肿瘤新生血管特异性结合多肽与人α干扰素融合蛋白及制备的利记博彩app

专利名称：肿瘤新生血管特异性结合多肽与人α干扰素融合蛋白及制备的利记博彩app
技术领域：
本发明属于医药生物技术领域的基因克隆、基因重组、外源基因在原核细胞中的表达、目的蛋白的纯化、肿瘤新生血管特异性结合多肽与α干扰素融合蛋白的体外活性测定及理化性质鉴定等技术，涉及一种抗肿瘤药物及其制备方法，特别涉及能够特异性结合于肿瘤组织新生血管内皮细胞及肿瘤细胞的肿瘤新生血管特异性结合多肽与人IFN-α融合蛋白(IFNα2a-NGR、IFNα2a-RGD、IFNα2b-NGR和IFNα2b-RGD)及其制备方法。
背景技术：
2.1干扰素的相关研究干扰素是一类生物学活性十分复杂的细胞因子，包括抗病毒、影响细胞的生长分化、调节免疫功能以及抗肿瘤等特性。1957年Isaacs和Lindenmann首次发现灭活的流感病毒作用于细胞后，细胞产生一种可溶性物质，这种物质干扰了活病毒的繁殖，因此命名为干扰素(Interferon)。2.1.1干扰素的生物学活性抗病毒活性目前研究表明，干扰素抗病毒的机理主要是诱导细胞产生几种抗病毒蛋白。(1)其中研究最清楚的就是2-5A合成酶(2-5Asynthetase)它可以催化一种特殊的寡核苷酸PPP(A2’P)nA(2-5A)的形成。这种寡核苷酸可使一种干扰素诱导的潜伏的核酸内切酶RNaseL发生活化，活化的RNaseL可降解病毒RNA，从而抑制病毒蛋白的合成。(2)干扰素也能诱生dsRNA依赖的蛋白激酶-PKR，它可使参与mRNA在核糖体上翻译的肽起始因子eIF2发生磷酸化，磷酸化的eIF2即被灭活，抑制病毒蛋白的合成。(3)干扰素还诱生一些只作用于某一类病毒的蛋白，如Mx蛋白只阻断流感病毒的复制。当然，在生物长期进化中，病毒也获得了破坏干扰素诱生的抗病毒蛋白的本领，如由腺病毒或EB病毒产生的病毒RNA小分子通过结合到PKR上而阻断dsRNA对PKR的激活；呼肠孤病毒和牛痘病毒产生的sigma3和SKI可以结合dsRNA；微小病毒EMCV可以灭活RNaseL；疱疹病毒合成的2-5A合成酶类似物可以竞争性抑制2-5A合成酶等等，另外，某些病毒还可以直接抑制干扰素所诱导基因的转录和翻译。
抗细胞增殖活性干扰素抑制某些细胞的增殖的机制同干扰素诱导抗病毒蛋白合成的机制相似。干扰素可诱生的PKR和2-5A合成酶/RNaseL系统也与干扰素抗细胞增殖有关。另外，α干扰素还可以抑制周期素依赖的激酶2(CDK-2)，从而抑制细胞的增殖。
免疫调节活性干扰素通过激活免疫系统，间接发挥抗病毒和抗肿瘤作用，如通过上调巨噬细胞IgG Fc受体促进ADCC；活化NK细胞，促进其杀伤功能；增强靶细胞MHCI类分子表达，促进杀伤病毒感染的靶细胞；诱导MHCII类分子的表达，提高机体体液免疫和细胞免疫水平。
抗肿瘤活性干扰素的抗肿瘤作用机理主要是以下几方面的综合作用(1)干扰素抑制肿瘤病毒的繁殖，这是由于干扰素可以抑制肿瘤病毒整合到细胞基因组中，从而抑制了病毒的感染。(2)干扰素可以通过诱导PKR和2-5A合成酶/RNaseL系统而直接抑制肿瘤细胞的生长。(3)干扰素可以调动机体免疫系统杀伤肿瘤细胞。(4)干扰素通过抑制肿瘤新生血管形成而抑制肿瘤的生长和转移。2.1.2干扰素的临床应用现状自1957年干扰素被发现以来，人们就很想将干扰素应用于临床。但是60年代初人们采用人外周血细胞经诱生获得干扰素，由于其产量低，纯度差，远远不能满足临床需求。1973年Cohen将两种不同DNA分子进行体外重组，并用大肠杆菌表达，使大量、廉价制备单组分干扰素成为可能；1980年利用基因工程成功地获得了IFN-α及IFN-β的cDNA；1982年又克隆了IFN-γ的cDNA；到了1987年三种干扰素的生产开始工业化，并大量进入临床。因此，直到干扰素重组基因产品的问世，才大大推动了干扰素的临床应用。
目前临床上IFN-α/β主要用于某些肿瘤和病毒性疾病的治疗，IFN-γ主要用于病毒性疾病和某些感染性疾病的治疗。
2.1.2.1抗肿瘤的治疗毛细胞性白血病干扰素治疗的肿瘤中疗效最好的就是一种少见的毛细胞性白血病，有效率可达80％以上。1984年，Quesada等首次报道了有关IFN-α对毛细胞性白血病的治疗。他们发现在7例经IFN-α治疗的患者中，有3例痊愈，4例部分痊愈且疗效维持6至10个月；随后，他们又对30例患者进行了IFN-α2a治疗，结果经骨髓活检证实9例(30％)痊愈，17例(56％)部分痊愈，并且所有患者外周血细胞计数改善或者恢复正常。后来，在1986年，多家医疗机构通过对64例患者进行的II期临床试验证实了干扰素对毛细胞白血病的疗效。因此，1986年美国FDA批准IFN-α2a和IFN-α2b用于毛细胞白血病的治疗。目前临床应用中存在的主要问题是复发率过高。
慢性髓样白血病(CML)早期的基础研究就发现，干扰素具有抗早幼粒细胞增殖的作用。1983年，Talpas等报道，7例经IFN治疗的患者，5例症状缓解；1986年，他们又报道，17例早期CML患者经rIFN-α2a治疗后，14例有明显疗效，其中13例痊愈，1例部分痊愈。细胞遗传学分析表明20％-25％患者的CML细胞中的“Philadephia”染色体长期消失。在CML治疗中，专家建议干扰素应与其他抗癌药物联合使用。1992年Kantarjian等人的研究表明，60例晚期CML患者经IFN-α与阿糖胞苷联合用药比单纯用IFN-α疗效好，表现为Ph染色体消失及生存时间都有所延长。Guihot等人的研究发现，360例患者经IFN-α2b、羟基脲和阿糖胞苷联合治疗，疗效明显优于单独用IFN-α2b或羟基脲，表现为生存时间延长和细胞遗传学改善率明显提高。
多发性骨髓瘤在80年代初，干扰素就开始用于多发性骨髓瘤的治疗。早期采用单剂IFN-α治疗，能使50％未经任何处理的病人产生反应。后来采用干扰素与常规化疗药物联用，取得了较好的疗效。如化疗12个月后，再连续应用IFN-α2b两年，半数存活率可延长12-13个月；用VBMCP联合治疗两个疗程合用IFN-α一个疗程，连续两年，反应时间和半数存活率比单用VBMCP要延长1年以上。
非何杰金氏病通常化疗能使75-90％的病人缓解，但是维持疗效一直是一个有待解决的问题。通过采用化疗合用干扰素就可以延长维持时间和存活时间。
ADIS相关的Kaposi肉瘤自1981年，干扰素就开始用于ADIS相关的KS的治疗。早期的用药剂量在20×106U/d左右，尽管疗效明显，但是细胞毒性反应严重。后来，Lane等人，发现，病人对药物的反应和CD4阳性T淋巴细胞计数有关，CD4阳性T淋巴细胞计数大于400/mm3的有反应，而小于150/mm3的几乎完全没有反应。在治疗方案方面，目前普遍接受的观点是，对CD4阳性T淋巴细胞计数大于150/mm3的患者采用干扰素和AZT合用效果较好。
胃肠道肿瘤单剂干扰素治疗结肠癌效果不佳，但是干扰素可以提高5FU的血浓度(1.5-64倍)，使病人的反应率从10-20％提高到了63％。IFN-α和5FU联合治疗结肠直肠癌也比单用5FU效果好，普遍使反应率从10-20％提高到了20-30％。
肾细胞癌50多个临床试验结果表明，单剂干扰素治疗肾细胞癌的反应率为0％-50％，其中IFN-α平均为15％而IFN-γ平均为10％。对转移性肾癌，IFN和IL-2或5FU联合治疗，可以明显提高疗效。I/II期临床试验表明反应率为20％，痊愈率为5％。
恶性黑色素瘤1980年，Bart等报道了鼠干扰素在体内和体外均可抑制B16黑色素瘤细胞生长。从此，展开了干扰素治疗黑色素瘤的临床试验。研究表明，干扰素单剂治疗后，转移性黑色素瘤的反应率约为了15％，而痊愈率为了5％。在黑色素瘤手术切除以后，不用IFN-α的平均无复发生存时间和平均生存时间分别为0.55年和2.06年，而用IFN-α后，两时间延长到1.7年和3.8年。
2.1.2.2抗病毒性疾病的治疗在治疗病毒性疾病中，IFN-α对乙型肝炎和丙型肝炎的效果最为明显，将近40％慢性乙型肝炎患者对IFN-α有不同程度的疗效，不同血清型的丙型肝炎的疗效不一。IFN-α/β对乳头状瘤病毒感染引起的损伤和生殖器疣有一定的疗效，但是对流感病毒的作用不明显。另外，尽管IFN可以抑制AIDS相关的KS的生长，但是并不能明显抑制HIV病毒的复制。
2.1.2.3其他由于IFN对造血细胞有抑制作用，它对白细胞增多症、真性红细胞增多症、血小板增多症也有一定疗效；IFN-α还可用于治疗不育症，多发性硬化病及某些自身免疫性疾病。IFN-β已申请用于治疗黄斑变性病。2.2肿瘤血管抑制剂的研究现状2.2.1肿瘤血管形成的机理肿瘤的生长分为两个明显不同的阶段，即缓慢生长的无血管期和快速增殖的有血管期。由于血管生成使肿瘤能够获得足够的营养物质，因此，在原发性实体瘤的生长和转移过程中，肿瘤血管形成起着非常重要的作用。如果没有血管形成，实体瘤的生长不会超过2-3mm3；只有血管形成后，肿瘤才得以恶性生长和转移。在肿瘤血管新生的过程中，主要受血管生成因子和血管抑制因子的调节。肿瘤细胞、内皮细胞和巨噬细胞受缺氧、系统刺激等局部微环境发生变化的因素作用而合成和释放上述因子，当两者的平衡被打破，即发生血管生成过程。一般包括以下几个步骤(1)内皮细胞激活、血管生成表型的形成，即内皮细胞血管生成的遗传信息进行表达的过程。(2)血管局部细胞外基质、基底膜降解后，内皮细胞芽生、增殖和迁移直至管腔形成。(3)新生血管腔形成及连通，即肿瘤微血管的分化和成型。2.2.3研究策略目前，以血管生成的各个环节及其发生过程中的生化改变为靶点，研制血管生成抑制剂，控制肿瘤生长和转移，已经越来越成为肿瘤防治的一个重要途径。主要以下几种研究策略1)阻断内皮细胞降解周围基质的能力(抑制细胞外蛋白降解酶的活性)胞外蛋白降解酶在肿瘤血管生成过程中，以MMPs起的作用为主，它促进了肿瘤细胞和内皮细胞的游走。因此，抑制它的活性可以作为抑制肿瘤血管形成的一个重要手段。目前，已有多种小分子量的MMPs抑制剂被合成。如Marimastat、AG3340、Neovastat和Bay12-9566已进入临床III期试验，主要用于治疗胰腺癌、非小细胞肺癌、肺癌、乳腺癌以及前列腺癌等。CGS27023A和COL-3处于I/II期临床试验。
2)直接抑制内皮细胞功能通过抑制内皮细胞对血管生成生长因子的反应来抑制内皮细胞的增殖和游走，从而抑制体外毛细血管的形成；另外，通过诱导增殖的内皮细胞凋亡也能起到同样的作用。目前这类药物均处于I/II期临床试验阶段，其中包括TNP-470(AGM-1470)、Thalidomide、Squalamine和CombretastatinA-4(CA4P)，这些药物主要用于成人实体瘤晚期、儿童实体瘤、淋巴瘤、急性自血病、Kaposi肉瘤、成胶质细胞瘤、乳腺癌等的治疗。
3)阻断血管生成因子的合成和释放或拮抗其作用目前已分离和纯化的血管生成因子有20余种，包括VEGF、aFGF、bFGF、angiogenin、PIGF、EGF、IL-8、TNF-α等等。在这些因子中，研究最深入的是VEGF和bFGF。VEGF具有增加微血管的通透性、促进不同来源的内皮细胞的分裂增殖和血管重构、促进内皮细胞的迁移等多种作用；bFGF是血管内皮细胞很强的促分裂剂及趋化因子。目前，抗VEGF抗体和α干扰素(抑制bFGF和VEGF生成)已进入III期临床试验；用于阻断VEGF和FGF受体的药物SU5416、SU6668、PTK787/ZK22584等均处于I/II期临床试验。
4)阻断内皮细胞表面整合素的作用整合素主要介导细胞与细胞外基质的黏附和传递信息的一类受体，通过与其配体的结合使细胞骨架在细胞膜表面特殊位点聚合，以便细胞运动或维持组织稳定；同时也激活调控细胞复制或程序性死亡。已知在肿瘤新生血管内皮细胞可以特异性地表达某些整合素分子，通过特异性拮抗或阻断这些整合素分子的作用也可以阻断肿瘤新生血管的形成。Vitaxin、EMDI21974作为该类药物的代表，正处于I/II期临床试验。
这类以血管生成的各个环节为靶点而开发的各种抗肿瘤药物于传统细胞毒类药物的最大优点就在于，(1)这类药物是直接作用于运动的及增殖的毛细血管内皮细胞，所以，不易造成血管抑制、胃肠道反应或脱发等传统化疗药物常见的毒副反应。(2)抗血管生成药物所作用的内皮细胞具有遗传稳定性，因而不易产生耐药性。这类药物的缺点就是它对肿瘤血管内皮细胞及正常血管内皮细胞并无特异的选择性，因此，对伤口愈合及女性生殖系统的生理功能会有一定影响。2.2.4特异性结合多肽的研究现状噬菌体展示技术是80年代中期发展起来的，该方法采用DNA重组技术将大量的多肽编码顺序导入噬菌体的衣壳蛋白基因中，从而使各种多肽以融合蛋白的形式表达于噬菌体表面，构建成噬菌体展示文库，再通过生物学方法从文库中与筛选出与已知的靶序列特异性结合的多肽编码顺序。近10多年来，人们在筛选识别蛋白或受体的多肽序列、模拟已知蛋白的多肽模拟物以及筛选鉴定能与人类病毒、细胞、组织及肿瘤等生物靶系统结合的多肽研究方面取得了巨大的进展，如尿激酶受体拮抗剂的筛选、EGFR高亲和力结合多肽的鉴定、黑色素受体-1配基模拟多肽的筛选和具有相应天然活性的13、14肽的EPO、TPO模拟多肽的开发等等。这为研制和开发具有高科技含量的一类生物技术新药开辟了一条崭新的道路。
1996年，Ruoslahti等人通过噬菌体展示技术筛选出了可以和活化的肿瘤新生血管内皮细胞特异性结合的多肽序列RGD(Arg-Gly-Asp)和NGR(Asn-Gly-Arg)。已知，多种细胞外的基质蛋白含有RGD，如纤维粘连蛋白，vitronectin和fibyiflogen等；NGR也存在于许多蛋白中，如纤维粘连蛋白等。研究表明，这两种多肽在内皮细胞上的受体不同，RGD主要通过与整合素αvβ3和αvβ5结合，而识别肿瘤新生血管；NGR通过与氨肽酶N(CD13)结合而定位于新生血管。为了证实这两个多肽的肿瘤新生血管的导向作用，1998年，Ruoslahti等人将RGD和NGR分别与具有抗血管形成作用的常规化疗药物阿霉素交联，发现导向性的阿霉素可以使人乳腺癌移植瘤小鼠存活时间明显延长，且毒副反应降低。后来，他们又将多肽与诱导凋亡的短肽融合，也取得了同样的治疗效果。
2000年Angelo等人，用基因工程的方法构建了鼠NGR-TNF的融合蛋白，对荷瘤小鼠的抑瘤作用比天然鼠TNF高12-15倍，而毒性相似；同样方法构建的人NGR-TNF对人体肿瘤的抑制作用比天然人TNF明显且用药量降低30倍。另外，抗CD13抗体的可以增强NGR-TNF的抗肿瘤效果。两年后，Angelo小组又发现，CD13可以表达于正常的髓样细胞、上皮细胞以及肿瘤血管内皮细胞，但是NGR-TNF却只与肿瘤血管内皮细胞上的CD13结合，而并不结合正常细胞上表达的CD13，其作用机理还并不清楚。

发明内容
本发明的目的在于，提供一种能够特异性作用于肿瘤组织新生血管内皮细胞及肿瘤细胞的肿瘤新生血管特异性结合多肽与人IFN-α融合蛋白(IFNα2a-NGR、IFNα2a-RGD、IFNα2b-NGR和IFNα2b-RGD)及其制备方法。本发明能够进一步提高IFN-α2a和IFN-α2b的抗肿瘤活性，同时降低毒副作用，减少用药量。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案是，选择肿瘤新生血管特异性结合多肽-CDCRGDCFC-(半胱氨酸-天门冬氨酸-半胱氨酸-精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-半胱氨酸)和-CNGRCVSGCAGRC-(-半胱氨酸-天门冬酰氨-甘氨酸-精氨酸-半胱氨酸-缬氨酸-丝氨酸-甘氨酸-半胱氨酸-丙氨酸-甘氨酸-精氨酸-半胱氨酸-)，其特点是，它们分别能与肿瘤新生血管内皮细胞表面高效表达的整合素αvβ3以及氨肽酶N(CD13)结合。采用分步基因克隆技术，构建肿瘤新生血管特异性结合多肽分别与IFN-α2a和IFN-α2b的融合基因，并在大肠杆菌中获得高效表达。表达产物经盐酸胍裂解、酸化、DEAE离子层析柱以及亲和层析柱的纯化，蛋白纯度可达95％以上。给皮下接种了多发性骨髓瘤SP2/0细胞株的荷瘤小鼠注射IFN-α2a-NGR后，观察发现IFN-α2a-NGR对肿瘤组织有良好的靶向性，其靶向分布为点为肿瘤组织新生血管内皮表面。给皮下接种了人肿瘤细胞株及SP2/0的荷瘤裸小鼠注射IFN-α2a-NGR后，观察发现IFN-α2a-NGR明显抑制了SPC-A-1和A549移植瘤的生长。
本发明的肿瘤新生血管特异性结合多肽与人α干扰素融合蛋白，其制备方法是，分步克隆法构建了重组质粒pGEM-3zf(-)-IFN-α2a-NGR，包括NGR导向肽基因的克隆和IFN-α2a与NGR导向肽融合基因克隆载体的构建；原核表达载体的构建及重组蛋白表达；表达产物的鉴定；重组蛋白的纯化；IFN-α2a-NGR对荷瘤小鼠肿瘤血管靶向性的研究和IFN-α2a-NGR对裸鼠移植瘤治疗作用的研究。
本发明的肿瘤新生血管特异性结合多肽与人α干扰素融合蛋白(IFNα2a-NGR、IFNα2a-RGD、IFNα2b-NGR和IFNα2b-RGD)，通过多肽与其新生血管处的受体结合，既可以起到封闭αvβ3和CD13的作用，又能使IFN-α2a/2b在肿瘤组织的新生血管处富集，针对性地发挥它们的抗肿瘤和抑制肿瘤血管形成的作用。从而为进一步降低IFN-α2a/2b 临床用药量，提高量效比，降低毒副作用奠定基础。
四

图1是pGEM-3Zf(-)-NGR的测序结果；图2是pGEM-3Zf(-)-RGD的测序结果；图3是pGEM-3Zf(-)-IFN-α2a-NGR的测序结果；图4是pGEM-3Zf(-)-IFN-α2b-NGR的测序结果；图5是pGEM-3Zf(-)-IFN-α2a-RGD的测序结果；图6是pGEM-3Zf(-)-IFN-α2b-RGD的测序结果；图7是PCR产物琼脂糖电泳8是pBV220-IFN-α2a-NGR、pBV220-IFN-α2b-NGR、pBV220IFN-α2a-RGD-和pBV220-IFN-α2b-RGD四个重组质粒的酶切鉴定结果图；图9是IFN-α2a-NGR纯化产物的SDS-PAGE；图10是肿瘤组织免疫组化检测结果图(5幅)；图11是普通干扰素和靶向干扰素对人肺腺癌SPC-A-1细胞裸鼠移植瘤生长的影响(给药剂量见表2)；图12是普通干扰素和靶向干扰素对人肺腺癌A549细胞裸鼠移植瘤生长的影响(给药剂量见表4)。
五具体实施例方式
为了更清楚的理解本发明，以下结合发明人完成的实施例对本发明作进一步的详细描述。
依本发明的技术方案，肿瘤新生血管特异性结合多肽与人α干扰素融合蛋白，选择肿瘤新生血管特异性结合多肽-CDCRGDCFC-(半胱氨酸-天门冬氨酸-半胱氨酸-精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-半胱氨酸)和-CNGRCVSGCAGRC-(-半胱氨酸-天门冬酰氨-甘氨酸-精氨酸-半胱氨酸-缬氨酸-丝氨酸-甘氨酸-半胱氨酸-丙氨酸-甘氨酸-精氨酸-半胱氨酸-)，其特征在于，它们分别能与肿瘤新生血管内皮细胞表面高效表达的整合素αvB3以及氨肽酶N(CD13)结合。采用分步基因克隆，构建肿瘤新生血管特异性结合多肽与IFN-α2a/2b的融合基因，并在大肠杆菌中获得高效表达。表达产物经盐酸胍裂解、酸化、DEAE离子层析柱以及亲和层析柱的纯化，蛋白纯度可达95％以上。给皮下接种了多发性骨髓瘤SP2/0细胞株的荷瘤小鼠注射IFN-α2a-NGR后，观察发现IFN-α2a-NGR对肿瘤组织有良好的靶向性，其靶向分布为点为肿瘤组织新生血管内皮表面。给皮下接种了人肿瘤细胞株及SP2/0的荷瘤裸小鼠注射IFN-α2a-NGR后，观察发现IFN-α2a-NGR明显抑制了SPC-A-1和A549移植瘤的生长。
实现本发明的肿瘤新生血管特异性结合多肽与人α干扰素融合蛋白(IFNα2a-NGR、IFNα2a-RGD、IFNα2b-NGR和IFNα2b-RGD)，其制备方法(以IFN-α2a-NGR融合蛋白为例)按以下步骤进行5.1分步克隆，重组质粒pGEM-3zf(-)-IFN-α2a-NGR的构建5.1.1NGR导向肽基因的克隆编码NGR的寡核苷酸片段的设计如下，在这对寡核苷酸片段的5’端引入了BamHI酶切位点，3’端引入了XbaI酶切位点S1(48nt) 5’-GAT CCT GCA ACG GTC GTT GCG TGA GCG GTT GCG CGG GTC GTT GCT AGT-3’S2(48nt) 5’-CTA GAC TAG CAA CGA CCC GCG CAA CCG CTC ACG CAA CGA CCG TTG CAG-3’取等量S1和S2，煮沸5分钟，自然冷却至室温，进行退火。克隆载体pGEM-3Zf(-)经BamHI和XbaI双酶切并回收大片段。NGR的退火产物与载体酶切后回收的大片段经T4连接酶进行连接反应。连接产物转化感受态细胞DH5α，挑取单克隆培养过夜，提取质粒，经酶切鉴定，获得预期大小的插入片段，进行测序(图1)。测序正确的质粒命名为pGEM-3Zf(-)-NGR5.1.2IFN-α2a与NGR导向肽融合基因克隆载体的构建PCR反应引物设计如下，将EcoRI酶切位点引入5’端引物，BamHI酶切位点引入3’端引物P1(5’端引物29nt) 5’-CGG AAT TCA TGT GTG ATC TGC CTC AAA CC-3’P2(3’端引物58nt) 5’-CGG GAT CCT TCC TTA CTT CTT AAA CTT TCT TGC AAG TTT GTTGAC AAA GAA AAA GAT C-3’对pBV220-IFN-α2a质粒按下述条件进行PCR扩增。
PCR扩增反应管组成pBV888-IFN-α2a(模板DNA，200ng/ml)0.5μl2.5mM dNTPs 1μl25mM MgCl24μlP1(20μM) 0.5μlP2(20μM) 0.5μl
Taq酶(5.0U/μl)0.5μl10×PCR Buffer 5μlH2O38μl总计 50μl反应管的配制均在冰浴中进行，配制过程中，先加水，模板DNA及其他反应组分，95℃反应5min，再加入Taq酶，然后进行PCR反应，PCR扩增的循环参数为94℃，60s(变性)；60℃，60s(退火)；72℃，60s(扩增)，进行30个循环，再于72℃延伸15min。PCR产物行0.8％琼脂糖凝胶电泳，可见预期大小的DNA片段(图7)。
质粒pGEM-3Zf(-)-NGR经EcoRI和BamHI双酶切后回收大片段，回收的片段与上述的PCR产物经同样双酶切的回收产物进行连接反应。连接产物转化感受态细胞DH5α，挑取单克隆培养过夜，提取质粒，经酶切鉴定获得预期大小的插入片段，进行测序(图3)。测序正确的质粒命名为pGEM-3Zf(-)-IFN-α2a-NGR。5.1.2原核表达载体的构建及重组蛋白表达质粒pGEM-3Zf(-)-IFN-α2a-NGR经EcoRI和PstI双酶切后回收小片段，原核非融合表达载体pBV220也经上述同样的双酶切后回收大片段，两者进行连接反应。连接产物转化感受态细胞DH5α，挑取单克隆培养过夜，提取质粒，经酶切鉴定正确的质粒命名为pBV220-NGR-IFN-α2a。将含有重组质粒pBV220-NGR-IFN-α2a的大肠杆菌DH5α于30℃于LB培养基中活化振摇培养过夜，次日清晨，按1∶100的比例接种于LB培养基中后，继续30℃培养3小时至对数生长后期，OD650nm＝0.4时，迅速升温至42℃，培养4.5小时，收集菌体。经7M盐酸胍裂解，生理盐水透析后，收集上清。5.1.3表达产物的鉴定由于干扰素在原核表达载体中的表达量普遍较低，约为1-2％，对表达产物行SDS-PAGE无法辨认新生条带，但是表达产物具有较高的体外杀伤活性，所以，对表达产物的鉴定采用国际通用WISH-VSV系统细胞病变法检测其抗病毒活性。同时，对纯化产物的体外活性检测参照以下方法。步骤如下WISH细胞在含抗生素和谷氨酰胺的10％FSC，pH7.4的Eagle’s培养液中37℃培养。待细胞呈单层生长后，消化传代继续培养。将消化的WISH细胞，按1,000个细胞/孔接种于96孔板。37℃孵箱培养过夜。换入用含5％FCS的Eagle’s液稀释的不同浓度的IFN裂菌上清，继续培养，次日用含2％FCS的Eagle’s培养液按1∶10-30稀释的VSV病毒培养液，换入细胞培养板，37℃培养24h，观察结果，以50％细胞保护的IFN稀释度为IFN效价。5.1.4重组蛋白的纯化按1克菌体加5ml裂菌缓冲液的比例将菌体重悬，冰浴下搅拌4h，生理盐水透析12-24h后，4℃离心，12,000rpm，15min，收集上清液，0.01N HCl(pH2.5)酸化蛋白液2h；用50倍溶液体积的A液25mM Tris·Cl(pH7.5)透析18h，中间换液一次，透析后的上清液用A液充分平衡的DEAE-Sepharose Fast Flow层析纯化，洗脱B液为0.3M NaCl，25mM Tris·Cl(pH7.5)，连续梯度洗脱10个柱床体积，收集各个洗脱峰，测定活性；取活性峰对50倍体积的C液5Mm NaAc·Ac(pH4.5)透析过夜，中间换掖一次，透析后上清用C液充分平衡的SP-Sepharose Fast Flow层析纯化，洗脱D液为0.4M NaAc·Ac，连续梯度洗脱10个柱床体积，收集各个洗脱峰，测定活性；取活性峰对50倍体积的E液25mM PBS(pH8.0)透析过夜，中间换液一次，透析后的上清用E液充分平衡的亲和色谱层析柱层析纯化，洗脱F液为0.1M甘氨酸(pH2.5)，连续梯度洗脱5个柱床体积，收集洗脱液，进行活性测定和SDS-PAGE检测。5.2对荷瘤小鼠肿瘤血管靶向性的研究5.2.1.实验材料5.2.1.1药物IFN-α2a-NGR(靶向干扰素)，由第四军医大学生物技术中心提供，300万单位/0.79μg/支，-20℃保存，使用前加生理盐水(NS)稀释成1μg/ml。
5.2.1.2对照药物①IFN-α2a(普通干扰素)，由第四军医大学生物技术中心提供，300万单位/0.93μg/支，-20℃保存，使用前加NS稀释成1μg/ml。干扰素质量单位由ELISA法测得。
②注射用生理盐水5.2.2 IFN-α2a ELISA诊断试剂盒由第四军医大学基础部免疫学教研室提供包被抗体1支(120μl)使用时用包被缓冲液作100倍稀释酶标抗体1支(120μl)使用时用稀释液作100倍稀释标准品1支(100μl)IFN-α2a-NGR(50ng/ml)，使用时先用稀释液10倍稀释为5ng/ml，再作倍比稀释为2.5ng/ml、1.25ng/ml、625pg/ml、313pg/ml、156pg/ml、78pg/ml、39pg/ml、19pg/ml；阴性对照血清1支(200μl)；ABTS底物1支。5.2.3 IFN-α2a免疫组化试剂盒由迈新生物技术开发公司提供；小鼠抗人IFN-α2a mAb(一抗，腹水)由第四军医大学基础部免疫教研室提供，供免疫组化测定干扰素用，分装成0.1ml，-20℃保存，临用前稀释200倍，4℃保存。5.2.4动物及分组Balb/c小鼠，SPF级，由兰州医学院试验动物中心提供。
雌雄各半，体重18-22g，随机分成3组，分别为生理盐水(NS)组，普通干扰素组，靶向干扰素组，每组小鼠4-5只。5.2.实验方法5.3.1移植瘤的制备取小鼠多发性骨髓瘤细胞株SP2/0，用RMPI-1640培养基传代培养，取对数生长期的细胞0.1ml(106/只)，在Balb/c小鼠的腋窝皮下接种，16天时肿瘤块长至1.5-3g时开始试验。5.3.2给药与取血荷瘤小鼠iv普通干扰素或靶向干扰素各20μg/kg(0.2ml/10g)，给药后分别于30min、120min眼眶静脉采血0.5ml，4℃凝固，低温离心(10000rpm，4℃)30min，分离血清，4℃保存，于4h内用Elisa法测血清中干扰素浓度。5.3.3瘤组织处理小鼠采血后处死，立即取肿瘤组织约1g，剪碎，1g组织加2ml稀释液(含0.1％BSA的PBS，pH7.4，4℃)，用玻璃匀浆器研磨，4℃超声粉碎细胞2min，制备匀浆，低温离心(10000rpm，40min)，取上清0.1ml，用ElISA测肿瘤组织中的干扰素浓度。5.3.4肺、肝组织处理5.3.4.1取0.2g左右肺组织，剪碎，1g组织加2ml稀释液(含0.1％BSA的PBS，pH7.4，4℃)，用玻璃匀浆器研细，低温离心(10000rpm，40min)，取上清0.1ml测肺组织中的干扰素浓度。5.3.4.2肝组织处理取1g左右肝组织，剪碎，1g组织加2ml稀释液(含0.1％BSA的PBS，pH7.4，4℃)，用玻璃匀浆器研磨，4℃超声粉碎细胞2min，制备匀浆，低温离心(10000rpm，40min)，取上清0.1ml，用Elisa法测肿瘤组织中的干扰素浓度。5.3.5 Elisa夹心法检测IFN-α2a的方法5.3.5.1包被将稀释好的包被抗体加入Elisa板，100μl/孔，4℃放置36-48h。5.3.5.2加待检标本用洗涤液冲洗Elisa板3次，加待测样品、阴性对照及标准品，100μl/孔，37℃，1h。5.3.5.3加酶标抗体用洗涤液洗板3次，加入稀释好的酶标抗体，100μl/孔，37℃，45min。5.3.5.4显色洗涤液洗板3次，加入配好的ABTS显色液，100μl/孔，室温显色15-30min。5.3.5.5 Elisa读数仪测410nm处OD值，绘制标准曲线，如图1所示。5.3.6 IFN-α2a免疫组化检测1)取0.3-0.5g肿瘤组织(厚度3mm)，，在甲醛磷酸缓冲固定液(含4％甲醛的PBS，0.05mol/L，pH7.15)中固定6h-8h，温度4℃。
2)用磷酸缓冲液(0.05mol/L，pH 7.28)冲洗2次，时间为每次40min-60min，温度4℃。
3)在5％蔗糖-PBS液中过夜，温度4℃。
4)50％丙酮固定30-45min。
5)入纯丙酮，更换2次，时间4h，温度4℃，最后1h-2h可在室温下进行，入二甲苯中，更换3次，每次20min。
6)透蜡入已熔化的蜡杯中，换2次，浸90min，温度54℃-56℃，石蜡包埋。
7)修块后切片，厚度为5μm，将切片放入盛有40℃左右的温水槽中展开，贴在载玻片上(有助粘剂)。
8)贴片后，以滤纸吸干，放37℃温箱内干燥，12h后，按常规脱蜡处理后，进行组织孵育反应。
9)用磷酸缓冲液(PBS，pH 7.4)冲洗3次，每次5min。
10)按照试剂盒说明进行免疫组化染色。
11)苏木素复染，中性树胶封固。
12)图像分析仪显微摄像。5.4.对裸鼠移植瘤治疗作用的研究5.4.1实验材料5.4.1.1药品IFNα2a-NGR(靶向干扰素，IFNα2a-NGR)由第四军医大学生物技术中心提供。比活性为300百万U/5μg和600百万U/15μg，-20℃保存，临用前用生理盐水稀释。5.4.1.2对照药品①IFNα2a(普通干扰素，IFNα2a)由第四军医大学生物技术中心提供。比活性为300百万U/5μg和600百万U/15μg，-20℃保存，临用前用生理盐水稀释。
②注射用生理盐水。5.4.2动物裸小鼠(Balb/C nu/nu)，4-6周龄，购自中科院上海药物研究所动物室。5.4.3鼻咽癌细胞株CNE、人肺腺癌细胞株A549和SPC-A-1、人胃腺癌低分化细胞株MKN-45引自中科院上海细胞生物研究所细胞库。人肺癌低分化细胞株GLC-82为本室保存瘤株。小鼠多发性骨髓瘤SP2/0自卫生部兰州生物制品研究所第四研究室引进。5.4.3.1细胞培养所有细胞均在RPMI1640培养基(GIBCO Co)中培养。培养基中含有20％小牛血清(杭州四季青生物制品厂)和100U*ml-1的青、链霉素。取对数生长期的细胞，用0.25％胰蛋白酶消化、计数，将单细胞悬液用不含小牛血清的培养基稀释至1×107个细胞/ml备用。5.4.3.2移植瘤种植及药物治疗取细胞悬液(1×107个细胞/ml)0.1ml，于裸鼠背部皮下接种。接种后待肿瘤直径长至4mm以上时，淘汰肿瘤体积过大、过小的荷瘤裸鼠，将合格动物随机分组。分组后即开始用药物治疗。药物50μl/10g，肌肉内注射，1日1次。每3-4天用1/50mm精度游标卡尺测肿瘤的长径和短径，按下式计算肿瘤体积肿瘤体积(mm3)＝肿瘤长径(mm)×肿瘤短径(mm)2×0.525.4.4实验分组整个实验设对照组(肌注生理盐水)，普通干扰素组和靶向干扰素组，每组5-7只荷瘤裸鼠。各给药组给药剂量组数根据各瘤株移植成功率和淘汰率而定(具体组数见结果)。5.5本发明的效果1)通过分步克隆法，将人工合成的编码NGR的寡核苷酸片段与IFN-α2a的3’端连接，构建了IFN-α2a-NGR融合基因的克隆载体pGEM-3Zf(-)-IFN-α2a-NGR，DNA序列测定证实完全正确。
2)构建了IFN-α2a-NGR融合基因的原核表达载体pBV220-IFN-α2a-NGR，经温度诱导，对诱导菌的裂解上清进行活性测定证实有体外抗病毒活性，进而证实在大肠杆菌中获得表达。
3)纯化了IFN-α2a-NGR融合蛋白。SDS-PAGE凝胶电泳和HPLC检测均证实纯度大于95％(参见图9)。
4)体外活性实验显示IFN-α2a-NGR融合蛋白对WISH-VSV系统有明显杀伤活性，比活性达到2.4×109U/mg5)用相似的方法克隆的另三种融合蛋白即IFN-α2b-NGR、IFN-α2a-RGD和IFN-α2b-RGD取得了相似的结果(参见图2，4，5，6，8)。
6)对荷瘤小鼠肿瘤血管靶向性研究的结果①Elisa法测得的iv30min时小鼠血清与肿瘤组织中的干扰素浓度实验中普通干扰素组与靶向干扰素组小鼠静脉给药剂量均为20μg/kg，给药30min后空白组血清、肿瘤组织中均未检出干扰素；普通干扰素组血清中干扰素浓度为298.6±52.3pg/ml，肿瘤组织中未检出；靶向干扰素组血清中为314.2±55.8pg/ml，肿瘤组织中为254.5±78.2pg/g，是血清靶向干扰素含量的80.9％(参见表1)。按肿瘤组织中检测下限为57pg/g计，靶向干扰素在肿瘤组织中的浓度在iv后30min时至少为普通干扰素的4.5倍。
②ELISA法测得的iv 120min小鼠血清与组织中的干扰素浓度实验中普通干扰素组与靶向干扰素组小鼠静脉给药剂量均为20.μg/kg，给药120min后空白组血清、肿瘤、肺中干扰素均未检出干扰素，肝组织中为50.1±4.2pg/g；普通干扰素组血清、肿瘤、肺、肝中干扰素浓度分别为46.5±8.9(pg/ml)和50.8±4.5、70.8±20.7、48.5±7.1pg/g；靶向干扰素组血清、肿瘤、肺、肝中靶向干扰素浓度分别为69.3±20.8(pg/ml)和93.3±27.9、77.6±12.9、66.6±12.1pg/g(参见表2)。靶向干扰素/普通干扰素浓度之比在血清、肿瘤、肺、肝中分别为149％、183.7％、109.6％和137.3％。肿瘤组织中此浓度比均低于血清(参见表3)③肿瘤组织免疫组化检测结果肿瘤组织切片免疫组化染色显示NS对照组肿瘤组织观察不到干扰素分布，普通干扰素组肿瘤组织间隙中显示弱阳性，血管内壁表面无阳性反应物分布；靶向干扰素组肿瘤组织血管内壁表面呈现强阳性(黄色)反应，组织间隙中也有阳性反应物分布，证明静脉给药30min时靶向干扰素主要分布于肿瘤血管内壁及组织间隙中(参见图10)。
7)对裸鼠移植瘤治疗作用研究的结果①对人非小细胞性肺癌裸鼠移植瘤生长的影响a.对人肺腺癌SPC-A-1细胞裸鼠移植瘤生长的影响3×106U/kg、9×106U/kg的普通干扰素和靶向干扰素1日1次肌肉内注射，明显抑制人肺腺癌SPC-A-1细胞裸鼠移植瘤的生长，作用呈剂量依赖性，和对照组比较，差别有显著性(参见表4，表5，图11)。3×106U/kg的普通干扰素与靶向干扰素的最大抑瘤率分别为34.4％和70.1％，且治疗20天后二组间瘤体积有显著性差别(p＜0.05)，显示同等剂量的靶向干扰素的抑瘤作用明显强于普通干扰素。
b.对人肺腺癌A549细胞裸鼠移植瘤生长的影响3×106U/kg、9×106U/kg的普通干扰素和靶向干扰素1日1次肌肉内注射，明显抑制人肺腺癌A549细胞裸鼠移植瘤的生长，作用呈剂量依赖性，和对照组比较，差别有显著性(参见表6，表7，图12)。3×106U/kg的普通干扰素和靶向干扰素的最大抑瘤率分别为57.4％和77.02％，治疗24天后二组间瘤体积有显著性差别(p＜0.05)，显示同等剂量的靶向干扰素的抑瘤作用明显强于普通干扰素。
C.对低分化人肺腺癌GLC-82细胞裸鼠移植瘤生长的影响普通干扰素3×106U/kg、9×106U/kg和靶向干扰素3×106U/kg，1日1次肌肉内注射，和对照组比较，对人低分化肺腺癌GLC-82细胞裸鼠移植瘤无明显抑制作用，和对照组比较，差别均无显著性。靶向干扰素9×106U/kg虽使肿瘤体积缩小，但差别无显著性(p＞0.05)。
②对人低分化胃癌MKN-45细胞裸鼠移植瘤生长的影响9×106U/kg的普通干扰素和靶向干扰素1日1次肌肉内注射对人低分化胃癌MKN-45裸鼠移植瘤无明显抑制作用，和对照组比较，差别均无显著性。
③对人高分化鼻咽癌CNE细胞裸鼠移植瘤生长的影响9×106U/kg的普通干扰素和靶向干扰素1日1次肌肉内注射对人高分化鼻咽癌CNE细胞裸鼠移植瘤无明显抑制作用，和对照组比较，差别均无显著性。
④对小鼠多发性骨髓瘤SP2/0细胞裸鼠移植瘤生长的影响1×106U/kg、3×106U/kg、9×106U/kg的普通干扰素和靶向干扰素1日1次肌肉内注射，和对照组比较，靶向干扰素1×106U/kg明显抑制肿瘤增长，差别有显著性，其他各剂量组对小鼠多发性骨髓瘤SP2/0细胞裸鼠移植瘤无明显抑制作用，和对照组比较，差别均无显著性(参见表8，表9)。
表1.ELISA法测得的iv 30min小鼠血清与肿瘤组织中的干扰素浓度

表2.ELISA法测得的iv 120min小鼠血清与组织中的干扰素浓度

表3.靶向组干扰素与普通组干扰素在血清和组织中的浓度比较

表4、普通干扰素与靶向干扰素对人肺腺癌SPC-A-1细胞裸鼠移植瘤体积(mm3)变化的影向

表5、普通干扰素与靶向干扰素对人SPC-A-1肺腺癌细胞裸鼠移植瘤的抑瘤率(％)

注L，3×106U/kg；H，9×106U/kg。
表6、普通干扰素与靶向干扰素对人肺腺癌A549细胞裸鼠移植瘤体积(mm3)变化的影响

注L，3×106U/kg；H，9×106U/kg。和对照组比较，*P＜0.05；**P＜0.01。普通干扰素L组与靶向干扰素L组比，#P＜0.05.
表7、普通干扰素与靶向干扰素对人肺腺癌A549细胞裸鼠移植瘤的抑瘤率(％)

注L，3×106U/kg；H，9×106U/kg。
表8、普通干扰素与靶向干扰素对小鼠多发性骨髓瘤SP2/0细胞裸鼠移植瘤体积(mm3)变化的影响

注L，1×106U/kg；M，3×106U/kg；H，9×106U/kg。和对照组比较，*P＜0.05；**P＜0.01。
表9、普通干扰素与靶向干扰素对小鼠SP2/0裸鼠移植瘤的抑瘤率(％)

注L，1×106U/kg；M，3×106U/kg；H，9×106U/kg。
权利要求
1.肿瘤新生血管特异性结合多肽与人α干扰素融合蛋白，选择肿瘤新生血管特异性结合多肽-CDCRGDCFC-(半胱氨酸-天门冬氨酸-半胱氨酸-精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-半胱氨酸)和-CNGRCVSGCAGRC-(-半胱氨酸-天门冬酰氨-甘氨酸-精氨酸-半胱氨酸-缬氨酸-丝氨酸-甘氨酸-半胱氨酸-丙氨酸-甘氨酸-精氨酸-半胱氨酸-)，其特征在于，它们分别能与肿瘤新生血管内皮细胞表面高效表达的整合素αvβ3以及氨肽酶N(CD13)结合。采用分步基因克隆，构建肿瘤新生血管特异性结合多肽与IFN-α2a和IFN-α2b的融合基因，并在大肠杆菌中获得高效表达。
2.实现如权利要求1所述的肿瘤新生血管特异性结合多肽与人α干扰素融合蛋白(IFNα2a-NGR、IFNα2a-RGD、IFNα2b-NGR和IFNα2b-RGD；以下以IFNα2a-NGR融合蛋白为例)的制备方法，其特征在于，按以下步骤进行1)分步克隆，重组质粒pGEM-3zf(-)-IFNα2a-NGR的构建①NGR导向肽基因的克隆编码NGR的寡核苷酸片段的设计如下，在这对寡核苷酸片段的5’端引入了BamHI酶切位点，3’端引入了XbaI酶切位点S1(48nt) 5’-GAT CCT GCA ACG GTC GTT GCG TGA GCG GTT GCG CGG GTC GTT GCT AGT-3’S2(48nt) 5’-CTA GAC TAG CAA CGA CCC GCG CAA CCG CTC ACG CAA CGA CCG TTG CAG-3’取等量S1和S2，煮沸5分钟，自然冷却至室温，进行退火。克隆载体pGEM-3Zf(-)经BamHI和XbaI双酶切并回收大片段；NGR的退火产物与载体酶切后回收的大片段经T4连接酶进行连接反应；连接产物转化感受态细胞DH5α，挑取单克隆培养过夜，提取质粒，经酶切鉴定，获得预期大小的插入片段，进行测序；测序正确的质粒命名为pGEM-3Zf(-)-NGR②IFNα2a与NGR导向肽融合基因克隆载体的构建PCR反应引物设计如下，将EcoRI酶切位点引入5’端引物，BamHI酶切位点引入3’端引物P1(5’端引物29nt) 5’-CGG AAT TCA TGT GTG ATC TGC CTC AAA CC-3’P2(3’端引物58nt) 5’-CGG GAT CCT TCC TTA CTT CTT AAA CTT TCT TGC AAG TTT GTT GACAAA GAA AAA GAT C-3’对pBV888-IFNα2a质粒按下述条件进行PCR扩增；PCR扩增反应管的配制均在冰浴中进行，配制过程中，先加水，模板DNA及其他反应组分，95℃反应5min，再加入Taq酶，然后进行PCR反应，PCR扩增的循环参数为94℃，60s(变性)；60℃，60s(退火)；72℃，60s(扩增)，进行30个循环，再于72℃延伸15min；PCR产物行0.8％琼脂糖凝胶电泳，可见预期大小的DNA片段；质粒pGEM-3Zf(-)-NGR经EcoRI和BamHI双酶切后回收大片段，回收的片段与上述的PCR产物经同样双酶切的回收产物进行连接反应。连接产物转化感受态细胞DH5α，挑取单克隆培养过夜，提取质粒，经酶切鉴定获得预期大小的插入片段，进行测序，测序正确的质粒命名为pGEM-3Zf(-)-IFNα2a-NGR；2)原核表达载体的构建及重组蛋白表达质粒pGEM-3Zf(-)-IFNα2a-NGR经EcoRI和PstI双酶切后回收小片段，原核非融合表达载体pBV220也经上述同样的双酶切后回收大片段，两者进行连接反应。连接产物转化感受态细胞DH5α，挑取单克隆培养过夜，提取质粒，经酶切鉴定正确的质粒命名为pBV220-IFNα2a-NGR。将含有重组质粒pBV220-IFNα2a-NGR的大肠杆菌DH5α于30℃于LB培养基中活化振摇培养过夜，次日清晨，按1∶100的比例接种于LB培养基中后，继续30℃培养3h至对数生长后期，OD650nm＝0.4时，迅速升温至42℃，培养4.5h，收集菌体；经7M盐酸胍裂解，生理盐水透析后，收集上清；3)表达产物的鉴定由于干扰素在原核表达载体中的表达量普遍较低，约为1-2％，对表达产物行SDS-PAGE无法辨认新生条带，但是表达产物具有较高的体外杀伤活性，所以，对表达产物的鉴定采用国际通用WISH-VSV系统细胞病变法检测其抗病毒活性；同时，对纯化产物的体外活性检测也参照WISH-VSV系统细胞病变法进行，步骤如下①WISH细胞在含抗生素和谷氨酰胺的10％FSC，pH7.4的Eagle’s培养液中37℃培养；②待细胞呈单层生长后，消化传代继续培养；将消化的WISH细胞，按1,000个细胞/孔接种于96孔板；③37℃孵箱培养过夜；换入用含5％FCS的Eagle’s液稀释的不同浓度的IFN裂菌上清，继续培养，次日用含2％FCS的Eagle’s培养液按1∶10-30稀释的VSV病毒培养液，换入细胞培养板，37℃培养24h，观察结果，以50％细胞保护的IFN稀释度为IFN效价；4)重组蛋白的纯化按1克菌体加5ml裂菌缓冲液的比例将菌体重悬，冰浴下搅拌4h，生理盐水透析12h-24h后，4℃条件下离心，12,000rpm，15min，收集上清液，0.01N HCl(pH2.5)酸化蛋白液2h；用50倍溶液体积的A液25mM Tris·Cl(pH7.5)透析18h，中间换液一次，透析后的上清液用A液充分平衡的DEAE-Sepharose Fast Flow层析纯化，洗脱B液为0.3M NaCl，25mMTris·Cl(pH7.5)，连续梯度洗脱10个柱床体积，收集各个洗脱峰，测定活性；取活性峰对50倍体积的C液5Mm NaAc·Ac(pH4.5)透析过夜，中间换掖一次，透析后上清用C液充分平衡的SP-Sepharose Fast Flow层析纯化，洗脱D液为0.4M NaAc·Ac，连续梯度洗脱10个柱床体积，收集各个洗脱峰，测定活性；取活性峰对50倍体积的E液25mM PBS(pH8.0)透析过夜，中间换液一次，透析后的上清用E液充分平衡的亲和色谱层析柱层析纯化，洗脱F液为0.1M甘氨酸(pH2.5)，连续梯度洗脱5个柱床体积，收集洗脱液，进行活性测定和SDS-PAGE检测。
3.如权利要求2所述的肿瘤新生血管特异性结合多肽与人α干扰素融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述PCR扩增反应管组成为pBV888-IFNα2a(模板DNA，200ng/ml) 0.5μl2.5mM dNTPs1μl25mM MgCl2 4μlP1(20μM) 0.5μlP2(20μM) 0.5μlTaq酶(5.0U/μl)0.5μl10×PCR Buffer 5μlH2O38μl总计 50μl
全文摘要
本发明公开了肿瘤新生血管特异性结合多肽与人α干扰素融合蛋白及制备方法，肿瘤新生血管特异性结合多肽－CDCRGDCFC－(半胱氨酸－天门冬氨酸－半胱氨酸－精氨酸－甘氨酸－天门冬氨酸－半胱氨酸－苯丙氨酸－半胱氨酸)和－CNGRCVSGCAGRC－(－半胱氨酸－天门冬酰氨－甘氨酸－精氨酸－半胱氨酸－缬氨酸－丝氨酸－甘氨酸－半胱氨酸－丙氨酸－甘氨酸－精氨酸－半胱氨酸－)分别能与肿瘤新生血管内皮细胞表面高效表达的整合素αvβ3以及氨肽酶N(CD13)结合。采用分步克隆，构建肿瘤新生血管特异性结合多肽与IFN－α2a和IFN－α2b的融合基因，并在大肠杆菌中获得高效表达。通过多肽与其新生血管处的受体结合，使IFN－α2a和IFN－α2b在肿瘤组织的新生血管处富集，发挥抗肿瘤和抑制肿瘤血管形成的作用。
文档编号C12P21/02GK1429846SQ0213953
公开日2003年7月16日 申请日期2002年11月21日 优先权日2002年11月21日
发明者张英起, 孟洁如, 颜真, 赵宁, 李波 申请人:中国人民解放军第四军医大学