专利名称：豆科作物花型调控基因及应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属于生物技术和植物学领域，具体地说，本发明涉及新地源自大豆和豌豆的花型调控基因，以及编码的花型蛋白。这些花型调控基因参与了植物的花型发育调控过程。本发明还提供了利用这些花型调控基因改变豆科植物-花型的方法。
背景技术：
目前，杂种优势已在水稻、小麦、玉米、棉花、油菜等重要农作物及多种蔬菜作物中得到广泛利用，使其产量和品质都有了较大幅度的提高。大豆是人类重要的农作物之一，是重要的植物油、植物蛋白及蔬菜的来源。大豆和豆制品已成为举世公认的营养健康食品。2000年，我国大豆播种面积达800万公顷，居世界第三位，产量居世界第四位。经过十余年的努力，我国科学家已成功选育出了适合于我国大豆主要产区的雄性不育系材料，并使该项研究处于国际领先地位，这为大豆杂种优势利用提供了基础。大豆属豆科蝶形花亚科，是严格的自花授粉植物，其花型呈两侧对称，共有五枚花瓣，包括一枚背部花瓣(旗瓣)、两枚侧部花瓣(翼瓣)，两枚腹部花瓣(龙骨瓣)，其中龙骨瓣紧紧包裹住雄蕊和雌蕊。研究表明由于花瓣特殊结构引起的机械障碍是造成豆科异花传粉困难的主要原因，大豆在大田栽培情况下天然异花传粉率低于1％。大豆异花传粉困难严重制约了大豆杂种优势利用技术在生产上的应用，目前大豆杂种优势的利用仍为一个世界性的难题，提高异花传粉率已成为大豆杂种优势利用成败的关键。
近年来，一类影响植物三维形态模式建成的基因家族-TCP结构域基因，受到了人们的重视。TCP的命名来源于玉米中的Teosinte Branched 1(TB1)、金鱼草的Cycloidea(CYC)和水稻的PCF1/PCF2(Cubas P，Lauter N，Doebley J，Coen E.(1999)The TCP domaina motif found in proteins regulating plant growth anddevelopment.Plant J.18(2)，215-222.)。序列研究表明，TCP基因家族编码的TCP蛋白属于一类植物转录因子。TCP蛋白有一个非常保守的结构域，称为TCP结构域，其功能可能是与DNA的结合、蛋白与蛋白的相互作用相关。但至今没有生化功能研究的报道。
最早被克隆的TCP蛋白是金鱼草的CYC基因。金鱼草的花为两侧对称花，在金鱼草花发育中，其背腹模式的建立是非常重要的。当Cyc基因突变后，金鱼草的两侧对称花变成半反常对称花，而当另一个TCP基因Dich同时突变后，金鱼草的花变为辐射对称花(又称反常整齐花)，背腹模式建立机制被破坏(Luo D，Carpenter R，Copsey L，Vincent C，Clark J，Coen E.(1999)Control of organasymmetry in flowers of Antirrhinum.Cell.99(4)，367-376；Luo D，Carpenter R，Vincent C，Copsey L，Coen E.(1996)Origin of floral asymmetry in Antirrhinum.Nature.383(6603)，794-799.)。
TB1在玉米中则是控制株形的基因，当它突变后，无分蘖的玉米出现许多分蘖，TB1参与玉米侧生分生组织细胞活性的调控，在进化上起了重要的作用(Doebley，J.，Stec，A.O.and Hubbard，L.(1997)The evolution of apical dominance inmaize Nature 386(6624)，485-488)。
对花型有影响的TCP基因属于CYC/TB1亚家族，鉴于花型调控基因对于植物生长具有重要作用，因此本领域迫切需要开发与花型调控有关的各种基因及其表达产物。
发明内容
本发明的目的是提供一类新的、在花型花序调控过程中涉及的花型调控基因序列及其编码蛋白，以及它们片段、类似物和衍生物。
本发明的另一目的是提供生产这些花型调控蛋白及其编码序列的制法，及其在改变植物花型花序方面的用途。
在本发明的第一方面，提供了一种分离的多核苷酸，即花型调控基因，所述的多核苷酸调控花型且包含一核苷酸序列，该核苷酸序列编码选自下组
(a)SEQ ID NO1、3、5、7、9所示的核苷酸序列；
(b)编码SEQ ID NO6所示氨基酸序列的核苷酸序列；
(c)在序列(a)或(b)中有一个或多个核苷酸取代、缺失或插入而衍生的核苷酸序列，且该核苷酸序列仍具有调控花型的功能。
较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO2、4、6、8、或10所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸具有选自下组的序列(i)SEQ ID NO1中1-693位的序列；(ii)SEQ ID NO3中1-825位的序列；(iii)SEQ ID NO5中8-1183位的序列；(iv)SEQ ID NO7中1-606位的序列；(v)SEQ ID NO9中1-792位的序列。
在本发明的第二方面，提供了新颖的分离出的Socyc1A、Socyc1B、Socyc2、Pcyc1和Pcyc2多肽，它选自下组(a)含有SEQ ID NO2、4、6、8、或10氨基酸序列的多肽；(b)具有花型调控功能的，多肽(a)的保守性变异多肽、或活性片段、或活性衍生物；(c)在SEQ ID NO2、4、6、8、或10限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或插入一个或几个氨基酸所衍生的，且具有花型调控功能的蛋白。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO2、4、6、8、或10氨基酸序列的多肽。
在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。
在本发明的第四方面，提供了花型调控蛋白的制备方法，该方法包含(a)在适合表达花型调控蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出花型调控蛋白。
在本发明的第五方面，提供了与上述花型调控蛋白多肽特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续的15-1000个核苷酸。
在本发明的第六方面，提供了模拟、促进、拮抗本发明花型调控蛋白多肽活性的化合物，以及抑制本发明花型调控蛋白多肽的表达的化合物。还提供了筛选和/或制备这些化合物的方法。较佳地，该化合物是本发明花型调控蛋白多肽的编码序列或其片段的反义序列。
在本发明的第七方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途，它们被用于改变植物的花型花序。
在本发明的第八方面，提供了一种改变植物花型花序的方法，包括步骤(a)将本发明编码花型花序调控蛋白的多核苷酸转入植物细胞；(b)将步骤(a)中的植物细胞再生成植株。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1显示了大豆中TCP结构域基因与百脉根和金鱼草中相关同源基因之间部分序列比较。
图2显示了豌豆中TCP结构域基因与百脉根和金鱼草中相关同源基因之间部分序列比较。
具体实施例方式
本发明人经过深入而广泛的研究，从在豆科模式植物百脉根中首次分离出TCP基因家族成员，即花型花序调控蛋白LJCYC1和LJCYC2。实验已证明百脉根中Ljcyc1和Ljcyc2基因参与控制豆科蝶形花亚科两侧对称花的发育，在转入其反义基因转基因植株中，已获得具有花形变化(龙骨瓣打开、雌雄蕊外露)和花序结构改变的转基因植株，证明利用豆科植物TCP基因进行遗传操作，实现对豆科蝶形花亚科花型的控制是可行的。
接着，本发明人又从大豆和豌豆中分离了Ljcyc1和Ljcyc2基因的同源基因，即大豆的Socyc1A、Socyc1B、Socyc2以及豌豆的Pcyc1和Pcyc2基因。已证实，大豆Socyc1A、Socyc1B、Socyc2等基因不仅具有与百脉根Ljcyc1和Ljcyc2基因很高的序列相似性，还具有相似的表达模式；同时证明在大豆Socyc1A、Socyc1B、Socyc2对花序结构和花型的控制有了更加精细的分工。对这些新花型调控蛋白的活性进行调节可以产生具有不同花序结构和花型的植株，在此基础上完成了本发明。
在本发明中，术语“花型调控蛋白”、“花型调控蛋白多肽”可互换使用，都指具有SEQ ID NO2、4、6、8或10所示氨基酸序列的花型调控蛋白或多肽。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的花型调控蛋白多肽”是指花型调控蛋白多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化花型调控蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。
本发明还包括花型调控蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然花型调控蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列、分泌序列、或用来纯化此多肽的序列等)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“花型调控蛋白多肽”既包括具有SEQ ID NO.2、4、6、8、或10序列的花型调控蛋白，还包括具有相同花型调控功能的、SEQ ID NO.2、4、6、8、或10序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明花型调控蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明花型调控蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明花型调控蛋白多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含本发明花型调控蛋白多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了花型调控蛋白多肽的可溶性片段。通常，该片段具有本发明花型调控蛋白多肽序列的至少约至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供花型调控蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然花型调控蛋白多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。
在本发明中，“花型调控蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO2、4、6、8或10的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链或双链。DNA可以是编码链或非编码链。对Socyc1A而言，编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“Socyc1A的简并变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO2的蛋白质，但与SEQ ID NO1所示的编码区序列有差别的核酸序列。对Socyc1B、Socyc2、Pcyc1和Pcyc2而言，依此类推。
编码成熟多肽的多核苷酸包括只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少60％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸，最佳地至少90％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ IDNO2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码本发明花型调控蛋白的多聚核苷酸。
本发明的花型调控蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用常规方法提取的DNA、或市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的载体和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或花型调控蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；2241431)，利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的花型调控蛋白。一般包括以下步骤
(1).用本发明的编码花型调控蛋白多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，花型调控蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于在细菌中表达的基于T7的表达载体，在植物细胞中表达的pCAMBIA表达载体等。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含花型调控蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状如真核细胞培养用的β-葡萄糖酸酶基因(Gus基因)，氯霉素乙酰转移酶基因(Cat基因)，二氢叶酸还原酶(DHFR基因)、新霉素磷酸转移酶基因(Npt-II基因)，潮霉素磷酸转移酶基因(HPT基因)，PPT乙酰转移酶基因(bar基因)以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有细菌细胞如大肠杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。优选的是植物细胞，尤其是豆科植物的细胞，其中包括豆类作物，如大豆、花生、蚕豆、绿豆、扁豆等；牧草和绿肥作物，如苜蓿、紫云英、百脉根，三叶草等；药用植物，如决明、黄芪、苦参等；观赏植物，如金雀花、紫藤、香豌豆属、龙牙豆属等；绿化树种，如黄檀、凤凰木、格木、铁刀木、台湾相思等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转化和转染方法根癌农杆菌Ti质粒介导的基因转化，发根农杆菌Ri质粒介导的基因转化，植物病毒载体介导的基因转化，磷酸钙共沉淀法，和DNA直接导入基因的转化方法如基因枪法，显微注射，电穿孔，超声波介导，激光微束介导，脂质体包装，物理诱导，化学诱导等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。通过常规的植物组织培养技术，可以将将转化的植物细胞再生成完全的植株。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的本发明花型调控蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)用于改变植物的花型花序，用于筛选促进或对抗花型调控蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。
利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与花型调控蛋白发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。当本发明蛋白激动剂或抑制剂等在农业上进行施用时，可提供不同的效果。
另一方面，本发明还提供了对本发明蛋白DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。
本发明的实用价值在于，不仅有助于了解豆科中Cyc基因家族功能的衍变与花型进化之间的关系，而且利用这两种基因及其类似基因可实现对植物花型的改造和新种质的培育，为创造豆科植物的新品种开辟了新的途径。具体而言，通过改变大豆等豆科作物中的花型调控基因的活性，可以实现对豆科作物花瓣形态的改变，解除由于龙骨瓣特殊结构所引起的异花传粉机械障碍，创造适宜于大豆及豆科作物大规模杂交制种的新种质资源。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1. 大豆中Socyc2，Socyc1A和Socyc1B基因的分离和结构分析
(1)基因的分离
根据Ljcyc1和Ljcyc2基因的序列，设计简并性引物和特异性引物(表A)。首先从大豆吉林21(购自中科院上海植物生理生态所)幼嫩花序中，分离mRNA；以此mRNA为模板，B26为引物合成cDNA第一条链。接着以该cDNA第一条链为模板，GPcy1/B25为引物进行第一轮扩增；用上述第一轮PCR产物为模板，以GPcyc1/G3848为引物进行第二轮扩增，获得了2个与百脉根花型/花序调控基因Ljcyc1同源的片段，分别克隆到pGEM-T载体(Promega公司)中并命名为Socyc1A，Socyc1B。以G3889/G3849为引物，获得了1个Ljcyc2基因的同源基因，克隆到pGEM-T载体中，命名为Socyc2。
Socyc1A的cDNA序列如SEQ ID NO1所示，共924bp，它编码一个231个氨基酸的蛋白(SEQID NO2)。
Socyc1B的cDNA序列如SEQ ID NO3所示，共1030bp，它编码一个275个氨基酸的蛋白(SEQ ID NO4)。
Socyc2的cDNA序列如SEQ ID NO5所示，共1523bp，它编码一个392个氨基酸的蛋白(SEQ ID NO6)。
(2)结构分析
TCP结构域基因家族是植物中特有的一个基因家族，其特点为具有TCP结构域。在模式植物金鱼草中的TCP-结构域基因Cyc/Dich控制了花和花瓣的对称性，这两个基因功能的缺失，使得金鱼草由两侧对称花转变成辐射对称花，并且其背部和侧部花瓣形状发生了改变。Cyc/Dich属于TCP结构域基因家族中的CYC/TB1亚家族，除具有TCP结构域外，还有另外一个保守区-R区。在豆科模式植物百脉根中，TCP结构域基因(即Ljcyc1和Ljcyc2)参与了豆科花型的调控。
用GCG软件的Gap程序进行序列比较，结果表明
(a)Socyc1A，Socyc1B和Socyc2都具有特征性的TCP结构域和R区，属于TCP结构域基因家族中的CYC/TB1亚家族(见图1)。其中SOCYC1A与CYC对应氨基酸片段的相似性为36.1％，一致性32.3％；SOCYC1B与CYC对应氨基酸片段的相似性为42.9％，一致性38.9％；SOCYC2与CYC对应氨基酸片段的相似性为45.0％，一致性41.1％。这3个基因与Cyc基因的同源性大大高于已公布的其他大豆基因或基因片段序列。
(b)Socyc1A与百脉根Ljcyc1基因对应基因片段核苷酸的一致性为77.7％，氨基酸的相似性为65.5％，一致性66.1％； Socyc1B与Ljcyc1基因对应基因片段的核苷酸的一致性为78.3％，氨基酸的相似性为63.8％，一致性61.0％；Socyc2与Ljcyc1基因对应基因片段的核苷酸一致性为79.1％，氨基酸的相似性为55.6％，一致性51.7％。
这表明Socyc1A、Socyc1B和Socyc2是百脉根Ljcyc1的同源基因；同时序列分析也证明它们与Ljcyc1和Ljcyc2基因的同源性高于大豆中的其他基因序列。
表A用于克隆Socyc1A、Socyc1B、Socyc2、Pcyc1和Pcyc2的引物
实施例2.大豆中Socyc2，Socyc1A和Socyc1B基因的时空表达
按冯献忠和罗达方法(1999，原位杂交，《现代植物生理学实验指南》，科学出版社)，分别对营养时期和生殖生长不同阶段的材料制片和杂交。杂交温度50℃，每毫升杂交液中含有10×salts(3M NaCl，0.1M Tris-HCl pH6.8，0.1MNaPO4缓冲液，50mM EDTA)125μl、去离子甲酰胺500μl、tRNA(100mg/ml)12.5μl、50×Denhardt’s 25μl、50％硫酸葡聚糖(dextran sulphate)250μl和DEPC-水87.5μl。
原位杂交结果表明Socyc1B在花原基起始以后，首先在早期花原基的背部区域表达，随着花芽的进一步发育，表达集中于背部花瓣。Socyc1A首先在花序原基划分花原基后，在花原基背部的狭窄区域内表达。当花芽的心皮原基起始后，可以在心皮原基处观察到表达信号。Socyc2在花序原基划分花原基后，在花序原基与花原基的连接处表达。
这些TCP结构域基因的时空表达模式提示它们的功能与花型的发育有关，但在功能上有差异。其中Socyc1A的基因表达模式与百脉根中的Ljcyc1相似，在花芽原基起始时，Socyc1A在花原基背部的狭窄区域内表达；当花器官原基起始后，只在心皮原基处表达。Socyc1B和Socyc2与百脉根中的Ljcyc1和金鱼草中的Cyc基因相似，Socyc1B在早期花芽原基的背部区域表达，随着花芽的进一步发育，在背部花瓣和花芽基部的背侧强烈表达。Socyc2在花序原基和花芽原基的连接处表达Socyc1A和Socyc1B的功能可能与花芽的背腹轴决定有关。
实施例3.豌豆中Pcyc1和Pcyc2基因的分离和结构分析
(1)基因分离
从豌豆野生型JI2413品系花芽发育早期顶端分生组织中分离总RNA，以此总RNA为模板，B26为引物合成cDNA第一条连。以cDNA第一链为模板，以Gpcyc1/B25为第一轮扩增引物，Gpcyc2/SL0147为第二轮引物，得到共812bp基因片段，命名为Pcyc1。Pcyc1的cDNA序列如SEQ ID NO7所示，它编码一个202个氨基酸的蛋白(SEQ ID NO8)。
以上述cDNA第一链为模板，以Gpcyc1/B25为第一轮扩增引物，Gpcyc2/G4035为第二轮引物，得到共794bp基因片段，命名为Pcyc2。Pcyc2的cDNA序列如SEQ ID NO9所示，它编码一个254个氨基酸的蛋白(SEQ ID NO10)。
(2)结构分析
用GCG软件的Gap程序进行序列比较，结果表明
(a)Pcyc1和Pcyc2都具有特征性的TCP结构域和R区(见图2)，属于TCP结构域基因家族成员。其中PCYC1与CYC基因对应基因片段氨基酸的相似性为46.2％，一致性39.3％；PCYC2与CYC基因对应基因片段氨基酸的相似性为34.4％，一致性29.9.9％。这2个基因与Cyc基因的同源性远高于已公布的其他豌豆基因或基因片段序列。
(a)Pcyc1与百脉根Ljcyc1基因对应基因片段核昔酸的一致性为73.7％，氨基酸的相似性为68.3％，一致性66.1％；Pcyc2与百脉根Ljcyc2基因对应基因片段的核苷酸的一致性为69.1％，氨基酸的相似性为55.6％，一致性51.7％。此外，序列分析也证明它们与Ljcyc1和Ljcyc2基因的同源性高于豌豆中的其他基因或基因片段序列。
这表明Pcyc1和Pcyc2是百脉根Ljcyc1和Ljcyc2的同源基因，是豌豆调控花型的基因。
实施例4.Socyc1A反义表达载体的构建
将Socyc1A长为924bp的cDNA反向连到中间载体pJIT163(英国JOIN INNES研究中心)上，然后将含有2个35S的强启动子加上反向Socyc1A cDNA基因再接上CaMV polyA的片段克隆到植物表达载体pCAMBIAl301(CAMBIA研究中心)中，得到Socyc1A反义的表达载体，该载体全长为14000bp，在大肠杆菌中的抗性为卡那霉素抗性，在植物体中的抗性为潮霉素抗性，该载体在T-DNA区域还带有GUS报告基因。
实施例5.Socyc1A反义表达载体对农杆菌LBA4401的转化
(A).制备电击转化法的农杆菌感受态细胞
农杆菌LBA4401(CAMBIA研究中心)生长于YEB固体培养基的平板上，任挑一单菌落接入5mlYEB液体培养基中于28℃震摇培养过夜；
按1∶100的比例将上述菌液接种入100ml新鲜的YEB液体培养基中，28℃、200rpm震摇培养至生长对数期；4000rpm、4℃、15min离心收集农杆菌菌体；弃上清，加入预冷的ddH2O重悬，补水加至50ml；4000rpm、4℃、15min离心；弃上清，加入预冷的ddH2O重悬，补水加至50ml；4000rpm、4℃、15min离心；弃上清，加入预冷的100ul的ddH2O重悬，20ul/管分装置于冰上，准备电击。
(B)Socyc1A反义表达载体质粒对农杆菌LBA4401的电击转化和鉴定
将电击杯洗干净，无水乙醇冲洗，超净台上吹干；各取质粒分别加入到20ul的上述农杆菌感受态细胞中；电击，加入900ul的SOC培养基；28℃摇菌，1小时后涂板，28℃倒置培养；2天后挑取单克隆，摇菌，抽提农杆菌质粒；PCR和酶切鉴定出阳性克隆。获得了携带Socyc1A反义表达载体的农杆菌。
实施例6.农杆菌介导法转化豆科植物
在本实施例中，通过农杆菌感染大豆外植体的方法，分别用含有Socyc1A等各花型调控基因的反义表达载体的农杆菌感染大豆吉林21的外植体。
(A)大豆外植体的获得
取大豆种子经70％乙醇浸泡1分钟后于0.1％的升汞溶液中消毒10分钟，用无菌水冲洗5-6次然后培养于MS培养基萌发无菌苗，当无菌苗子叶刚展开时，取子叶节作为农杆菌转化的受体材料。
(B)根癌农杆菌的培养及大豆转化
农杆菌菌种自YEB平板上接种到3ml含利福平100mg/L、卡那霉素50mg/L、链霉素25mg/L的YEB液体培养基中于28℃振摇培养过夜，第2天按1％接种量转接入50ml含利福平100mg/L、卡那霉素50mg/L、链霉素25mg/L的YEB 液体培养基中，200rpm继续培养16-24hr，将新鲜的培养液于5000g、4℃离心10min收集并重悬于MS BA1.1mg/L和IBA0.05mg/L的液体培养基中使得OD260在0.5左右，用于大豆的转化。
转化前制备MS BA1.1mg/L和IBA0.05mg/L固体培养基。在三角瓶中将大豆外植体浸泡入新鲜的农杆菌菌液中并不时摇动，10min后将大豆外植体移出，在无菌滤纸上吸去过多的菌液即转移到MS BA1.1mg/L和IBA0.05mg/L培养基于26℃、暗处共培养。
共培养3天后，从共培养基上取出大豆外植体，转入含潮霉素25mg/L的MSBA 1.1mg/L和IBA 0.05mg/L选择培养基进行进行选择培养。3-4周后转到不加潮霉素的MS BA 1.1mg/L和IBA 0.05mg/L培养基上继续培养一个月，在子叶节和下胚轴有许多芽苗产生，选择生长旺盛的小苗在1/2MS0上生根壮苗，随后移入人工气候室盆栽。
结果表明，本发明的上述各花型调控基因对豆科植物的花型有调控作用。
序列表<110>中国科学院上海植物生理研究所<120>豆科作物花型调控基因及应用<130>023360<160>18<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>924<212>DNA<213>大豆(Glycine Max)<400>1agcaacacgc ttgaatggct cttcacaaag tccaagaagg caatcaagga gcttactcga60agcaagcaca gtgctgatag cttcgaattc tcctcatcgt cggatggtga agtggtttct120accatccacc aagacctaca ccaacaacaa ggggtagatt tggaagaggg aaaggtgaaa180gaacctgcag cttattgtgt taaagcaaag atgaaggaat ctagggaaaa agcaagggca240agagcaaggc aaaggactag tagcaaggta ttgtgcaaca taagtggcga agggaaggtg300caagacttga agaaaaaatg ccctgcaact gaaaaccctc aaatcctgaa ccaattaagg360tcaccccttc agcctcctca tcctcaaggt gtgggtggag aagtgccaag agatgatgac420ttcaatgtga ttgaggaatc cattgtcatc agaagaaagt tgaaacacac tttgatgtct480tccattcatc accaaaacgc tgtgatccct aaggaagcaa gtgtaaacaa cagtgactac540cactccttcc ccaatctgtc tccaaatttg gaagctaata ataatggtgc tagtggacgc600tccacctttt gtgcaatagc cagcatgaat ctatctacag ggcttcaaat ttttggaaaa660tcttgggagg agtgcaccaa tcctcatcca agctaatatc ttagttttca gtattatgcg720atgattgtct ctagtgtttt gccaaggaat atcatggtca tggaggcatc tttctgtgtt780tttctacctg taactttttc tgtcctatat ttcctttcta caatgtactg atttttttgt840tgctctagat ctcagccaag gcatgtgaca gttggcaaaa aaggatgctt cgtgtataat900ttctgaccaa tatttaaagt gtgg 924<210>2<211>231<212>PRT<213>大豆(Glycine Max)<400>2Ser Asn Thr Leu Glu Trp Leu Phe Thr Lys Ser Lys Lys Ala Ile Lys1 5 10 15Glu Leu Thr Arg Ser Lys His Ser Ala Asp Ser Phe Glu Phe Ser Ser
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权利要求
1.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸调控花型且包含一核苷酸序列，该核苷酸序列编码选自下组
(a)SEQ ID NO1、3、5、7、9所示的核苷酸序列；
(b)编码SEQ ID NO6所示氨基酸序列的核苷酸序列；
(c)在序列(a)或(b)中有一个或多个核苷酸取代、缺失或插入而衍生的核苷酸序列，且该核苷酸序列仍具有调控花型的功能。
2.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ IDNO2、4、6、8、或10所示氨基酸序列的多肽。
3.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸具有选自下组的序列
(i)SEQ ID NO1中1-693位的序列；
(ii)SEQ ID NO3中1-825位的序列；
(iii)SEQ ID NO5中8-1183位的序列；
(iv)SEQ ID NO7中1-606位的序列；
(v)SEQ ID NO9中1-792位的序列。
4.一种分离的花型调控蛋白多肽，其特征在于，它选自下组
(a)含有SEQ ID NO2、4、6、8、或10氨基酸序列的多肽；
(b)具有花型调控功能的，多肽(a)的保守性变异多肽、或活性片段、或活性衍生物；
(c)在SEQ ID NO2、4、6、8、或10限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或插入一个或几个氨基酸所衍生的，且具有花型调控功能的蛋白。
5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO2、4、6、8、或10氨基酸序列的多肽。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的多核苷酸。
7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。
8.一种花型调控蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包含
(a)在适合表达花型调控蛋白的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出花型调控蛋白。
9.一种改变植物花型花序的方法，其特征在于，包括步骤
(a)将权利要求1所述的多核苷酸转入植物细胞，
(b)将步骤(a)中的植物细胞再生成植株。
10.一种权利要求1所述的花型调控蛋白的用途，其特征在于，它用于改变植物的花型花序。
全文摘要
本发明提供了一种新的源自大豆和豌豆的花型调控基因，即Socyc1A、Socyc1B、Socyc2、Pcyc1和Pcyc2，以及这些基因编码的多肽。这些花型调控基因参与了植物的花型调控过程。本发明还提供了利用这些花型调控蛋白改变植物花型的方法。
文档编号C12N15/63GK1464061SQ02112288
公开日2003年12月31日 申请日期2002年6月28日 优先权日2002年6月28日
发明者冯献忠, 罗达, 田朝霞, 王峥 申请人:中国科学院上海植物生理研究所