夜香树黄叶卷曲病毒启动子的利记博彩app

专利名称：夜香树黄叶卷曲病毒启动子的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及在植物中作为相连核苷酸序列的转录启动子而发挥功能的新DNA序列。更具体的说，本发明涉及赋予相连目的核苷酸序列以组成性表达的新启动子。
在农业领域中，一直希望根据需要来修饰植物。实现这一需要的一种方法是使用现代遗传工程技术。例如，通过将目的基因导入植物，能够特异修饰植物而使其表达期望的表型性状。为此目的，最通常的做法是用包含启动子区、编码区、和终止区的异源基因转化植物。在通过遗传工程来实现异源基因在植物中的表达时，启动子的选择是决定性的因素。虽然可能希望只在应答特定刺激时表达某些基因或者将表达限制于特定细胞或组织，但是更希望组成性表达其它基因，即一直在整个植物的大多数组织和器官中进行表达。过去，来自花椰菜花叶病毒的35S启动子(CaMV 35S启动子)已经广泛用于在植物中组成性表达异源基因。然而，偶尔希望使用其它启动子。因此，本发明的主要目的是提供用于在植物中表达目的核苷酸序列的候选启动子。本发明还涉及包含本发明启动子的重组DNA分子、表达载体、和转基因植物。
本发明因而提供了能够驱动相连核苷酸序列表达的DNA序列，其中所述DNA序列可得自夜香树花叶卷曲病毒(Cestrum yellow leafcurling Virus，CmYLCV)的基因组。优选可得自CmYLCV全长转录本启动子且包含SEQ ID NO1所述核苷酸序列的DNA序列。
具体而言，提供了如下DNA序列，其中● 所述DNA序列包含SEQ ID NO2所述DNA序列● 所述DNA序列包含SEQ ID NO3所述DNA序列● 所述DNA序列包含SEQ ID NO4所述DNA序列
● 所述DNA序列包含SEQ ID NO5所述DNA序列● 所述DNA序列包含SEQ ID NO6所述DNA序列● 所述DNA序列在严谨条件下与SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、或SEQ ID NO6之任一发生杂交，特别是上述DNA序列包含SEQ ID NO19或SEQ ID NO20所述核苷酸序列。
本发明还提供了包含SEQ ID NO1的至少50nt、优选大约400碱基-大约650碱基、更优选大约200碱基-大约400碱基、最优选大约350碱基的连续片段的DNA序列，其中所述DNA序列能够驱动相连核苷酸序列的表达。
在本发明的一个具体实施方案中，所述至少50nt、优选大约400碱基-大约650碱基、更优选大约200碱基-大约400碱基、最优选大约350碱基的连续片段与SEQ ID NO1的至少50nt、优选大约400碱基-大约650碱基、更优选大约200碱基-大约400碱基、最优选大约350碱基的连续片段具有至少75％、优选80％、更优选90％、最优选95％的序列同一性。
本发明还提供了包含由夜香树黄叶卷曲病毒分离的全长转录本启动子区的重组DNA分子。另外，本发明提供了包含依照本发明的DNA序列且其可操作连接目的核苷酸序列的重组DNA分子和DNA表达盒。本发明还提供了分别包含所述重组DNA分子和表达盒的DNA表达载体。
具体而言，提供了如下重组DNA分子和DNA表达盒，其中目的核苷酸序列包含编码区。具体而言，其中● 编码序列编码期望的表型性状● 编码序列编码可选择的或可筛选的标记基因● 编码序列编码赋予抗生素抗性、病毒抗性、昆虫抗性、疾病抗性、或对其它害虫的抗性、除草剂耐受性、改进的营养价值、工业加工中改进的性能、或改变的生殖能力的蛋白质● 编码序列编码赋予经所述编码序列转化的细胞以阳性选择优势的蛋白质
● 编码序列编码赋予经所述编码序列转化的细胞以代谢优势(包括能够代谢化合物)的蛋白质，其中所述化合物是甘露糖或木糖或其衍生物或前体，或是蛋白质的底物，或者能够由经所述编码序列转化的细胞代谢成这种底物● 编码序列编码选自下组的酶木糖异构酶、磷酸甘露糖异构酶、甘露糖-6-磷酸异构酶、甘露糖-1-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖差向异构酶、甘露糖或木糖磷酸酶、甘露糖-6-磷酸酶、甘露糖-1-磷酸酶、和甘露糖或木糖通透酶● 编码序列编码磷酸甘露糖异构酶● 编码区是不能翻译的● 不能翻译的编码区来自病毒基因，特别是来自TSWV，更特别的是来自TSWV NP基因● 编码序列编码具有商业价值的酶或者植物中的代射物● 编码序列处于反义取向本发明还提供了包含上述DNA序列或重组DNA分子的DNA表达载体。在本发明的一个具体实施方案中，所述DNA表达载体是pNOV2819或pNOV2820。本发明还提供了包含依照本发明的第一DNA序列且其可操作连接目的核苷酸序列和依照本发明的第二DNA序列且其可操作连接目的核苷酸序列的DNA表达载体。在本发明的一个具体实施方案中，上述DNA表达载体能够改变病毒基因组的表达。
在一个甚至更具体的实施方案中，上述DNA表达载体包含能够在细胞中表达所述病毒基因组或其部分的有义RNA片段的第一DNA序列和能够在细胞中表达所述病毒基因组或其部分的反义RNA片段的第二DNA序列，其中所述有义RNA片段与所述反义RNA片段能够形成双链RNA。
本发明提供了上述表达载体，其中● 所述病毒选自下组tospoviruses、马铃薯Y病毒组、马铃薯X病毒组、烟草花叶病毒组、黄矮病毒组、南瓜花叶病毒组、雀麦花叶病毒组、线形病毒组(closteorvirus)、番茄丛矮病毒组、和真菌传棒状病毒组
● 所述DNA序列包含衍生自病毒外壳蛋白基因、病毒核壳蛋白基因、病毒复制酶基因、或病毒移动蛋白基因或其部分的核苷酸序列● 所述DNA序列衍生自番茄斑萎病毒(tomato spotted wiltvirus，TSWV)● 所述DNA衍生自核壳蛋白基因本发明还提供了经依照本发明的DNA序列、重组DNA分子、或DNA表达载体稳定转化的宿主细胞，具体而言，其中● 宿主细胞是细菌● 宿主细胞是植物细胞● 宿主细胞是选自下组的植物细胞水稻、玉米、小麦、大麦、黑麦、甘薯、甜玉米、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、甘蓝、花椰菜、嫩茎花椰菜、芜菁、萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、胡椒、芹菜、南瓜、西葫芦、大麻、夏南瓜、苹果、梨、温柏(quince)、甜瓜、李、樱桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、悬钩子、黑莓、凤梨、鳄梨、番木瓜、芒果、香蕉、大豆、番茄、高粱、甘蔗、甜菜、向日葵、油菜籽、三叶草、烟草、胡萝卜、棉花、苜蓿、马铃薯、茄子、黄瓜、拟南芥、和木本植物诸如针叶树和落叶树，特别是水稻、玉米、小麦、大麦、甘蓝、花椰菜、胡椒、南瓜、甜瓜、大豆、番茄、甜菜、向日葵、或棉花，尤其是水稻、玉米、小麦、高粱、果园草、甜菜、和大豆细胞● 宿主细胞是来自双子叶植物的植物细胞● 宿主细胞是来自选自下组的双子叶植物的植物细胞大豆、棉花、烟草、甜菜、和油菜籽● 宿主细胞是来自单子叶植物的植物细胞● 宿主细胞是来自选自下组的单子叶植物的植物细胞玉米、小麦、高粱、黑麦、燕麦、草坪草、水稻、和大麦另外，本发明还提供了经依照本发明的DNA序列、重组DNA分子、或DNA表达载体稳定转化的植物或其后代，包括种子。具体而言，其中● 植物选自下组水稻、玉米、小麦、大麦、黑麦、甘薯、甜玉米、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、甘蓝、花椰菜、嫩茎花椰菜、芜菁、萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、胡椒、芹菜、南瓜、西葫芦、大麻、夏南瓜、苹果、梨、温柏(quince)、甜瓜、李、樱桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、悬钩子、黑莓、凤梨、鳄梨、番木瓜、芒果、香蕉、大豆、番茄、高粱、甘蔗、甜菜、向日葵、油菜籽、三叶草、烟草、胡萝卜、棉花、苜蓿、马铃薯、茄子、黄瓜、拟南芥、和木本植物诸如针叶树和落叶树，特别是水稻、玉米、小麦、大麦、甘蓝、花椰菜、胡椒、南瓜、甜瓜、大豆、番茄、甜菜、向日葵、或棉花，尤其是水稻、玉米、小麦、高粱、果园草、甜菜、和大豆本发明还公开了● 依照本发明的DNA序列用于表达目的核苷酸序列的用途● 生成依照本发明的DNA序列的方法，其中通过聚合酶链式反应生成该DNA，其中至少一种所用寡核苷酸包含展现SEQ ID NO1的15、18、20、22、24、或更多碱基对的连续片段的核苷酸序列。
为了确保清楚且一致的理解说明书和权利要求书，提供下列定义CmYLCV夜香树黄叶卷曲病毒。
DNA改组DNA改组是快速、容易、且有效的将重排导入DNA分子(优选随机)或在两种或多种DNA分子之间产生DNA序列交换(优选随机)的方法。由DNA改组产生的DNA分子即改组后DNA分子是由至少一种模板DNA分子衍生的非天然存在DNA分子。
表达指内源基因或转基因在植物中的转录和/或翻译。例如，在反义构建物的情况中，表达可以只指反义DNA的转录。
功能等同序列指具有与CmYLCV全长转录本启动子或其部分基本相似的启动子活性且在严谨杂交条件下与所述启动子序列发生杂交的DNA序列。
基因指编码序列和相连调控序列，其中编码序列转录成RNA，诸如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、有义RNA、或反义RNA。调控序列的范例是启动子序列、5’和3’非翻译序列、和终止序列。可能存在的其它元件是例如内含子。
目的基因指在转移至植物后赋予植物以期望特征的任何基因，诸如抗生素抗性、病毒抗性、昆虫抗性、疾病抗性、或对其它害虫的抗性、除草剂耐受性、改进的营养价值、工业加工中改进的性能、或改变的生殖能力。“目的基因”还可以是为了在植物中生成具有商业价值的酶或代谢物而转移至植物的基因。
异源在用于本文时，指具有不同的天然或合成来源。例如，若用未转化宿主细胞中不存在的核酸序列转化宿主细胞，则说核酸序列对于宿主细胞而言是异源的。转化所用核酸可以包含异源启动子、异源编码序列、或异源终止序列。或者，转化所用核酸可以是完全异源的，或者可以包含异源与内源核酸序列的任意可能组合。
前导区基因中转录起始位点与翻译起始位点之间的区域。
标记基因指编码可选择的或可筛选的性状的基因。
可操作连接/相连若两种序列的定位使得调控DNA序列影响编码DNA序列的表达，则说调控DNA序列与编码RNA或蛋白质的DNA序列“可操作连接”或“相连”。
植物指任何植物，特别是种子植物。
植物细胞植物的结构和生理单位，包括原生质体和细胞壁。植物细胞可以是分离的单细胞或培养细胞的形式，或者是更高组织单位诸如植物组织或植物器官的一部分。
植物材料指叶、茎/干、根、花或其部分、果实、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、卵细胞、接合子、胚、种子、插条、细胞或组织培养物、或植物的任何其它部分或产物。
启动子指起始相连DNA序列转录的DNA序列。启动子区还可包含作为基因表达的调节基因而发挥作用的元件，包括激活子、增强子、和/或遏制子，而且可以包含5’非翻译前导序列的整个或部分。
重组DNA分子使用重组DNA技术连接起来的DNA序列组合。
重组DNA技术用于将DNA序列连接起来的流程，例如描述于Sambrook等人，1989，冷泉港，纽约，冷泉港实验室出版社。
可筛选的标记基因指其表达不赋予经转化细胞以选择优势但使得经转化细胞在表型上与未转化细胞截然不同的基因。
可选择的标记基因指其在植物细胞中的表达给予细胞以选择优势的基因。经可选择的标记基因转化的细胞所具有的选择优势可能归功于它们在存在负选择剂诸如抗生素或除草剂时相对于未转化细胞的生长能力。经转化细胞相对于未转化细胞所具有的选择优势还可能归功于它们具有新的或增强的利用所添加化合物如营养物、生长因子、能源的能力。可选择的标记基因还指其在植物细胞中的表达在存在选择剂时相对于缺乏选择剂时对经转化植物细胞具有积极影响而对未转化植物细胞具有消极影响(例如在生长方面)从而给予经转化植物细胞以正选择优势的基因或基因组合。
序列同一性序列同一性百分比是使用基于动力学编程算法的计算机程序测定的。本发明这一方面优选的计算机程序包括设计用于探索所有可获得的序列数据库(无论检索的是蛋白质或DNA)的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool即基本局部比对搜索工具)搜索程序。已经可以在因特网(目前的网址是http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)上公开获得这种搜索工具的BLAST 2.0版(Gapped BLAST即缺口BLAST)。它使用试探式算法，寻找局部而非整体比对，因而能够检测只共享分离区域的序列之间的关联。BLAST搜索中给出的得分具有明确定义的统计学解释。优选将任选参数设成缺省值来运行所述程序。
转化指将核酸导入细胞。具体而言，指DNA分子稳定整合到目的生物体的基因组中。
TSWV番茄斑矮病毒。
本发明涉及可以由夜香树黄叶卷曲病毒(CmYLCV)基因组获得的DNA序列。优选可以由能够驱动相连目的核苷酸序列表达的CmYLCV全长转录本启动子获得的DNA序列。本发明还涵盖包含其功能和/或结构等同物的DNA序列。本发明因而涉及可作为相连核苷酸序列的转录启动子而发挥功能的DNA序列。启动子区还可包含可作为基因表达的调节基因而发挥作用的元件，诸如激活子、增强子、和/或遏制子，而且可以包含转录所得mRNA的5’非翻译前导序列。
在本发明的一个优选实施方案中，所述DNA序列赋予相连核苷酸序列的组成性表达。组成性表达指目的核苷酸序列一直在大多数组织和器官中进行表达。在瞬时表达实验中与GUS或CAT报告基因一起测试时，依照本发明的DNA序列赋予GUS或CAT报告基因的高水平表达。因而，依照本发明的DNA序列可用于高水平表达相连目的核苷酸序列，优选编码序列。熟练技术人员知道能够以有义或反义取向表达相连目的编码序列。另外，目的编码序列可以与待转化的植物具有异源或同源来源。在同源编码序列的情况中，依照本发明的DNA序列可用于所述序列的异位表达。在本发明的一个具体实施方案中，目的编码序列处于依照本发明的DNA序列控制下的表达通过所谓的共遏制过程遏制其自身表达及该基因原始拷贝的表达。
可以由夜香树黄叶卷曲病毒(CmYLCV)基因组DNA获得本发明的启动子，例如可以由受感染的夜香树Cestrum parqui植株分离所述DNA。受CmYLCV感染的Cestrum parqui植株是通过它们的花叶和皱叶畸形来鉴定的。然后将该DNA测序并分析。与数据库中序列的序列比较显示，CmYLCV的基因组组织与花椰菜花叶病毒科的其它成员有关。CmYLCV包含8个开放读码框。CmYLCV基因产物的序列比较显示，基因I产物参与胞内运动；基因A编码未知功能的小蛋白；基因B编码蚜虫传播因子；基因C编码病毒体相关蛋白；基因IV编码主要衣壳蛋白；基因V编码逆转录酶；基因VI反式激活全长转录本上病毒基因的翻译。特别感兴趣的是所谓的CmYLCV全长转录本启动子。
熟练技术人员知道可以依照本发明使用CmYLCV全长转录本启动子的各个区域。本发明的一个具体实施方案是SEQ ID NO1所示的CmYLCV全长转录本启动子区，称为CmpD启动子。该序列包含350bp CmYLCV全长转录本启动子和320bp CmYLCV全长转录本5’非翻译前导序列。可以通过将CmYLCV基因组DNA测序来获得该序列。分别通过与数据库中序列进行比较来鉴定启动子和前导序列。SEQ ID NO19显示了SEQ ID NO1的一种变体，称为CmpE，其中CmYLCV全长转录本5’非翻译前导序列的长度是318bp而非320bp。
本发明的一个优选实施方案是SEQ ID NO2所述DNA序列，称为CmpC启动子。CmpC启动子是SEQ ID NO1所示序列的片段，包含346bp的CmYLCV全长转录本启动子，对应于SEQ ID NO1的第5-350位碱基。可以使用正向引物Cmp1(SEQ ID NO13)和反向引物CmpC2(SEQ IDNO14)通过PCR由来自夜香树黄叶卷曲病毒或受其感染的Cestrumparqui植株的基因组DNA获得该DNA序列。CmpC启动子的推定TATA盒位于SEQ ID NO2的第308-315位碱基。CmpC启动子包含至少3个推定增强子区。具有核苷酸序列CAAT的增强子区1位于SEQ ID NO2的第232-235位碱基；同样具有核苷酸序列CAAT的增强子区2位于SEQ ID NO2的第243-246位碱基；具有核苷酸序列TGACGTAA的增强子区3位于SEQID NO2的第246-253位碱基。
本发明的另一个优选实施方案是SEQ ID NO3所示DNA，称为CmpS启动子。CmpS启动子也是SEQ ID NO1所示序列的片段，包含SEQ ID NO2的346bp和来自CmYLCV全长转录本启动子前导区的54bp。前导区是位于编码区之前、转录但不翻译成蛋白质的核苷酸序列。熟练技术人员知道前导区可能包含在基因表达中具有重要功能的调控元件。可以使用正向引物Cmp1(SEQ ID NO13)和反向引物CmpS2(SEQ ID NO15)通过PCR由来自夜香树黄叶卷曲病毒或受其感染的Cestrum parqui植株的基因组DNA获得CmpS启动子。CmpS启动子在前导区中包含至少2个推定增强子区。增强子区4(GAGAGA)位于SEQ ID NO3的第354-359位碱基，增强子区5(GAGAGAGA)位于SEQ ID NO3的第368-375位碱基。
本发明的还有一个优选实施方案是SEQ ID NO4所述序列，称为CmpL启动子。正如上述启动子，CmpL启动子是SEQ ID NO1所示序列的片段，包含SEQ ID NO2的346bp和CmYLCV全长转录本5’非翻译前导序列的288bp。可以使用正向引物Cmp1(SEQ ID NO13)和反向引物CmpL2(SEQ ID NO16)通过PCR由来自夜香树黄叶卷曲病毒或受其感染的Cestrum parqui植株的基因组DNA获得CmpL启动子。SEQ ID NO20显示了SEQ ID NO4的一种变体，称为CmpF，其中CmYLCV全长转录本5’非翻译前导序列是286bp而非288bp。
熟练技术人员知道可以用同源或异源核苷酸序列在其5’和3’末端延伸SEQ ID NO1、2、3、4、19、和20所示核苷酸序列。例如，可以将SEQ ID NO1、2、3、4、19、和20的5’末端延伸SEQ ID NO6所示核苷酸的全部或部分。发现SEQ ID NO6天然的位于SEQ ID NO2、3、4、和20的上游，而且包含CmYLCV ORF VI的一部分(SEQ ID NO6的第1-100位碱基)以及CmYLCV全长转录本启动子的一部分(SEQ ID NO6的第101-104位碱基)。同样的，可以将SEQ ID NO2、3、4、和20的3’末端延伸SEQ ID NO5所示核苷酸的全部或部分。发现该核苷酸序列天然的位于SEQ ID NO4和20的3’末端，而且包含CmYLCV全长转录本前导序列的一部分。
如上所述，例如，可以通过PCR由来自夜香树黄叶卷曲病毒或受其感染的Cestrum parqui植株的基因组DNA获得本发明的DNA序列。或者，可以使用序列特异引物由包含本发明DNA序列同系物的花椰菜花叶病毒科的任何其它病毒获得本发明的DNA序列。熟练技术人员知道，可以根据SEQ ID NO1-6、19、和20所示核苷酸序列选择任何目的引物组合来PCR扩增可依照本发明使用的各种长度的DNA片段。本发明因而包括由依照本发明发挥功能(即能够赋予相连核苷酸序列的表达)的CmYLCV全长转录本启动子衍生的片段。
可以如下进行测试生成这种启动子片段，将它们融合可选择的或可筛选的标记基因，并对融合构建物测定启动子活性的保持。这种测定法属于本领域技术人员的常规技术范围之内。本发明的优选DNA片段的长度是至少大约50碱基、优选大约400碱基-大约650碱基、更优选大约200碱基-大约400碱基、最优选大约350碱基。
熟练技术人员还知道可以使用本领域已知方法将一个或多个核苷酸的突变、插入、删除、和/或替代导入SEQ ID NO1、2、3、4、5、和6的DNA序列或由其序列信息衍生的更长或更短片段。另外，可以通过本发明序列的改组使未修饰或经修饰的本发明核苷酸序列多样化。为了测试依照本发明的DNA序列变体的功能，将目的序列可操作连接可选择的或可筛选的标记基因，并在使用原生质体的瞬时表达实验或稳定转化的植株中测试标记基因的表达。熟练技术人员知道能够驱动相连核苷酸序列表达的DNA序列是以模块化方式构造的。因此，来自较短DNA片段的表达水平可能与来自最长片段的表达水平不同，而且可能彼此不同。例如，删除下调的上游元件将导致相连核苷酸序列表达水平的升高，而删除上调元件将降低相连核苷酸序列的表达水平。熟练技术人员还知道删除发育特异的或组织特异的元件将导致相连核苷酸序列表达模式的时间或空间变化。
本发明还涵盖本发明启动子的功能等同物，即在严谨条件下与SEQID NO1、2、3、4、5、或6之任一发生杂交的核苷酸序列，诸如SEQ IDNO19和20所示序列。于65℃、优选60℃、最优选55℃在包含0.1％SDS的二倍强度(2×)柠檬酸盐缓冲液(SSC)中进行严谨杂交，随后于相同温度用SSC浓度降低的缓冲液漂洗支持物。这种浓度降低的缓冲液通常是包含0.1％SDS的十分之一强度SSC(0.1×SSC)、优选包含0.1％SDS的0.2×SSC、最优选包含0.1％SDS的半数强度SSC(0.5×SSC)。事实上，可以通过将SEQ ID NO1、2、3、4、5、6、19、或20之任一与由目的生物体(特别是其它花椰菜花叶病毒)分离的基因组DNA进行杂交来寻找来自其它生物体的整个或部分CmYLCV全长转录本启动子的功能等同物。熟练技术人员知道如何找到这些序列，本领域知道许多方法来鉴定其它生物体中的同源序列。然后可以将这些新鉴定的DNA分子测序，将序列与SEQ ID NO1、2、3、4、5、6、19、或20之任一进行比较，并测试启动子活性。本发明的范围涵盖与SEQ ID NO1、2、3、4、或6之任一核苷酸序列在至少50个核苷酸的长度上具有至少75％、优选80％、更优选90％、最优选95％的序列同一性的DNA分子。序列同一性百分比是使用基于动力学编程算法的计算机程序测定的。本发明这一方面优选的计算机程序包括设计用于探索所有可获得的序列数据库(无论检索的是蛋白质还是DNA)的BLAST(Basic LocalAlignment Search Tool即基本局部比对搜索工具)搜索程序。已经可以在因特网(目前的网址是http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)上公开获得这种搜索工具的BLAST 2.0版(Gapped BLAST即缺口BLAST)。它使用试探式算法，寻找局部而非整体比对，因而能够检测只共享分离区域的序列之间的关联。BLAST搜索中给出的得分具有明确定义的统计学解释。优选将任选参数设成缺省值来运行所述程序。
本发明的另一个目标是提供包含依照本发明的DNA序列且其可操作连接目的核苷酸序列的重组DNA分子。目的核苷酸序列可以编码例如核糖体RNA、反义RNA、或不翻译成蛋白质的任何其它类型的RNA。在本发明的另一个优选实施方案中，目的核苷酸序列翻译成蛋白质产物。与启动子序列相连的核苷酸序列可以与待转化的植物具有同源或异源来源。序列还可以是完全或部分合成的。无论来源是什么，相连DNA序列将在经转化植物中以符合相连启动子的表达特性的方式进行表达。在与启动子相连的是同源核苷酸序列的情况中，依照本发明的启动子可用于所述同源序列的异位表达。异位表达指与启动子序列相连的核苷酸序列在受其自身启动子的控制下不表达的组织和器官和/或时间进行表达。在本发明的一个具体实施方案中，与启动子序列相连的核苷酸的表达通过所谓的共遏制过程遏制其自身表达以及该基因原始拷贝的表达。
在本发明的一个优选实施方案中，相连核苷酸序列可能编码希望一直在整个植物的大多数组织和器官中进行表达的蛋白质。这些核苷酸序列优选编码赋予经其转化的植物以期望的表型性状的蛋白质。范例是所编码的蛋白质赋予抗生素抗性、病毒抗性、昆虫抗性、疾病抗性、或对其它害虫的抗性、除草剂耐性、改进的营养价值、工业加工中改进的性能、或改变的生殖能力的核苷酸序列。相连核苷酸序列还可以是为了在植物中生成具有商业价值的酶或代谢物而转移至植物的核苷酸序列。本发明还涵盖可选择的或可筛选的标记基因，即包含本发明DNA序列且其可操作连接编码区的基因，其中编码区编码可选择的或可筛选的性状。
下文描述了可选择或可筛选标记基因的范例。对于某些目的物种，可能优选不同的抗生素或除草剂选择标记。在转化中常规使用的选择标记包括赋予卡那霉素、巴龙霉素、遗传霉素、和相关抗生素抗性的nptII基因(Vieira和Messing，1982，Gene，19259-268；Bevan等人，1983，Nature，304184-187)、编码氨基糖苷3’-腺苷酰转移酶并赋予链霉素或壮观霉素抗性的细菌aadA基因(Goldschmidt-Clermont，1991，Nucl.Acids Res.，194083-4089)、赋予潮霉素抗性的hph基因(Blochlinger和Diggelmann，1984，Mol.Cell.Biol.，42929-2931)、和赋予氨甲蝶呤抗性的dbfr基因(Bourouis和Jarry，1983，EMBO J.，21099-1104)。可以使用的其它标记包括赋予除草剂膦丝菌素抗性的膦丝菌素乙酰基转移酶基因(White等人，1990，Nucl.Acids Res.，181062；Spencer等人，1990，Theor.Appl.Genet.，79625-631)、编码草甘膦抗性的突变型EPSP合酶基因(Hinchee等人，1988，Bio/Technology，6915-922)、赋予咪唑啉酮或磺酰脲抗性的突变型乙酰乳酸合酶(ALS)基因(Lee等人，1988，EMBO J.，71241-1248)、赋予莠去净抗性的突变型psbA基因(Smeda等人，1993，Plant Physiol.，103911-917)、或突变型原卟啉原氧化酶基因(EP 0 769 059)。还可以通过可筛选标记基因的表达来实现经转化细胞的鉴定，诸如编码氯霉素乙酰基转移酶(CAT)、β-葡糖醛酸酶(GUS)、萤光素酶(LUC)、绿色荧光蛋白(GFP)、或赋予经转化细胞以截然不同的表型性状的任何其它蛋白质的基因。
还可以使用导致正选择的选择标记，诸如磷酸甘露糖异构酶基因(专利申请WO 93/05163)。WO 94/20627描述了可用于正选择的其它基因，它们编码木糖异构酶和磷酸甘露糖异构酶，诸如甘露糖-6-磷酸异构酶和甘露糖-1-磷酸异构酶；磷酸甘露糖变位酶；甘露糖差向异构酶，诸如将碳水化合物转变成甘露糖或将甘露糖转变成碳水化合物诸如葡萄糖或半乳糖的酶；磷酸酶，诸如甘露糖或木糖磷酸酶、甘露糖-6-磷酸酶、和甘露糖-1-磷酸酶；和参与将甘露糖或其衍生物或前体转运至细胞内的通透酶。降低化合物对细胞的毒性的试剂通常是葡萄糖衍生物，诸如甲基-3-O-葡萄糖或根皮苷。可以鉴定群体中的经转化细胞而不损伤或杀死未转化细胞且不共导入抗生素或除草剂抗性基因。正如WO 93/05163所述，除了需要消除抗生素或除草剂抗性基因的事实，还显示正选择方法常常远比传统的负选择更有效。
因此，本发明的启动子优选可操作连接编码包含如下区域的蛋白质的核苷酸序列(1)编码参与化合物代谢的蛋白质和/或(2)调控蛋白质编码基因的活性，其中化合物是甘露糖或木糖或其衍生物或前体、或是该蛋白质的底物，或者能够由经转化细胞代谢成这种底物。所述核苷酸序列可以编码甘露糖-6-磷酸异构酶，化合物可以是甘露糖。或者，核苷酸序列可以编码磷酸糖异构酶、磷酸糖变位酶诸如磷酸甘露糖变位酶、磷酸酶诸如甘露糖-6-磷酸酶、糖差向异构酶、糖通透酶、磷酸糖通透酶、或木糖异构酶，化合物可以是甘露糖、甘露糖-6-磷酸、D-甘露糖胺、或木糖。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的启动子可操作连接编码磷酸甘露糖异构酶(PMI)的大肠杆菌manA基因(Joersbo和Okkels，1996，Plant Cell Reports，16219-221；Negrotto等人，2000，Plant Cell Reports，19798-803)的编码区和由根癌农杆菌T-DNA获得的Nos(胭脂碱合酶)终止子(Depicker等人，1982，J.Mol.Appl.Genet.，1(6)561-573)。熟练技术人员知道可以用能够在植物中发挥功能的任何其它终止子替代Nos终止子。本发明的启动子可以是SEQ ID NO1-6、19、和20所述CmpD、CmpC、CmpS、CmpL、CmpB、CmpA、CmpE、或CmpF启动子或由其衍生的任何启动子。在本发明的一个甚至更优选的实施方案中，启动子是SEQ ID NO3所述CmpS启动子。
本发明的启动子还可用于提供对病毒的抗性或耐受，即通过将本发明的启动子可操作连接来自待控制病毒的基因的编码区。
对于负链病毒诸如番茄斑矮病毒(TSWV)的病毒控制，可以使用病毒核壳蛋白(NP)和移动蛋白(MP)基因序列。对于属于α样病毒亚组的病毒诸如TMV和CMV，可以使用依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp)和移动蛋白(MP)基因序列。对于属于小RNA病毒样亚组的病毒，包括马铃薯Y病毒组，可以将任何病毒序列连接本发明的启动子。最后，对于其它病毒，包括DNA病毒，可以使用依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp)或复制酶相关基因序列。可以如WO 00/68374的实施例8和实施例9所示构建用于病毒控制的这些构建物。用本发明的启动子取代WO 00/68374中所公开的启动子属于本领域技术人员的常规技术范围之内。遵循WO00/68374的传授，熟练技术人员还知道如何制备包含本发明启动子且其可操作连接上述病毒序列的构建物以赋予对所述病毒的抗性或耐受。
除了在转基因植物中表达双链病毒RNA(正如WO 00/68374所公开的)，还可以作为不能翻译的RNA和有义病毒RNA分子来表达病毒RNA(正如US 558302或本发明实施例12和13所述)。
本发明的另一个目标是提供包含本发明的DNA序列且其与相连目的核苷酸序列融合的重组表达载体。在这些载体中，可以将外源DNA插入多接头区，使得这些外源序列可以在合适的宿主细胞中进行表达，其中所述宿主细胞可以是例如细菌或植物来源。例如，衍生自根癌农杆菌二元载体pBIN19的质粒pBI101能够克隆并使用β-葡糖醛酸酶(GUS)表达信号来测试启动子(Jefferson等人，1987，EMBO J.，63901-3907)。该载体的大小是12.2kb。它具有低拷贝的RK2复制起点，并赋予细菌和植物二者以卡那霉素抗性。本领域熟练技术人员知道许多其它表达载体可以依照本发明进行使用。
本发明的另一个目标是提供包含本发明重组DNA序列的转基因植物。本发明因而涉及通过下文所述转化方法之任一获得的植物细胞、由这些细胞衍生的植株、植物材料、由这些植株衍生的后代和种子、和具有改进特性的农业产品。依照本发明转化的植物可以是单子叶植物或双子叶植物，包括但不限于水稻、玉米、小麦、大麦、黑麦、甘薯、甜玉米、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、甘蓝、花椰菜、嫩茎花椰菜、芜菁、萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、胡椒、芹菜、南瓜、西葫芦、大麻、夏南瓜、苹果、梨、温柏(quince)、甜瓜、李、樱桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、悬钩子、黑莓、凤梨、鳄梨、番木瓜、芒果、香蕉、大豆、番茄、高粱、甘蔗、甜菜、向日葵、油菜籽、三叶草、烟草、胡萝卜、棉花、苜蓿、马铃薯、茄子、黄瓜、拟南芥、和木本植物诸如针叶树和落叶树。优选用于转化的植物是水稻、玉米、小麦、大麦、甘蓝、花椰菜、胡椒、南瓜、甜瓜、大豆、番茄、甜菜、向日葵、或棉花，尤其是水稻、玉米、小麦、高粱、果园草、甜菜、和大豆。可以通过许多众所周知的方法将本发明的重组DNA序列导入植物细胞。本领域技术人员知道这些方法的选择可能取决于用于转化的植物类型，即单子叶植物或双子叶植物。适用于转化植物细胞的方法包括显微注射(Crossway等人，1986，Bio Techniques，4320-334)、电穿孔(Riggs和Bates，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，835602-5606)、由农杆菌介导的转化(Hinchee等人，1988，Bio/Technology，6915-922；EP 0 853 675)、直接基因转移(Paszkowski等人，1984，EMBO J.，32717-2722)、和使用购自Agracetus公司(麦迪逊，威斯康星州)和Dupont公司(Wilmington，特拉华州)的设备的弹果颗粒加速(美国专利号4,945,050；McCabe等人，1988，Bio/Technology，6923-926)。用于转化的细胞可以是已分化的叶细胞、胚细胞、或任何其它类型的细胞。
在原生质体的直接转化中，可以通过使用化学剂或电场来增强原生质体对外源遗传物质的摄取。然后外源物质可以整合到细胞核基因组中。先前的工作是在双子叶植物烟草中进行的，导致外源DNA掺入并转移至后代植株(Paszkowski等人，1984，EMBO J.，32717-2722；Potrykus等人，1985，Mol.Gen.Genet.，199169-177)。单子叶植物，例如小麦(Triticum monococcum)、多花黑麦草(Loliummultiflorum)(意大利黑麦草)、玉米、和黑墨西哥甜玉米的原生质体可以通过这种流程而转化。另一个优选实施方案是EP 0 292 435和EP 0 846 771中公开的用于玉米的原生质体转化方法。关于玉米转化还可参阅Koziel等人，1993，Bio/Technology，11194-200。可以通过利用原生质体的直接基因转移技术或颗粒轰击来进行水稻转化。由原生质体介导的转化据说被用于日本型和印度型(Zhang等人，1988，Plant Cell Rep.，7379-384；Shimamoto等人，1989，Nature，338274-276；Datta等人，1990，Bio/Technology，8736-740)。上述两种类型也可常规的使用微粒轰击进行转化(Christou等人，1991，Bio/Technology，9957-962)。专利申请号EP 0 332 581描述了用于Pooideae原生质体的生成、转化、和再生的技术。这些技术能够转化所有的Pooideae植物，包括鸭茅属(Dactylis)和小麦。另外，小麦转化描述于专利申请号EP 0 674 715；和Weeds等人，1993，Plant Physiol.，1021077-1084。
例如，可以依照常规植物转化方法将由此构建的植物表达载体导入水稻愈伤组织，由其诱导根和叶的分化，然后转移至花盆用于栽培，以获得经转化水稻。
经本发明DNA序列或载体的转化而生成的植物将在整个植物的大多数组织和器官中表达目的核苷酸序列。
改造到上文所述转基因植物中的遗传特性通过有性生殖或营养生长进行传递，从而在后代植株中实现维持和繁殖。一般而言，所述维持和繁殖利用了开发用于特定目的的已知农业方法，诸如耕地、播种、或收获。还可以应用专业方法诸如水培或温室技术。还可以在以开发具有改进特性(诸如对害虫、除草剂、或压力的耐受，改进的营养价值，提高的产量，或改进的结构)且引起较少倒伏或脱粒损失的植物为目的的植物育种中，使用依照本发明的转基因植物的有利遗传特性。多种育种步骤表征为详细定义的人为干涉，诸如选择待杂交的系，指引亲本系的授粉，或选择适当的后代植株。根据期望的特性，采用不同的育种措施。相关技术在本领域是众所周知的，包括但不限于杂交、自交、回交、多系育种、品种融合、种间杂交、非整倍体技术、等。杂交技术还包括通过机械、化学、或生化手段使植物不育以生成雄性或雌性不育植株。雄性不育植株与不同系的花粉的交叉授粉确保雄性不育植株而雌性可育植株的基因组将一致获得两种亲本系的特性。因而，依照本发明的转基因植物可用于改进植物系的育种，例如增加常规方法诸如除草剂或杀虫剂处理的效力，或者能够由于它们的经修饰遗传特性而免除所述方法。或者，可以获得具有改进的压力耐受的新作物，由于它们优化的遗传“装备”，所生成的收获产物的品质好于不能耐受可比的不利发育条件的作物的产物。
本发明的另一个目标是提供可用于在期望生物体中表达目的核苷酸序列的DNA序列。所述生物体可以是细菌、植物、或任何其它目的生物体。
另外，SEQ ID NO1-6的公开使得本领域技术人员能够设计用于聚合酶链式反应的寡核苷酸，试图由模板扩增DNA片段，所述模板包含表征为SEQ ID NO1、2、3、4、5、或6中15、优选20-30或更多碱基对的任何连续序列的核苷酸序列。所述核苷酸包含代表SEQ ID NO1、2、3、4、5、或6中15、优选20-30或更多碱基对的核苷酸序列。使用至少这样一种核苷酸进行的聚合酶链式反应及其扩增产物构成本发明的另一个实施方案。
序列表中序列的简述
实施例本文所用标准重组DNA和分子克隆技术在本领域是众所周知的，且描述于例如Sambrook等人，1989，《Molecular Cloning》即分子克隆，冷泉港，冷泉港实验室出版社，纽约和Ausubel等人，1994，《Currentprotocols in molecular biology》即分子生物学通用方案，JohnWiley & Sons，纽约。
4.生成的构建物● pCmpCG(CmpC启动子片段+GUS基因+polyA)● pCmpSG(CmpS启动子片段+GUS基因+polyA)● pCmpCC(CmpC启动子片段+CAT基因+polyA)● pCmpSC(CmpS启动子片段+CAT基因+polyA)● pCmpLC(CmpL启动子片段+CAT基因+polyA)
将包含启动子片段、报告基因、和多腺苷酸化信号的盒插入经XbaI和EcoRI限制性消化的pUC19载体(Stratagene)。
5.用于比较的构建物● pCapG(Cap启动子片段+GUS基因+polyA)● pCapSG(CapS启动子片段+GUS基因+polyA)● pCapC(Cap启动子片段+CAT基因+polyA)这些构建物所含启动子片段得自CaMV(Franck等人，Cell，21(1)285-294，1980；参阅GenBank编号V00141)。GUS、CAT、和polyA片段与用于CmYLCV构建物的相同。Cap对应于自TATA盒第-227-+33位碱基(CaMV基因组的第7175-7438位碱基，参阅GenBank编号V00141)的片段，CapS对应于自TATA盒第-227-+82位碱基(CaMV基因组的第7175-7486位碱基，参阅GenBank编号V00141)的片段。这些位置大致对应于CmYLCV片段的位置。
实施例4瞬时表达实验1.悬浮培养物和原生质体的制备诸葛菜(Orychophragmus violaceus)。在40ml含100mg/ml肌醇、2％蔗糖、和0.1mg/ml 2，4D的MS培养基(Murashige和Skoog，Physiol Plant，15474-497，1962)中进行悬浮培养。由4-5日龄的培养物分离原生质体。在0.1％果胶裂解酶(pectolyase)Y23(Seishin Pharmaceutical公司，日本)、1％纤维素酶Onozuka R10(Yakult Honsha公司，日本)、0.4M D-甘露醇、和0.1％MES pH5.5中于26℃消化细胞壁1小时。将原生质体滤过50μm筛子，并用电穿孔(EP)溶液(10mM HEPES、150mM NaCl、5mM CaCl2、0.2M甘露醇pH7.1)清洗两次。
烟草(Nicotiana plumbaginifolia)。在添加7g/L细菌用琼脂的RPM2培养基(Blonstein等人，Mol Gen Genet，211252-259，1988)pH5.6上无污染维持植物。为了制备原生质体，将叶片切碎，并在含0.5％driselase(Fluka)、0.25mM PVP 10(聚乙烯吡咯烷酮MW10000)、3.85mM CaCl2、6mg/L NAA、2mg/L BAP、和0.5M蔗糖pH5.7的溶液中于26℃保温过夜。将原生质体滤过100μm筛子。向原生质体悬浮液中加入蔗糖溶液(0.6M蔗糖、0.1％MES、和15mM CaCl2pH5.7)进行第一步纯化，并将悬浮液覆盖上W5溶液(150mM NaCl、125mM CaCl2、5mM KCl、6mM葡萄糖；Menczel等人，Theor Appl Genet，59191-195，1981)上。然后将原生质体用W5溶液清洗一次，最后用EP溶液清洗一次。
水稻(Oryza sativa)。由自O.sativa cv.Nipponbare建立的形态发生水稻悬浮培养物制备原生质体(Datta等人，1990，Bio/Technology，8736-740)。
2.瞬时表达实验在0.66ml EP缓冲液中通过电穿孔转染2×106个诸葛菜原生质体，即用960μF电容对距离4mm的原生质体悬浮液放电。对电容器施加450伏。在存在5-10μg质粒DNA时进行电穿孔，然后将原生质体于25℃培养16-24小时。在存在0.3ml PEG(40％聚乙二醇6000)和5-10μg质粒DNA时，在0.3ml悬浮液中转染2×106个烟草(Nicotianaplumbaginifolia)原生质体。将原生质体在0.4ml K3培养基(Godall等人，Methods Enzymol，181148-161，1990)中于25℃培养16-24小时，并在收获前添加10ml W5缓冲液。
通过至少三轮冻融来制备蛋白质提取物，并通过离心来实现澄清。
实施例5CAT和GUS测定法为了检测CAT基因表达，依照制造商的指示，使用CAT ELISA试剂盒(Boehringer)进行双重抗体三明治(DAS)-ELISA。使用Dynex MRXII装置测量CAT活性。在GUS缓冲液(0.05M NaPO4 pH7、0.01M EDTA、0.1％屈立通X-100、0.1％Sarkosyl)中稀释用于GUS测定法的样品。在存在等量的GUS反应缓冲液(100ml/L 10xGUS缓冲液、200mg/L BSA、705mg/L葡糖苷酸4-甲基伞形酯)时于37℃进行反应，并用2M Ammediol终止反应。在Titertek F1uoreskan II中测量活性。
基于实施方案实例的描述，应当理解本发明包括仅由所附的权利要求范围限制的其它组合。
将培养基高压灭菌(121℃20min)。将维生素溶于水，并在高压灭菌前加到培养基中。将激素溶于二甲亚砜(DMSO)。将抗生素溶于水，并过滤除菌(0.22μm)。将培养基高压灭菌，并在冷却至65℃后加入激素和抗生素。在所有情况中，使用9cm培养皿(Falcon，3003)，只是通常将GM和GM K50倒到15cm培养皿(Falcon，3025)中。
使用前将装有固体培养基的平板在层流中干燥以除去冷凝水。实施例7拟南芥品系和生长条件拟南芥种子生态型哥伦比亚(Col-0)野生型购自美国Lehle种子公司(1102 South Industrial大街，Suite D，Round Rock TX 78681，美国)。在装有4份沙、4份园土、和1份agrilit混合物的盆中栽培植物，22℃，光照/黑暗循环16/8小时。实施例8农杆菌菌株和培养物依照Walkerpeach和Velten(“Agrobacterium-mediated genetransfer to plant cellCointegrate and binary vector systems”即由农杆菌介导基因转移至植物细胞共整合和二元载体系统，《PlantMolecular Biology Manual》即植物分子生物学手册，B11-19，1994，S.B.Gelvin、R.A.Schilperoort编，Kluvers学术出版社)描述的方案，通过三亲交配将载体质粒导入受体根癌农杆菌菌株LBA4404(Clontech)。所用转移菌株是包含接合质粒pRK2013(Ditta等人，1980，Broad host range DNA cloning system from Gram-negativebacteria.Construction of gene bank of Rhizobium meliloti.即来自革兰氏阴性细菌的宿主范围广泛的DNA克隆系统。苜蓿根瘤菌基因库的构建，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，777347-7351)的大肠杆菌HB101。在未添加抗生素的LB培养基(Sambrook等人，1989，《Molecular Cloning》即分子克隆，冷泉港，冷泉港实验室出版社，纽约)中于28℃以200rpm培养用于根转化的农杆菌。
在栽培室中，将来自各个转基因植株的种子在GM K50培养基上发芽2周。选择表型正常即形成绿色真叶和分支根系统的卡那霉素抗性幼苗用于进一步分析。实施例11β-葡糖醛酸酶(GUS)的组织化学测定法将体外培养的幼苗或土壤中生长的植株用于GUS测定法。将整个幼苗或解离的器官浸入GUS染色液。GUS染色液包含1mM 5-溴-4-氯-3-吲哚葡糖苷酸(X-Gluc，Duchefa，储液20mM溶于DMSO)、100mM磷酸钠缓冲液pH7.0、10mM EDTA pH8.0、和0.1％屈立通X-100。将组织样品于37℃保温1-16小时。如果需要，可以清理样品，即用70％EtOH清洗几次以除去叶绿素。实施例12烟草转化载体pZU627的构建依照制造商的指示，使用铂金Pfx DNA聚合酶(LifeTechnologies)进行所有PCR反应。1.NOS终止子的扩增和克隆使用NOS终止子正向引物(SEQ ID NO21)和NOS终止子反向引物(SEQ ID NO22)由pBIN19(Bevan等人，1984)扩增NOS终止子。正向引物经修饰包含PstI位点，反向引物经修饰包含HindIII位点。将NOS终止子扩增产物作为PstI/HindIII片段克隆到pBluescript(Stratagene)的相同位点中，生成质粒pZU400A。2.番茄斑矮病毒核壳蛋白(TSWV NP)基因的扩增和克隆为了获得不能翻译的TSWV NP基因，将经修饰的TSWV NP基因引物用于扩增TSWV NP基因。TSWV NP基因正向引物导入BamHI、SphI、起始密码子、和终止密码子(SEQ ID NO23)。反向引物经修饰导入PstI位点(SEQ ID NO24)。将扩增产物作为BamHI/PstI片段克隆到pZU400A的BamHI/PstI位点中，位于NOS终止子上游，方向与其相同。在生成的克隆pZU400b中，依照制造商的指示，通过T4 DNA聚合酶处理(LifeTechnologies)除去TSWV NP基因与NOS终止子之间的PstI位点。由生成的克隆pZU400C，将TSWV NP基因和NOS终止子作为SphI/HindIII片段克隆到穿梭载体pZO1560的SphI/HindIII位点中，生成质粒pZU400。pZO1560是pBluescript的衍生物，其中原始多克隆位点被AGLINK多克隆位点(SEQ ID NO27)取代。3.CmYLCV启动子的扩增和克隆使用CmYLCV启动子正向引物(SEQ ID NO25)和CmYLCV启动子反向引物(SEQ ID NO26)扩增CmYLCV病毒启动子。正向引物经修饰包含SstI位点，反向引物经修饰包含PstI位点。将扩增的CmYLCV病毒启动子作为SstI/PstI片段克隆到pZU400的SstI/PstI位点中，位于TSWV-N基因上游，方向与TSWV-N基因相同。生成的克隆pZU625所包含的病毒基因盒能够生成不能翻译的TSWV NP RNA。4.将病毒基因盒克隆至pVictorHiNK将病毒基因盒作为AscI/PacI片段由pZU625克隆到pVictorHiNK载体pZU494的AscI/PacI位点中，生成植物转化载体pZU627。pVictorHiNK是包含衍生自铜绿假单胞菌质粒pVS1的复制起点(ORI)(已知它在根癌农杆菌中高度稳定)的二元载体(Itoh等人，1984，Plasmid，11206-220；Itoh和Haas，1985，Gene，3627-36)。pVS1 ORI只在农杆菌中有功能，而且能够通过三亲交配流程被辅助质粒pRK2013由大肠杆菌转移至根癌农杆菌(Ditta等人，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，777347-7351)。
该二元载体还包含ColE1复制起点，它在大肠杆菌中有功能且衍生自pUC19(Yannisch-Perron等人，1985，Gene，33103-119)。
为了在大肠杆菌和根癌农杆菌中得到维持，该载体包含由来自转座子Tn7(Fling等人，1985，Nucl.Acid Res.，137095)的0.93kb基因编码的、针对壮观霉素和链霉素的细菌抗性基因，它作为选择标记而发挥功能，用于在大肠杆菌和根癌农杆菌中维持载体。为了有效的细菌表达，将该基因融合tac启动子(Amman等人，1983，Gene，25167-178)。
长度分别为1.9kb和0.9kb、包含24bp边界重复序列的T-DNA右边界和左边界片段衍生自胭脂碱型根癌农杆菌菌株pTi137的Ti质粒(Yadev等人，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，796322-6326)。随后修饰边界之间的T-DNA区域，即删除由M13衍生的序列，并且为了改进它的克隆通用性而导入BIGLINK多克隆位点(SEQ ID NO28)，生成pVictorHiNK。
pVictorHiNK包含用于在植物转化过程中选择转化体的NPTII基因盒。该基因盒包含由根癌农杆菌获得的NOS启动子、NPTII基因、和NOS终止子。实施例13植物转化和抗性筛选1.用二元载体转化植物材料将二元载体转移至植物材料的方法已经建立且对于本领域技术人员而言是知道的。由于例如所用农杆菌菌株的不同、外植体材料的来源不同、依赖所用栽培种以及植物物种的再生系统的不同，流程中存在变化。依照如下流程，将二元载体pZU627用于植物转化实验。通过三亲交配用pZU627转染至受体根癌农杆菌菌株中，随后对接合后体进行Southern印迹分析以确认构建物正确转移至受体菌株，将拒受性外植体材料接种重组根癌农杆菌菌株并与其共培养，使用适当的抗生素选择性杀死根癌农杆菌菌株，通过在含卡那霉素的选择培养基上的生长来选择经转化细胞，将小植株转移至土壤，通过对植株的分离染色体DNA进行Southern印迹分析来测定整合的T-DNA的完整性。2.植物对TSWV感染的抗性在温室中在标准隔离条件下培养经转化植株以防止任何病原体感染。在四叶期，通过机械接种用TSWV感染植株。将来自全身感染TSWV植株的组织在5倍体积的冰冷接种缓冲液(10mM磷酸盐缓冲液，添加1％Na2SO3)中研磨，并在存在金刚砂粉末时摩擦前两片完全伸展的新叶。在接种后3周内对接种后的植株监测症状发展。包含pZU627序列的植株不显示TSWV症状，而未转化对照植株在接种后7天内显示严重的全身性TSWV症状。将抗性植株自花授粉，并收获种子。对后代植株分析整合基因的分离，随后如上所述再次筛选对TSWV感染的抗性。实施例14用于植物转化的CmpS-磷酸甘露糖异构酶-nos构建物的构建使用具有侧翼BamHI位点的Cmpf-B引物(cgc gga tcc tgg cag acaaag tgg cag a；SEQ ID NO29)和CmpS-B引物(cgc gga tcc tac ttctag gct act tg；SEQ ID NO30)PCR扩增CmpS启动子。将生成的PCR片段克隆到pBluescript KS(+)的BamHI位点中，形成pNOV4211。
为了构建用于根癌农杆菌转化的二元载体，使用BamHI由pNOV4211切下CmpS启动子，并在PMI基因上游插入经BamHI消化的pNOV2804(SEQID NO31)，生成载体pNOV2819。pNOV2804(SEQ ID NO31)是具有VS1复制起点的二元载体，主链中具有一个拷贝的农杆菌virG基因，且在T-DNA的左边界与右边界之间具有无启动子的PMI-nos终止子表达盒。PMI(磷酸甘露糖异构酶)是大肠杆菌manA基因(Joersbo和Okkels，1996，Plant Cell Reports，16219-221；Negrotto等人，2000，Plant Cell Reports，19798-803)的编码区。nos(胭脂碱合酶)终止子得自根癌农杆菌T-DNA(Depicker等人，1982，J.Mol.Appl.Genet.，1(6)561-573)。磷酸甘露糖异构酶编码区和nos终止子分别位于pNOV2804(SEQ ID NO31)的第290-1465nt和第1516-1789nt。
为了构建用于biolistic转化的载体，使用BamHI由pNOV4211切下CmpS启动子，并插入经BamHI消化的pNOV3604(SEQ ID NO32)，形成pNOV2820，由此构建成由CmpS启动子驱动的PMI表达盒。pNOV3604是用于制备biolistic片段的载体，而且是以pUC19为基础的，具有ColE1复制起点和赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。与pNOV2804一样，pNOV3604也包含无启动子的PMI-nos终止子表达盒(见下文)。磷酸甘露糖异构酶编码区和nos终止子分别位于pNOV3604(SEQID NO32)的第42-1217nt和第1268-1541nt。
将二元载体pNOV2819用于根癌农杆菌转化，将载体pNOV2820用于biolistic转化。实施例15用于在植物中稳定表达的CmpC-GUS质粒的构建1.二元载体的构建选择并修饰载体pCambia 1302(Cambia，堪培拉，澳大利亚；Roberts，C.S.、Rajagopal，S.、Smith，L.、Nguyen，T.、Yang，W.、Nugroho，S.、Ravi，K.S.、Cao，M.L.、Vijayachandra，K.等人，“Acomprehensive set of modular vectors for advanced manipulationand efficient transformation of plants”即用于植物的高级操作和有效转化的一组全面的模块化载体，洛克菲勒基金会水稻生物技术国际计划会议，马六甲，马来西亚，1997年9月15-19日)用于实验通过HindIII内切核酸酶对第9788位的消化和NcoI内切核酸酶对第1位的消化除去GFP基因前面的CaMV 35S启动子，并将载体的两个相容末端再次连接。通过XhoI内切核酸酶对第7613位的消化和BstXI对第9494位的消化切除潮霉素基因及其前面的CaMV 35S启动子。由载体切除35S启动子序列以排除由同源性介导的基因沉默的任何风险。
将由1’启动子(Mengiste等人，Plant J.，12(4)945-948，1997)驱动的bar基因导入第9737位EcoRI位点作为选择标记。将获得的载体命名为pCamBar。2.生成的构建物分别将实施例3所述盒CmpCG和CapG插入pCamBar载体的第9764位XbaI位点与第9737位EcoRI位点之间，获得pCamBarCmpCG和pCamBarCapG质粒。将两种构建物用于转化根癌农杆菌细胞。实施例16拟南芥中的稳定表达1.植物的生成和转染将拟南芥(哥伦比亚0)野生型种子播种，于4℃在黑暗中冷处理3天以实现同步发芽，并转移至栽培室(22℃，24小时光照)。当它们生成最大数目的未展开芽苞时，浸润发芽植株。浸润是依照clough和Bent，Plant J.，16735-743，1987所述方案进行的。2.转基因植株的选择通过每5天喷洒BASTA即草铵膦除草剂(Plüss-Staufer AG/SA)(150mg/L)，进行3次来选择由T1代种子获得的幼苗。选择后收集了20株pCamBarCmpCG抗性植株和9株pCamBarCapG抗性植株。在所述条件下栽培它们以获得T2代种子。这些种子经历与上文所述用于野生型的相同流程，通过草铵膦喷洒选择T2幼苗，并对抗性突变体分析GUS基因表达。3.稳定转化的拟南芥植株中的组织化学GUS表达如实施例11所述进行GUS组织化学染色。在15ml培养管中进行分析，将转化后的幼苗浸泡在X-gluc溶液中，以130mBar施压10分钟，并于37℃保温过夜。由经pCamBarCmpCG转化的拟南芥植株获得的结果指示，GUS报告基因在所有营养器官中具有由CmpC启动子驱动的组成性表达。4.稳定转化的拟南芥植株中的定量酶学GUS测定法A.样品制备每种转基因系选4株植株、每株植株选1片叶子用于测试。将4片叶子收集到相同eppendorf管中，用液氮冷冻，并用一次性研磨器磨成细粉。将其在150μl GUS缓冲液(0.05M NaPO4 pH7、0.01M EDTA、0.1％屈立通X-100、0.1％Sarkosyl)中稀释，于37℃保温5分钟，并在微量离心机中以最大速度离心5分钟。将上清液转移至新的eppendorf管，并将这些样品用于酶学测试。
依照Bradford法(Bradford，M.M.，Anal.Biochem.，72248-254，1976)评估这些植物提取物中的蛋白质，以BSA作为标准。使用提取的样品作为模板，通过PCR分析确认了突变系中启动子和GUS基因的存在。
B.荧光GUS测定法如实施例5所述进行GUS荧光测定法。为了检测GUS基因表达，在GUS缓冲液中稀释表达样品。在存在等量的GUS反应缓冲液时于37℃进行反应，并用2M Ammediol终止反应。在Titertek Fluoroskan II中测量活性。
在选择的经pCamBarCmpCG转化的20个系中有15个、在经pCamBarCapG转化的9个系中有8个在叶片中显示有GUS酶活性。几个CmpCG转化系中的活性水平与CapG可比。但是，由于基因型的差异(基因座的数目和每个基因座的转基因插入片段数目)，不同转基因系的结果是不同的。实施例17CmpC启动子变体的构建正如实施例1所述，使用Pfu聚合酶(Stratagene)进行所有PCR反应。1.DNA的扩增和克隆生成pCmpCG质粒(实施例3)的两种变体，pCmpMG和pCmpMsG。前者删除了CmpC启动子中的序列“GTGGTCCC”，后者将其突变成序列“GTGCTCGC”。
为了获得pCmpMG，扩增了3个PCR片段CmpM1使用Cmp1正向引物(见实施例3，SEQ ID NO13)和CmpMr反向引物(CCATCGTGGTATTTGGTATTG，SEQ ID NO33)，以pCmpCG质粒作为模板。CmpM2使用CmpMf正向引物(CAATACCAAATACCACGATGG，SEQ ID NO34)和CmpC2反向引物(见实施例3，SEQ ID NO14)，以pCmpCG质粒作为模板。CmpM使用Cmp1正向引物和CmpC2反向引物，以等摩尔混和的CmpM1和CmpM2 PCR产物作为模板。
为了获得pCmpMsG，扩增了3个PCR片段CmpMs1使用Cmp1正向引物和CmpMrs反向引物(CGTGGTAGCGAGCACTTTGGT，SEQ ID NO35)，以pCmpCG质粒作为模板。CmpMs2使用CmpMfs正向引物(AAGTGCTCGCTACCACGATGG，SEQ ID NO36)和Cmp2反向引物，以pCmpCG质粒作为模板。CmpsM使用Cmp1正向引物和Cmp2反向引物，以等摩尔混和的CmpMs1和CmpMs2 PCR产物作为模板。
为了获得pCmpMG和pCmpMsG质粒，用XbaI和BamHI内切核酸酶限制性消化原始pCmpCG质粒以切除CmpC片段，并在该处插入CmpM和CmpMsPCR产物。实施例18使用pCmpM和pCmpMs构建物的瞬时表达实验1.悬浮培养物和原生质体的制备如实施例4所述生成悬浮培养物和原生质体。2.GUS测定法如实施例4所述进行转染和蛋白质提取物的制备，如实施例5所述进行GUS测定法。
由10次不同实验的平均值获得GUS测定法的结果，并对标准克隆值进行标准化。CmpCG构建物中“GTGGTCCC”序列的删除将所有原生质体种类中GUS报告基因的表达降至来自CmpC的GUS报告基因表达的大约50％(见下文)。由“GTGCTCGC”突变诱导的效果依赖植物物种。在诸葛菜和水稻的原生质体中，GUS基因表达水平分别降至65.2％和73.6％。在N.plumbaginifolia的原生质体中，CmpMs启动子活性与CmpM启动子相似。

实施例19包含5’启动子片段且其可操作连接GFP或GUS报告基因的植物转化载体的构建1.启动子的扩增和克隆构建嵌合基因，它包含来自CmYLCV全长转录本启动子(SEQ ID NO1)的DNA序列且其融合包含内含子的植物优化GFP(synGFPI，SEQ ID NO37)或包含内含子的GUS报告基因(GIG，SEQ ID NO38)序列。GIG基因在SEQ ID NO38的第385-576nt包含来自马铃薯(Solanumtuberosum)的ST-LS1内含子(由Purdue大学的Standon Gelvin博士处获得，且描述于Narasimhulu等人，1996，Plant Cell，8873-886)。synGFPI是在SEQ ID NO37的第278-465nt导入了ST-LS1内含子的植物优化GFP基因。关于启动子，将CmYLCV基因组DNA作为模板用于聚合酶链式反应(PCR)。设计基因特异引物来扩增DNA序列。使用Cmpf-B正向引物(SEQ ID NO29)，联合5’向3’引物(CGCGGATTGCTCCCTTAACAATGAGG，SEQ ID NO39)作为反向引物，分离对应于CmpC(SEQ ID NO2)的基因片段。使用Cmpf-B正向引物(SEQ ID NO29)，联合CmpS-B反向引物(SEQ ID NO30)，分离对应于CmpS(SEQ ID NO3)的基因片段。所有3种引物都在它们的5’端包含BamHI限制酶识别位点CGCGGA。依照制造商的指示，使用Pfu聚合酶(Stratagene)进行所有PCR反应。使用热循环仪(DNA Engine，MJResearch公司，Waltham，MA，美国)和如下PCR条件来扩增启动子片段94℃ 10sec；20个循环的94℃ 10sec、56℃ 30sec、72℃ 60sec；72℃ 90sec。BamHI限制性消化后，将启动子片段连接到包含GIG基因或synGFPI基因的基于pUC的载体中，以构建启动子-报告基因融合体且其可操作连接nos终止子。2.生成的启动子-报告基因盒● CmpS启动子片段+synGFPI基因+nos(SEQ ID NO40)● CmpS启动子片段+GIG基因+nos(SEQ ID NO41)● CmpC启动子片段+synGFPI基因+nos(SEQ ID NO42)● CmpC启动子片段+GIG基因+nos(SEQ ID NO43)
3.亚克隆到农杆菌二元载体中将包含启动子片段、报告基因、和nos终止子的启动子-报告基因盒(SEQ ID NO40-43)插入用于玉米转化的二元载体pNOV2117和用于番茄转化的二元载体pNOV4200。pNOV2117(SEQ ID NO44)是具有VS1复制起点的二元载体，主链中具有一个拷贝的农杆菌virG基因，且在T-DNA的左边界与右边界之间具有玉米遍在蛋白启动子-PMI基因-nos终止子表达盒。PMI(磷酸甘露糖异构酶)是大肠杆菌manA基因(Joersbo和Okkels，1996，Plant Cell Reports，16219-221；Negrotto等人，2000，Plant Cell Reports，19798-803)的编码区。nos(胭脂碱合酶)终止子得自根癌农杆菌T-DNA(Depicker等人，1982，J.Mol.Appl.Genet.，1(6)561-573)。玉米遍在蛋白启动子、磷酸甘露糖异构酶编码区、和nos终止子分别位于pNOV2117(SEQ ID NO44)的第31-2012nt、第2109-3212nt、和第3273-3521nt。紧挨右边界插入报告基因-启动子盒。二元载体中的选择标记表达盒紧挨着左边界。
为了番茄转化，将pNOV4200(SEQ ID NO45)用作二元载体，它包含VS1复制起点，位于主链中的一个拷贝的农杆菌virG基因，且在左边界与右边界之间包含潮霉素选择标记盒。潮霉素选择标记盒包含拟南芥遍在蛋白3启动子(Ubq3(At)，Callis等人，J.Biol.Chem.，26512486-12493，1990)且其可操作连接编码潮霉素抗性的基因(本文称为“HYG”，来自大肠杆菌的合成潮霉素B磷酸转移酶基因，专利JP 1986085192-A1，1986年4月30日)和nos终止子(Depicker等人，J.Mol.Appl.Genet.，1(6)561-573，1982)。拟南芥遍在蛋白启动子、HYG基因、和nos终止子分别位于pNOV4200(SEQ ID NO45)的第162-11494nt、第1897-2939nt、和第2939-3236nt。紧挨右边界插入报告基因-启动子盒(SEQ ID NO40-43)。二元载体中的选择标记表达盒紧挨着左边界。
下文显示了二元载体构建物中选择标记和启动子-报告基因盒的取向。4.二元载体构建物● NOV4215(右边界CmpS启动子片段+synGFPI基因+nos-ZmUbi+PMI基因+nos左边界)● NOV4216(右边界nos+synGFPI基因+CmpS启动子片段-ZmUbi+PMI基因+nos左边界)● NOV4217(右边界CmpS启动子片段+synGFPI基因+nos-Ubq3(At)+HYG基因+nos左边界)● NOV4220(右边界CmpS启动子片段+GIG基因+nos-Ubq3(At)+HYG基因+nos左边界)● NOV4224(右边界CmpC启动子片段+GIG基因+nos-ZmUbi+HYG基因+nos左边界)● NOV4226(右边界CmpC启动子片段+synGFPI基因+nos-ZmUbi+PMI基因+nos左边界)使用已知启动子构建了其它盒用于比较。为此目的，构建了包含玉米遍在蛋白启动子(Christensen等人，Plant Mol.Biol.，12619-632，1989)且其可操作连接synGFP和35S终止子(35S term)的启动子盒ZmUbi-GFP-35S终止子(SEQ ID NO46)，还构建了包含玉米遍在蛋白启动子且其可操作连接GIG基因和nos终止子的启动子盒(NOV 3612，SEQ ID NO47)。ZmUbi启动子、GFP基因、和35S终止子分别位于SEQ ID NO46的第1-2019nt、第2020-2751nt、和第2876-2949nt。ZmUbi启动子、GIG、和nos终止子分别位于SEQ ID NO47的第1-1982nt、第2015-4015nt、和第4069-4341nt。将ZmUbi-GIG-nos盒(SEQ ID NO47)克隆到基于pUC的载体中。如上所述，将ZmUbi-GFP-nos盒(SEQ ID NO46)克隆到pNOV2117二元载体中，用于玉米转化。构建了包含拟南芥遍在蛋白3启动子(Ubq3(At))且其可操作连接synGFPI和nos终止子的启动子盒(SEQ ID NO48)和包含拟南芥遍在蛋白3启动子且其可操作连接GIG基因和nos终止子的启动子盒(SEQ ID NO49)。遍在蛋白3启动子、synGFPI基因、和nos终止子分别位于SEQ ID NO48的第1-1332nt、第1738-2658nt、和第2670-2943nt。遍在蛋白3启动子、GIG基因、和nos终止子分别位于SEQID NO49的第1-1335nt、第1746-3746位、和第3800-4072nt。如上所述，将启动子盒克隆到包含潮霉素选择标记盒的pNOV4200二元载体中，用于番茄转化。下文显示了二元载体构建物中选择标记和启动子-报告基因盒的取向。5.二元载体构建物● NOV2110(右边界ZmUbi启动子+synGFPI基因+35S终止子-ZmUbi+PMI基因+nos左边界)● NOV4209(右边界Ubq3(At)启动子+synGFPI基因+nos-Ubq3(At)+HYG基因+nos左边界)● NOV4208(右边界Ubq3(At)启动子+GUS-内含子-GUS基因+nos-Ubq3(At)+HYG基因+nos左边界)实施例20由农杆菌介导的玉米转化基本上如Negrotto等人，2000，Plant Cell Reports，19798-803所述进行未成熟玉米胚的转化。关于这个实施例，所有培养基的成分描述于Negrotto等人，见上文。但是，可以替代该文献中描述的各种培养基成分。1.转化质粒和选择标记如实施例19所述，将用于转化的基因克隆到适用于玉米转化的载体中。所用载体包含磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因(Negrotto等人，2000，Plant Cell Reports，19798-803)。2.根癌农杆菌的制备将包含植物转化质粒的农杆菌菌株LBA4404(pSB1)在YEP(酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L、琼脂15g/L pH6.8)固体培养基上于28℃培养2-4天。将大约0.8×109个农杆菌悬于添加100μM乙酰丁香酮(As)的LS-inf培养基(Negrotto等人，2000，Plant CellReports，19798-803)。将细菌在该培养基中预诱导30-60分钟。3.接种由A188或其它合适玉米基因型的8-12日龄穗切下未成熟胚并转移至添加100μM As的液体LS-inf。将胚用新鲜的感染培养基漂洗一次。然后加入农杆菌溶液，并将胚漩涡震动30秒钟，使其与细菌作用5分钟。然后将胚转移至LSAs培养基，盾片侧朝上，并在黑暗中培养2-3天。随后，将每个培养皿20-25个胚转移至添加250mg/L头孢噻肟和1.6mg/L硝酸银的LSDc培养基，并在黑暗中于28℃培养10天。4.经转化细胞的选择和经转化植株的再生将未成熟胚生成的胚性愈伤组织转移至LSD1M0.5S培养基。在该培养基上对培养物选择6周，第3周进行继代培养步骤。将存活愈伤组织转移至LSD1M0.5S培养基扩大培养或转移至Reg1培养基。在光照下培养(16小时光照/8小时黑暗方案)之后，将绿色组织转移至不含调节剂的Reg2培养基，并培养1-2周。将小植株转移至装有Reg3培养基的Magenta GA-7盒(Magenta公司，Chicago III)，并在光照下培养。将启动子-报告基因盒呈PCR阳性的植株转移至土壤，并在温室中栽培。实施例21番茄的稳定转化基本上如Meissner等人，The Plant Journal，121465-1472，1997所述进行番茄转化。1.转化质粒和选择标记如实施例19所述，将用于转化的基因克隆到适用于番茄转化的载体中。载体包含用于选择的潮霉素抗性基因。2.根癌农杆菌的制备将包含植物转化质粒的农杆菌菌株GV3101在LB(酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L、琼脂15g/L pH6.8)液体培养基上于22℃培养2天。将大约0.8×109个农杆菌悬于添加100μM乙酰丁香酮的KCMS接种培养基(MS盐4.3g/L、Myo-Inositol、硫胺素1.3μg/ml、2，4-D 0.2μg/ml、激动素0.1μg/ml、和蔗糖3％，pH5.5)。将细菌在该培养基中预诱导60分钟。3.种子的灭菌和发芽将番茄Micro-Tom栽培种(Meissner等人，The Plant Journal，121465-1472，1997)和ZTV-840栽培种的种子在含吐温的20％漂白液中浸泡20分钟。然后将种子用无菌水清洗3次，并置于Magenta盒(Magenta公司，Chicago III)中的TSG培养基(1/2 MS盐、1％蔗糖、1％植物用琼脂pH5.8)上进行发芽。在发芽后7-10天切下子叶，并将子叶叶柄切成5mm区段。4.接种在接种农杆菌之前，将7-10日龄子叶和子叶叶柄区段在烟草BY-2饲养细胞平板(MS盐、Myo-inisitol 0.1mg/ml、酪蛋白水解物0.2mg/ml、盐酸硫胺系1.3μg/ml、3％蔗糖pH5.5)上保温24小时。
将子叶在液体KCMS农杆菌悬浮液中浸泡5分钟。然后将20-25片子叶转移至相同饲养细胞平板，远轴侧朝上，并在黑暗中培养2-3天。5.经转化子叶和叶柄的选择和经转化植株的再生在光照下接种农杆菌后2-3天，将子叶和叶柄区段转移至选择培养基TSM-1(4.3g/L MS盐、1xB5维生素、2％蔗糖、1％葡萄糖、1μg/ml玉米素、0.05μg/ml IAA、5μg/ml潮霉素、和250μg/ml羧苄青霉素pH5.8)。将子叶和叶柄区段生成的胚性愈伤组织转移至TSM-2培养基(MS盐4.3g/L、1xMS维生素、2％蔗糖、1μg/ml玉米素、5μg/ml潮霉素、和250μg/ml羧苄青霉素pH5.8)。将存活愈伤组织形成的小植株转移至装有TRM培养基(4.3g/L MS盐、1xMS维生素、2％蔗糖pH5.8)的Magenta GA-7盒(Magenta公司，Chicago III)，并在光照下培养。生根后，将原代转化体转移至土壤。实施例22绿色荧光蛋白(GFP)的荧光测定法为了检测synGFP基因表达而进行荧光测定法。
将稳定转化的玉米和番茄的叶片在干冰上冷冻。将冷冻组织彻底磨碎，并与300μl GFP提取缓冲液(10mM Tris-HCl pH7.5、100mM NaCl、1mM MgCl2、10mM DTT、和0.1％Sarcosyl)混和。通过离心将提取物与叶片碎屑分开，随后转移至具有透明底部的黑色96孔板(Costar3615)。通过Spectra Fluor Plus Plate Reader在465nm激发和512nm发射处测量相对荧光单位(RFU)。将GFP活性对使用BCA测定法(依照Pierce)测量的总蛋白进行标准化。实施例23稳定转化的玉米和番茄植株的表达分析1.玉米转基因To植株GFP在CmpS启动子(NOV4215、NOV4216)控制下的表达水平比在ZmUbi启动子(NOV2110)控制下高10-20倍。这些结果是由42株独立To系的叶片样品获得的，代表了总共93株To植株。2.GFP ELISA测定法为了检测绿色荧光蛋白(GFP)而进行定量三明治免疫测定法。使用两种商品化的多克隆抗体。山羊抗GFP IAP(Rockland，#600-1-1-215)是免疫亲和纯化的，兔抗GFP抗体(Torrey PinesBiolabs，#TP401)是蛋白A纯化的。通过兔抗体将植物提取物中的GFP蛋白质捕获到固相微量滴定板上。然后在固相兔抗体、GFP蛋白质、与孔中的第二种山羊抗体之间形成“三明治”。通过清洗步骤除去未结合的二抗之后，使用碱性磷酸酶标记的抗体检测结合的抗体。加入酶的底物，并通过读取每个孔的吸光值来测量显色。然后将读数拟合标准曲线，绘制GFP浓度对吸光值的曲线。
2.番茄(Lycopersicon esculentum)TO植株CmYLcV启动子的CmpS片段(NOV4217)导致synGFP的表达水平显著高于拟南芥Ubq3启动子(NOV4209)的表达水平。
synGFP报告基因这些结果是通过使用显微镜对5株独立的经NOV4217盒稳定转化的愈伤组织系和2株独立的经NOV4209盒稳定转化的愈伤组织系评估愈伤组织和初生苗中的synGFP荧光强度而获得的。
GUS-内含子-GUS报告基因这些结果是通过对11株独立的包含CmpS启动子-报告基因盒的稳定转化的愈伤组织系(系NOV4220-1至NOV4220-11)评估GUS染色强度而获得的。还评估了2株包含CmYLCV启动子的CmpC启动子片段的稳定转化的愈伤组织系(NOV4224-1、NOV4224-2)。为了比较，还评估了2株包含拟南芥遍在蛋白3(Ubq3)启动子的稳定转化的愈伤组织系(NOV4208-1、NOV4208-2)。
实施例24玉米中的瞬时表达实验1.胚的制备由A188或其它合适玉米基因型的8-12日龄穗切下未成熟胚并转移至液体2DG4+0.5d(Duncan氏D培养基经修改包含20mg/L葡萄糖并添加10g/L甘露糖)，并培养1-2天。2.质壁分离在轰击前，将未成熟胚在12％蔗糖溶液中保温3-4小时。将胚在平板上排列成8-10mm圈。3.轰击如Wright等人(2001，Plant cell Reports，印刷中)所述，通过在存在5μg质粒DNA时于650psi对玉米胚进行微粒轰击来进行转染。
倘若“印刷中”的参考文献不起作用，下面是由该论文提取的细节如DuPont Biolistics手册所述将片段DNA沉淀在金微载体(＜1μm)上。使用PDS-1000He Biolistics装置将基因投递至靶组织细胞。装置的设置如下破裂盘与巨载体相距8mm，巨载体与终止屏相距10mm，终止屏与靶相距7cm。使用650psi破裂盘用DNA包被的微粒射击平板两次。为了降低氦爆冲击波对组织的损伤，将不锈钢筛网(在水平和垂直方向上每英寸线性距离有200个孔；McMaster-Carr，New Brunswick，NJ)置于终止屏与靶组织之间。将胚在平板上在黑暗中于25℃培养48小时。通过在GUS裂解缓冲液中裂解细胞来制备蛋白质提取物，并通过离心来实现澄清。
将构建物pCmpS和pCmpMG(实施例17)的GUS结果对比较克隆值(pNOV3612，实施例19)进行标准化。由2次不同实验获得的结果显示，与pCmpS相比，CmYLCV启动子中的8bp删除(pCmpMG，实施例17)不显著影响GUS报告基因的表达水平。玉米胚中的瞬时表达
序列表<110>Syngenta Participations AG<120>夜香树黄叶卷曲病毒启动子<130>S-31359A<140><141><150>GB 0007427.8<151>2000-03-27<150>GB 0010486.9<151>2000-04-28<150>EP 01101802.5<151>2001-01-26<150>US<151>2001-02-28<160>49<170>PatentIn Ver.2.2<210>1<211>670<212>DNA<213>夜香树黄叶卷曲病毒<400>1attactggca gacaaagtgg cagacatact gtcccacaaa tgaagatgga atctgtaaaa 60gaaaacgcgt gaaataatgc gtctgacaaa ggttaggtcg gctgccttta atcaatacca 120aagtggtccc taccacgatg gaaaaactgt gcagtcggtt tggctttttc tgacgaacaa 180ataagattcg tggccgacag gtgggggtcc accatgtgaa ggcatcttca gactccaata 240atggagcaat gacgtaaggg cttacgaaat aagtaagggt agtttgggaa atgtccactc 300acccgtcagt ctataaatac ttagcccctc cctcattgtt aagggagcaa aatctcagag 360agatagtcct agagagagaa agagagcaag tagcctagaa gtagtcaagg cggcgaagta 420ttcaggcagg gtggccagga agaagaaaag ccaagacgac gaaaacaggt aagagctaag 480ctttctcatc tcaaagatga ttcttgatga tttttgtctc cacggtccgt ataggatcca 540ctgaattgat aaatatcata tggtttgtat aaaacccgat atttaaatct gtatcattct 600gtttgaataa aacttgatac tttgttggag tcgtttgtaa aaacataaac aattataatc 660tgttaaaaac670<210>2<211>346<212>DNA<213>夜香树黄叶卷曲病毒<400>2ctggcagaca aagtggcaga catactgtcc cacaaatgaa gatggaatct gtaaaagaaa 60acgcgtgaaa taatgcgtct gacaaaggtt aggtcggctg cctttaatca ataccaaagt 120ggtccctacc acgatggaaa aactgtgcag tcggtttggc tttttctgac gaacaaataa 180gattcgtggc cgacaggtgg gggtccacca tgtgaaggca tcttcagact ccaataatgg 240agcaatgacg taagggctta cgaaataagt aagggtagtt tgggaaatgt ccactcaccc 300gtcagtctat aaatacttag cccctccctc attgttaagg gagcaa346<210>3<211>400<212>DNA<213>夜香树黄叶卷曲病毒<400>3ctggcagaca aagtggcaga catactgtcc cacaaatgaa gatggaatct gtaaaagaaa 60acgcgtgaaa taatgcgtct gacaaaggtt aggtcggctg cctttaatca ataccaaagt 120ggtccctacc acgatggaaa aactgtgcag tcggtttggc tttttctgac gaacaaataa 180gattcgtggc cgacaggtgg gggtccacca tgtgaaggca tcttcagact ccaataatgg 240agcaatgacg taagggctta cgaaataagt aagggtagtt tgggaaatgt ccactcaccc 300gtcagtctat aaatacttag cccctccctc attgttaagg gagcaaaatc tcagagagat 360agtcctagag agagaaagag agcaagtagc ctagaagtag 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atcaacgacc ttttggaaac ttcggcttcc 2460cctggagaga gcgagattct ccgcgctgta gaagtcacca ttgttgtgca cgacgacatc 2520attccgtggc gttatccagc taagcgcgaa ctgcaatttg gagaatggca gcgcaatgac 2580attcttgcag gtatcttcga gccagccacg atcgacattg atctggctat cttgctgaca 2640aaagcaagag aacatagcgt tgccttggta ggtccagcgg cggaggaact ctttgatccg 2700gttcctgaac aggatctatt tgaggcgcta aatgaaacct taacgctatg gaactcgccg 2760cccgactggg ctggcgatga gcgaaatgta gtgcttacgt tgtcccgcat ttggtacagc 2820gcagtaaccg gcaaaatcgc gccgaaggat gtcgctgccg actgggcaat ggagcgcctg 2880ccggcccagt atcagcccgt catacttgaa gctaggcagg cttatcttgg acaagaagat 2940cgcttggcct cgcgcgcaga tcagttggaa gaatttgttc actacgtgaa aggcgagatc 3000accaaagtag tcggcaaata aagctctagt ggatctccgt acccccgggg gatctggctc 3060gcggcggacg cacgacgccg gggcgagacc ataggcgatc tcctaaatca atagtagctg 3120taacctcgaa gcgtttcact tgtaacaacg attgagaatt tttgtcataa aattgaaata 3180cttggttcgc atttttgtca tccgcggtca gccgcaattc tgacgaactg cccatttagc 3240tggagatgat tgtacatcct tcacgtgaaa atttctcaag 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1.能够驱动相连核苷酸序列表达的DNA序列，其中所述DNA序列包含SEQ ID NO1所述核苷酸序列。
2.依照权利要求1的DNA序列，其中所述DNA序列包含SEQ ID NO2所述核苷酸序列。
3.依照权利要求1的DNA序列，其中所述DNA序列包含SEQ ID NO3所述核苷酸序列。
4.依照权利要求1的DNA序列，其中所述DNA序列包含SEQ ID NO4所述核苷酸序列。
5.依照权利要求1的DNA序列，其中所述DNA序列包含SEQ ID NO5所述核苷酸序列。
6.依照权利要求1的DNA序列，其中所述DNA序列包含SEQ ID NO6所述核苷酸序列。
7.在严谨条件下与SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、或SEQ ID NO6之任一发生杂交的DNA序列。
8.依照权利要求7的DNA序列，其中所述DNA序列包含SEQ ID NO19所述核苷酸序列。
9.依照权利要求7的DNA序列，其中所述DNA序列包含SEQ ID NO20所述核苷酸序列。
10.包含SEQ ID NO1的至少50nt的连续片段的DNA序列，其中所述DNA序列能够驱动相连核苷酸序列的表达。
11.依照权利要求10的DNA序列，其中所述至少50nt的连续片段与SEQ ID NO1的至少50nt的连续片段具有至少70％的序列同一性。
12.包含由夜香树黄叶卷曲病毒分离的全长转录本启动子区的重组DNA分子。
13.包含依照权利要求1-11之任一的DNA序列且其可操作连接目的核苷酸序列的重组DNA分子。
14.权利要求13的重组DNA分子，其中目的核苷酸序列包含编码序列。
15.权利要求14的重组DNA分子，其中编码序列编码期望的表型性状。
16.权利要求15的重组DNA分子，其中编码序列编码赋予经所述编码序列转化的细胞以正选择优势的蛋白质。
17.权利要求15或16的重组DNA分子，其中编码序列编码赋予经所述编码序列转化的细胞以代谢优势的蛋白质，该代谢优势包括能够代谢化合物，其中所述化合物是甘露糖或木糖或其衍生物或前体，或是该蛋白质的底物，或者能够由经所述编码序列转化的细胞代谢成这种底物。
18.权利要求17的重组DNA分子，其中所述编码序列编码选自下组的酶木糖异构酶、磷酸甘露糖异构酶、甘露糖-6-磷酸异构酶、甘露糖-1-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖差向异构酶、甘露糖或木糖磷酸酶、甘露糖-6-磷酸酶、甘露糖-1-磷酸酶、和甘露糖或木糖通透酶。
19.权利要求18的重组DNA分子，其中编码序列编码磷酸甘露糖异构酶。
20.依照权利要求14的重组DNA，其中编码区是不能翻译的。
21.依照权利要求20的重组DNA，其中不能翻译的编码区来自病毒基因。
22.依照权利要求21的重组DNA，其中病毒基因衍生自TSWV，特别是来自TSWV NP基因。
23.权利要求14的重组DNA分子，其中编码序列处于反义取向。
24.包含依照权利要求1-11之任一的DNA序列或依照权利要求12-23之任一的重组DNA分子的DNA表达载体。
25.权利要求24的DNA表达载体，其中所述DNA表达载体是pNOV2819。
26.权利要求24的DNA表达载体，其中所述DNA表达载体是pNOV2820。
27.包含依照权利要求1-11之任一的第一DNA序列及与之可操作连接的目的核苷酸序列以及依照权利要求1-11之任一的第二DNA序列及与之可操作连接的目的核苷酸序列的DNA表达载体。
28.依照权利要求27的DNA表达载体，其能够改变病毒基因组的表达。
29.依照权利要求28的DNA表达载体，其中包含能够在细胞中表达所述病毒基因组或其部分的有义RNA片段的第一DNA序列和能够在细胞中表达所述病毒基因组或其部分的反义RNA片段的第二DNA序列，所述有义RNA片段与所述反义RNA片段能够形成双链RNA。
30.依照权利要求29的DNA表达载体，其中所述病毒选自下组tospoviruses、马铃薯Y病毒组、马铃薯X病毒组、烟草花叶病毒组、黄矮病毒组、南瓜花叶病毒组、雀麦花叶病毒组、线形病毒组、番茄丛矮病毒组、和真菌传棒状病毒组。
31.权利要求30的DNA表达载体，其中所述DNA序列包含衍生自病毒外壳蛋白基因、病毒核壳蛋白基因、病毒复制酶基因、或病毒移动蛋白基因或者其部分的核苷酸序列。
32.权利要求31的DNA表达载体，其中所述DNA序列衍生自番茄斑萎病毒(TSWV)。
33.权利要求32的DNA表达载体，其中所述DNA衍生自核壳蛋白基因。
34.经依照权利要求1-11之任一的DNA序列或依照权利要求12-23之任一的重组DNA分子或依照权利要求24-33之任一的DNA表达载体稳定转化的宿主细胞。
35.权利要求34的宿主细胞，其中所述宿主细胞是植物细胞。
36.经依照权利要求1-11之任一的DNA序列或依照权利要求12-23之任一的重组DNA分子或依照权利要求24-33之任一的DNA表达载体稳定转化的植物和其后代。
37.权利要求36的植物，其中所述植物选自下组玉米、小麦、高粱、黑麦、燕麦、草坪草、水稻、大麦、大豆、棉花、烟草、甜菜、和油籽油菜。
38.权利要求1-11之任一的DNA序列用于表达目的核苷酸序列的用途。
39.生成依照权利要求1的DNA序列的方法，其中通过聚合酶链式反应生成该DNA，其中至少一种所用寡核苷酸包含代表SEQ ID NO1的15或更多碱基对的连续片段的核苷酸序列。
全文摘要
本发明描述了作为相连核苷酸序列的转录启动子而发挥功能的新DNA序列。更具体的说，本发明描述了赋予相连核苷酸序列以组成性表达的DNA序列。本发明还描述了包含这些启动子序列的重组序列。所述重组DNA序列可用于构建转基因植物，尤其是在大多数组织和器官中一直表达目的核苷酸序列的植物。
文档编号C12N15/82GK1430673SQ01809118
公开日2003年7月16日 申请日期2001年3月26日 优先权日2000年3月27日
发明者T·霍恩, L·斯塔沃隆, P·T·德哈恩, H·T·利宫, M·科诺诺瓦 申请人:辛根塔参与股份公司