专利名称：观察细胞信号传导通路的组织芯片和细胞系芯片的利记博彩app
技术领域：
本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种高通量检测与分析不同细胞(如各种正常与疾病组织细胞)中信号传导通路的组织与细胞(系)芯片。
背景技术：
人基因组学研究目前是国际上的热点。随着研究的进展，人们迫切发现在各种恶性肿瘤组织及细胞中信号传导通路的变化并确定人类新基因和已知序列的基因，以及各种基因在各种细胞通路中所起的作用。
除人染色体DNA大规模测序，表达序列测序(EST)蛋白质组的方法外，还缺少一种高通量检测细胞信号传导通路改变的方法。现有的基因芯片也只是将DNA固定在基片上，形成微阵列，无法直接原位检测某一细胞中一种或多种基因的表达变化情况。
因此，本领域迫切需要开发新的技术，以便能高通量地细胞原位检测一种或多种基因表达变化。
发明内容
本发明的目的就是提供一种可高通量地细胞原位检测一种或多种基因表达变化的芯片。
本发明的另一目的是提供所述芯片的制备方法和用途。
在第一方面，本发明提供了一种组织-细胞系芯片，它包括(a)一个基片；(b)位于所述基片的一个主表面上的石蜡切片，所述切片的厚度为1-20微米，并且具有4-1000个点样孔，所述的每个点样孔中固定有一种组织/细胞，且切片上有2种以上的组织/细胞。
在一优选例中，所述点样孔的大小是直径为0.25-1.5毫米，且所述点样孔之间的间距是0.25-5毫米，按点样孔中心之间的距离计。
在另一优选例中，所述的点样孔密度是16-100点样孔/平方厘米。
在另一优选例中，所述的组织/细胞选自正常细胞、肿瘤组织、癌旁组织、体外培养的细胞系、传代细胞和/或原代细胞、体外培养的肿瘤细胞系、石蜡包埋的组织、石蜡包埋的细胞系。
在另一优选例中，所述的基片选自载玻片和塑料基片。
在第二方面，本发明提供了一种组织-细胞系芯片的制备方法，它包括步骤(a)提供一空白石蜡块，所述的石蜡块具有4-1000个点样孔，所述点样孔的大小是直径为0.25-1.5毫米，且所述点样孔之间的间距是0.25-5毫米，按点样孔中心之间的距离计；(b)在步骤(a)中的石蜡块的点样孔中推入组织/细胞样品，所述组织/细胞的种类为2种以上；(c)从步骤(b)中的石蜡块切取1-20微米的石蜡切片；(d)将步骤(c)中的石蜡切片置于基片之上，形成组织-细胞系芯片。
在一优选例中，步骤(b)中，所述的组织/细胞样品选自(i)固定和石蜡包埋的正常组织、肿瘤组织和/或癌旁组织；(ii)石蜡包埋裸鼠皮下移植瘤组织；(iii)固定和石蜡包埋的细胞系。
在另一优选例中，在步骤(b)中，用点阵仪供体穿刺针从包埋有组织/细胞样品的石蜡母块的定位处穿取组织/细胞，推入石蜡块的点样孔中，所述的穿刺针的直径与点样孔的直径相符；且步骤(d)的基片是用聚-L-赖氨酸处理过的载玻片。
在第三方面，本发明提供了本发明所述的组织-细胞系芯片的用途，它们被用于观察细胞信号传导、细胞转染、原位杂交、免疫细胞化学检测、免疫荧光分析、原位PCR、筛选药物或药靶。
在第四方面，本发明还提供了一种检测不同细胞间信号传导通路中基因表达状态和/或磷酸化状态差异的方法，它包括以下步骤(i)提供第一和第二组织/细胞系芯片，所述的芯片包括(a)一个基片；
(b)位于所述基片的一个主表面上的石蜡切片，所述切片的厚度为1-20微米，并且具有4-1000个点样孔，所述的每个点样孔中固定有一种组织/细胞，且切片上有2种以上的组织/细胞；且第一和第二组织/细胞系芯片上的石蜡切片为相邻的连续切片；(ii)在第一组织/细胞系芯片上用与信号传导相关的基因磷酸化蛋白的抗体进行免疫组化检测分析，并且在第二组织/细胞系芯片上用与信号传导相关的总蛋白的抗体进行免疫组化检测分析；(iii)比较第一和第二组织/细胞系芯片之间的免疫组化检测结果。
在一优选例中，所述的不同细胞是病理组织的细胞和正常细胞。更佳地所述的不同细胞是肿瘤细胞、癌旁组织的细胞以及正常细胞。
图1显示了本发明的癌组织-细胞系芯片。
图2显示了本发明的癌组织-细胞系芯片的免疫组化切片照片，其中从上至下分别为用HE染色的组织-细胞系芯片、用phospho-Akt-1抗体处理的组织-细胞系芯片、和用Akt1/2总蛋白抗体处理的组织-细胞系芯片。
图3显示了本发明的癌组织-细胞系芯片的检测结果。
具体实施例方式
本发明经过广泛而深入的研究，开发了制备组织-细胞系芯片的新工艺，在此基础上完成了本发明。
可用于本发明的组织/细胞没有特别限制。代表性的例子包括正常细胞、肿瘤组织、癌旁组织、体外培养的细胞系、传代细胞和/或原代细胞、体外培养的肿瘤细胞系、石蜡包埋的组织、石蜡包埋的细胞系。
用于本发明的基片没有特别限制，可以选用基因芯片领域常用的各种基片，例如载玻片、塑料基片。较佳地，基片是透明的、无色的。选用塑料基片时，塑料应不受有机溶剂腐蚀。一种特别优选的基片是用聚-L-赖氨酸处理过的载玻片。
在本发明的芯片中，点样孔的大小、间距和或点样密度没有特别限制。通常取决于所选用的细胞类型、石蜡类型以及穿刺针等因素。一般，所述点样孔的大小是直径为0.25-1.5毫米或更大，较佳地为0.3-1.0毫米。所述点样孔之间的间距是0.25-5毫米或更大，较佳地为0.3-4毫米，更佳地为0.4-3毫米，按点样孔中心之间的距离计。而所述的点样孔密度是16-100点样孔/平方厘米。
至于本发明芯片上的点样孔的数目，通常为4-10000个点样孔或更多。点样孔的数目一方面取决于点样密度，另一方面也取决于基片的大小。当点样孔较多时，可以选用表面积较大的基片。
在本发明中，固定在所述点样孔的组织/细胞种类没有特别限制，通常为2种至1000种细胞类型或更多。一种优选的情况是正常细胞、肿瘤组织、癌旁组织、各种细胞系。
用于本发明芯片的石蜡芯片的厚度没有特别限制，通常为1-20微米，较佳地为2-15微米，更佳地为3-10微米。
在本发明中所用的组织/细胞固定技术、石蜡包埋技术、以及切片技术没有特别限制，可以选用本领域的常规技术。
优选制备组织/细胞系样品的方法包括(1)对于正常组织，肿瘤组织和瘤周非肿瘤组织(癌旁组织)行常规固定和石蜡包埋，石蜡切片经HE染色后选择欲制备组织芯片的部位，并在切片上标记备用；(2)对于细胞系，可用贴壁细胞经固定后用细胞刮子刮下后洗涤，再用2％琼脂悬浮冷凝后将其切成小块常规石蜡包埋(用于体外状态的检测)，(3)对于肿瘤细胞系，可用裸鼠皮下移植瘤组织常规石蜡包埋；在一种优选例中，选用硬度适中的空白石蜡块[称为“芯片石蜡块”或“受体块”(Recipient block)]，并按设计打阵列孔。例如打孔针外径，即实际受体石蜡孔孔径为0.6mm，横向和纵向孔距为0.6-0.9mm。
然后，根据各供体块的组织定位信息，用点阵仪供体穿刺针(例如，穿刺针内径，即实际供体石蜡包埋组织外径也为0.6mm)从石蜡母块的定位处穿取组织，推入芯片石蜡块的坐标定位孔(即点样孔)中，依次进行直至将所有标本点成阵列。常规制作连续石蜡切片(例如，5μm厚切片)粘贴在聚-L-赖氨酸处理过的载玻片上。
本发明芯片的应用范围包括用于观察细胞信号传导、细胞转染、原位杂交、免疫细胞化学检测、免疫荧光分析、原位PCR、筛选药物或药靶。尤其是用于筛选影响肿瘤组织和细胞系中细胞信号传导通路改变的关键基因及其蛋白质，从而发现具有诊断、治疗价值的新基因及可作为药靶的新基因。
具体而言，本发明芯片可高通量地应用各种组织(正常组织、疾病组织如癌组织和癌旁组织)，各种细胞(正常细胞、原代细胞、传代细胞及恶性肿瘤细胞)，用于不同方法如原位杂交(ISH)方法检测各种基因在核酸水平的表达变化；用免疫组化(IHC)检测各种基因表达产物(蛋白)的变化等；用免疫荧光(IF)技术进行基因的亚细胞定位。在一张组织-细胞系芯片上不仅用于检测同种基因在各种组织中的表达差异；更重要的是检测与分析同一基因的蛋白质(包括磷酸化蛋白和总蛋白)的变化状况。
因此，本发明还提供了一种检测观察细胞信号传导通路方法，其主要基于以下原理信号传导过程中，蛋白质磷酸化普遍存在，如生长因子和细胞因子可使其相应受体磷酸化，而磷酸化的受体又可激活细胞质内蛋白激酶使之磷酸化；细胞周期进程中是由CDK的磷酸化和去磷酸化调节G1/S和G2/M的转变；代谢过程中葡萄糖和糖原的互变及葡萄糖的运输，也是由蛋白质磷酸化调节的。因此利用信号传导分子的磷酸化抗体检测疾病状态下该细胞信号传导分子的磷酸化程度，可以为研究疾病的发生机理提供重要线索。采用同时筛选大量信号传导通路分子的磷酸化，再择其磷酸化变化明显者对该信号传导分子的上游调控基因或/和受该分子调控的下游分子进行研究，或通过抑制该信号传导分子的上游调控分子来观察其磷酸化状态或活性的改变，这种新型研究方法将对疾病致病机理的研究甚或基因功能研究是一种可行和有效的研究手段。
本发明的检测不同细胞间信号传导通路中基因表达状态和/或磷酸化状态差异的方法，包括以下步骤(i)提供本发明的第一和第二组织/细胞系芯片，所述的芯片包括(a)一个基片；(b)位于所述基片的一个主表面上的石蜡切片，所述切片的厚度为1-20微米，并且具有4-1000个点样孔，所述的每个点样孔中固定有一种组织/细胞，且切片上有2种以上的组织/细胞；
且第一和第二组织/细胞系芯片上的石蜡切片为相邻的连续切片；(ii)在第一组织/细胞系芯片上用与信号传导相关的基因磷酸化蛋白的抗体进行免疫组化检测分析，并且在第二组织/细胞系芯片上用与信号传导相关的总蛋白的抗体进行免疫组化检测分析；(iii)比较第一和第二组织/细胞系芯片之间的免疫组化检测结果。
然后，根据检测结果进行进一步的研究，例如(1)选择发生改变的基因的信号通路上游和下游的基因，检测其表达状态和/或磷酸化状态；(2)进行各种疾病组织(如各种肿瘤及相应正常组织)及各种癌细胞系不同通路的各种磷酸化和非磷酸化蛋白的对比检测及其谱型；(3)观察已知基因或新基因转染细胞或转基因动物组织中信号传导的改变；(4)研究体内和体外化学药物和生物药物处理后细胞和组织中信号传导的改变，进行药靶筛选；(5)进行原位杂交检测基因在mRNA水平的表达改变。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1Akt基因在正常肝组织、肝癌组织、癌旁肝组织及肝癌细胞系中的磷酸化状态检测1.材料和方法癌组织-细胞系芯片本研究采用的组织芯片由54对肝细胞癌和癌旁组织，9例意外死亡者正常肝组织和3株肝癌细胞系Hep3B，SMMC7721，BEL7402的裸鼠皮下移植瘤组织等组成(见表1和图1)。
表1磷酸化Akt-1抗体免疫组化结果(组织-细胞系芯片)日期2001.12.6
N细胞核P细胞质E内皮细胞F成纤维细胞
2.结果Akt1磷酸化蛋白抗体及Akt1/2总蛋白抗体免疫组化结果(肝癌组织/细胞系芯片)为癌细胞中胞核内磷酸化Akt1呈异常强阳性，胞质内呈弱阳性；而癌旁肝和正常肝组织胞质和胞核均为中等程度的表达或低表达，SMMC7721，BEL7402和Hep3B只有核内高表达。癌旁肝组织中增生胆管上皮细胞核内也呈高表达。Akt1/2总蛋白在肝癌组织，癌旁肝和正常肝组织胞质均为高表达，胞核也呈阳性反应，但较胞质表达低；SMMC7721，BEL7402和Hep3B胞质和胞核内均为高表达(详见表2和图2)，图3为图2的部分和局部放大。
表2Akt1磷酸化蛋白抗体和Akt1/2总蛋白抗体免疫组化结果(肝癌组织/细胞系芯片)抗体 各种蛋白在组织中的阳性率(％)*结果说明名称 肝癌组织 癌旁肝组织正常肝组织肝癌细胞系胞质 细胞核 胞质 细胞核 胞质 细胞核 胞质 细胞核 癌细胞中胞核内磷酸化+～ ++～ +～Akt1呈异常强阳性，胞质内±/- +～+++ ±/- +++±/- +++±/- +++弱阳性；而癌旁肝和正常肝磷酸化组织胞质和胞核均为中等程Akt-1度的阳性或弱阳性，(p-Akt1 90.6 90.6 100 100 100 100 100 100SMMC7721，BEL7402和(Ser473))(48/53)(48/53)(54/54)(54/54)(9/9)(9/9)(3/3)(3/3)Hep3B只有核内高表达。癌旁肝组织中增生胆管上皮细胞核内也呈强阳性+～+～ ++～ ++～Akt1/2总蛋白在肝癌组织，+++ ±/++～+++++++ + +++ +++癌旁肝和正常肝组织胞质均Akt-1 为强阳性，胞核呈弱阳性反总蛋白100100100100 100 100 100 100 应，较胞质阳性反应低；(Akt1/2)(53/53)(53/53)(54/54)(54/54)(9/9)(9/9)(3/3)(3/3) SMMC7721，BEL7402和Hep3B胞质和胞核内均为强阳性*免疫组化结果的判定主要依据各种肿瘤(癌旁和癌)组织中实质细胞的免疫化学反应结果(阳性细胞数和阳性细胞着色深浅)综合判定的；具体标准是无阳性反应细胞，为“-”；阳性细胞数少于15％，为“+”；阳性细胞数约为15-25％，为“+”；阳性细胞数在25-50％，为“++”；在50-75％之间，为“+++”；大于75％，为“++++”。表中阳性率以“+”以上计算。
实施例2Smad1基因在正常肝组织，肝癌组织，癌旁肝组织及肝癌细胞系中的磷酸化状态检测按实施例1中所述的方法，用Smad1磷酸化蛋白抗体和Smad1总蛋白抗体进行的免疫组织化学分析。
结果表明癌细胞中胞质内磷酸化Smad1呈弱阳性，阳性率为31.37％(16/51)，胞核内呈阴性；而癌旁肝和正常肝组织胞质均为中等程度的阳性反应，其阳性率均为100％(57/57；9/9)；SMMC7721，BEL7402和Hep3B胞质内均呈中等程度的阳性反应。
癌细胞中胞质内Smad1总蛋白呈弱阳性，阳性率为31.37％(16/51)，胞核也呈不同程度的阳性；而癌旁肝胞质内弱阳性率为100(54/54)，胞核内疑似阳性率为59.26％(32/54)；正常肝组织胞质和胞核均呈中等程度的阳性反应，其阳性率均为100％(9/9)；SMMC7721，BEL7402胞质胞核内均呈中等程度的阳性反应，Hep3B胞质阳性，胞核阴性(详见表3)。
表3Smad1磷酸化蛋白抗体和Smad1总蛋白抗体免疫组化结果(肝癌组织/细胞系芯片)抗体 各种蛋白在组织中的阳性率(％)*结果说明名称肝癌组织 癌旁肝组织正常肝组织 肝癌细胞系胞质 细胞 胞质 细胞 胞质细胞 胞质 细胞 癌细胞中胞质内磷酸化Smad1核 核 核 核呈弱阳性，阳性率为+～++～ + ++～ ++～++ +31.37％(16/51)，胞核内呈阴性；而+++ +++ +++磷酸化癌旁肝和正常肝组织胞质均为中等31.37 0100 0100 01000Smad1 程度的阳性反应，其阳性率均为(16/51) (54/54)(9/9) (3/3)100％(57/57；9/9)；SMMC7721，BEL7402和Hep3B胞质内均呈中等程度的阳性反应。
+～ +～++ +～++±/+ +～+++++～ +～++″癌细胞中胞质内Smad1总蛋白+++ +++呈弱阳性，阳性率31.37％(16/51)，31.37 11.32 10059.26 100 100 100 66.67胞核也呈不同程度的阳性；而癌旁Smad1肝胞质内弱阳性率为100(54/54)，胞(16/51)(6/53)(54/54)(32/54)(9/9) (9/9) (3/3) (2/3)总蛋白 核内疑似阳性率为59.26％(32/54)；正常肝组织胞质和胞核均呈中等程度的阳性反应，其阳性率均为100％(9/9)；SMMC7721，BEL7402胞质胞核内均呈中等程度的阳性反应。
″*免疫组化结果的判定主要依据各种肿瘤(癌旁和癌)组织中实质细胞的免疫化学反应结果(阳性细胞数和阳性细胞着色深浅)综合判定的；具体标准是无阳性反应细胞，为“-”；阳性细胞数少于15％，为“+”；阳性细胞数约为15-25％，为“+”；阳性细胞数在25-50％，为“++”；在50-75％之间，为“+++”；大于75％，为“++++”。表中阳性率以“+”以上计算。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种组织-细胞系芯片，其特征在于，它包括(a)一个基片；(b)位于所述基片的一个主表面上的石蜡切片，所述切片的厚度为1-20微米，并且具有4-1000个点样孔，所述的每个点样孔中固定有一种组织/细胞，且切片上有2种以上的组织/细胞。
2.如权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述点样孔的大小是直径为0.25-1.5毫米，且所述点样孔之间的间距是0.25-5毫米，按点样孔中心之间的距离计。
3.如权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述的点样孔密度是16-100点样孔/平方厘米。
4.如权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述的组织/细胞选自正常细胞、肿瘤组织、癌旁组织、体外培养的细胞系、传代细胞和/或原代细胞、体外培养的肿瘤细胞系、石蜡包埋的组织、石蜡包埋的细胞系。
5.如权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述的基片选自载玻片和塑料基片。
6.一种组织-细胞系芯片的制备方法，其特征在于，包括步骤(a)提供一空白石蜡块，所述的石蜡块具有4-1000个点样孔，所述点样孔的大小是直径为0.25-1.5毫米，且所述点样孔之间的间距是0.25-5毫米，按点样孔中心之间的距离计；(b)在步骤(a)中的石蜡块的点样孔中推入组织/细胞样品，所述组织/细胞的种类为2种以上；(c)从步骤(b)中的石蜡块切取1-20微米的石蜡切片；(d)将步骤(c)中的石蜡切片置于基片之上，形成组织-细胞系芯片。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，所述的组织/细胞样品选自(i)固定和石蜡包埋的正常组织、肿瘤组织和/或癌旁组织；(ii)石蜡包埋裸鼠皮下移植瘤组织；(iii)固定和石蜡包埋的细胞系。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，用点阵仪供体穿刺针从包埋有组织/细胞样品的石蜡母块的定位处穿取组织/细胞，推入石蜡块的点样孔中，所述的穿刺针的直径与点样孔的直径相符；且步骤(d)的基片是用聚-L-赖氨酸处理过的载玻片。
9.如权利要求1所述的组织-细胞系芯片的用途，其特征在于，用于观察细胞信号传导、细胞转染、原位杂交、免疫细胞化学检测、免疫荧光分析、原位PCR、筛选药物或药靶。
10.一种检测不同细胞间信号传导通路中基因表达状态和/或磷酸化状态差异的方法，其特征在于，包括以下步骤(i)提供第一和第二组织/细胞系芯片，所述的芯片包括(a)一个基片；(b)位于所述基片的一个主表面上的石蜡切片，所述切片的厚度为1-20微米，并且具有4-1000个点样孔，所述的每个点样孔中固定有一种组织/细胞，且切片上有2种以上的组织/细胞；且第一和第二组织/细胞系芯片上的石蜡切片为相邻的连续切片；(ii)在第一组织/细胞系芯片上用与信号传导相关的基因磷酸化蛋白的抗体进行免疫组化检测分析，并且在第二组织/细胞系芯片上用与信号传导相关的总蛋白的抗体进行免疫组化检测分析；(iii)比较第一和第二组织/细胞系芯片之间的免疫组化检测结果。
全文摘要
本发明提供了一种高通量检测与分析各种正常与疾病组织的细胞中信号传导通路的组织与细胞芯片。所述芯片包括(a)一个基片；(b)位于所述基片的一个主表面上的石蜡切片，所述切片的厚度为1－20微米，并且具有4－1000个点样孔，所述的每个点样孔中固定有一种组织/细胞，且切片上有2种以上的组织/细胞。本发明还提供了所述芯片的制法和用途，尤其是用于检测不同细胞间信号传导通路中基因表达状态和/或磷酸化状态差异。
文档编号C12Q1/02GK1458283SQ0211166
公开日2003年11月26日 申请日期2002年5月15日 优先权日2002年5月15日
发明者顾健人, 李锦军 申请人:上海新世界基因技术开发有限公司