专利名称：一种甲、乙型流感病毒的快速检测方法及试剂盒的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种甲、乙型流感病毒的快速检测方法及试剂盒，属于流感监测领域。
基于上述原因，目前建立了许多快速检测法间接或直接免疫荧光法；ELISA；RT-PCR法；新神经氨酸酶测定法；Diretigen FLU-A KIT和FLU OIA KIT等。这些方法的敏感性和特异性在检测过程中随着实验室、工作人员、操作方法和标本的不同而异，同时需要一定的特殊设备，价格昂贵，指示系统多采用免疫荧光标记或酶标记，操作复杂，基层单位难以开展。上述所提到的新神经氨酸酶测定法，Diretigen FLU-A KIT和FLU OIA KIT虽然能在30分钟内得出结果，但其敏感性很低，在采集的标本中病毒含量需要达到1000～2000个融斑形成单位或至少含有20个或以上呼吸道脱落细胞方可测出阳性的结果，并且无法获得活病毒。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案本发明的原理是(1)流感病毒与红细胞相互作用甲、乙型流感病毒在较高温度下，依靠其血凝素蛋白很快吸附到红细胞表面，同时又可通过其表面的神经氨酸酶蛋白迅速地从吸附的红细胞表面游离下来，再去吸附其他的红细胞，而被吸附过的红细胞由于其表面受体受到了损伤，不再被同种病毒所吸附。
(2)花生凝集素(Arachis Lectin or Peanut Agglutinin，简称PNA)与细胞结合的特异性正常宿主细胞及人、豚鼠和鸡红细胞表面受体为含有神经氨酸的糖蛋白或糖脂，PNA不与之作用；但是当这些细胞被神经氨酸酶作用后，细胞表面受体上的神经氨酸就被游离下来，因而就能够被PNA识别并聚集。这种聚集现象通过普通光学显微镜就可清楚地观察到，并根据结果作出判断。
一种甲、乙型流感病毒的快速检测方法，该方法包括下列步骤(一)接种用pH7.5±0.1的Hank’s液洗涤长成单层的MDCK细胞两遍，加入标本接种液，置33～35℃，CO2孵箱吸附1～3小时；(二)培养吸掉接种液，用相同的Hank’s液洗涤三遍，以将残余的唾液酸酶洗净、防止其与红细胞作用；加入维持液和红细胞，轻轻摇匀，置33～35℃，CO2孵箱孵育16～18小时；(三)检测加入工作浓度的PNA混匀，再置33～35℃，CO2孵箱孵育1～3小时，取出，轻摇，将与MDCK细胞不发生聚集的红细胞摇起，然后在普通光学显微镜下观察结果。
一种用于检测甲、乙型流感病毒的快速检测试剂盒，该试剂盒包括下列溶液A液洗涤液，即pH7.5±0.1的Hank’s液；B液pH7.5±0.1的Eagle溶液；C液胰蛋白酶；D液花生凝集素(PNA)。作为原料的PNA可购得或自行制备。
该试剂盒还包括E液1％豚鼠或人的红细胞(A、B、AB、O型均可)，此液也可由使用者自行配制。
本发明的优点是适用性广、灵敏度高、指示系统简易且清晰、能够获得活病毒、可排除副流感病毒的干扰、可防止口、咽、鼻中唾液酸酶对测定的影响，便于基层单位开展工作。
(2)提取将干燥物移入500ml三角烧瓶中，放入一个磁力棒，加入pH7.4，0.1M PBS 500ml，置搅拌器上搅拌3～4小时，停机让其自然沉淀20～30分钟，吸出上清置4℃保存。按同法再重复3次。
(3)过滤于干净的漏斗颈部松松地置入一条脱脂棉，将收集到的上清通过脱脂棉进行过滤。如遇到不易过滤时，可从漏斗中取出上清，将用过的脱脂棉取出，换新漏斗按同法过滤或将漏斗冲洗干净，放入新的脱脂棉，然后再放入上清进行过滤。
(4)加防腐剂于滤液中加入终浓度为0.5‰的叠氮钠(NaN3)，混匀，置4℃保存。实施例2、PNA工作浓度的确定在MDCK细胞上进行方阵测定，选一株当时在人群中流行的甲1(H1N1)或甲3(H3N2)亚型毒株，将其稀释成10-1～10-8，与不同浓度(1∶20～1∶640)PNA进行方阵测定，在24小时内，最低浓度的PNA能测出最高稀释度病毒神经氨酸酶活性者为PNA的工作浓度。实施例3、红细胞终浓度的测定新鲜采集的豚鼠红细胞，用Eagle’s液，先配成1％，然后用前用同样溶液进行倍比稀释，对6株病毒分两批进行测定TCID50值，每株均测定两次，两次的平均值列于表1。表1病毒红细胞终浓度/ml1‰ 0.5‰ 0.25‰ 0.125‰A/CNIC/143/2001(H1N1)6.56.56.05.5A/CNIC/123/2001(H3N2)5.55.55.03.5B/Shandong/1/20025.55.54.53.5B/Sichuan/63/20013.53.53.5＜2.0A/Guangzhou/333/99(H9N2) 4.54.54.53.5A/Hongkong/156/97(H5N1) 4.53.53.03.0正常鸡胚尿囊液 ＜1.0 ＜1.0 ＜1.0 ＜1.0
由实验结果得到测定中最佳红细胞终浓度为1‰。实施例4、不同种类红细胞对测定敏感性的影响同一时间，在同一条件下采集豚鼠，人A型、B型、O型和AB型红细胞，立即按同法，在同一条件下配制1％，而测定病毒分三批进行测定，每株病毒测两次，然后算出其平均值的TCID50。
测定结果指出不同红细胞间见不到有差异，它们的TCID50按表1列出毒株从上到下顺序为6.5，5.5，4.5，2.5，4.5和5.5。对正常鸡胚尿囊液进行同样的测定，TCID50均为＜1.0，表明不发生任何特异性聚集。实施例5、本法与常规法的敏感性和特异性的比较1、用已知病毒进行比较病毒按Lg稀释，按上述方法接种、吸附、洗涤，然后分成两组，实验组(本法)和对照组(常规法)，同样进行两次重复测定，算出24h内观察结果平均的TCID50。结果见表2，括号外为CPE值，括号内为HA值。表2病毒 测定方法 相差Lg常规法 本法A/CNIC/143/2001(H1N1) 2.5(2.5)7.0 4.5A/CNIC/123/2001(H3N2) ＜2.0(＜2.0)5.5 ≥3.5B/Shandong/1/2002 ＜2.0(＜2.0)4.5 ≥2.5B/Sichuan/63/2001 ＜2.0(＜2.0)4.0 ≥2.0A/Guangzhou/333/99(H9N2) ＜2.0(＜2.0)4.5 ≥2.5A/Hongkong/156/97(H5N1) 2.5(2.5)5.5 3.0Para influenza I ＜1.0(＜1.0)＜1.0Para influenza II ＜1.0(＜1.0)＜1.0Para influenza III＜1.0(＜1.0)＜1.0表2结果指出，本法比常规法至少敏感100倍以上，最多可达30000倍以上。同时清楚表明本法测不出副流感病毒I-III型神经氨酸酶活性的存在，从而证明本法可以排除副流感病毒的干扰。2、对未知标本进行比较共比较79份从流感样患者采集的标本，本法与常规法共分离到阳性标本40份，阳性率达51％，其中甲3亚型17份，甲1亚型15份，乙型8份，而且两者标本号也相符，即两者符合率达100％。实施例6、用本发明方法在24孔板中进行检测长成单层的MDCK细胞，用pH7.4的Hank’s液洗3遍，标明每孔接种标本的名称和号码，每标本可接种1～2孔，0.5ml/孔，置33～35℃，CO2孵箱吸附2小时。吸掉接种液，再用相同的Hank’s液洗3遍，每孔加入0.9ml维持液(不含小牛血清，但含有终浓度为2.5μg/ml胰酶，1‰红细胞(人或豚鼠的)，pH7.5～7.6的Eagle’s液)，轻轻摇匀，置33～35℃，CO2孵箱16~18小时，取出，每孔加入0.1ml工作浓度的PNA，混匀，再置33～35℃，CO2孵箱孵育2小时，取出，轻轻摇晃，将与MDCK细胞不发生聚集的红细胞摇起，然后在普通光学低倍显微镜下观察凡在MDCK细胞上能见到2个或2个以上典型的红细胞聚集块(像出血斑点)的可判为阳性；出现1个聚集块判为可疑，再继续孵育一天，如聚集块仅有一个并不扩大，可判为阴性；不出现任何聚集块的判为阴性。
为获得具有较高红细胞滴度的活病毒，可将显示为阳性的培养板再孵育1～2天，收集维持液，并可进行型或亚型鉴定，然后冻存之。
如实验室不具备CO2孵箱或细胞培养板，可用小方瓶或细胞管代替，具体方法同上。实施例7、快速检测试剂盒的使用方法一种甲、乙型流感病毒的快速检测试剂盒，该试剂盒由下列溶液构成A液洗涤液，即pH7.5±0.1的Hank’s液，(4℃保存)B液pH7.5±0.1的Eagle溶液，(4℃保存)；C液胰蛋白酶，(≤-20℃保存)；D液花生凝集素(PNA)，(4℃保存)；E液1％豚鼠或人的红细胞(A、B、AB、O型均可)，(4℃保存)。
C液胰蛋白酶的工作浓度为2.5μg/ml，可用其它浓度(如250μg/ml)的胰蛋白酶稀释到此工作浓度使用。
E液的配制方法(无菌操作)新鲜采集的红细胞，1500rpm，离心3分钟，弃上清，加入适量无菌生理盐水(约红细胞体积的5倍)，轻轻吹打混匀，1500rpm离心3分钟，弃上清，按同法再洗两遍。加入B液配制成1％浓度悬液，置4℃备用。
以24孔细胞板为例，介绍本发明试剂盒的使用方法1、孔中MDCK细胞已长成单层，倒掉生长液，加入A液，1ml/孔，轻轻摇动后，倒掉，按同法重复一次。
2、每孔标明接种标本名称，接种采集标本，0.5ml/孔。
3、接种后塑料板置33～35℃，CO2孵箱孵育2小时。
4、配制细胞维持液0.9ml/孔，为留有余地一般需配制24ml，取23.52mlB液，0.24mlC液和0.24mlE液，混匀。此比例适合于配制任何体积的细胞维持液。
5、吸出孵育后的接种液，加入A液，1ml/孔，轻轻摇动后，吸掉，按同法再重复两次。
6、将4中配制好的维持液再次摇匀，然后每孔加入0.9ml。
7、将细胞板放入33～35℃，CO2孵箱孵育16～18小时。
8、稀释D液把D液稀释成工作浓度，如当前试剂盒所提供的即1mlD液，加入9mlB液，充分混匀，用时配制。
9、从孵箱中取出培养板，每孔加入0.1ml稀释的D液(原则上所加的容量为维持液的1/10)，轻轻摇匀。
10、放入33～35℃，CO2孵箱孵育2小时。
11、取出，轻轻摇动细胞板，使未发生聚集红细胞悬起，不致因堆积而影响结果的观察，置低倍(约100倍)显微镜下观察。
12、结果判断凡在低倍显微镜下能见到两个或两个以上清晰的红细胞聚集块的判断为阳性；一个为可疑，可置33～35℃，CO2孵箱再孵育一天，如果聚集块增多或明显扩大，判断为阳性，反之为阴性；其余情况为阴性。
本发明方法操作简便，不需特殊设备，只要能开展组织培养工作的单位均可加以使用；敏感性强，24小时内观察结果，它比常规法敏感100-10000倍以上；特异性强，其病毒分离情况与常规法符合率达100％；快速，在流感监测中，一般20小时内就可得出准确结果，节省了经费和鸡胚。
权利要求
1.一种甲、乙型流感病毒的快速检测方法，其特征在于该方法包括下列步骤(一)接种用pH7.5±0.1的Hank’s液洗涤长成单层的MDCK细胞，加入标本接种液，置33～35℃，CO2孵箱吸附1～3小时；(二)培养吸掉接种液，用相同的Hank’s液洗涤，加入维持液和红细胞，轻轻摇匀，置33～35℃，CO2孵箱孵育16～18小时；(三)检测加入工作浓度的PNA混匀，再置33～35℃，CO2孵箱孵育1～3小时，取出，轻摇，将与MDCK细胞不发生聚集的红细胞摇起，然后在普通光学显微镜下观察结果。
2.一种甲、乙型流感病毒的快速检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括下列溶液A液洗涤液，即pH7.5±0.1的Hank’s液；B液pH7.5±0.1的Eagle溶液；C液胰蛋白酶；D液花生凝集素(PNA)。
3.如权利要求2所述的一种甲、乙型流感病毒的快速检测试剂盒，其特征在于该试剂盒还包括E液1％豚鼠红细胞或人的红细胞。
4.如权利要求2或3所述的一种甲、乙型流感病毒的快速检测试剂盒，其特征在于C液胰蛋白酶的浓度为250μg/ml。
全文摘要
本发明公开了一种甲、乙型流感病毒的快速检测方法和试剂盒，该方法包括(一)接种用pH7.4的Hank’s液洗涤长成单层的MDCK细胞，加入接种液，置33～35℃，CO
文档编号C12Q1/04GK1464065SQ0212135
公开日2003年12月31日 申请日期2002年6月14日 优先权日2002年6月14日
发明者郭元吉, 温乐英, 王敏, 张烨, 郭俊峰, 李梓 申请人:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所