修饰的精氨酸脱亚胺酶的利记博彩app

专利名称：修饰的精氨酸脱亚胺酶的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及经聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚胺酶、治疗癌症的方法，和治疗和/或抑制转移性病症的方法。
背景技术：
恶性黑素瘤(阶段3)和肝癌是在诊断一年内杀死大多数患者的致命性疾病。美国每年大约有16,000人死于这些疾病。在美国黑素瘤的发病率正迅速地增长，在其他国家，如澳大利亚其增长速率甚至更高。在世界上肝炎流行的地方，肝癌的发病率更高，例如，在日本和台湾，肝癌是首要的癌症之一。急需对这些疾病进行有效治疗。
已有用选择性去除必需氨基酸的方法来治疗某些癌症。最为著名的例子是利用L-天冬酰胺酶降低天冬酰胺的水平以治疗急性成淋巴细胞白血病。最常用的L-天冬酰胺酶分离自大肠杆菌。但由于该酶所固有的抗原性和短循环半衰期使在临床应用中受到限制，参见Y.K.Park等，Anticancer Res.，1373-376(1981)。用聚乙二醇共价修饰的大肠杆菌L-天冬酰胺酶抗原性得以降低，循环半衰期得以延长，参见Park，Anticancer Res.，同上；Y.Kamisald等，J Pharmacol.Exp.Ther.，216410-414(1981)；和Y.Kamisaki等，Gann.，7347-474(1982)。尽管已付出了许多努力试图鉴定出其他用于治疗癌症的必需氨基酸降解酶，但没有获得成功，主要是因为通过限定去除必需氨基酸产生许多严重的副作用。
已有报道称降解非必需氨基酸如精氨酸的酶，可能是控制某些癌症的有效方法。例如，从恶臭假单胞菌(Pseudomonas pudita)中分离的精氨酸脱亚胺酶(ADI)，参见J.B.Jones，″精氨酸脱亚胺酶对鼠白血病成淋巴细胞的影响(The Effect of Arginine Deiminase on MurineLeukemic Lymphoblasts)″，博士论文，The University of Oklahoma，第1-165页(1981)。尽管可在体外可有效地杀死肿瘤细胞，但由恶臭假单胞菌(P.pudita)中分离的ADI没能在体内显示出功效，这是因为其在中性pH下几乎不表现酶活性，并被迅速地从实验动物的血液循环中清除。下述文献中描述了来自精氨酸支原体(Mycoplasmaarginini)的精氨酸脱亚胺酶，参见例如Takaku等，Int.J.Cancer，51244-249(1992)和美国专利No.5,474,928，其所公开的内容在此引入作为参考。然而，这种异源蛋白质的治疗用途涉及到抗原性的问题。也有描述称利用聚乙二醇通过氰尿酰氯连接基团对精氨酸支原体(Mycoplasme arginini)的精氨酸脱亚胺酶进行化学修饰，参见Takaku等，Jpn.J Cancer Res.，841195-1200(1993)。但由于从氰尿酰氯连接基团中释放出氰化物，上述修饰后的蛋白在代谢中是有毒的。
目前需要既能降解非必需氨基酸，又不产生与现有技术相关联的问题的组合物。本发明涉及这些及其他重要目的。
发明概述本发明涉及经聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚胺酶。在优选的实施方案中，该精氨酸脱亚胺酶经总重均分子量为约1,000到约50,000的聚乙二醇直接地或通过一种生物相容性连接基团修饰。
本发明的另一实施方案涉及治疗癌症的方法，所述的癌症包括例如肉瘤、肝癌和黑素瘤。本发明还涉及治疗和/或抑制肿瘤细胞转移的方法。
本发明的这些及其他方面将在以下发明详述部分予以阐明。
附图的简要描述

图1表示精氨酸脱亚胺酶的氨基酸序列，所述的氨基酸序列克隆自精氨酸支原体(Mycoplasma arginini)(上部的氨基酸序列SEQ IDNO1，称作ADIPROT)、关节炎支原体(Mycoplasma arthritides)(中部的氨基酸序列SEQ ID NO2，称作ARTADIPRO)和人型支原体(Mycoplasma hominus)(底部的氨基酸序列SEQ ID NO3，称作HOMADIPRO)。
图2A和2B表示单剂量天然精氨酸脱亚胺酶和经聚乙二醇(如分子量5,000)修饰的精氨酸脱亚胺酶对小鼠血清精氨酸水平和血清瓜氨酸水平的作用。
图3表示当PEG10,000通过不同的连接基团与ADI共价连接时对血清精氨酸水平的影响。
图4表示用单剂量的PEG-ADI注射小鼠时，连接基团和聚乙二醇的分子量对其中瓜氨酸产量的影响。
图5A和5B表示由ADI-SS-PEG5,000引起的血清精氨酸和瓜氨酸水平的剂量反应。图5C和5D表示由ADI-SS-PEG20,000引起的血清精氨酸和瓜氨酸水平的剂量反应。
图6表示天然ADI、ADI-SS-PEG5,000和ADI-SS-PEG20,000的抗原性。
图7表示用ADI-SS-PEG5,000、ADI-SS-PEG12,000或ADI-SS-PEG20,000治疗对注射了SK-mel 2人黑素瘤细胞的小鼠中的肿瘤大小的影响。
图8表示用ADI-PEG20,000治疗对注射了SK-mel 28、SK-mel 2或M24-met人黑素瘤细胞的小鼠中的肿瘤大小的影响。
图9表示用ADI-PEG5,000、ADI-PEG12,000或ADI-PEG20,000治疗对注射了人肝癌SK Hep1细胞的小鼠存活的影响。
图10表示精氨酸脱亚胺酶的氨基酸序列，所述的氨基酸序列克隆自化脓链球菌(Steptococcus pyogenes)(上部的氨基酸序列SEQ IDNO6，称作STRADIPYR)和肺炎链球菌(Steptococcus pneumoniae)(底部的氨基酸序列SEQ ID NO7，称作STRADIPNE)。
图11表示精氨酸脱亚胺酶的氨基酸序列，所述的氨基酸序列克隆自布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)(上部的氨基酸序列SEQ IDNO8，称作BORADIBUR)和阿氏疏螺旋体(Borrelia afzelii)(下部的氨基酸序列SEQ ID NO9，称作BORADIAFZ)。
图12表示Qiardiu intestinalis的氨基酸序列(上部的氨基酸序列SEQ ID NO10，称作QIAADIINT)、产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridiumperfringens)的氨基酸序列(中部的氨基酸序列SEQ ID NO11，称作CLOADIPER)和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的氨基酸序列(下部的氨基酸序列SEQ ID NO12，称作BACADILIC)。
图13表示粪肠球菌(Enterococcus faecalis)(上部的氨基酸序列SEQ ID NO13，称作ENTADIFAE)和清酒乳芽孢杆菌(Lactobacillussake)的氨基酸序列(下部的氨基酸序列SEQ ID NO14，称作LACADISAK)。
发明详述正常细胞的生长不需要精氨酸，这是因为它们可以通过精氨基琥珀酸合酶和精氨基琥珀酸裂解酶催化两步反应从瓜氨酸合成精氨酸。相反，黑素瘤、肝细胞瘤和一些肉瘤不表达精氨基琥珀酸合酶；所以，它们是精氨酸营养缺陷型。这个代谢差异可用来开发对治疗这些癌症安全而有效的治疗剂。精氨酸脱亚胺酶催化精氨酸向瓜氨酸转化，可用于去除精氨酸。因此，精氨酸脱亚胺酶可用于治疗黑素瘤、肝细胞瘤和一些肉瘤。
存在于微生物中的天然精氨酸脱亚胺酶是抗原性的且可被迅速地从患者的血液循环中清除。这些问题可由经聚乙二醇(PEG)共价修饰的精氨酸脱亚胺酶克服。经聚乙二醇共价修饰的精氨酸脱亚胺酶(有或者没有连接基团)以下简称″ADI-PEG″。与天然精氨酸脱亚胺酶相比，ADI-PEG保留了其大部分的酶活性、少得多的抗原性，大大延长了循环半衰期，并在治疗肿瘤方面更加有效。
″聚乙二醇″或″PEG″指支链或直链形式的环氧乙烷和水的缩合聚合物的混合物，由通式H(OCH2CH2)nOH表示，其中n至少为4。″聚乙二醇″或″PEG″与表示其近似平均分子量的数字后缀一起出现。例如，PEG5,000指总重均分子量约为5,000的聚乙二醇；PEG12,000指总重均分子量约为12,000的聚乙二醇；以及PEG20,000指总重均分子量约为20,000的聚乙二醇。
″黑素瘤″可能是一种由皮肤及其他器官，包括口腔、食管、肛管、阴道、柔脑膜和/或结膜或眼睛的黑素细胞系统发展而来的恶性或良性肿瘤。术语″黑素瘤″包括例如肢端-雀斑(acral-lentiginous)黑素瘤、无黑色素性黑素瘤、良性幼态(juvenile)黑素瘤、恶性雀斑样黑素瘤、恶性黑素瘤、结节性黑素瘤、指甲下黑素瘤和表面传播性黑素瘤。
″肝细胞瘤″可能是一种肝恶性或良性肿瘤，包括例如肝细胞癌。
″患者″指动物，优选哺乳动物，更优选人。
″生物相容性″通常指这样的物质或化合物，它们不损害生物学功能、不产生任何程度的不可接受的毒性，包括过敏和病态。
本说明书中使用下述的缩写形式PEG，聚乙二醇；ADI，精氨酸脱亚胺酶；SS，琥珀酸琥珀酰亚胺酯；SSA，琥珀酰亚胺基琥珀酰胺；SPA，丙酸琥珀酰亚胺酯；和NHS，N-羟基琥珀酰亚胺。
本发明是基于一个意外的发现，即经聚乙二醇修饰的ADI对治疗某些类型的癌症和抑制癌扩散具有显著的效果。在通过或不通过连接基团的情况下ADI可与聚乙二醇共价相连，在优选的实施方案中利用了连接基团。
在本发明中，精氨酸脱亚胺酶基因可从任何来源，包括如微生物、重组生物技术或其任意组合中衍生、克隆或产生。例如，精氨酸脱亚胺酶可从支原体属(Mycoplasma)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、疏螺旋体属(Borrelia)、肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、Qiardia的微生物中克隆得到。所述精氨酸脱亚胺酶优选克隆自肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、人型支原体(Mycoplasma hom、inus)、精氨酸支原体(Mycoplasma arginini)、化脓链球菌(Steptococcuspyogenes)、肺炎链球菌(Steptococcus pneumoniae)、布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、阿氏疏螺旋体(Borrelia afzelii)、Qiardiaintestinalis、产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、清酒乳芽孢杆菌(Lactobacillus sake)或其任意组合。具体说来，用于本发明的精氨酸脱亚胺酶可具有图1和10-13所示的一个或多个氨基酸序列。
在本发明的特定实施方案中，优选地，所述精氨酸脱亚胺酶克隆自支原体属的微生物。更优选地，所述精氨酸脱亚胺酶克隆自精氨酸支原体(Mycoplasnia arginini)、人型支原体(Mycoplasma hominus)和关节炎支原体(Mycoplasnia arthritides)或其任意组合。具体说来，用于本发明的精氨酸脱亚胺酶可具有图1所示的一个或多个氨基酸序列。
在本发明的一个实施方案中，所述聚乙二醇(PEG)具有总重均分子量为约1,000到约50,000；更优选从约3,000到约40,000，更优选从约5,000到约30,000；更优选从约8,000到约30,000；更优选从约11,000到约30,000；更优选从约12,000到约28,000；更优选从约16,000到约24,000；更优选从约18,000到约22,000；更优选从约19,000到约21,000以及最优选约20,000。通常，具有30,000或更高分子量的聚乙二醇很难溶解，致使制剂产量大大降低。聚乙二醇可以是支链或直链的，优选直链。通常，提高聚乙二醇的分子量降低ADI的免疫原性。具有本实施方案中描述的分子量的聚乙二醇可与ADI，以及任选与一种生物相容的连接基团连接以治疗癌症，包括例如黑素瘤、肝细胞瘤和肉瘤，优选黑素瘤。
在本发明另一个实施方案中，所述聚乙二醇具有总重均分子量约1,000到约50,000；优选约3,000到约30,000；更优选从约3,000到约20,000；更优选从约4,000到约12,000；更优选从约4,000到约10,000；更优选从约4,000到约8,000；更优选从约4,000到约6,000；最优选约5,000。聚乙二醇可以是支链或直链的，优选直链。具有本实施方案中描述的分子量的聚乙二醇可与ADI，以及任选与一种生物相容的连接基团连接以治疗癌症，包括例如肝细胞瘤、肝细胞瘤和肉瘤，优选肝细胞瘤。
用于将ADI共价连接到PEG上的连接基因可以是任意的生物相容性连接基团。如上所述，″生物相容的″指那些无毒的可在体外或体内使用而不引起损伤、小恙、疾病或死亡的化合物或基团。PEG可以通过例如醚键、酯键、硫醇键或酰胺键与连接基团相连。合适的生物相容性连接基团包括例如酯基、酰胺基、酰亚胺基、氨基甲酸酯基、羧基、羟基、碳水化合物、琥珀酰亚胺基团(包括例如琥珀酸琥珀酰亚胺酯(SS)、丙酸琥珀酰亚胺酯(SPA)、羧甲基化琥珀酰亚胺(SCM)、琥珀酰亚胺基琥珀酰胺(SSA)或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS))、环氧基团、氧基羰基咪唑基(包括例如羰基二咪唑基(CDI))、硝基苯基(包括例如碳酸硝基苯酯(NPC)或碳酸三氯苯酯(TPC))、trysylate基团、醛基、异氰酸酯基、乙烯砜基、酪氨酸基团、半胱氨酸基团、组氨酸基团或伯胺。优选地，所述生物相容性连接基团是酯基和/或琥珀酰亚胺基。更优选地，该连接基团是SS、SPA、SCM、SSA或NHS；更优选SS、SPA或NHS，最优选SS或SPA。
或者，ADI可通过氨基、巯基、羟基或羧基直接与PEG偶联(即没有连接基团)。
利用现有技术中已知的方法，可将ADI通过生物相容性连接基团共价连接于PEG，参见例如，Park等，Anticancer Res.，1373-376(1981)；以及Zaplipsky和Lee，Polyethylene Glycol ChemistryBiotechnical and Biomedical Applications，J.M.Harris编，Plenum Press，NY，Chapter 21(1992)，其所公开的内容在此引入作为参考。
将PEG连接到ADI上可延长ADI的循环半衰期。通常，PEG与ADI的伯胺相连。正如本领域的技术人员已知，在精氨酸脱亚胺酶上选择聚乙二醇连接位点取决于该蛋白质活性结构域内每一位点的作用。PEG可在基本上不损失酶活性的前提下连接到精氨酸脱亚胺酶的伯胺上。例如，由精氨酸支原体、关节炎支原体和人型支原体中克隆的ADI具有约17个可经该程序修饰的赖氨酸。换句话说，这17个赖氨酸都是使ADI通过生物相容性连接基团与PEG相连的可能位点，所述的生物相容性连接基团如SS、SPA、SCM、SSA和/或NHS。PEG也可与ADI在其他位点相连，根据本发明所公开的内容，这对本领域的技术人员而言是显而易见的。
有1到约30个PEG分子可与ADI共价相连。优选地，ADI经约7到约15个PEG分子修饰，更优选经约9到约12个PEG分子修饰。换句话说，精氨酸脱亚胺酶上约30％到约70％的伯氨基被PEG修饰，优选约40％到约60％，更优选约45％到约55％，最优选精氨酸脱亚胺酶上约50％的伯氨基被PEG修饰。当PEG共价连接到ADI末端时，优选只利用了一个PEG分子。增加ADI上的PEG数目可延长该酶的循环半衰期。然而，增加ADI上的PEG数目降低该酶的比活性。因此，需要在两者之间达成平衡，根据本发明所公开的内容，这对本领域的技术人员是显而易见的。
本发明中，最优选的生物相容性连接基团的共同特征在于它们都是通过顺丁烯二酰亚胺基团与精氨酸脱亚胺酶的伯胺相连。一旦与精氨酸脱亚胺酶偶联，SS-PEG有了邻近PEG的酯键，这可使该位点对血清酯酶敏感，从而在体内将PEG从ADI上释放出来。SPA-PEG和PEG2-NHS不具有酯键，所以它们对血清酯酶不敏感。
在本发明中，特定的连接基团似乎不影响PEG-ADI的循环半衰期或其特异酶活性。然而，在本发明中应用生物相容性连接基团非常重要。与蛋白相连的PEG可以是单链，如SS-PEG、SPA-PEG和SC-PEG，也可以用支链PEG，如PEG2-NHS。本发明中优选的连接基团结构式如下阐述。

本发明的化合物之一的治疗有效量是能有效地抑制肿瘤生长的量。通常，治疗以小剂量开始，然后逐渐增加剂量直至达到所述环境下的最佳效果。通常，本发明的化合物的治疗剂量可以是从约1到约200mg/kg，每周两次到大约每两周一次。例如，所述剂量可以是约1mg/kg每周一次，相当于2ml静脉注射，到约20mg/kg每3天一次。ADI-SS-PEG5,000的最佳的剂量可以是约每周两次，而ADI-SS-PEG20,000的最佳剂量可以是从一周大约一次到每两周大约一次。注射前，PEG-ADI可与磷酸盐缓冲液或任何本领域技术人员已知的适当溶液相混合。根据需要，所述的PEG-ADI制剂可以固体(冷干物)或液体剂型施用。
本发明的方法包括体外或体内应用。就体外应用而言，包括细胞培养在内，可将此处描述的化合物添加到培养的细胞中，然后温育。应用本领域众所周知的抗体生产工艺，本发明的化合物也可用于促进单克隆和/或多克隆抗体产生。上述的单克隆和/或多克隆的抗体可用于多种诊断用途，这对本领域的技术人员而言也是显而易见的。
在体内施用本发明的化合物的途径依所要达到的目的不同而有所不同。如本领域的技术人员可以认识到的，可通过下述方式施用本发明的PEG-ADI组合物，例如口服、鼻内、腹膜内、肠胃外、静脉内、淋巴管内、肿瘤内、肌内、间质内、动脉内、皮下、眼内、滑膜内、经上皮和经皮。
实施例通过下述的实施例进一步说明本发明，这些实施例只是起说明的作用，并不对本发明的范围作任何限制。
实施例1重组ADI的产生精氨酸支原体(mycoplasnia arginini)(ATCC 23243)、人型支原体(mycoplasma hominus)(ATCC 23114)和关节炎支原体(mycoplasma arthritides)(ATCC 23192)的培养物从美国典型培养物保藏中心Rockville，Maryland获得。
从精氨酸支原体(mycoplasnia arginini)、人型支原体(Mycoplasmahominus)和关节炎支原体(mycoplasma arthritides)中克隆出精氨酸脱亚胺酶并在大肠杆菌中表达，参见S.Misawa等，J.Biotechnology，36145-155(1994)，该文献中所公开的内容在此以其全文引入作为参考。图1给出了来自上述每一物种中的精氨酸脱亚胺酶的氨基酸序列。上部的氨基酸序列称作ADIPROT来自于精氨酸支原体(mycoplasniaarginini)；中间的氨基酸序列称作ARTADIPRO来自于关节炎支原体(mycoplasma arthritides)，以及下部的氨基酸序列称作HOMADIPRO来自于人型支原体(Mycoplasma hominus)。每一氨基酸序列都有96％以上保守的序列。以本领域技术人员已知的方法表征每一蛋白质的特异酶活性、Km、Vmax和最佳pH，表明它们彼此间在生物化学方面是不能区分的。用柠檬酸缓冲液(pH 5-6.5)、磷酸缓冲液(pH 6.5-7.5)和硼酸缓冲液(pH 7.5-8.5)确定最佳的pH。使酶与不同浓度的精氨酸一起温育并测定瓜氨酸产量，由此确定Km和Vmax。不同酶的Km为约0.02到0.06μM，以及Vmax为约15-20μmol/分钟/mg，这些值都在各自的标准误差范围内。
由源自己公开的精氨酸支原体序列的引物对通过PCR反应扩增精氨酸脱亚胺酶基因，参见例如T.Ohno等，Ihfect.Immun.，583788-3795(1990)，该文献中所公开的内容在此以其全文引入作为参考SEQ ID NO4，5′-GGGATCCATGTCTGTATTTGACAGT-3′SEQ ID NO5，5′-TGAAAGCTTTTACTACCACTTAACATCTTTACG-3′将PCR反应的产物以BamHI-HindIII片段的形式克隆到表达质粒pQE16中。DNA序列分析表明通过PCR扩增出的来自精氨酸支原体的片段与Ohno等，Infect.Immun.，同上中所公开的精氨酸脱亚胺酶基因具有同样的序列。在基因于大肠杆菌中表达前，通过寡核苷酸定点诱变将ADI基因中的5个编码色氨酸的TGA密码子转变为TGG，参见J.R.Sayers等，Biotechniques，13592-596(1992)。重组ADI以包涵体的形式表达，所述包含体占总细胞蛋白的10％。
来自上述三种支原体中的各物种的蛋白具有95％的同源性，且易于通过柱层析纯化。从1公升发酵液中可纯化出大约200mg纯蛋白。重组ADI在37℃下能稳定约两星期，而在4℃下至少能保存8个月。应用本领域技术人员已知的方法测定出该蛋白对精氨酸具有高亲合力(0.04μM)，最佳生理pH为约7.2到约7.4。
实施例2重组ADI的复性与纯化使带有较少修饰的ADI蛋白复性，参见Misawa等，J.Biotechnology，36145-155(1994)，该文献中所公开的内容在此以其全文引入作为参考。将100g细胞浆重悬于800ml的10mM K2PO4、pH7.0，1mM EDTA(缓冲液1)中，在细胞微流量计(Microfluidizer)(Microfluidics Corporation，Newton，MA)中通过两次以使细胞破裂。添加Triton-100达终浓度4％(v/v)。所述匀浆在4℃下搅拌30分钟，然后以13,000g离心30分钟。收集沉淀，将其重悬于1升含有0.5％ TritonX-100的缓冲液1中。用具有100kD截留率的中空纤维柱(Microgon Inc.，Laguna Hills，CA)对5倍体积的变性缓冲液(50mM Tris HCl、pH 8.5，10mM DTT)透滤上述溶液。加入盐酸胍达终浓度6M，将所述溶液在4℃下搅拌15分钟。使所得溶液于再折叠缓冲液1(10mM K2PO4、pH7.0)中稀释100倍，并在15℃下搅拌48小时，15,000xg离心去除颗粒状物。
将所得的上清液经事先用再折叠缓冲液平衡过的Q Sepharose FastFlow(Pharmacia Inc.，Piscataway，NJ)浓缩。用含有0.2M NaCl的再折叠缓冲液洗脱ADI。经SDS-PAGE分析，由上述纯化过程生成的ADI蛋白质纯度高于95％。从1kg细胞浆中可纯化出8g纯的复性的ADI蛋白，相当于每公升发酵产物200mg纯化的ADI。
用Oginsky等，Meth.Enzymol.，(1957)3639-642中描述的微修饰法测定ADI活性。将0.1M Na2PO4、pH 7.0(BUN试验缓冲液)中的10μl样品置于96孔微滴定板中，添加40μl BUN试验缓冲液中的0.5mM精氨酸，盖上培养板，于37℃下温育15分钟。添加20μl完全的BUN试剂(Sigma Diagnostics)，将滴定板在100℃下温育10分钟。将所述滴定板冷却到22℃，并用微滴定板读数仪(Molecular Devices，Inc)在490nm下分析。每分钟将1μmol的L-精氨酸转化成L-胍氨酸的酶量规定为1.0IU。用Pierce考马斯蓝蛋白质分析试剂(Pierce Co.，Rockford，IL)，以牛血清白蛋白作为标准确定蛋白浓度。
纯化的ADI制品酶活性是17-25IU/mg。
实施例3PEG和ADI的连接在100mM、pH 7.4的磷酸缓冲液中将PEG与ADI共价相连。简言之，磷酸缓冲液中的ADI与过量的100mol PEG相混合。在室温下搅拌反应1小时，然后将所述混合物透析以去除非结合的PEG。
第一个实验用来评估PEG-ADI组合物中所用的连接基团的作用。PEG和ADI通过四种不同的连接基团即酯基或顺丁烯二酰亚胺基包括SS、SSA、SPA和SSPA共价相连，其中PEG的总重均分子量为5,000、10,000、12,000、20,000、30,000和40,000；环氧基，环氧-PEG其中PEG的总重均分子量为5,000；以及分枝的PEG基团，PEG2-NHS，其中PEG的总重均分子量为10,000、20,000和40,000。
将5.0IU的所得组合物注射到小鼠中(每组各5只小鼠)。为了测定精氨酸血清水平，对小鼠通过眼眶血管(retro orbital plexus)放血(100μl)。收集后立即加入等体积的50％(w/v)三氯乙酸。离心(13,000xg，30分钟)去除沉淀，取上清于-70℃保存。用Beckman Instruments全自动氨基酸分析仪和试剂，根据制造商所提供的方案分析样品。该方法对精氨酸的灵敏度限度是大约2-6μM，测定值的重复性在约8％以内。通过氨基酸分析确定血清精氨酸的量。如图3结果所示，共价键合PEG和ADI的连接基团对在体内ADI减少血清精氨酸的能力没有可评估的作用。换句话说，除在体内应用必须使用无毒的连接基团外，该连接基团对实验结果并不十分重要。
第二个实验用于评价连接基团和PEG的分子量在体内对血清瓜氨酸水平的影响。小鼠(5只为一组)接受了5.0IU量的不同ADI和PEG-ADI的组合物。为了测定瓜氨酸血清水平，对小鼠通过眼眶血管放血(100μl)。收集后立即加入等体积的50％(w/v)三氯乙酸。离心(13,000xg，30分钟)去除沉淀，取上清于-70℃保存。用BeckmanInstruments全自动氨基酸分析仪和试剂，根据制造商所提供的方案分析样品。该方法对瓜氨酸的灵敏度限度是大约2-6μM，测定值的重复性在约8％以内。确定瓜氨酸的量，曲线下面的面积粗略估计并表示为μmol天。
在图4中，空心圆圈表示由天然ADI产生的瓜氨酸的量，实心圆圈表示ADI-SC-PEG，空心方块表示ADI-SS-PEG，空心三角形表示ADI-SPA-PEG，实心三角形表示支链PEG-NHS-PEG2。图4所示的结果表明PEG的分子量决定PEG-ADI组合物的功效。除在体内使用必须使用生物相容性连接基团之外，PEG-ADI组合物的功效不必需依赖于PEG与ADI结合的方法或方式。
图4的结果还表明PEG的最佳分子量是20,000。尽管在药效方面PEG30,000似乎优于PEG20,000，但PEG30,000可溶性差使其难于操作。产量依赖于酶活性回收，对于PEG5,000和PEG12,000约为90％；对PEG20,000约为85％，以及对PEG30,000约为40％。因此，如瓜氨酸产量所确定的，PEG20,000是在产量和循环半衰期之间达到平衡的最佳选择。
第三个实验用于确定ADI-SS-PEG5,000和ADI-SS-PEG20,000对血清精氨酸消耗和瓜氨酸产量的剂量反应。对小鼠(5只为一组)单次注射0.05IU、0.5IU或5.0IU的ADI-SS-PEG5,000或者ADI-SS-PEG20,000。如上所述在所示的时间收集血清，进行氨基酸分析以量化血清精氨酸(图5A和5C)和血清瓜氨酸(图5B和5D)。两种剂型都诱导剂量依赖性的血清精氨酸减少和血清瓜氨酸增加。然而，ADI-SS-PEG20,000的诱导效果比ADI-SS-PEG5,000的效果更明显，持续时间更长。
实施例4ADI介导的细胞毒性的选择性用一些人肿瘤证明精氨酸脱亚胺酶介导的细胞毒性的选择性。具体而言，在体外检测人肿瘤对ADI-SS-PEG5,000(50ng/ml)的灵敏度。7天后确定培养物的生存力。在多于95％的细胞吸收台盼蓝染料的情况下，可将所述培养物定义为“抑制的”。也检测了许多正常细胞，包括内皮细胞、平滑肌细胞、上皮细胞和成纤维细胞，这些细胞均不受ADI-SS-PEG5,000的抑制。尽管精氨酸脱亚胺酶对正常细胞和大多数肿瘤细胞没有可测量的毒性，但是ADI-SS-PEG5,000却大大抑制了全部的人黑素瘤和肝细胞瘤，这些瘤细胞是从ATCC、MSKCC和欧洲商购。
表1精氨酸脱亚胺酶细胞毒性的专一性
在一组平行实验中，从所述肿瘤中分离mRNA。利用人精氨基琥珀酸合酶cDNA探针进行Northern印迹分析，表明在精氨酸脱亚胺酶处理的灵敏度与不能表达精氨基琥珀酸合酶之间存在完全一致性。这些数据表明ADI毒性是由于其不能诱导精氨基琥珀酸合酶引起的。因此，这些细胞不能从瓜氨酸合成精氨酸，也不能合成生长所必须的蛋白质。
实施例5循环半衰期如图2A和2B所示，Balb C小鼠(5只为一组)静脉内注射单剂量5.0IU的天然精氨酸脱亚胺酶或者不同剂型的经聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚胺酶。为了测定精氨酸和瓜氨酸的血清水平，对小鼠通过眼眶血管放血(100μl)。收集后立即加入等体积的50％(w/v)三氯乙酸。离心(13,000xg，30分钟)去除沉淀，取上清于-70℃保存。用BeckmanInstruments全自动氨基酸分析仪和试剂，根据制造商所提供的方案分析样品。该方法对精氨酸的灵敏度限度是大约6pM，测定值的重复性在约8％以内。
单剂量施用天然ADI(实心圆圈)或ADI-SS-PEG(空心三角形)后，检测到剂量依赖性的血清精氨酸水平降低，如图2A的实心圆圈所示，和血清瓜氨酸升高，如图2B中的空心三角形所示。然而血清精氨酸降低和血清升高都是短暂的，不久即恢复正常。精氨酸消耗的半衰期概括于下表。
表2血清精氨酸消耗的半衰期
该实验表明正常细胞和组织能在细胞内将瓜氨酸转变回精氨酸，而黑素瘤和肝细胞瘤不能，这是因为它们缺乏精氨基琥珀酸合成酶。
实施例6PEG修饰的ADI的抗原性为了确定天然ADI、ADI-SS-PEG5,000和ADI SS-PEG20,000的抗原性，应用下述文献中所述的方法，参见Park，Ahticancer Res.，同上和Kamisaki，J.Pharmacol.Exp.Ther.，同上。简言之，每周对Balb C小鼠(5只为一组)静脉内注射大约0.5IU(100μg蛋白质)的天然ADI、ADI-SS-PEG5,000或ADI-SS-PEG20,000，共12周。在实验开始和第4、8和12周将所述动物从眼眶后血管放血(0.05ml)。分离血清并贮存于-70℃。用ELISA测定抗-ADI IgG的效价。在96孔微滴定板的每孔中加入50μg ADI，室温下温育4小时。用PBS洗板，接着用牛血清白蛋白(1mg/ml)包被以封闭非特异性蛋白结合位点，在4℃下保存过夜。次日稀释小鼠血清，并加到孔中。1小时后，用PBS洗板，并将偶联了过氧化物酶的兔抗小鼠IgG加到孔中。板温育30分钟，然后用微滴定板读数仪测定所得的UV吸光度。将效价单位定义为导致较背景吸光度(约0.50OD)高出两倍的血清最高稀释度。
结果如图6所示。空心圆圈代表由注射抗原性很强的天然ADI的动物所得的数据。实心圆圈代表由注射了ADI-SS-PEG5,000的动物所获得的数据，而空心三角形代表由注射了ADI-SS-PEG20,000的动物所获得的数据。从图6中可以看出，ADI-SS-PEG5,000和ADI-SS-PEG20,000的抗原性显著地低于天然ADI。例如，少至4次注射天然ADI导致约106的效价，而4次注射任何PEG-ADI剂型均未产生任何可测量的抗体。然而，在8次注射ADI-PEG5,000后产生了大约102的效价，而在12次注射以前，ADI-PEG20,000均未诱导如此的免疫系统反应。该结果表明PEG结合到ADI上钝化了该蛋白的免疫应答。
实施例7人黑素瘤的肿瘤抑制在裸鼠中测定了PEG-ADI对人黑素瘤生长的影响。给裸鼠(5只为一组)注射106SK-mel 2人黑素瘤细胞，并使所述细胞生长到肿瘤直径约3-5毫米。小鼠或不经处理(空心圆圈)，或用5.0IU的ADI-SS-PEG5,000(实心三角形)、ADI-SS-PEG12,000(空心三角)或ADI-SS-PEG20,000(实心圆圈)每周处理一次，共8周。每周测定肿瘤的大小，所述肿瘤的平均直径示于图7中。
图8表示ADI-SS-PEG20,000对在裸鼠体内生长的三种人黑素瘤(SK-mel 2、SK-mel 28、M24-met)的效果。给裸鼠(5只为一组)注射106SK mel 2、SK mel 28或M24-met人黑素瘤细胞。使所述肿瘤生长到直径约为3-5毫米。其后，上述动物每周注射一次5.0IU的ADI-SS-PEG20,000。如图8所示的结果表明，PEG-ADI抑制了肿瘤的生长，最终使肿瘤慢慢变小直至完全消失。因为肿瘤没有精氨基琥珀酸合成酶，它们不能合成蛋白质(因为ADI去除了精氨酸且肿瘤不能合成精氨酸)，因此该细胞“饥饿致死”。
由于M24-met人黑素瘤是高度转移性的，注射了M24-met人黑素瘤细胞的动物在处理4周后处死，测定动物肺中转移灶的数目。对照动物平均有32个转移灶，而用ADI-SS-PEG20,000处理的动物种没有任何转移灶。这一结果似乎表明，ADI-SS-PEG20,000不但抑制原发性黑素瘤的生长而且抑制肿瘤的转移。
有趣的是，在200只以上的受试动物中，对照组的平均转移灶数目为49±18，而在经处理的动物中仅有1只发现有单个转移灶。
实施例8人肝细胞瘤的抑制检测了PEG-ADI在体内抑制人肝细胞瘤生长的能力。给裸鼠(5只为一组)注射106人肝细胞瘤SKHepl细胞。使所述的肿瘤生长2周，然后用5.0IU的SS-PEG5,000-ADI(实心圆圈)、SS-PEG12,000-ADI(实心三角形)或SS-PEG20,000-ADI(空心三角形)处理所述动物，每周一次。结果如图9所示。未经处理的动物(空心圆圈)在3周内全部死亡。相反，从图9中可以看出，用ADI处理的动物可有较长的寿命。所存活的小鼠在6个月后处以安乐死，尸检表明它们都没有肿瘤。
令人惊讶的是，PEG5,000-ADI在体内抑制肝细胞瘤生长最有效。这种现象的恰切机理仍是未知的。本发明的工作不束缚于任何理论，似乎用SS-PEG5,000-ADI配制的蛋白在肝中被隔离开了。较大分子量的PEG不是如此，这可能是因为肝内皮的独特性和空间的大小使较大分子量的PEG-ADI结合物被排除在外了。
实施例9对人的应用将PEG5,000-ADI和PEG20,000-ADI在体外与正常人血清一同温育，通过氨基酸分析确定其对精氨酸浓度的影响，其中发现该酶是完全活性的，并能以与在小鼠实验中相同的动力学降解全部可检测到的精氨酸。0.1ml的反应体积在37℃下进行1小时。
另外，在人血清中的精氨酸和瓜氨酸水平与在小鼠中发现的情况相同。PEG-蛋白质在人中比在小鼠中循环更长时间。例如，腺苷脱亚胺酶、天冬酰胺酶、glucocerbrocidase、尿酸酶、血球蛋白(hemoglobulin)和过氧化物歧化酶与PEG结合后，其循环半衰期都比相同制剂在小鼠中的循环半衰期长5到10倍。这意味着，用于人的剂量通常是用于小鼠剂量的1/5到1/10。因此，PEG-ADI在人中应当比在小鼠中循环更长的时间。
本说明书中所引述的每一篇专利、专利申请和出版物均以其全文引入作为参考。
除此处所描述的以外，鉴于前文所述，本发明所做的任何改变对本领域的技术人员而言显而易见。这些修改也同样落入本申请所附权利要求的范围之内。
序列表<110> 凤凰药理学公司(Phoenix Pharmaceologics，Inc.)<120> 修饰的精氨酸脱亚胺酶(Modified Arginine Deiminase)<130> SCT031404-47<150> PCT/US01/29184<151> 2001-09-19<150> 09/723,546<151> 2000-11-28<160> 14<170> PatentIn version 3.2<210> 1<211> 410<212> PRT<213> 精氨酸支原体(Mycoplasma arginini)<400> 1Met Ser Val Phe Asp Ser Lys Phe Lys Gly Ile His Val Tyr Ser Glu1 5 10 15Ile Gly Glu Leu Glu Ser Val Leu Val His Glu Pro Gly Arg Glu Ile20 25 30Asp Tyr Ile Thr Pro Ala Arg Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ile35 40 45Leu Glu Ser His Asp Ala Arg Lys Glu His Lys Gln Phe Val Ala Glu50 55 60Leu Lys Ala Asn Asp Ile Asn Val Val Glu Leu Ile Asp Leu Val Ala65 70 75 80Glu Thr Tyr Asp Leu Ala Ser Gln Glu Ala Lys Asp Lys Leu Ile Glu85 90 95Glu Phe Leu Glu Asp Ser Glu Pro Val Leu Ser Glu Glu His Lys Val100 105 110
Val Val Arg Asn Phe Leu Lys Ala Lys Lys Thr Ser Arg Lys Leu Val115 120 125Glu Ile Met Met Ala Gly Ile Thr Lys Tyr Asp Leu Gly Ile Glu Ala130 135 140Asp His Glu Leu Ile Val Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg145 150 155 160Asp Pro Phe Ala Ser Val Gly Asn Gly Val Thr Ile His Tyr Met Arg165 170 175Tyr Lys Val Arg Gln Arg Glu Thr Leu Phe Ser Arg Phe Val Phe Ser180 185 190Asn His Pro Lys Leu Ile Asn Thr Pro Trp Tyr Tyr Asp Pro Ser Leu195 200 205Lys Leu Ser Ile Glu Gly Gly Asp Val Phe Ile Tyr Asn Asn Asp Thr210 215 220Leu Val Val Gly Val Ser Glu Arg Thr Asp Leu Gln Thr Val Thr Leu225 230 235 240Leu Ala Lys Asn Ile Val Ala Asn Lys Glu Cys Glu Phe Lys Arg Ile245 250 255Val Ala Ile Asn Val Pro Lys Trp Thr Asn Leu Met His Leu Asp Thr260 265 270Trp Leu Thr Met Leu Asp Lys Asp Lys Phe Leu Tyr Ser Pro Ile Ala275 280 285Asn Asp Val Phe Lys Phe Trp Asp Tyr Asp Leu Val Asn Gly Gly Ala290 295 300Glu Pro Gln Pro Val Glu Asn Gly Leu Pro Leu Glu Gly Leu Leu Gln305 310 315 320Ser Ile Ile Asn Lys Lys Pro Val Leu Ile Pro Ile Ala Gly Glu Gly325 330 335Ala Ser Gln Met Glu Ile Glu Arg Glu Thr His Phe Asp Gly Thr Asn
340 345 350Tyr Leu Ala Ile Arg Pro Gly Val Val Ile Gly Tyr Ser Arg Asn Glu355 360 365Lys Thr Asn Ala Ala Leu Glu Ala Ala Gly Ile Lys Val Leu Pro Phe370 375 380His Gly Asn Gln Leu Ser Leu Gly Met Gly Asn Ala Arg Cys Met Ser385 390 395 400Met Pro Leu Ser Arg Lys Asp Val Lys Trp405 410<210>2<211>410<212>PRT<213>关节炎支原体(Mycoplasma arthritidis)<400>2Met Ser Val Phe Asp Ser Lys Phe Lys Gly Ile His Val Tyr Ser Glu1 5 10 15Ile Gly Glu Leu Glu Ser Val Leu Val His Glu Pro Gly Arg Glu Ile20 25 30Asp Tyr Ile Thr Pro Ala Arg Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ile35 40 45Leu Glu Ser His Asp Ala Arg Lys Glu Gln Ser Gln Phe Val Ala Ile50 55 60Leu Lys Ala Asn Asp Ile Asn Val Val Glu Thr Ile Asp Leu Val Ala65 70 75 80Glu Thr Tyr Asp Leu Ala Ser Gln Glu Ala Lys Asp Arg Leu Ile Glu85 90 95Glu Phe Leu Glu Asp Ser Glu Pro Val Leu Ser Glu Ala His Lys Lys100 105 110Val Val Arg Asn Phe Leu Lys Ala Lys Lys Thr Ser Arg Lys Leu Val115 120 125
Glu Leu Met Met Ala Gly Ile Thr Lys Tyr Asp Leu Gly Val Glu Ala130 135 140Asp His Glu Leu Ile Val Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg145 150 155 160Asp Pro Phe Ala Ser Val Gly Asn Gly Val Thr Ile His Phe Met Arg165 170 175Tyr Lys Val Arg Arg Arg Glu Thr Leu Phe Ser Arg Phe Val Phe Arg180 185 190Asn His Pro Lys Leu Val Asn Thr Pro Trp Tyr Tyr Asp Pro Ala Met195 200 205Lys Leu Ser Ile Glu Gly Gly Asp Val Phe Ile Tyr Asn Asn Asp Thr210 215 220Leu Val Val Gly Val Ser Glu Arg Thr Asp Leu Asp Thr Val Thr Leu225 230 235 240Leu Ala Lys Asn Leu Val Ala Asn Lys Glu Cys Glu Phe Lys Arg Ile245 250 255Val Ala Ile Asn Val Pro Lys Trp Thr Asn Leu Met His Leu Asp Thr260 265 270Trp Leu Thr Met Leu Asp Lys Asn Lys Phe Leu Tyr Ser Pro Ile Ala275 280 285Asn Asp Val Phe Lys Phe Trp Asp Tyr Asp Leu Val Asn Gly Gly Ala290 295 300Glu Pro Gln Pro Val Glu Asn Gly Leu Pro Leu Glu Lys Leu Leu Gln305 310 315 320Ser Ile Ile Asn Lys Lys Pro Val Leu Ile Pro Ile Ala Gly Glu Gly325 330 335Ala Ser Gln Met Glu Ile Glu Arg Glu Thr His Phe Asp Gly Thr Asn340 345 350Tyr Ile Ala Ile Arg Pro Gly Val Val Ile Gly Tyr Ser Arg Asn Glu
355 360 365Lys Thr Asn Ala Ala Leu Lys Ala Ala Gly Ile Lys Val Leu Pro Phe370 375 380His Gly Asn Gln Leu Ser Leu Gly Met Gly Asn Ala Arg Cys Met Ser385 390 395 400Met Pro Leu Ser Arg Lys Asp Val Lys Trp405 410<210>3<211>409<212>PRT<213>人型支原体(Mycoplasma hominis)<400>3Met Ser Val Phe Asp Ser Lys Phe Asn Gly Ile His Val Tyr Ser Glu1 5 10 15Ile Gly Glu Leu Glu Thr Val Leu Val His Glu Pro Gly Arg Glu Ile20 25 30Asp Tyr Ile Thr Pro Ala Arg Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ile35 40 45Leu Glu Ser His Asp Ala Arg Lys Glu His Gln Ser Phe Val Lys Ile50 55 60Met Lys Asp Arg Gly Ile Asn Val Val Glu Leu Thr Asp Leu Val Ala65 70 75 80Glu Thr Tyr Asp Leu Ala Ser Lys Ala Ala Lys Glu Glu Phe Ile Glu85 90 95Thr Phe Leu Glu Glu Thr Val Pro Val Leu Thr Glu Ala Asn Lys Lys100 105 110Ala Val Arg Ala Phe Leu Leu Ser Lys Pro Thr His Glu Met Val Glu115 120 125Phe Met Met Ser Gly Ile Thr Lys Tyr Glu Leu Gly Val Glu Ser Glu130 135 140
Asn Glu Leu Ile Val Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg Asp145 150 155 160Pro Phe Ala Ser Val Gly Asn Gly Val Thr Ile His Phe Met Arg Tyr165 170 175Ile Val Arg Arg Arg Glu Thr Leu Phe Ala Arg Phe Val Phe Arg Asn180 185 190His Pro Lys Leu Val Lys Thr Pro Trp Tyr Tyr Asp Pro Ala Met Lys195 200 205Met Pro Ile Glu Gly Gly Asp Val Phe Ile Tyr Asn Asn Glu Thr Leu210 215 220Val Val Gly Val Ser Glu Arg Thr Asp Leu Asp Thr Ile Thr Leu Leu225 230 235 240Ala Lys Asn Ile Lys Ala Asn Lys Glu Val Glu Phe Lys Arg Ile Val245 250 255Ala Ile Asn Val Pro Lys Trp Thr Asn Leu Met His Leu Asp Thr Trp260 265 270Leu Thr Met Leu Asp Lys Asn Lys Phe Leu Tyr Ser Pro Ile Ala Asn275 280 285Asp Val Phe Lys Phe Trp Asp Tyr Asp Leu Val Asn Gly Gly Ala Glu290 295 300Pro Gln Pro Gln Leu Asn Gly Leu Pro Leu Asp Lys Leu Leu Ala Ser305 310 315 320Ile Ile Asn Lys Glu Pro Val Leu Ile Pro Ile Gly Gly Ala Gly Ala325 330 335Thr Glu Met Glu Ile Ala Arg Glu Thr Asn Phe Asp Gly Thr Asn Tyr340 345 350Leu Ala Ile Lys Pro Gly Leu Val Ile Gly Tyr Asp Arg Asn Glu Lys355 360 365Thr Asn Ala Ala Leu Lys Ala Ala Gly Ile Thr Val Leu Pro Phe His
370 375 380Gly Asn Gln Leu Ser Leu Gly Met Gly Asn Ala Arg Cys Met Ser Met385 390 395 400Pro Leu Ser Arg Lys Asp Val Lys Trp405<210>4<211>25<212>DNA<213>精氨酸支原体(Mycoplasma arginini)<400>4gggatccatg tctgtatttg acagt 25<210>5<211>33<212>DNA<213>精氨酸支原体(Mycoplasma arginini)<400>5tgaggatcct tactaccact taacatcttt acg 33<210>6<211>411<212>PRT<213>化脓链球菌(Steptococcus pyogenes)<400>6Met Thr Ala Gln Thr Pro Ile His Val Tyr Ser Glu Ile Gly Lys Leu1 5 10 15Lys Lys Val Leu Leu His Arg Pro Gly Lys Glu Ile Glu Asn Leu Met20 25 30Pro Asp Tyr Leu Glu Arg Leu Leu Phe Asp Asp Ile Pro Phe Leu Glu35 40 45Asp Ala Gln Lys Glu His Asp Ala Phe Ala Gln Ala Leu Arg Asp Glu50 55 60
Gly Ile Glu Val Leu Tyr Leu Glu Thr Leu Ala Ala Glu Ser Leu Val65 70 75 80Thr Pro Glu Ile Arg Glu Ala Phe Ile Asp Glu Tyr Leu Ser Glu Ala85 90 95Asn Ile Arg Gly Arg Ala Thr Lys Lys Ala Ile Arg Glu Leu Leu Met100 105 110Ala Ile Glu Asp Asn Gln Glu Leu Ile Glu Lys Thr Met Ala Gly Val115 120 125Gln Lys Ser Glu Leu Pro Glu Ile Pro Ala Ser Glu Lys Gly Leu Thr130 135 140Asp Leu Val Glu Ser Asn Tyr Pro Phe Ala Ile Asp Pro Met Pro Asn145 150 155 160Leu Tyr Phe Thr Arg Asp Pro Phe Ala Thr Ile Gly Thr Gly Val Ser165 170 175Leu Asn His Met Phe Ser Glu Thr Arg Asn Arg Glu Thr Leu Tyr Gly180 185 190Lys Tyr Ile Phe Thr His His Pro Ile Tyr Gly Gly Gly Lys Val Pro195 200 205Met Val Tyr Asp Arg Asn Glu Thr Thr Arg Ile Glu Gly Gly Asp Glu210 215 220Leu Val Leu Ser Lys Asp Val Leu Ala Val Gly Ile Ser Gln Arg Thr225 230 235 240Asp Ala Ala Ser Ile Glu Lys Leu Leu Val Asn Ile Phe Lys Gln Asn245 250 255Leu Gly Phe Lys Lys Val Leu Ala Phe Glu Phe Ala Asn Asn Arg Lys260 265 270Phe Met His Leu Asp Thr Val Phe Thr Met Val Asp Tyr Asp Lys Phe275 280 285Thr Ile His Pro Glu Ile Glu Gly Asp Leu Arg Val Tyr Ser Val Thr
290 295 300Tyr Asp Asn Glu Glu Leu His Ile Val Glu Glu Lys Gly Asp Leu Ala305 310 315 320Glu Leu Leu Ala Ala Asn Leu Gly Val Glu Lys Val Asp Leu Ile Arg325 330 335Cys Gly Gly Asp Asn Leu Val Ala Ala Gly Arg Glu Gln Trp Asn Asp340 345 350Gly Ser Asn Thr Leu Thr Ile Ala Pro Gly Val Val Val Val Tyr Ash355 360 365Arg Asn Thr Ile Thr Asn Ala Ile Leu Glu Ser Lys Gly Leu Lys Leu370 375 380Ile Lys Ile His Gly Ser Glu Leu Val Arg Gly Arg Gly Gly Pro Arg385 390 395 400Cys Met Ser Met Pro Phe Glu Arg Glu Asp Ile405 410<210>7<211>409<212>PRT<213>肺炎链球菌(Steptococcus pneumoniae)<400>7Met Ser Ser His Pro Ile Gln Val Phe Ser Glu Ile Gly Lys Leu Lys1 5 10 15Lys Val Met Leu His Arg Pro Gly Lys Glu Leu Glu Asn Leu Leu Pro20 25 30Asp Tyr Leu Glu Arg Leu Leu Phe Asp Asp Ile Pro Phe Leu Glu Asp35 40 45Ala Gln Lys Glu His Asp Ala Phe Ala Gln Ala Leu Arg Asp Glu Gly50 55 60Ile Glu Val Leu Tyr Leu Glu Gln Leu Ala Ala Glu Ser Leu Thr Ser65 70 75 80
Pro Glu Ile Arg Asp Gln Phe Ile Glu Glu Tyr Leu Asp Glu Ala Asn85 90 95Ile Arg Asp Arg Gln Thr Lys Val Ala Ile Arg Glu Leu Leu His Gly100 105 110Ile Lys Asp Asn Gln Glu Leu Val Glu Lys Thr Met Ala Gly Ile Gln115 120 125Lys Val Glu Leu Pro Glu IIe Pro Asp Glu Ala Lys Asp Leu Thr Asp130 135 140Leu Val Glu Ser Glu Tyr Pro Phe Ala Ile Asp Pro Met Pro Asn Leu145 150 155 160Tyr Phe Thr Arg Asp Pro Phe Ala Thr Ile Gly Asn Ala Val Ser Leu165 170 175Asn His Met Phe Ala Asp Thr Arg Asn Arg Glu Thr Leu Tyr Gly Lys180 185 190Tyr Ile Phe Lys Tyr His Pro Ile Tyr Gly Gly Lys Val Asp Leu Val195 200 205Tyr Asn Arg Glu Glu Asp Thr Arg Ile Glu Gly Gly Asp Glu Leu Val210 215 220Leu Ser Lys Asp Val Leu Ala Val Gly Ile Ser Gln Arg Thr Asp Ala225 230 235 240Ala Ser Ile Glu Lys Leu Leu Val Asn Ile Phe Lys Lys Asn Val Gly245 250 255Phe Lys Lys Val Leu Ala Phe Glu Phe Ala Asn Asn Arg Lys Phe Met260 265 270His Leu Asp Thr Val Phe Thr Met Val Asp Tyr Asp Lys Phe Thr Ile275 280 285His Pro Glu Ile Glu Gly Asp Leu His Val Tyr Ser Val Thr Tyr Glu290 295 300Asn Glu Lys Leu Lys Ile Val Glu Glu Lys Gly Asp Leu Ala Glu Leu
305 310 315 320Leu Ala Gln Asn Leu Gly Val Glu Lys Val His Leu Ile Arg Cys Gly325 330 335Gly Gly Asn Ile Val Ala Ala Ala Arg Glu Gln Trp Asn Asp Gly Ser340 345 350Asn Thr Leu Thr Ile Ala Pro Gly Val Val Val Val Tyr Asp Arg Asn355 360 365Thr Val Thr Asn Lys Ile Leu Glu Glu Tyr Gly Leu Arg Leu Ile Lys370 375 380Ile Arg Gly Ser Glu Leu Val Arg Gly Arg Gly Gly Pro Arg Cys Met385 390 395 400Ser Met Pro Phe Glu Arg Glu Glu Val405<210>8<211>410<212>PRT<213>布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)<400>8Met Glu Glu Glu Tyr Leu Asn Pro Ile Asn Ile Phe Ser Glu Ile Gly1 5 10 15Arg Leu Lys Lys Val Leu Leu His Arg Pro Gly Glu Glu Leu Glu Asn20 25 30Leu Thr Pro Leu IIe Met Lys Asn Phe Leu Phe Asp Asp Ile Pro Tyr35 40 45Leu Lys Val Ala Arg Gln Glu His Glu Val Phe Val Asn Ile Leu Lys50 55 60Asp Asn Ser Val Glu Ile Glu Tyr Val Glu Asp Leu Val Ser Glu Val65 70 75 80Leu Ala Ser Ser Val Ala Leu Lys Asn Lys Phe Ile Ser Gln Phe Ile85 90 95
Leu Glu Ala Glu Ile Lys Thr Asp Gly Val Ile Asn Ile Leu Lys Asp100 105 110Tyr Phe Ser Asn Leu Thr Val Asp Asn Met Val Ser Lys Met Ile Ser115 120 125Gly Val Ala Arg Glu Glu Leu Lys Asp Cys Glu Phe Ser Leu Asp Asp130 135 140Trp Val Asn Gly Ser Ser Leu Phe Val Ile Asp Pro Met Pro Asn Val145 150 155 160Leu Phe Thr Arg Asp Pro Phe Ala Ser Ile Gly Asn Gly Ile Thr Ile165 170 175Asn Lys Met Tyr Thr Lys Val Arg Arg Arg Glu Thr Ile Phe Ala Glu180 185 190Tyr Ile Phe Lys Tyr His Ser Ala Tyr Lys Glu Asn Val Pro Ile Trp195 200 205Phe Asn Arg Trp Glu Glu Thr Ser Leu Glu Gly Gly Asp Glu Phe Val210 215 220Leu Asn Lys Asp Leu Leu Val Ile Gly Ile Ser Glu Arg Thr Glu Ala225 230 235 240Gly Ser Val Glu Lys Leu Ala Ala Ser Leu Phe Lys Asn Lys Ala Pro245 250 255Phe Ser Thr Ile Leu Ala Phe Lys Ile Pro Lys Asn Arg Ala Tyr Met260 265 270His Leu Asp Thr Val Phe Thr Gln Ile Asp Tyr Ser Val Phe Thr Ser275 280 285Phe Thr Ser Asp Asp Met Tyr Phe Ser Ile Tyr Val Leu Thr Tyr Asn290 295 300Ser Asn Ser Asn Lys Ile Asn Ile Lys Lys Glu Lys Ala Lys Leu Lys305 310 315 320Asp Val Leu Ser Phe Tyr Leu Gly Arg Lys Ile Asp Ile Ile Lys Cys
325 330 335Ala Gly Gly Asp Leu Ile His Gly Ala Arg Glu Gln Trp Asn Asp Gly340 345 350Ala Asn Val Leu Ala Ile Ala Pro Gly Glu Val Ile Ala Tyr Ser Arg355 360 365Asn His Val Thr Asn Lys Leu Phe Glu Glu Asn Gly Ile Lys Val His370 375 380Arg Ile Pro Ser Ser Glu Leu Ser Arg Gly Arg Gly Gly Pro Arg Cys385 390 395 400Met Ser Met Ser Leu Val Arg Glu Asp Ile405 410<210>9<211>409<212>PRT<213>阿氏疏螺旋体(Borrelia afzelii)<400>9Met Glu Glu Tyr Leu Asn Pro Ile Asn Ile Phe Ser Glu Ile Gly Arg1 5 10 15Leu Lys Lys Val Leu Leu His Arg Pro Gly Glu Glu Leu Glu Asn Leu20 25 30Thr Pro Phe Ile Met Lys Asn Phe Leu Phe Asp Asp Ile Pro Tyr Leu35 40 45Glu Val Ala Arg Gln Glu His Glu Val Phe Ala Ser Ile Leu Lys Asn50 55 60Asn Leu Val Glu Ile Glu Tyr Ile Glu Asp Leu Ile Ser Glu Val Leu65 70 75 80Val Ser Ser Val Ala Leu Glu Asn Lys Phe Ile Ser Gln Phe Ile Leu85 90 95Glu Ala Glu Ile Lys Thr Asp Phe Thr Ile Asn Leu Leu Lys Asp Tyr100 105 110
Phe Ser Ser Leu Thr Ile Asp Asn Met Ile Ser Lys Met Ile Ser Gly115 120 125Val Val Thr Glu Glu Leu Lys Asn Tyr Thr Ser Ser Leu Asp Asp Leu130 135 140Val Asn Gly Ala Asn Leu Phe Ile Ile Asp Pro Met Pro Asn Val Leu145 150155 160Phe Thr Arg Asp Pro Phe Ala Ser Ile Gly Asn Gly Val Thr Ile Asn165 170 175Lys Met Phe Thr Lys Val Arg Gln Arg Glu Thr Ile Phe Ala Glu Tyr180 185 190Ile Phe Lys Tyr His Pro Val Tyr Lys Glu Asn Val Pro Ile Trp Leu195 200 205Asn Arg Trp Glu Glu Ala Ser Leu Glu Gly Gly Asp Glu Leu Val Leu210 215 220Ash Lys Gly Leu Leu Val Ile Gly Ile Ser Glu Arg Thr Glu Ala Lys225 230 235 240Ser Val Glu Lys Leu Ala Ile Ser Leu Phe Lys Asn Lys Thr Ser Phe245 250 255Asp Thr Ile Leu Ala Phe Gln Ile Pro Lys Asn Arg Ser Tyr Met His260 265 270Leu Asp Thr Val Phe Thr Gln Ile Asp Tyr Ser Val Phe Thr Ser Phe275 280 285Thr Ser Asp Asp Met Tyr Phe Ser Ile Tyr Val Leu Thr Tyr Asn Pro290 295 300Ser Ser Ser Lys Ile His Ile Lys Lys Glu Lys Ala Arg Ile Lys Asp305 310 315 320Val Leu Ser Phe Tyr Leu Gly Arg Lys Ile Asp Ile Ile Lys Cys Ala325 330 335Gly Gly Asp Leu Ile His Gly Ala Arg Glu Gln Trp Asn Asp Gly Ala
340 345 350Asn Val Leu Ala Ile Ala Pro Gly Glu Ile Ile Ala Tyr Ser Arg Asn355 360 365His Val Thr Asn Lys Leu Phe Glu Glu Asn Gly Ile Lys Val His Arg370 375 380Ile Pro Ser Ser Glu Leu Ser Arg Gly Arg Gly Gly Pro Arg Cys Met385 390 395 400Ser Met Pro Leu Ile Arg Glu Asp Ile405<210>10<211>580<212>PRT<213>Qiardia intestinalis<400>10Met Thr Asp Phe Ser Lys Asp Lys Glu Lys Leu Ala Gln Ala Thr Glnl 5 10 15Gly Gly Glu Asn Glu Arg Ala Glu Ile Val Val Val His Leu Pro Gln20 25 30Gly Thr Ser Phe Leu Thr Ser Leu Asn Pro Glu Gly Asn Leu Leu Glu35 40 45Glu Pro Ile Cys Pro Asp Glu Leu Arg Arg Asp His Glu Gly Phe Gln50 55 60Ala Val Leu Lys Glu Lys Gly Cys Arg Val Tyr Met Pro Tyr Asp Val65 70 75 80Leu Ser Glu Ala Ser Pro Ala Glu Arg Glu Val Leu Met Asp Gln Ala85 90 95Met Ala Ser Leu Lys Tyr Glu Leu His Ala Thr Gly Ala Arg Ile Thr100 105 110Pro Lys Met Lys Tyr Cys Val Ser Asp Glu Tyr Lys Arg Lys Val Leu115 120 125
Ser Ala Leu Ser Thr Arg Asn Leu Val Asp Val Ile Leu Ser Glu Pro130 135 140Val Ile His Leu Ala Pro Gly Val Arg Asn Thr Ala Leu Val Thr Asn145 150 155 160Ser Val Glu Ile His Asp Ser Asn Asn Met Val Phe Met Arg Asp Gln165 170 175Gln Ile Thr Thr Arg Arg Gly Ile Val Met Gly Gln Phe Gln Ala Pro180 185 190Gln Arg Arg Arg Glu Gln Val Leu Ala Leu Ile Phe Trp Lys Arg Leu195 200 205Gly Ala Arg Val Val Gly Asp Cys Arg Glu Gly Gly Pro His Cys Met210 215 220Leu Glu Gly Gly Asp Phe Val Pro Val Ser Pro Gly Leu Ala Met Met225 230 235 240Gly Val Gly Leu Arg Ser Thr Tyr Val Gly Ala Gln Tyr Leu Met Ser245 250 255Lys Asp Leu Leu Gly Thr Arg Arg Phe Ala Val Val Lys Asp Cys Phe260 265 270Asp Gln His Gln Asp Arg Met His Leu Asp Cys Thr Phe Ser Val Leu275 280 285His Asp Lys Leu Val Val Leu Asp Asp Tyr Ile Cys Ser Gly Met Gly290 295 300Leu Arg Tyr Val Asp Glu Trp lle Asp Val Gly Ala Asp Ala Val Lys305 310 315 320Lys Ala Lys Ser Ser Ala Val Thr Cys Gly Asn Tyr Val Leu Ala Lys325 330 335Ala Asn Val Glu Phe Gln Gln Trp Leu Ser Glu Asn Gly Tyr Thr Ile340 345 350Val Arg Ile Pro His Glu Tyr Gln Leu Ala Tyr Gly Cys Asn Asn Leu
355 360 365Asn Leu Gly Asn Asn Cys Val Leu Ser Val His Gln Pro Thr Val Asp370 375 380Phe Ile Lys Ala Asp Pro Ala Tyr Ile Ser Tyr Cys Lys Ser Asn Asn385 390 395 400Leu Pro Asn Gly Leu Asp Leu Val Tyr Val Pro Phe Arg Gly Ile Thr405 410 415Arg Met Tyr Gly Ser Leu His Cys Ala Ser Gln Val Val Tyr Arg Thr420 425 430Pro Leu Ala Pro Ala Ala Val Lys Ala Cys Glu Gln Glu Gly Asp Gly435 440 445Ile Ala Ala Ile Tyr Glu Lys Asn Gly Glu Pro Val Asp Ala Ala Gly450 455 460Lys Lys Phe Asp Cys Val Ile Tyr Ile Pro Ser Ser Val Asp Asp Leu465 470 475 480Ile Asp Gly Leu Lys Ile Asn Leu Arg Asp Asp Ala Ala Pro Ser Arg485 490 495Glu Ile Ile Ala Asp Ala Tyr Gly Leu Tyr Gln Lys Leu Val Ser Glu500 505 510Gly Arg Val Pro Tyr Ile Thr Trp Arg Met Pro Ser Met Pro Val Val515 520 525Ser Leu Lys Gly Ala Ala Lys Ala Gly Ser Leu Lys Ala Val Leu Asp530 535 540Lys Ile Pro Gln Leu Thr Pro Phe Thr Pro Lys Ala Val Glu Gly Ala545 550 555 560Pro Ala Ala Tyr Thr Arg Tyr Leu Gly Leu Glu Gln Ala Asp Ile Cys565 570 575Val Asp Ile Lys580
<210>11<211>413<212>PRT<213>产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)<400>11Met Arg Asp Asp Arg Ala Leu Asn Val Thr Ser Glu Ile Gly Arg Leu1 5 10 15Lys Thr Val Leu Leu His Arg Pro Gly Glu Glu Ile Glu Asn Leu Thr20 25 30Pro Asp Leu Leu Asp Arg Leu Leu Phe Asp Asp Ile Pro Tyr Leu Lys35 40 45Val Ala Arg Glu Glu His Asp Ala Phe Ala Gln Thr Leu Arg Glu Ala50 55 60Gly Val Glu Val Leu Tyr Leu Glu Val Leu Ala Ala Glu Ala Ile Glu65 70 75 80Thr Ser Asp Glu Val Lys Gln Gln Phe Ile Ser Glu Phe Ile Asp Glu85 90 95Ala Gly Val Glu Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala Leu Ile Glu Tyr Phe100 105 110Asn Ser Phe Ser Asp Asn Lys Ala Met Val Asp Lys Met Met Ala Gly115 120 125Val Arg Lys Glu Glu Leu Lys Asp Tyr His Arg Glu Ser Leu Tyr Asp130 135 140Gln Val Asn Asn Val Tyr Pro Phe Val Cys Asp Pro Met Pro Asn Leu145 150 155 160Tyr Phe Thr Arg Glu Pro Phe Ala Thr Ile Gly His Gly Ile Thr Leu165 170 175Asn His Met Arg Thr Asp Thr Arg Asn Arg Glu Thr Ile Phe Ala Lys180 185 190Tyr Ile Phe Arg His His Pro Arg Phe Glu Gly Lys Asp Ile Pro Phe
195 200 205Trp Phe Asn Arg Asn Asp Lys Thr Ser Leu Glu Gly Gly Asp Glu Leu210 215 220Ile Leu Ser Lys Glu Ile Leu Ala Val Gly Ile Ser Gln Arg Thr Asp225 230 235 240Ser Ala Ser Val Glu Lys Leu Ala Lys Lys Leu Leu Tyr Tyr Pro Asp245 250 255Thr Ser Phe Lys Thr Val Leu Ala Phe Lys Ile Pro Val Ser Arg Ala260 265 270Phe Met His Leu Asp Thr Val Phe Thr Gln Val Asp Tyr Asp Lys Phe275 280 285Thr Val His Pro Gly Ile Val Gly Pro Leu Glu Val Tyr Ala Leu Thr290 295 300Lys Asp Pro Glu Asn Asp Gly Gln Leu Leu Val Thr Glu Glu Val Asp305 310 315 320Thr Leu Glu Asn Ile Leu Lys Lys Tyr Leu Asp Arg Asp Ile Lys Leu325 330 335Ile Lys Cys Gly Gly Gly Asp Glu Ile Ile Ala Ala Arg Glu Gln Trp340 345 350Asn Asp Gly Ser Asn Thr Leu Ala Ile Ala Pro Gly Glu Val Val Val355 360 365Tyr Ser Arg Asn Tyr Val Thr Asn Glu Ile Leu Glu Lys Glu Gly Ile370 375 380Lys Leu His Val Ile Pro Ser Ser Glu Leu Ser Arg Gly Arg Gly Gly385 390 395 400Pro Arg Cys Met Ser Met Pro Leu Ile Arg Glu Asp Leu405 410<210>12<211>413
<212>PRT<213>地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)<400>12Met Ile Met Thr Thr Pro Ile His Val Tyr Ser Glu Ile Gly Pro Leu1 5 10 15Lys Thr Val Met Leu Lys Arg Pro Gly Arg Glu Leu Glu Asn Leu Thr20 25 30Pro Glu Tyr Leu Glu Arg Leu Leu Phe Asp Asp Ile Pro Phe Leu Pro35 40 45Ala Val Gln Lys Glu His Asp Gln Phe Ala Glu Thr Leu Lys Gln Gln50 55 60Gly Ala Glu Val Leu Tyr Leu Glu Lys Leu Thr Ala Glu Ala Leu Asp65 70 75 80Asp Ala Leu Val Arg Glu Gln Phe Ile Asp Glu Leu Leu Thr Glu Ser85 90 95Lys Ala Asp Ile Asn Gly Ala Tyr Asp Arg Leu Lys Glu Phe Leu Leu100 105 110Thr Phe Asp Ala Asp Ser Met Val Glu Gln Val Met Ser Gly Ile Arg115 120 125Lys Asn Glu Leu Glu Arg Glu Lys Lys Ser His Leu His Glu Leu Met130 135 140Glu Asp His Tyr Pro Phe Tyr Leu Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe145 150 155 160Thr Arg Asp Pro Ala Ala Ala Ile Gly Ser Gly Leu Thr Ile Asn Lys165 170 175Met Lys Glu Pro Ala Arg Arg Arg Glu Ser Leu Phe Met Arg Tyr Ile180 185 190Ile Asn His His Pro Arg Phe Lys Gly His Glu Ile Pro Val Trp Leu195 200 205Asp Arg Asp Phe Lys Phe Asn Ile Glu Gly Gly Asp Glu Leu Val Leu
210 215 220Asn Glu Glu Thr Val Ala Ile Gly Val Ser Glu Arg Thr Thr Ala Gln225 230 235 240Ala Ile Glu Arg Leu Val Arg Asn Leu Phe Gln Arg Gln Ser Arg Ile245 250 255Arg Arg Val Leu Ala Val Glu Ile Pro Lys Ser Arg Ala Phe Met His260 265 270Leu Asp Thr Val Phe Thr Met Val Asp Arg Asp Gln Phe Thr Ile His275 280 285Pro Ala Ile Gln Gly Pro Glu Gly Asp Met Arg Ile Phe Val Leu Glu290 295 300Arg Gly Lys Thr Ala Asp Glu Ile His Thr Thr Glu Glu His Asn Leu305 310 315 320Pro Glu Val Leu Lys Arg Thr Leu Gly Leu Ser Asp Val Asn Leu Ile325 330 335Phe Cys Gly Gly Gly Asp Glu Ile Ala Ser Ala Arg Glu Gln Trp Asn340 345 350Asp Gly Ser Asn Thr Leu Ala Ile Ala Pro Gly Val Val Val Thr Tyr355 360 365Asp Arg Asn Tyr Ile Ser Asn Glu Cys Leu Arg Glu Gln Gly Ile Lys370 375 380Val Ile Glu Ile Pro Ser Gly Glu Leu Ser Arg Gly Arg Gly Gly Pro385 390 395 400Arg Cys Met Ser Met Pro Leu Tyr Arg Glu Asp Val Lys405 410<210>13<211>408<212>PRT<213>粪肠球菌(Enterococcus faecalis)
<400>13Met Ser His Pro Ile Asn Val Phe Ser Glu Ile Gly Lys Leu Lys Thr1 5 10 15Val Met Leu His Arg Pro Gly Lys Glu Leu Glu Asn Leu Met Pro Asp20 25 30Tyr Leu Glu Arg Leu Leu Phe Asp Asp Ile Pro Phe Leu Glu Lys Ala35 40 45Gln Ala Glu His Asp Ala Phe Ala Glu Leu Leu Arg Ser Lys Asp Ile50 55 60Glu Val Val Tyr Leu Glu Asp Leu Ala Ala Glu Ala Leu Ile Asn Glu65 70 75 80Glu Val Arg Arg Gln Phe Ile Asp Gln Phe Leu Glu Glu Ala Asn Ile85 90 95Arg Ser Glu Ser Ala Lys Glu Lys Val Arg Glu Leu Met Leu Glu Ile100 105 110Asp Asp Asn Glu Glu Leu Ile Gln Lys Ala Ile Ala Gly Ile Gln Lys115 120 125Gln Glu Leu Pro Lys Tyr Glu Gln Glu Phe Leu Thr Asp Met Val Glu130 135 140Ala Asp Tyr Pro Phe Ile Ile Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr145 150 155 160Arg Asp Asn Phe Ala Thr Met Gly His Gly Ile Ser Leu Asn His Met165 170 175Tyr Ser Val Thr Arg Gln Arg Glu Thr Ile Phe Gly Gln Tyr Ile Phe180 185 190Asp Tyr His Pro Arg Phe Ala Gly Lys Glu Val Pro Arg Val Tyr Asp195 200 205Arg Ser Glu Ser Thr Arg Ile Glu Gly Gly Asp Glu Leu Ile Leu Ser210 215 220Lys Glu Val Val Ala Ile Gly Ile Ser Gln Arg Thr Asp Ala Ala Ser
225 230 235 240Ile Glu Lys Ile Ala Arg Asn Ile Phe Glu Gln Lys Leu Gly Phe Lys245 250 255Asn Ile Leu Ala Phe Asp Ile Gly Glu His Arg Lys Phe Met His Leu260 265 270Asp Thr Val Phe Thr Met Ile Asp Tyr Asp Lys Phe Thr Ile His Pro275 280 285Glu Ile Glu Gly Gly Leu Val Val Tyr Ser Ile Thr Glu Lys Ala Asp290 295 300Gly Asp Ile Gln Ile Thr Lys Glu Lys Asp Thr Leu Asp Asn Ile Leu305 310 315 320Cys Lys Tyr Leu His Leu Asp Asn Val Gln Leu Ile Arg Cys Gly Ala325 330 335Gly Asn Leu Thr Ala Ala Ala Arg Glu Gln Trp Asn Asp Gly Ser Asn340 345 350Thr Leu Ala Ile Ala Pro Gly Glu Val Val Val Tyr Asp Arg Asn Thr355 360 365Ile Thr Asn Lys Ala Leu Glu Glu Ala Gly Val Lys Leu Asn Tyr Ile370 375 380Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg Gly Arg Gly Gly Pro Arg Cys Met Ser385 390 395 400Met Pro Leu Tyr Arg Glu Asp Leu405<210>14<211>409<212>PRT<213>清酒乳芽孢杆菌(Lactobacillus sake)<400>14Met Thr Ser Pro Ile His Val Asn Ser Glu Ile Gly Lys Leu Lys Thr1 5 10 15
Val Leu Leu Lys Arg Pro Gly Lys Glu Val Glu Asn Ile Thr Pro Asp20 25 30Ile Met Tyr Arg Leu Leu Phe Asp Asp Ile Pro Tyr Leu Pro Thr Ile35 40 45Gln Lys Glu His Asp Gln Phe Ala Gln Thr Leu Arg Asp Asn Gly Val50 55 60Glu Val Leu Tyr Leu Glu Asn Leu Ala Ala Glu Ala Ile Asp Ala Gly65 70 75 80Asp Val Lys Glu Ala Phe Leu Asp Lys Met Leu Asn Glu Ser His Ile85 90 95Lys Ser Pro Gln Val Gln Ala Ala Leu Lys Asp Tyr Leu Ile Ser Met100 105 110Ala Thr Leu Asp Met Val Glu Lys Ile Met Ala Gly Val Arg Thr Asn115 120 125Glu Ile Asp Ile Lys Ser Lys Ala Leu Ile Asp Val Ser Ala Asp Asp130 135 140Asp Tyr Pro Phe Tyr Met Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg145 150 155 160Asp Pro Ala Ala Ser Met Gly Asp Gly Leu Thr Ile Asn Lys Met Thr165 170 175Phe Glu Ala Arg Gln Arg Glu Ser Met Phe Met Glu Val Ile Met Gln180 185 190His His Pro Arg Phe Ala Asn Gln Gly Ala Gln Val Trp Arg Asp Arg195 200 205Asp His Ile Asp Arg Met Glu Gly Gly Asp Glu Leu Ile Leu Ser Asp210 215 220Lys Val Leu Ala Ile Gly Ile Ser Gln Arg Thr Ser Ala Gln Ser Ile225 230 235 240Glu Glu Leu Ala Lys Val Leu Phe Ala Asn His Ser Gly Phe Glu Lys
245 250 255Ile Leu Ala Ile Lys Ile Pro His Lys His Ala Met Met His Leu Asp260 265 270Thr Val Phe Thr Met Ile Asp Tyr Asp Lys Phe Thr Ile His Pro Gly275 280 285Ile Gln Gly Ala Gly Gly Met Val Asp Thr Tyr Ile Leu Glu Pro Gly290 295 300Asn Asn Asp Glu Ile Lys Ile Thr His Gln Thr Asp Leu Glu Lys Val305 310 315 320Leu Arg Asp Ala Leu Glu Val Pro Glu Leu Thr Leu Ile Pro Cys Gly325 330 335Gly Gly Asp Ala Val Val Ala Pro Arg Glu Gln Trp Asn Asp Gly Ser340 345 350Asn Thr Leu Ala Ile Ala Pro Gly Val Val Val Thr Tyr Asp Arg Asn355 360 365Tyr Val Ser Asn Glu Asn Leu Arg Gln Tyr Gly Ile Lys Val Ile Glu370 375 380Val Pro Ser Ser Glu Leu Ser Arg Gly Arg Gly Gly Pro Arg Cys Met385 390 395 400Ser Met Pro Leu Val Arg Arg Lys Thr40权利要求
1.一种包含通过连接基团与聚乙二醇共价相连的精氨酸脱亚胺酶的化合物，其中所述聚乙二醇的总重均分子量为从约1,000到约40,000，以及所述的连接基团选自琥珀酰亚胺基、酰胺基、酰亚胺基、氨基甲酸酯基团、酯基、环氧基、羧基、羟基、碳水化合物、酪氨酸基团、半胱氨酸基团、组氨酸基团及其组合。
2.如权利要求1所述的化合物，其中所述的连接基团是琥珀酰亚胺基团。
3.如权利要求2所述的化合物，其中所述琥珀酰亚胺基团是琥珀酸琥珀酰亚胺酯、丙酸琥珀酰亚胺酯、羧甲基化琥珀酰亚胺、琥珀酰亚胺基琥珀酰胺，N-羟基琥珀酰亚胺或其组合。
4.如权利要求3所述的化合物，其中所述琥珀酰亚胺基团是琥珀酸琥珀酰亚胺酯、丙酸琥珀酰亚胺酯或其组合。
5.如权利要求1所述的化合物，其中所述精氨酸脱亚胺酶来源于支原体属的微生物。
6.如权利要求5所述的化合物，其中所述的微生物选自精氨酸支原体(Mycoplasnia arginini)、人型支原体(Mycoplasma hominus)、关节炎支原体(Mycoplasma arthritides)及其组合。
7.如权利要求1所述的化合物，其中所述的精氨酸脱亚胺酶来源于链球菌属的微生物。
8.如权利要求7所述的化合物，其中所述的微生物选自化脓链球菌(Steptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Steptococcus pneumoniae)及其组合。
9.如权利要求1所述的化合物，其中所述的精氨酸脱亚胺酶来源于疏螺旋体属的微生物。
10.如权利要求9所述的化合物，其中所述的微生物选自布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、阿氏疏螺旋体(Borrelia afzelii)及其组合。
11.如权利要求1所述的化合物，其中所述的精氨酸脱亚胺酶来源于Qiardia属的微生物。
12.如权利要求11所述的化合物，其中所述的微生物是Qiardiaintestinalis。
13.如权利要求1所述的化合物，其中所述的精氨酸脱亚胺酶来源于梭状芽孢杆菌属的微生物。
14.如权利要求13所述的化合物，其中所述的微生物是产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)。
15.如权利要求1所述的化合物，其中所述的精氨酸脱亚胺酶来源于肠球菌属的微生物。
16.如权利要求15所述的化合物，其中所述的微生物是粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。
17.如权利要求1所述的化合物，其中所述的精氨酸脱亚胺酶来源于乳杆菌属的微生物。
18.如权利要求17所述的化合物，其中所述的微生物是清酒乳芽孢杆菌(Lactobacillus sake)。
19.如权利要求1所述的化合物，其中所述的精氨酸脱亚胺酶来源于芽孢杆菌属的微生物。
20.如权利要求19所述的化合物，其中所述的微生物是地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。
21.如权利要求1所述的化合物，其中所述的微生物选自肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、人型支原体(Mycoplasma hominus)、精氨酸支原体(Mycoplasma arginini)、化脓链球菌(Steptococcuspyogenes)、肺炎链球菌(Steptococcus pneumoniae)、布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、阿氏疏螺旋体(Borrelia afzelii)、Qiardiaintestinalis、产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、清酒乳芽孢杆菌(Lactobacillus sake)及其组合。
22.如权利要求1所述的化合物，其中所述的精氨酸脱亚胺酶共价连接于约7到约15个聚乙二醇分子。
23.如权利要求22所述的化合物，其中所述的精氨酸脱亚胺酶共价连接于约9到约12个聚乙二醇分子。
24.如权利要求1所述的化合物，其中所述的聚乙二醇的总重均分子量为从约10,000到约30,000。
25.一种延长精氨酸脱亚胺酶的循环半衰期的方法，该方法包括通过连接基团把所述的精氨酸脱亚胺酶与聚乙二醇共价相连来修饰所述的精氨酸脱亚胺酶，其中所述的聚乙二醇的总重均分子量为从约1,000到约4,000，以及所述的连接基团选自琥珀酰亚胺基、酰胺基、酰亚胺基、氨基甲酸酯基团、酯基、环氧基、羧基、羟基、碳水化合物、酪氨酸基团、半胱氨酸基团、组氨酸基团及其组合。
26.一种增强精氨酸脱亚胺酶抗肿瘤活性的方法，该方法包括通过连接基团把所述的精氨酸脱亚胺酶与聚乙二醇共价相连来修饰所述的精氨酸脱亚胺酶，其中所述的聚乙二醇分子的总重均分子量为从约1,000到约4,000，以及所述的连接基团选自琥珀酰亚胺基、酰胺基、酰亚胺基、氨基甲酸酯基团、酯基、环氧基、羧基、羟基、碳水化合物、酪氨酸基团、半胱氨酸基团、组氨酸基团及其组合。
27.一种治疗患者的肿瘤的方法，该方法包括对所述患者施用如权利要求1所述的化合物。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述的肿瘤是黑素瘤。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述的聚乙二醇的总重均分子量约为20,000。
30.如权利要求28所述的方法，其中所述的连接基团是琥珀酰亚胺基团。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述琥珀酰亚胺基团是琥珀酸琥珀酰亚胺酯、丙酸琥珀酰亚胺酯、羧甲基化琥珀酰亚胺、琥珀酰亚胺基琥珀酰胺、N-羟基琥珀酰亚胺或其组合。
32.如权利要求27所述的方法，其中所述的肿瘤是肝细胞瘤。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述聚乙二醇的总重均分子量约为5,000。
34.如权利要求32所述的方法，其中所述的连接基团是琥珀酰亚胺基团。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述琥珀酰亚胺基团是琥珀酸琥珀酰亚胺酯、丙酸琥珀酰亚胺酯、羧甲基化琥珀酰亚胺、琥珀酰亚胺基琥珀酰胺、N-羟基琥珀酰亚胺或其组合。
36.如权利要求27所述的方法，其中所述的肿瘤是肉瘤。
37.一种治疗和抑制患者肿瘤转移的方法，该方法包括对所述患者施用如权利要求1所述的化合物。
全文摘要
本发明涉及经聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚胺酶、治疗癌症的方法以及治疗和/或抑制肿瘤转移的方法。
文档编号C12N15/09GK1518595SQ01819673
公开日2004年8月4日 申请日期2001年9月19日 优先权日2000年11月28日
发明者迈克·A·克拉克, 迈克 A 克拉克 申请人:凤凰药理学公司