专利名称：外消旋奥硝唑的酶法拆分方法
技术领域：
本发明涉及一种从奥硝唑的消旋体利用酶法拆分制备光学纯的(S)-(-)-奥硝唑或/和(R)-(+)-奥硝唑的方法。进一步说是一种使奥硝唑的消旋体在手性合成脂肪酶的作用下和醋酸乙烯酯反应生成(S)-(-)-奥硝唑的醋酸酯，纯化该酯，水解转化为光学纯的(S)-(-)-奥硝唑，(R)-(+)-奥硝唑因为没有反应，可通过纯化母液得到；或者先将奥硝唑的消旋体制备成醋酸酯，使醋酸酯在手性合成脂肪酶的作用下进行选择性水解得到光学纯的(S)-(-)-奥硝唑，而(R)-(+)-奥硝唑则仍以醋酸酯的形式存在，该醋酸酯水解转化为光学纯的(R)-(+)-奥硝唑。
背景技术：
奥硝唑是一新型的5-硝基咪唑类抗生素，具有很好的抗毛滴虫、阿米巴虫、贾第虫、厌氧菌感染的活性，目前市场上销售和临床应用的是其消旋体。
关于(S)-(-)-奥硝唑和(R)-(+)-奥硝唑的药理活性差异的文章未见有报道，只是有一篇文献(Bone，W.，et al，Int.J.Andrology，1997，20，347)提到它们的副作用没有明显差异。
制备奥硝唑光学对映体的报道很少，只有Skupin，R.等(Skupin，R.，et al，TetrahedronAsymmetry，1997，8，2453)利用手性合成脂肪酶PS(Lipase PS)不对称成酯获得某一光学对映体。
发明内容
本发明的目的就是提供一种从奥硝唑的消旋体利用酶法拆分制备光学纯的(S)-(-)-奥硝唑和(R)-(+)-奥硝唑的方法。
本发明的方法是使奥硝唑的消旋体在手性合成脂肪酶的作用下和醋酸乙烯酯反应生成(S)-(-)-奥硝唑的醋酸酯，纯化该酯，水解转化为光学纯的(S)-(-)-奥硝唑，(R)-(+)-奥硝唑因为没有反应，可通过纯化母液得到；或者先将奥硝唑的消旋体制备成醋酸酯，使醋酸酯在手性合成脂肪酶的作用下进行选择性水解得到光学纯的(S)-(-)-奥硝唑，而(R)-(+)-奥硝唑则仍以醋酸酯的形式存在，该醋酸酯水解转化为光学纯的(R)-(+)-奥硝唑。
本发明的方法是将奥硝唑的消旋体溶于醋酸乙烯酯中，加入手性合成脂肪酶，10～50℃反应1～40天，推荐反应温度为25～35℃，反应时间以检测为准。所述的奥硝唑的消旋体与醋酸乙烯酯摩尔比是1∶1～100，因为醋酸乙烯酯在本发明中可以作为溶剂，所以采用更多的醋酸乙烯酯对本发明的结果没有影响。所述的奥硝唑的消旋体与手性合成脂肪酶的重量比为1∶0.1～10，推荐重量比为1∶0.5-2。
反应毕，滤去手性合成脂肪酶，反应液浓缩至干，柱层析分离得光学纯的(S)-(-)-奥硝唑醋酸酯和(R)-(+)-奥硝唑。
(S)-(-)-奥硝唑醋酸酯用无机酸或其水溶液水解，反应结束后，加碱性溶液中和，非水溶性有机溶剂萃取，即可获得光学纯的(S)-(-)-奥硝唑。
上述(S)-(-)-奥硝唑醋酸酯、(S)-(-)-奥硝唑或(R)-(+)-奥硝唑的光学纯度若达不到要求，可在有机溶剂中进行多次重结晶至达到要求为止。
光学纯度达不到要求的(S)-(-)-奥硝唑(含少量(R)-(+)-奥硝唑)也可再与醋酸乙烯酯按照上述方法重复反应制备(S)-(-)-奥硝唑醋酸酯，柱层析分离除去少量的(R)-(+)-奥硝唑，再将制得的(S)-(-)-奥硝唑醋酸酯水解，得光学纯的(S)-(-)-奥硝唑。
光学纯度达不到要求的(R)-(+)-奥硝唑(含少量(S)-(-)-奥硝唑)也可再与醋酸乙烯酯按照上述方法重复反应，使残留的少量(S)-(-)-奥硝唑生成醋酸酯，柱层析分离除去少量的(S)-(-)-奥硝唑醋酸酯，得光学纯的(R)-(+)-奥硝唑。
本发明的方法还可以先将奥硝唑的消旋体用文献(Skupin，R.，et al，TetrahedronAsymmetry，1997，8，2453)所述方法制备成醋酸酯，也可以将奥硝唑的消旋体与乙酰氯反应制备成醋酸酯，也可以加入少量含氮化合物，如吡啶、六氢吡啶、三乙胺等作为催化剂。
奥硝唑消旋体的醋酸酯和手性合成脂肪酶在磷酸缓冲液(pH＝5.0～9.0)中，10～50℃反应1～40天，推荐反应温度为25～35℃，反应时间以检测为准。所述的奥硝唑消旋体的醋酸酯与手性合成脂肪酶的重量比为1∶0.1～10，推荐重量比为1∶0.5-2。
反应毕，加入非水溶性有机溶剂萃取，滤去手性合成脂肪酶，合并萃取液，减压浓缩至干，柱层析分离得光学纯的(S)-(-)-奥硝唑和(R)-(+)-奥硝唑醋酸酯。(R)-(+)-奥硝唑醋酸酯在酸性条件下水解，得光学纯的(R)-(+)-奥硝唑。
上述(S)-(-)-奥硝唑、(R)-(+)-奥硝唑醋酸酯或(R)-(+)-奥硝唑的光学纯度若达不到要求，可在有机溶剂中进行多次重结晶至达到要求为止。
光学纯度达不到要求的(S)-(-)-奥硝唑(含少量(R)-(+)-奥硝唑)可先用常规方法制备成醋酸酯，将制得的(S)-(-)-奥硝唑醋酸酯按照上述方法再次反应，柱层析分离除去未反应的少量(R)-(+)-奥硝唑醋酸酯，得光学纯的(S)-(-)-奥硝唑。
光学纯度达不到要求的(R)-(+)-奥硝唑醋酸酯(含少量(S)-(-)-奥硝唑醋酸酯)可按照上述方法再次反应，柱层析分离除去已反应的少量(S)-(-)-奥硝唑，将未反应的(R)-(+)-奥硝唑醋酸酯水解，得光学纯的(R)-(+)-奥硝唑。
所述手性合成脂肪酶包括脂肪酶AK(Lipase AK，fromPseudomonas fluorescens)、脂肪酶AYS(Lipase AYS，from Candida rugosa)、脂肪酶AS(Lipase AS，from Aspergillus niger)、脂肪酶PS-C(Lipase PS-C，fromPseudomonas cepacia)、脂肪酶PS-D(Lipase PS-D，from Pseudomonas cepacia)、猪胰脂肪酶(Porcine Pancreas Lipase，PPL)、脂肪酶A(Lipase A，from Aspergillusniger)、脂肪酶F-AP15(Lipase F-AP15，from Rhizopus oryzae)、脂肪酶G(Lipase G，from Penicillium camemberti)、脂肪酶M(Lipase M，from Mucor javanicus)、脂肪酶PS-C I(Lipase PS-C I，固定在陶瓷上)、脂肪酶PS-C II(Lipase PS-C II，固定在陶瓷上)、脂肪酶PS-D I(Lipase PS-D I，固定在陶瓷上)和脂肪酶CAL(Candidaantarctica Lipase，Novozym 435)，推荐为脂肪酶AK。
所述无机酸可以是硫酸、盐酸、磷酸等，推荐为浓盐酸；所述碱可以是碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、浓氨水、氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液等，推荐用浓氨水；所述非水溶性有机溶剂可以是氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚等，推荐为乙酸乙酯。
所述手性合成脂肪酶和醋酸乙烯酯可回收使用。
具体实施例方式
通过下述实施例将有助于理解本发明，但并不限制本发明的内容。
实施例1(S)-(-)-奥硝唑的制备奥硝唑13.2g，脂肪酶AK 7.0g，醋酸乙烯酯100ml，混合，28℃搅拌反应18天，HPLC检测反应进程。反应毕，滤去脂肪酶，乙酸乙酯洗涤，浓缩至干，得油状物。柱层析分离得淡黄色固体(S)-(-)-奥硝唑醋酸酯6.77g和淡黄色油状物(R)-(+)-奥硝唑6.9g。
上述所得(S)-(-)-奥硝唑醋酸酯用乙酸乙酯-石油醚重结晶两次得细针状近白色结晶5.5g([α]D20＝-69.3°(c＝1.01，CH2Cl2))，ee值为0.95。将该结晶溶于50ml浓盐酸中，室温搅拌18小时水解，用浓氨水中和，乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯萃取液，水洗，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩至干得油状物，约0℃放置固化得淡黄色固体4.1g，用乙酸乙酯-石油醚重结晶两次得(S)-(-)-奥硝唑短棱柱状晶体2.88g([α]D20＝-66.7°(c＝0.99，CH2Cl2))，ee值为0.99，收率为43.6％(基于(S)-对映体)。
实施例2(R)-(+)-奥硝唑的制备实施例1所得(R)-(+)-奥硝唑6.9g用乙酸乙酯-石油醚(1∶1)重结晶三次得白色棱柱状晶体3.9g([α]D20＝+65.3°(c＝1.08，CH2Cl2))，ee值为0.99，收率为59.1％(基于(R)-对映体)。
实施例3(S)-(-)-奥硝唑的制备按实施例1方法，奥硝唑11.4g，脂肪酶PS-C 7.0g，醋酸乙烯酯85ml，混合反应30天，得(S)-(-)-奥硝唑醋酸酯5.45g和(R)-(+)-奥硝唑6.15g。(S)-(-)-奥硝唑醋酸酯重结晶两次，水解，再重结晶两次得(S)-(-)-奥硝唑2.23g([α]D20＝-67.1°(c＝1.03，CH2Cl2))，ee值为0.99，收率为39.1％(基于(S)-对映体)。
实施例4(R)-(+)-奥硝唑的制备实施例3所得(R)-(+)-奥硝唑6.15g用乙酸乙酯-石油醚(1∶1)重结晶四次得白色棱柱状晶体2.85g([α]D20＝+64.9°(c＝0.99，CH2Cl2))，ee值为0.99，收率为50.0％(基于(R)-对映体)。
实施例5(S)-(-)-奥硝唑的制备按实施例1方法，奥硝唑12.5g，猪胰脂肪酶6.5g，醋酸乙烯酯100ml，混合反应30天，得(S)-(-)-奥硝唑醋酸酯3.12g和(R)-(+)-奥硝唑9.18g(含少量(S)-(-)-奥硝唑)。(S)-(-)-奥硝唑醋酸酯重结晶两次，水解，再重结晶两次得(S)-(-)-奥硝唑1.29g([α]D20＝-66.8°(c＝1.00，CH2Cl2))，ee值为0.99，收率为20.6％(基于(S)-对映体)。
实施例6(R)-(+)-奥硝唑的制备实施例5所得(R)-(+)-奥硝唑9.18g用乙酸乙酯-石油醚(1∶1)重结晶四次得白色棱柱状晶体4.41g([α]D20＝+34.2°(c＝1.05，CH2Cl2))，ee值为0.53，收率为70.6％(基于(R)-对映体)。
实施例7(S)-(-)-奥硝唑的制备按实施例1方法，奥硝唑11.4g，脂肪酶AK 6.4g，醋酸乙烯酯85ml，混合，28℃搅拌反应18天。反应毕，滤去脂肪酶，乙酸乙酯洗涤，浓缩至干，得油状物。柱层析分离得(S)-(-)-奥硝唑醋酸酯5.71g和(R)-(+)-奥硝唑5.83g。
上述所得(S)-(-)-奥硝唑醋酸酯5.71g用浓盐酸水解得(S)-(-)-奥硝唑4.49g，以35ml醋酸乙烯酯溶解，加入脂肪酶AK 2.8g，重复上述操作，得(S)-(-)-奥硝唑醋酸酯4.45g，水解，乙酸乙酯-石油醚重结晶得(S)-(-)-奥硝唑3.05g([α]D20＝-67.5°(c＝0.97，CH2Cl2))，ee值为0.99，收率为53.5％(基于(S)-对映体)。
实施例8(R)-(+)-奥硝唑的制备实施例7所得(R)-(+)-奥硝唑5.83g，以45ml醋酸乙烯酯溶解，加入脂肪酶AK 3.3g，混合反应18天，柱层析分离得(R)-(+)-奥硝唑4.42g，乙酸乙酯-石油醚重结晶得(R)-(+)-奥硝唑3.72g([α]D20＝+64.7°(c＝1.02，CH2Cl2))，ee值为0.99，收率为65.3％(基于(R)-对映体)。
实施例9消旋的奥硝唑醋酸酯的制备10.98g奥硝唑的消旋体，37.8ml醋酐，4ml吡啶，室温混合搅拌1小时。加入100ml冰水，白色固体析出，冰水洗涤，过滤干燥得11.9g近白色固体，用乙酸乙酯重结晶得消旋的奥硝唑醋酸酯9.3g，收率为70.8％。
实施例10(S)-(-)-奥硝唑的制备奥硝唑醋酸酯5.76g，脂肪酶AK 5.0g，1M磷酸缓冲液(pH＝7)400ml，混合，28℃搅拌反应20天，HPLC检测反应进程。反应毕，加入400ml乙酸乙酯，搅拌，滤去脂肪酶，水相再用乙酸乙酯萃两次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干，柱层析分离得(S)-(-)-奥硝唑1.84g和(R)-(+)-奥硝唑醋酸酯3.16g。
上述所得(S)-(-)-奥硝唑用乙酸乙酯-石油醚重结晶三次，得(S)-(-)-奥硝唑棱柱状晶体1.13g([α]D20＝-66.9°(c＝1.10，CH2Cl2))，ee值为0.99，收率为46.9％(基于(S)-对映体)。
实施例11(R)-(+)-奥硝唑的制备实施例10所得(R)-(+)-奥硝唑醋酸酯3.16g，按实施例1方法，重结晶两次，水解，再重结晶两次得(R)-(+)-奥硝唑1.23g([α]D20＝+65.3°(c＝0.99，CH2Cl2))，ee值为0.99，收率为51.1％(基于(R)-对映体)。
实施例12(S)-(-)-奥硝唑的制备按实施例10方法，奥硝唑醋酸酯5.36g，猪胰脂肪酶3.2g，1M磷酸缓冲液(pH＝7)400ml，混合反应30天，得(S)-(-)-奥硝唑1.63g和(R)-(+)-奥硝唑醋酸酯3.04g。
上述所得(S)-(-)-奥硝唑用乙酸乙酯-石油醚重结晶三次，得(S)-(-)-奥硝唑棱柱状晶体1.02g([α]D20＝-67.2°(c＝1.03，CH2Cl2))，ee值为0.99，收率为45.5％(基于(S)-对映体)。
实施例13(R)-(+)-奥硝唑的制备实施例12所得(R)-(+)-奥硝唑醋酸酯3.04g，按实施例1方法，重结晶三次，水解，再重结晶两次得(R)-(+)-奥硝唑0.99g([α]D20＝+65.1°(c＝1.01，CH2Cl2))，ee值为0.99，收率为44.2％(基于(R)-对映体)。
实施例14(S)-(-)-奥硝唑的制备按实施例10方法，奥硝唑醋酸酯5.23g，脂肪酶AK 2.8g，1M磷酸缓冲液(pH＝7)400ml，混合反应20天，得(S)-(-)-奥硝唑1.67g和(R)-(+)-奥硝唑醋酸酯2.69g。
上述所得(S)-(-)-奥硝唑1.67g按实施例9方法制得(S)-(-)-奥硝唑醋酸酯1.43g，加入1M磷酸缓冲液(pH＝7)100ml和脂肪酶AK 0.8g，重复上述操作，得(S)-(-)-奥硝唑0.92g，乙酸乙酯-石油醚重结晶得(S)-(-)-奥硝唑0.82g([α]D20＝-66.3°(c＝0.98，CH2Cl2))，ee值为0.99，收率为37.5％(基于(S)-对映体)。
实施例15(R)-(+)-奥硝唑的制备实施例14所得(R)-(+)-奥硝唑醋酸酯2.69g，脂肪酶AK 1.6g，1M磷酸缓冲液(pH＝7)200ml，混合反应20天，反应产物柱层析分离得(R)-(+)-奥硝唑2.23g，水解，乙酸乙酯-石油醚重结晶得(R)-(+)-奥硝唑1.49g([α]D20＝+65.0°(c＝1.04，CH2Cl2))，ee值为0.99，收率为68.1％(基于(R)-对映体)。
实施例16(S)-(-)-奥硝唑的制备按实施例1方法，奥硝唑11.9g，回收的脂肪酶AK6.3g，回收的醋酸乙烯酯90ml，混合反应18天，得(S)-(-)-奥硝唑醋酸酯5.97g和(R)-(+)-奥硝唑6.13g。(R)-(-)-噻克硝唑醋酸酯重结晶两次，水解，再重结晶两次得(S)-(-)-奥硝唑2.42g([α]D20＝-66.6°(c＝1.04，CH2Cl2))，ee值为0.99，收率为40.7％(基于(S)-对映体)。
以上实施例中的ee值均为HPLC法(高压液相法测得。
权利要求
1.一种从奥硝唑或其醋酸酯的消旋体制备光学纯的(S)-(-)-奥硝唑或/和(R)-(+)-奥硝唑的方法，其特征是通过下述(1)，(1)和(2)，(3)，或(3)和(4)四种方法分别制得(1).奥硝唑的消旋体溶于醋酸乙烯酯中，加入手性合成脂肪酶，10～50℃反应1～40天，滤去手性合成脂肪酶，浓缩，柱层析分离得光学纯的(S)-(-)-奥硝唑醋酸酯和(R)-(+)-奥硝唑，所述的奥硝唑的消旋体与手性合成脂肪酶的重量比为1∶0.1～10；(2).上述光学纯的(S)-(-)-奥硝唑醋酸酯用无机酸或其水溶液水解，反应后，加碱性溶液中和，非水溶性有机溶剂萃取，即可获得光学纯的(S)-(-)-奥硝唑；(3).奥硝唑消旋体的醋酸酯和手性合成脂肪酶在pH＝5.0～9.0的磷酸缓冲液中，在10～50℃反应1～40天，再加入非水溶性有机溶剂萃取，滤去手性合成脂肪酶，合并萃取液，浓缩，柱层析分离得光学纯的(S)-(-)-奥硝唑和(R)-(+)-奥硝唑醋酸酯；(4).上述光学纯的(R)-(+)-奥硝唑醋酸酯用无机酸或其水溶液水解，反应结束后，加碱性溶液中和，非水溶性有机溶剂萃取，即可获得光学纯的(R)-(+)-奥硝唑。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征是所述的手性合成脂肪酶包括脂肪酶AK、脂肪酶AYS、脂肪酶AS、脂肪酶PS-C、脂肪酶PS-D、猪胰脂肪酶、脂肪酶A、脂肪酶F-AP15、脂肪酶G、脂肪酶M、脂肪酶PS-CI、脂肪酶PS-CII、脂肪酶PS-DI和脂肪酶CAL。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征是所述的(S)-(-)-奥硝唑、(S)-(-)-奥硝唑醋酸酯、(R)-(+)-奥硝唑或(R)-(+)-奥硝唑醋酸酯经过重结晶。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征是方法(1)和(2)所述的(S)-(-)-奥硝唑再与醋酸乙烯酯按照(1)和(2)相同的方法重复操作，进一步纯化(S)-(-)-奥硝唑。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征是方法(1)所述的(R)-(+)-奥硝唑再与醋酸乙烯酯按照(1)相同的方法重复操作，进一步纯化(R)-(+)-奥硝唑。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征是方法(3)所述的(S)-(-)-奥硝唑制备成醋酸酯，再按照(3)相同的方法重复操作，进一步纯化(S)-(-)-奥硝唑。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征是方法(3)和(4)所述的(R)-(+)-奥硝唑醋酸酯再按照(3)和(4)相同方法重复操作，进一步纯化(R)-(+)-奥硝唑。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征是所述的无机酸是硫酸、盐酸、磷酸。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征是所述的碱是一价金属的碳酸盐、碳酸氢盐、氢氧化物及其水溶液或氨水。
10.如权利要求1所述的制备方法，其特征是采用回收所得的手性合成脂肪酶和醋酸乙烯酯。
全文摘要
本发明是一种从奥硝唑的消旋体利用酶法拆分制备光学纯的(S)－(－)－奥硝唑或/和(R)－(+)－奥硝唑的方法。即使奥硝唑的消旋体在手性合成脂肪酶的作用下和醋酸乙烯酯反应生成(S)－(－)－奥硝唑的醋酸酯，纯化该酯，水解转化为光学纯的(S)－(－)－奥硝唑，(R)－(+)－奥硝唑因为不反应，可通过纯化母液得到；或者先将奥硝唑的消旋体制备成醋酸酯，使醋酸酯在手性合成脂肪酶的作用下进行选择性水解得到光学纯的(S)－(－)－奥硝唑，而(R)－(+)－奥硝唑则仍以醋酸酯的形式存在，该醋酸酯水解转化为光学纯的(R)－(+)－奥硝唑。
文档编号C12P17/10GK1400312SQ0213662
公开日2003年3月5日 申请日期2002年8月23日 优先权日2002年8月23日
发明者林国强, 彭家仕, 骆宏丰, 田平 申请人:中国科学院上海有机化学研究所