V蛋白酶温度影响实验1.将2mgN-V蛋白酶电泳纯纯品溶解于1ml生理盐水。
2.分别放置在20、30、37、45、50、60、70℃水浴箱中保温1小时。
3.纤维蛋白平板测定活性(37℃，15分钟)。
激酶活性分析与纤溶酶原激活分析(一)激酶活性分析1.以10000截留值的超滤离心管，用10mM Tris pH7.4，150mM NaCl，10mM MgCl2缓冲液充分洗涤N-V蛋白酶的电泳纯纯品，洗涤三次。
2.吸取上清，在37℃条件下，加入ATP、[32P]ATP、以及偶氮酪蛋白、纤维蛋白原等底物，共同孵育15分钟。
3.加入SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上样液，煮沸终止反应，离心取上清。
4.进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，以0.25％Coomassie blue(45％甲醇，10％乙酸配制)固定，于X光片曝光，检查磷酸化的底物带。结果表明，N-V蛋白酶无激酶活性。
纤溶酶原激活分析方法1.以生理盐水配制纤溶酶原溶液、以pH7.4，0.1mol/L的磷酸盐缓冲液配制N-V蛋白酶溶液。以5μl、1U/mL纤溶酶原溶液与5μlN-V蛋白酶溶液(①液)，以5μl生理盐水与5μl N-V蛋白酶溶液(②液)，以5μl、10U/mL纤溶酶原溶液与5μl N-V蛋白酶溶液(③液)，分别混合配制，并分为三份。
2.所有配液同(二)、1，但是在①液与③液加入ATP溶液，②液中不加。分别混合配制，并分为三份。
3.将上述两种方法制备的各三份配液，第一份在混合后直接在纤维蛋白平板上点样，第二份混合后于37℃下放置10分钟，在纤维蛋白平板上点样，第三份混合后于37℃下放置20分钟在纤维蛋白平板上点样。点样完成后，于37℃下放置15分钟，后测定活性。结果显示N-V蛋白酶无纤溶酶原激活作用。
N-V蛋白酶血块溶解实验a)取Wister大鼠，麻醉后腹主动脉取血，放置于平皿，室温形成血栓，切割并称量血块，装入试管中。
b)将尿激酶和N-V蛋白酶加入血块试管中，37℃恒温，于不同时间观测溶解情况。结果表明10小时内完全溶解，而磷酸盐缓冲液对照组无溶解。
具体实施例方式实施例1取200g沙蚕，洗净后绞碎，加入4.5倍体积的pH7.0，0.01mol/LNa2HPO4-NaH2PO4，缓冲液制成匀浆；4℃，9000转/分离心30分钟，取上清液即N-V蛋白酶粗提液。取N-V蛋白酶粗提液1000ml，置冰浴中冷却至0℃，在搅拌条件下，加入-20℃预冷的无水乙醇，使乙醇的浓度达5％，保持在冰浴中使其产生沉淀；-10℃，9000转/分离心30分钟，弃沉淀；上清液边搅拌边加入-20℃预冷的无水乙醇，终浓度为30％，同样在冰浴中使其充分沉淀；-10℃，9000转/分离心30分钟，弃上清液，沉淀尽可能抽干。将沉淀溶于适量pH5.8，0.01mol/LNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液中，分装。用前以pH8.0，0.02mol/L Tris-HCl缓冲液稀释5倍，在截留值100000-10000之间超滤，获得超滤液。分别用含5％乙醇的pH8.0、0.02mol/L Tris-HCl缓冲液充分平衡N-V蛋白酶超滤液和DEAE Sepharose Fast Flow层析介质。平衡液上柱，采用直线梯度洗脱法洗脱(NaCl浓度从0-0.5mol/L)，收集活性峰并冻干，以纤维蛋白平板法鉴定活性和以聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯度，进行蛋白定量。分别用含15％乙醇的pH4.0、0.02mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液充分平衡经上一步DEAE Sepharose Fast Flow层析柱纯化获得的冻干活性样品和CM Sepharose Fast Flow层析介质。平衡液上柱，采用直线梯度洗脱法洗脱(NaCl浓度从0-0.5mol/L)，以纤维蛋白平板法鉴定活性和以聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯度，进行蛋白定量。获得N-V蛋白酶产率为0.23‰。
实施例2取200g沙蚕，洗净后绞碎，加入8倍体积的pH8.0，0.08mol/LTris缓冲液制成匀浆；4℃，6000转/分离心60分钟，取上清液即N-V蛋白酶粗提液。取N-V蛋白酶粗提液1000ml，置冰浴中冷却至0℃，在搅拌条件下，加入-20℃预冷的无水乙醇，使乙醇的浓度达10％，保持在冰浴中使其产生沉淀；-10℃，6000转/分离心60分钟，弃沉淀；上清液边搅拌边加入-20℃预冷的无水乙醇，终浓度为25％，同样在冰浴中使其充分沉淀；-10℃，8000转/分离心30分钟，弃上清液，沉淀尽可能抽干。将沉淀溶于适量pH5.8，0.01mol/L HAC-NaAC缓冲液中，分装。用前以pH7.8，0.04mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液稀释5倍，在截留值100000-10000之间超滤，获得超滤液。分别用含5％乙醇的pH7.8，0.04mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液充分平衡N-V蛋白酶超滤液和DEAE Sepharose Fast Flow层析介质。平衡液上柱，采用直线梯度洗脱法洗脱(NaCl浓度从0-0.5mol/L)，收集活性峰并冻干，以纤维蛋白平板法鉴定活性和以聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯度，进行蛋白定量。分别用含25％乙醇的pH6.0、0.02mol/L柠檬酸盐缓冲液充分平衡经上一步DEAE Sepharose Fast Flow层析柱纯化获得的冻干活性样品和CM Sepharose Fast Flow层析介质。平衡液上柱，采用直线梯度洗脱法洗脱(KCl浓度从0-0.5mol/L)，以纤维蛋白平板法鉴定活性和以聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯度，进行蛋白定量。获得N-V蛋白酶产率为0.21‰。
实施例3取200g沙蚕，洗净后绞碎，加入8倍体积的pH5.0，0.04mol/LHAC-NaAC，缓冲液制成匀浆；4℃，4000转/分离心60分钟，取上清液即N-V蛋白酶粗提液。取N-V蛋白酶粗提液1000ml，置冰浴中冷却至0℃，在搅拌条件下，加入-20℃预冷的无水乙醇，使乙醇的浓度达10％，保持在冰浴中使其产生沉淀；-10℃，4000转/分离心60分钟，弃沉淀；上清液边搅拌边加入-20℃预冷的无水乙醇，终浓度为25％，同样在冰浴中使其充分沉淀；-10℃，6000转/分离心45分钟，弃上清液，沉淀尽可能抽干。将沉淀溶于适量pH5.8，0.01mol/LHAC-NaAC缓冲液中，分装。用前以pH7.8，0.04mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液稀释5倍，在截留值100000-10000之间超滤，获得超滤液。分别用含20％乙醇的pH6.0，0.03mol/L柠檬酸盐缓冲液充分平衡N-V蛋白酶超滤液和DEAE Sepharose Fast Flow层析介质。平衡液上柱，采用直线梯度洗脱法洗脱(NaCl浓度从0-0.5mol/L)，收集活性峰并冻干，以纤维蛋白平板法鉴定活性和以聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯度，进行蛋白定量。分别用含25％乙醇的pH 4.0、0.02mol/L柠檬酸盐缓冲液充分平衡经上一步DEAE Sepharose Fast Flow层析柱纯化获得的冻干活性样品和CM Sepharose Fast Flow层析介质。平衡液上柱，采用直线梯度洗脱法洗脱(KCl浓度从0-0.5mol/L)，以纤维蛋白平板法鉴定活性和以聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯度，进行蛋白定量。获得N-V蛋白酶产率为0.26‰。
实施例4取沙蚕300g，洗净后绞碎，加入2倍体积的pH7.0，0.025mol/L磷酸盐缓冲液制成匀浆；4℃，9000转/分离心15分钟，取上清液即N-V蛋白酶粗提液。N-V蛋白酶粗提液用300000MW膜超滤，滤出液由10000MW膜截留浓缩，得浓缩液。分别用pH4.6 0.01mol/L柠檬酸-柠檬酸钠+0.01mol/L NaCl缓冲液充分平衡浓缩液和CM-52纤维素层析介质。平衡液浓缩上柱，采用常液洗脱法洗脱，超滤浓缩。用pH4.6 0.01mol/L柠檬酸-柠檬酸钠+0.01mol/L NaCl缓冲液充分平衡QAE Sephadex A50层析介质。将浓缩液用这种缓冲液充分透析平衡，平衡液上柱，采用常液洗脱法洗脱，收集活性峰，超滤浓缩。将活性峰浓缩液用pH7.0 0.025mol/L Na2HPO4-NaH2PO4+1.5mol/LNaCl缓冲液充分平衡。用pH7.0 0.025mol/L Na2HPO4-NaH2PO4+1.5mol/L NaCl缓冲液充分平衡Phenyl-Sepharose CL-4B层析介质。平衡液浓缩上柱，采用直线梯度洗脱法洗脱(NaCl浓度从1.5～0.05mol/L)，收集活性峰，分别测定A260和A280值，超滤浓缩，PAGE鉴定纯度，获得N-V蛋白酶产率为0.3‰。
实施例5取沙蚕300g，洗净后绞碎，加入5倍体积的pH5.0，0.02mol/L乙酸盐缓冲液制成匀浆；4℃，6000转/分离心30分钟，取上清液即N-V蛋白酶粗提液。N-V蛋白酶粗提液用300000MW膜超滤，滤出液由10000MW膜截留浓缩，得浓缩液。分别用pH5.0，0.02mol/L乙酸盐缓冲液充分平衡浓缩液和CM-52纤维素层析介质。平衡液浓缩上柱，采用常液洗脱法洗脱，超滤浓缩。用pH5.0，0.02mol/L乙酸盐缓冲液充分平衡QAE Sephadex A50层析介质。将浓缩液用这种缓冲液充分透析平衡，平衡液上柱，采用常液洗脱法洗脱，收集活性峰，超滤浓缩。将活性峰浓缩液用pH7.5 0.025mol/L Na2HPO4-NaH2PO4+1mol/LNaCl缓冲液充分平衡。用pH7.5 0.025mol/L Na2HPO4-NaH2PO4+1mol/L NaCl缓冲液充分平衡Phenyl-Sepharose CL-4B层析介质。平衡液浓缩上柱，采用直线梯度洗脱法洗脱(NaCl浓度从1～0.05mol/L)，收集活性峰，分别测定A260和A280值，超滤浓缩，PAGE鉴定纯度，获得N-V蛋白酶产率为0.35％。
实施例6取沙蚕300g，洗净后绞碎，加入10倍体积的pH6.0，0.02mol/L乙酸盐缓冲液制成匀浆；4℃，4000转/分离心60分钟，取上清液即N-V蛋白酶粗提液。N-V蛋白酶粗提液用300000MW膜超滤，滤出液由10000MW膜截留浓缩，得浓缩液。分别用pH6.0，0.02mol/L乙酸盐缓冲液充分平衡浓缩液和CM-52纤维素层析介质。平衡液浓缩上柱，采用常液洗脱法洗脱，超滤浓缩。用pH6.0，0.02mol/L乙酸盐缓冲液充分平衡QAE Sephadex A50层析介质。将浓缩液用这种缓冲液充分透析平衡，平衡液上柱，采用常液洗脱法洗脱，收集活性峰，超滤浓缩。将活性峰浓缩液用pH7.5 0.01mol/L Na2HPO4-NaH2PO4+0.5mol/L NaCl缓冲液充分平衡。用pH7.5 0.01mol/LNa2HPO4-NaH2PO4+0.5mol/L NaCl缓冲液充分平衡Phenyl-Sepharose CL-4B层析介质。平衡液浓缩上柱，采用直线梯度洗脱法洗脱(NaCl浓度从0.5～0.05mol/L)，收集活性峰，分别测定A260和A280值，超滤浓缩，PAGE鉴定纯度，获得N-V蛋白酶产率为0.33‰。
实施例71)抗原的获得采用制备型电泳获得目标蛋白—沙蚕蛋白酶。连续系统聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶浓度为10％。电泳结束后剥胶，切下一窄条胶块，放入染色液中染色10分钟，即可观察到活性带；剩余的凝胶块用保鲜膜包好，保存在4℃条件下。将染色的胶块与未染色的胶块在玻璃板上对齐，切下未染色的大胶块上与活性蛋白带相对应的胶条，切下的胶条封入透析袋中，内装少量缓冲液A，放入水平电泳槽电泳，80mA，电泳4小时。收集袋内液体，用蒸馏水透析除盐，离心，过微孔滤膜除菌，然后冻干，即获得电泳纯抗原。
2)免疫动物2.1)卡介苗致敏给每只家兔两后足皮内注射活卡介苗，每只1mg。
2.2)基础免疫两星期后进行基础免疫。在高压灭菌的研钵中加入弗氏不完全佐剂，再滴加灭活的卡介苗，边滴加边研磨，制成弗氏完全佐剂(2mg卡介苗/ml弗氏完全佐剂)；将冻干的抗原溶于适量的高压灭菌的缓冲液A中，滴加入完全佐剂中，边滴加边研磨，再加入青霉素钠溶液、硫酸链霉素溶液少许，研磨均匀，制成油包水乳剂，抗原浓度为100μg/ml乳剂。给每只兔子背部皮下多点注射，每只2ml。
2.3)加强免疫每3周加强免疫一次，方法基本与基础免疫相同，不同的是用弗氏不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，加强注射的剂量可适当降低。每次加强免疫后7～10天，耳缘静脉取血，用双向琼脂扩散试验[31]测定抗血清效价，当效价≥8时，从耳缘静脉放血20～30ml/只。放血后继续饲养，继续免疫。效价稳定后，可每间隔1周从耳缘静脉放血20～30ml/只，直至血清效价下降，最后从兔主动脉取全血。
2.4)在用电泳纯溶栓素免疫四只兔子的同时，用沙蚕匀浆上清液免疫另外两只兔子，作为对照。
2.5)取抗血清每次获得的血样收集于灭菌的离心管中(不加抗凝剂)，于室温放置使之凝固。用一玻棒沿管壁旋松凝块，再室温放置数小时，使抗血清完全析出；5000转/分离心15分钟，上清即为抗血清。分装，-20℃贮存。
3)IgG的提纯3.1)取适量抗血清冻融，加入等体积的预冷的缓冲液B混匀。冰浴条件下滴加饱和(NH4)2SO4溶液，边加边搅拌，使溶液的(NH4)2SO4饱和度达到50％，4℃静置2小时，4000转/分离心20分钟，弃上清。
3.2)沉淀用同体积的缓冲液B溶解，冰浴条件下逐滴加入饱和(NH4)2SO4溶液，边加边搅拌，使溶液的(NH4)2SO4饱和度达33％，4℃静置2小时，4000转/分离心20分钟，弃上清；重复4.2操作两次。
3.3)将沉淀溶于少量缓冲液B中，装入透析袋，4℃对缓冲液C透析除盐平衡，离心，上清为较纯的IgG溶液。
3.4)上步得到较纯的IgG过DEAE Sepharose Fast Flow柱层析，平衡缓冲液是缓冲液C，洗脱液是缓冲液D，常液洗脱，收集第一峰，用PEG20000浓缩。杂蛋白用缓冲液E洗脱。提纯的IgG用SDS-PAGE鉴定。
4)亲和层析介质的制备与亲和层析用Epoxy-activated Sepharose6B为介质，制成介质悬液；将纯化的兔抗溶栓素抗体溶解于偶联缓冲液中，与凝胶颗粒悬液混合，于37℃摇床中作用16小时后装柱；用偶联缓冲液、蒸馏水等依次冲洗过量的抗体；用1M乙醇胺，37℃过夜处理凝胶，以封闭残余活性基团；用偶联缓冲液彻底冲洗亲和柱，用上样缓冲液洗脱亲和介质；收集洗脱液进行蛋白定量，计算偶联率。将制备好的亲和介质装柱，以溶栓素超滤液为上样样品，以阶段洗脱方法，收集活性峰并冻干。
实施例8取沙蚕300g，洗净后绞碎，加入2倍体积的pH8.0，0.03mol/L Tris缓冲液制成匀浆；4℃，6000转/分离心30分钟，取上清液即N-V蛋白酶粗提液。N-V蛋白酶粗提液用300000MW膜超滤，滤出液由10000MW膜截留浓缩，得浓缩液。以pH8.0，0.03mol/L Tris缓冲液充分平衡浓缩液和DEAE Sepharose Fast Flow层析介质，并进行常液洗脱，收集活性峰并超滤浓缩。以乙酸盐缓冲液充分平衡浓缩液和CM Sepharose Fast Flow层析介质，以0.02mol/L乙酸盐缓冲液(pH4.5-pH6.5)进行pH梯度洗脱，以pH6.5 0.02mol/L乙酸盐缓冲液(NaCl 0-0.5mol/L)进行盐梯度洗脱，超滤浓缩。采用pH7.0，0.02mol/L磷酸盐缓冲液进行Sephadex G-50层析，分别测定A260和A280值，PAGE鉴定纯度。获得N-V蛋白酶产率为0.32‰。
实施例9取沙蚕300g，洗净后绞碎，加入2倍体积的含10％乙醇的pH8.0，0.03mol/L Tris缓冲液制成匀浆；4℃，6000转/分离心60分钟，取上清液即N-V蛋白酶粗提液。N-V蛋白酶粗提液用300000MW膜超滤，滤出液由10000MW膜截留浓缩，得浓缩液。以pH7.5，0.025mol/LTris缓冲液充分平衡浓缩液和DEAE Sepharose Fast Flow层析介质，并进行常液洗脱，收集活性峰并超滤浓缩。以柠檬酸盐缓冲液充分平衡浓缩液和CM Sepharose Fast Flow层析介质，以0.04mol/L乙酸盐缓冲液(pH4.5-pH6.5)进行pH梯度洗脱，以pH6.5 0.04mol/L柠檬酸盐缓冲液(NaCl 0-0.5mol/L)进行盐梯度洗脱，超滤浓缩。采用pH7.0，0.04mol/L磷酸盐缓冲液进行Sephadex G-75层析，分别测定A260和A280值，PAGE鉴定纯度。获得N-V蛋白酶产率为0.39‰。
实施例101)取500g沙蚕，洗净后绞碎，加入4.5倍体积的pH7.0，0.1mol/LNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液制成匀浆；4℃，9000转/分离心30分钟，取上清液即溶栓素粗提液；粗提液经15-60％(NH4)2SO4盐析沉淀；2)重新溶解沉淀，经Sephacryl S-100层析柱层析分离，收集活性峰；活性峰冻干浓缩；3)Phenyl-Sepharose CL-4B柱层析用pH7.0、0.025mol/LNa2HPO4-NaH2PO4+1mol/L(NH4)2SO4缓冲液充分平衡上述样品、Phenyl-Sepharose CL-4B层析介质；平衡液上样，采用线性梯度洗脱法洗脱((NH4)2SO4浓度从1-0.05mol/L)，收集活性峰，超滤浓缩，分别测定A260和A280值，PAGE鉴定纯度。
实施例11N-V蛋白酶制剂工艺制剂种类和每瓶装量冻干制剂，N-V蛋白酶1-3mg/瓶；赋型剂种类和用量甘露醇10-40mg，右旋糖苷10-40mg，L赖氨酸5-15mg，人血白蛋白2-10mg，各组成成分以上述用量任意配比，以单方或复方形式，冻干赋型。
冻干操作一级冻干-30～-20℃冻干16-48小时；二级冻干0-10℃冻干16-24小时。
权利要求
1.一种沙蚕蛋白酶，直接水解于纤维蛋白、不具有激酶性质的蛋白水解酶，其分子量在27000-35000之间，等电点在5-7.5之间，最适温度为40-50℃，最适pH为8-9，N-V蛋白酶最适pH8-9，pH4-12均有活性，加热70℃10分钟，活性丧失，酶分子内部5个肽段的氨基酸残基的序列如下(1)AVYLAGMK(2)NFPNYYINLY(3)VYLAANPTASS(4)QTFNSDTL(5)VYILDTGI
2.沙蚕蛋白酶的分离提取纯化方法，包括以下步骤1)取沙蚕，洗净后绞碎，加入1-10倍体积的pH4.0-9.0，0.01-0.4mol/L磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液制成匀浆；0-10℃，3000-9000转/分离心15-60分钟，取上清液即N-V蛋白酶粗提液；2)取N-V蛋白酶粗提液，置冰浴中冷却至0-10℃，在搅拌条件下，加入-70-0℃预冷的无水乙醇，使乙醇的浓度达5-15％，保持在冰浴中使其产生沉淀；-10-0℃，3000-9000转/分离心15-60分钟，弃沉淀；上清液边搅拌边加入预冷的无水乙醇，终浓度为25-45％，同样在冰浴中使其充分沉淀；-10-0℃，3000-9000转/分离心15-60分钟，弃上清液，沉淀尽可能抽干。保存方法，将沉淀溶于适量pH4.0-9.0，0.01-0.4mol/L磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液中，分装，-20℃保存，或将沉淀冷冻干燥，-20℃保存取保存液用pH4.0-9.0，0.01-0.4mol/L磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液稀释10-50倍，在截留值100000-10000之间超滤，获得超滤液；3)分别用含5-10％乙醇的pH6.5-8.0、0.02-0.1mol/L磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液充分平衡N-V蛋白酶超滤液和DEAESepharose Fast Flow层析介质。平衡液上柱，采用直线梯度洗脱法洗脱(NaCl，KCl等中性盐浓度从0~0.5mol/L)，收集活性峰并冻干；4)分别用含10-15％乙醇的pH4.0-6.5、0.02-0.1mol/L磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液充分平衡经上一步DEAE SepharoseFast Flow层析柱纯化获得的冻干活性样品和CM Sepharose FastFlow层析介质。平衡液上柱，采用直线梯度洗脱法洗脱(NaCl，KCl等中性盐浓度浓度从0-0.5mol/L)，收集活性峰并冻干，鉴定活性和纯度，进行蛋白定量，获得N-V蛋白酶产率为0.2-0.7‰。
3.沙蚕蛋白酶的分离提取纯化方法，包括以下步骤1)超滤分离和浓缩取沙蚕，洗净后绞碎，加入1-10倍体积的pH4.0-9.0，0.01-0.4mol/L磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液制成匀浆；0-10℃，3000-9000转/分离心15-60分钟，取上清液即N-V蛋白酶粗提液；N-V蛋白酶粗提液用300000MW膜超滤，滤出液由10000MW膜截留浓缩，得浓缩液，分别测定A260和A280值，PAGE鉴定纯度；2)CM-52纤维素柱层析分别用pH3-4.6 0.01-0.05mol/L乙酸盐、柠檬酸盐缓冲液充分平衡浓缩液和CM-52纤维素层析介质；平衡液浓缩上柱，采用常液洗脱法洗脱；用300000MW膜超滤，滤出液由10000MW膜截留浓缩，分别测定A260和A280值，PAGE鉴定纯度；3)QAE Sephadex A50柱层析用pH3-4.6 0.01-0.05mol/L乙酸盐、柠檬酸盐缓冲液充分平衡QAE Sephadex A50层析介质；将浓缩液用这种缓冲液充分透析平衡，平衡液上柱，采用常液洗脱法洗脱，收集活性峰，分别测定A260和A280值，用300000MW膜超滤，滤出液由10000MW膜截留浓缩，PAGE鉴定纯度；4)Phenyl-Sepharose CL-4B柱层析将活性峰浓缩液用pH5.0-8.0 0.01-0.025mol/L磷酸盐、Tris等缓冲液充分平衡；用pH5.0-8.0 0.01-0.025mol/L磷酸盐、Tris等缓冲液充分平衡Phenyl-Sepharose CL-4B层析介质；平衡液浓缩上柱，采用直线梯度洗脱法洗脱(NaCl浓度从1.5~0.05mol/L)；收集活性峰，分别测定A260和A280值，用300000MW膜超滤，滤出液由10000MW膜截留浓缩，PAGE鉴定纯度，获得N-V蛋白酶产率为0.2-0.7‰。
4.沙蚕蛋白酶的分离提取纯化方法，包括以下步骤1)超滤分离和浓缩取沙蚕，洗净后绞碎，加入1-10倍体积的pH4.0-9.0，0.01-0.4mol/L磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液制成匀浆；0-10℃，3000-9000转/分离心15-60分钟，取上清液即N-V蛋白酶粗提液；N-V蛋白酶粗提液用300000MW膜超滤，滤出液由10000MW膜截留浓缩，得浓缩液，分别测定A260和A280值，PAGE鉴定纯度；2)采用pH7.0-8.0，0.02-0.04mol/L磷酸盐、Tris等缓冲液，以常液洗脱方法，进行DEAE Sepharose Fast Flow层析，收集活性峰并超滤浓缩，分别测定A260和A260值，PAGE鉴定纯度；3)采用pH梯度洗脱(pH 4.0-6.5，0.01-0.02mol/L乙酸盐、柠檬酸盐缓冲液)与盐梯度洗脱方法(pH 5.5-6.5，0.01-0.02mol/L乙酸盐、柠檬酸盐缓冲液，NaCl浓度从0-0.5mol/L)组合，进行CMSepharose Fast Flow层析，超滤浓缩，分别测定A260和A280值，PAGE鉴定纯度，获得N-V蛋白酶产率为0.2-0.7‰。
5.沙蚕蛋白酶的分离提取纯化方法，包括以下步骤1)取沙蚕洗净后绞碎，加入1～5倍体积的pH6.0～8.0，0.1mol/LNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液制成匀浆；离心，取上清液即溶栓素粗提液；粗提液经15-60％(NH4)2SO4盐析沉淀；2)重新溶解沉淀，经Sephacryl S-100层析柱层析分离，收集活性峰；活性峰冻干浓缩；3)Phenyl-Sepharose CL-4B柱层析用pH6.0～8.0，0.025mol/LNa2HPO4-NaH2PO4+1mol/L(NH4)2SO4缓冲液充分平衡上述样品、Phenyl-Sepharose CL-4B层析介质；平衡液上样，采用线性梯度洗脱法洗脱((NH4)2SO4浓度从1-0.05mol/L)，收集活性峰，超滤浓缩，分别测定A260和A280值，PAGE鉴定纯度。
6.沙蚕蛋白酶的制备性分离提取纯化方法，包括以下步骤用Epoxy-activated Sepharose 6B为介质，制成介质悬液；将纯化的兔抗沙蚕蛋白酶抗体溶解于偶联缓冲液中，与凝胶颗粒悬液混合，于摇床中作用过夜后装柱；用偶联缓冲液、蒸馏水等依次冲洗过量的抗体；用乙醇胺过夜处理凝胶，以封闭残余活性基团；用偶联缓冲液彻底冲洗亲和柱，用上样缓冲液洗脱亲和介质；收集洗脱液进行蛋白定量，计算偶联率；将制备好的亲和介质装柱，以沙蚕蛋白酶超滤液为上样样品，以阶段洗脱方法，收集活性峰并冻干。
7.沙蚕蛋白酶在制备血栓性疾病的预防和治疗药物。
8.沙蚕蛋白酶作为治疗有效量的活性成分，以及含有一种或多种药学上可接受的载体。
9.根据权利要求5、6所述的药物组合物，优选重量比为0.1％～99.5％活性成分。
10.根据权利要求5、6所述的药物，其特征在于所说的药物是任何一种药剂学上所说的剂型。
全文摘要
本发明提供了一种沙蚕蛋白酶，同时提供了其分离提取纯化方法，此酶的英文名称N－V proteinase在Swissprot中的登录名为N－V proteinase，登录号为P83433。其分子量在27000－35000之间，等电点在5－7.5之间，最适温度为45℃，最适pH为7.8。该酶分子内部10个肽段的氨基酸残基的序列，其特征是(1)AVYLAGMK(2)NFPNYYINLY(3)VYLAANPTASS(4)QTFNSDTL(5)VYILDTGI沙蚕蛋白酶是一种蛋白水解酶，在体内体外都能强烈地水解纤维蛋白原和纤维蛋白，可做为溶栓药物和抗凝血药物，预防和治疗心肌梗塞、脑动脉血栓形成等疾病的应用。
文档编号C12N9/68GK1500873SQ02144828
公开日2004年6月2日 申请日期2002年11月15日 优先权日2002年11月15日
发明者洪敏 , 程熠, 白若伦, 洪 敏 申请人:洪敏 , 洪 敏