差异表达筛选方法

专利名称：差异表达筛选方法
技术领域：
本发明涉及通过差异表达筛选基因的方法。
背景技术：
基因寻找(gene discovery)领域的一个中心目标是了解和阐明特定病状与限定和/或引起该病状的基因表达模式之间的关系。这样，有可能鉴定出对疾病诊断或治疗具有潜在的巨大医学价值的基因。这些基因的产物可以直接用作治疗剂，基因本身可以用于基因治疗，或者可以发现调节这些基因的表达和作用以治疗疾病的小分子效应物。研究集中在患病和健康组织之间表达模式的差异上，以阐明疾病的生理学机制。鉴定出的表达模式差异提供了一般认定的逆转疾病表型的治疗切入点。这些差异还提供了诊断标记，并确定进一步研究的蛋白质为影响所述疾病的因素。
基因表达的差异筛选是本领域一项众所周知的技术，经常与扣除cDNA克隆法一起成功用于鉴定参与一系列细胞活动的基因。一般来说，或者使用测定mRNA表达水平的核酸型方法进行差异筛选，或者使用诸如双向凝胶电泳的技术分离细胞含有的总蛋的蛋白质组方法进行差异筛选。
迄今为止已知的差异表达筛选方法(甚至那些基于DNA芯片技术的方法)的一个问题是目的基因产物的绝对水平和/或两种特定状态(例如，存在和不存在生长因子，或者在两种不同的细胞类型中)之间的基因产物表达差异可能相当低。因此，尽管迄今为止使用标准差异表达筛选技术已经鉴定出一些非常重要的基因，但许多在细胞活动中可能起重要作用的基因仍然难以鉴别，因为其表达水平低，或者因为可观察到的其表达水平变化可能相当小。
常规差异筛选方法存在的另一个问题是这些方法不能让人们剖析正在研究的遗传或生化途径。鉴定出的基因表达的任何变化都是整体性的，而不是明确针对研究途径的特定方面。因此，本领域需要一种易于在分子水平剖析生物途径的方法。
发明概述因此，本发明的一个目标是提供一种基于差异表达的改进型筛选方法。
在本发明的第一个方面，提供一种用于鉴定参与细胞活动的遗传因子的差异表达筛选方法，该方法包括对比在以下细胞中的基因表达(a)第一种目的细胞；和(b)第二种目的细胞，该细胞由于引入异源核酸而包含相对于生理水平来说水平改变的生物分子；鉴定差异表达的遗传因子。
术语“遗传因子”是指包括基因、基因产物(如RNA分子和多肽)、顺式作用调节元件(如启动子元件和增强子元件)。该方法可鉴别所评价的这些分子类型中任一种的表达模式差异，并按照所研究的细胞活动置于生物演化关系(biological context)中。该方法还允许可鉴别研究的组成型遗传因子差异，以便例如鉴定对特定生物活动的生物反应有影响的突变和多态性。
在一个实施方案中，所述第一种目的细胞还包括相对于生理水平来说水平改变的生物分子。然而，在一个替代的实施方案中，所述第一种目的细胞具有正常生理水平的生物分子。所述生物分子可能已在功能上表征，或者未充分表征。
通常，第二种目的细胞中的生物分子水平升高或降低。在一个优选的实施方案中，所述生物分子和由所述异源核酸编码的多肽为同一分子。所述多肽可能已在功能上表征，或者未充分表征。
所述核酸最好控制多肽表达。所述异源核酸编码的多肽最好参与细胞活动。所述“参与细胞活动”是指发现所述基因在细胞的遗传或代谢途径中具有与众不同的作用。所述多肽可能涉及产生或维持特定疾病表型或生理条件的敏感性。专业技术读者显而易见的是，任何途径中的任意点都可能是独一无二的点，细胞在该点偏离正常生理反应而产生疾病表型。表现为疾病的作用经常是由突变事件造成，其中在相关生理途径起作用的蛋白的基因编码序列发生突变。
核酸最好使用病毒载体传递至细胞。在此情况下，异源核酸应当与病毒载体同线。专业技术读者显而易见的是，不同的病毒载体适于不同的细胞类型。按照本发明使用的病毒载体最好得自逆转录病毒、慢病毒如马传染性贫血病病毒(EIAV)或1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和痘病毒如昆虫痘病毒。
用于本发明目的的病毒载体优选特征为有效转导靶细胞的能力以及使基因表达中任何微扰最小化的能力，所述干扰可能缘自使用的病毒载体本身，但与引入的异源目的核酸不是特异性相关(“表型沉默”)。病毒介导的基因转移领域的技术人员应当知道，该领域在迅速发展，用于各种细胞类型的优选载体随着领域的发展在变化。例如，在撰写本发明时，优选的巨噬细胞转导载体是腺病毒载体，因为该载体可能使转导水平最高。该载体不能以表型沉默转导，但有可能使用合适的控制因素将载体对细胞基因表达的影响排除在外。另一方面，能够表型沉默转导的得自慢病毒EIAV的载体在海马神经元中产生最有效的转导，因此成为选择用于该用途的载体。载体的表型沉默经常是需要的，但必须与转导效率相平衡。本文包括的实施例中描述的载体开发以所述细胞类型中的这两个特征最优化为目标。对载体技术领域的技术人员显而易见的是，本发明与载体类型无关，但通过优化选择每种细胞类型的载体，可以增进本发明的实施。
一般而言，可以使用蛋白质组技术或使用基于核酸的基因组或cDNA技术测定第一种和第二种细胞中的基因表达。
在本发明第一方面的一个优选的实施方案中，提供一种用于鉴定参与细胞活动的遗传因子的差异表达筛选方法，该方法包括对比在以下细胞中的基因表达(a)第一种目的细胞；和(b)与所述第一种细胞不同的第二种目的细胞，该细胞由于引入异源核酸而包含相对于生理水平来说水平改变的生物分子；并鉴定差异表达的遗传因子。
所述核酸最好控制多肽(例如上述参与细胞活动的多肽)的表达。
在第二个方面，本发明提供一种用于鉴定其表达受信号调控的遗传因子的差异表达筛选方法，该方法包括在两种不同信号水平下对比(a)在第一种目的细胞中的基因表达，其中所述信号处于第一种水平；和(b)在第二种目的细胞中的基因表达，该细胞由于引入控制多肽表达的异源核酸而包含相对于生理水平来说水平改变的生物分子，该生物分子的活性对信号起反应，其中所述信号处于第二种水平；并鉴定差异表达的遗传因子。
在本发明的第三个方面，使用已知或猜测参与细胞活动的多肽鉴定该活动的其它组分，方法是改变细胞中所述多肽的水平，以改善所鉴定其它组分水平的信噪比，使它们更易于通过差异表达技术进行鉴定。
因此，本发明还提供一种用于鉴定其表达在细胞活动中发生改变的遗传因子的差异表达筛选方法，该方法包括对比(a)在第一种目的细胞中的基因表达；和(b)在第二种目的细胞中的基因表达，该细胞经修饰含有水平改变的影响细胞活动的多肽；并鉴定差异表达的遗传因子。
所述多肽的水平改变优选是由于将控制所述多肽在细胞中表达的异源核酸引入细胞中造成。更优选所述异源核酸与病毒载体共线。
在本发明第三方面的一个优选的实施方案中，通过生物信号调节遗传因子的表达，所述方法包括对比两种不同信号水平的两种细胞类型中的基因表达的步骤。
因此，本发明在此方面提供一种用于鉴定参与细胞活动的遗传因子的差异表达筛选方法，该方法包括对比(a)在第一种目的细胞中的基因表达；和(b)在第二种目的细胞中的基因表达，该细胞由于引入控制多肽表达的异源核酸而包含相对于生理水平来说水平改变的影响细胞活动的生物分子；并鉴定差异表达的遗传因子，其中在至少两种与细胞活动相关的不同环境条件下对比所述第一种和/或第二种目的细胞中的基因表达。优选在至少两种与细胞活动相关的不同环境条件下同时对比所述第一种和第二种目的细胞中的基因表达。
在一个实施例中，细胞接触的环境条件可以是不同水平的生物信号。可以在以下环境条件下对比两种细胞类型中的基因表达没有信号、存在第一种水平的信号和/或存在第二种水平的信号(例如，在含氧量正常[20％氧]和低氧[＜1％氧]之间的不同百分比的大气氧含量)。使用至少两种水平的生物信号允许对比环境条件改变以及异源核酸对这些细胞类型的作用，并鉴定其表达在生物信号水平和测试的环境条件之间以相同方式或以不同方式作用的遗传因子。当然，不同类型的环境变化、细胞类型和异源核酸可以以相同的方式应用两种以上水平的生物信号。
因此，本发明此方面的一个实施方案提供一种用于鉴定参与细胞活动的遗传因子的差异表达筛选方法，该方法包括对比
(a)在第一种目的细胞中的基因表达；(b)在第一种目的细胞中的基因表达，其中该细胞接触与细胞活动相关的生物信号，其中所述生物信号为第一种水平；(c)在第一种目的细胞中的基因表达，其中该细胞接触与细胞活动相关的生物信号，其中所述生物信号为第二种水平；(d)在第二种目的细胞中的基因表达，该细胞由于引入控制多肽表达的异源核酸而包含相对于生理水平来说水平改变的生物分子，该分子的活性对所述生物信号起反应，其中所述信号为没有、第一种水平或第二种水平；并鉴定差异表达的遗传因子。
在本发明此方面的一个替代的实施方案中，细胞接触的环境条件可以为不同类型的环境变化(例如细胞接触的不同生长因子的水平变化)。使用两种环境变化允许对比每种环境变化和异源核酸对每种细胞类型的作用，并鉴定其表达在这些测试的环境变化之间以相同方式或不同方式作用的遗传因子。每种细胞类型和每种异源核酸可以以相同的方式应用两种以上的环境变化。
因此，本发明在此方面提供一种用于鉴定参与细胞活动的遗传因子的差异表达筛选方法，该方法包括对比；(a)在第一种目的细胞中的基因表达；(b)在第一种目的细胞中的基因表达，其中该细胞接触第一种类型的环境变化；(c)在第一种目的细胞中的基因表达，其中该细胞接触第二种类型的环境变化；(d)第二种目的细胞在接触或不接触第一种和/或第二种类型环境变化的条件下的基因表达，所述第二种细胞由于引入控制多肽表达的异源核酸而包含相对于生理水平来说水平改变的生物分子，该分子的活性对b)和c)项提及的一种或两种环境变化起反应；并鉴定差异表达的遗传因子。
在本发明以上的实施方案中，第一种细胞类型还可以含有由于引入控制多肽表达的异源核酸而包含相对于生理水平来说水平改变的生物分子，该分子的活性对环境条件差异起反应。
第一种细胞中的生物分子可以与第二种细胞中水平改变的生物分子相同。在该实施方案中，第一种细胞和第二种细胞中的生物分子水平应当不同。
因此，本发明在此方面提供一种用于鉴定参与细胞活动的遗传因子的差异表达筛选方法，该方法包括对比(a)在第一种目的细胞中的基因表达；(b)在第一种目的细胞中的基因表达，其中该细胞接触与细胞活动相关的生物信号；(c)在第一种目的细胞中的基因表达，其中该细胞由于引入控制多肽表达的异源核酸而包含相对于生理水平来说水平改变的生物分子，其活性对所述生物信号起反应，其中所述水平改变的生物分子为第一种水平，而其中所述生物信号或者存在或者不存在；(d)在第二种目的细胞中的基因表达；(e)在第二种目的细胞中的基因表达，其中该细胞接触与细胞活动相关的生物信号；(f)在第二种目的细胞中的基因表达，其中该细胞由于引入控制多肽表达的异源核酸而包含相对于生理水平来说水平改变的生物分子，其中所述水平改变的生物分子为第二种水平，而其中所述生物信号或者存在或者不存在；并鉴定差异表达的遗传因子。
使用两种表达水平的异源核酸允许对比每种水平和生物信号对每种细胞类型的作用，并鉴定其表达在这些测试的水平和生物信号之间以相同方式或不同方式作用的遗传因子。每种细胞类型和每种生物信号可以以相同的方式应用两种以上表达水平的异源核酸。
另一方面，第一种细胞中的生物分子可以与第二种细胞中水平改变的生物分子不同。在该实施方案中，第一种细胞和第二种细胞中的生物分子水平可以相同，或者可以不同。
因此，本发明在此方面提供一种用于鉴定参与细胞活动的遗传因子的差异表达筛选方法，该方法包括对比；(a)在第一种目的细胞中的基因表达；(b)在第一种目的细胞中的基因表达，其中该细胞接触与细胞活动相关的生物信号；(c)在第一种目的细胞中的基因表达，该细胞由于引入控制第一种多肽表达的异源核酸而包含相对于生理水平来说水平改变的第一种生物分子，其活性对所述生物信号起反应，其中所述生物信号或者存在或者不存在；(d)在第二种目的细胞中的基因表达；(e)在第二种目的细胞中的基因表达，其中该细胞接触与细胞活动相关的生物信号；(f)在第二种目的细胞中的基因表达，该细胞由于引入控制第二种多肽表达的异源核酸而包含相对于生理水平来说水平改变的第二种生物分子，其中所述生物信号或者存在或者不存在；并鉴定差异表达的遗传因子。
使用两种类型的异源核酸允许对比每种异源核酸类型和生物信号对每种细胞类型的作用，并鉴定其表达在这些异源核酸类型和生物信号之间以相同方式或不同方式作用的遗传因子。所测试的每种细胞类型和每种生物信号可以以相同的方式应用两种以上类型的的异源核酸。本发明的该方面能够寻找在特定环境变化下受不同生物分子差异调节的基因。这提高了组织和细胞特异性治疗调节细胞反应的可能性。
在以上所有的实施方案中，对比其基因表达的第一种和第二种细胞可以为不同的细胞类型(例如，健康细胞和患病细胞)。使用两种或多种细胞类型允许对比不同生物信号和异源核酸对这些细胞类型的作用，并鉴定其表达在这些测试的细胞类型和生物信号之间以相同方式或不同方式作用的遗传因子。可以以相同方式评价两种以上的细胞类型。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述多肽影响疾病过程。因此，第一种细胞可以得自正常患者，而第二种细胞得自患病患者，反之亦可。或者，第一种细胞得自患病患者，而第二种细胞得自同一患病患者或患同样疾病的患者。
因此，本发明再一个方面提供一种用于鉴定参与细胞活动的基因或基因产物的差异表达筛选方法，该方法包括(i)对比以下细胞中的基因表达(a)第一种目的细胞；和(b)第二种目的细胞；(ii)对比以下细胞中的基因表达(a)第一种目的细胞；和(b)第三种目的细胞，该细胞由于引入控制侯选基因或基因产物扩增或表达的异源核酸而包含相对于生理水平来说水平改变的侯选基因或基因产物；和(iii)选择那些导致第三种目的细胞中的第二种基因或基因产物的水平、拷贝数或表达相对于第一种目的细胞发生改变的侯选基因或基因产物，所述第二种目的细胞中的第二种基因或基因产物相对于第一种目的细胞也具有改变的水平、拷贝数或表达。
所述侯选基因产物优选为多肽或RNA分子。
在本发明以上方面的一个优选的实施方案中，提供一种用于鉴定参与疾病过程的基因产物的差异表达筛选方法，该方法包括(i)对比以下细胞中的基因表达(a)得自正常患者的第一种目的细胞；和(b)得自患病患者的第二种目的细胞；(ii)对比以下细胞中的基因表达
(a)第一种目的细胞；和(b)得自正常患者的第三种目的细胞，该细胞由于引入控制侯选基因或基因产物扩增或表达的异源核酸而包含相对于生理水平来说水平改变的侯选基因或基因产物；和(iii)选择那些导致第三种目的细胞中的第二种基因或基因产物的水平、拷贝数或表达相对于第一种目的细胞发生改变的侯选基因或基因产物，所述第二种目的细胞中的第二种基因或基因产物相对于第一种目的细胞也具有改变的水平、拷贝数或表达。
在本发明此方面的一个特别优选的实施方案中，基因产物的表达优选受到信号(例如和疾病过程相关的生物或其他环境信号)调节，该方法包括对比两种不同信号水平下所述细胞类型中基因表达的步骤。
在上述的本发明实施方案中，通过使用核酸技术鉴定那些其水平在不同目的细胞类型改变的mRNA转录物，进行基因表达对比。
在上述的本发明实施方案中，通过使用蛋白分析技术鉴定那些其水平在不同目的细胞类型之间改变的多肽，进行基因表达对比。
按照本发明的再另一方面，提供一种增加差异表达筛选方法敏感性的方法，其中对比第一种和第二种目的细胞在两种不同水平信号作用下的基因表达，该方法包括将异源核酸引入第一种细胞或第二种细胞中，以增加调节细胞对信号反应的生物分子的水平。发明详述尽管本文提及的技术是本领域众所周知的，但特别可参阅Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(1989)和Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology(1999)，第4版，John Wiley &Sons，Inc。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科技术语都与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。A.差异表达筛选技术基因编码基因产物，主要为多肽，但也有RNA，这些产物参与的细胞活动不计其数。差异表达筛选技术是基于这样一种构思通过对比两组环境下的表达，可以鉴定出在这两种条件下其表达发生改变的基因，反过来其功能又与这些条件之间的差异有关。例如，可通过对比接触有丝分裂原如血小板衍生生长因子(PDGF)的细胞中的基因表达和未接触PDGF的细胞中的基因表达，鉴定涉及PDGF反应途径的基因。
因此，本文使用的术语“差异表达筛选”是指对比不同条件下两种细胞之间的基因表达或相同或不同条件下两种不同细胞之间的基因表达，目的是鉴定其表达水平在两种细胞之间不同的基因或基因产物。
可使用各种技术检测基因表达差异。第一种主要类型的技术是基于核酸检测，本文称为“基因组或cDNA技术”。Kozian和Kirschbaum(1999)中提供了有用的综述。第二种主要类型的技术是基于细胞蛋白含量的检测，本文称为“蛋白质组技术”。基因组或cDNA技术本领域一个众所周知的方法是扣除cDNA杂交。该技术包括将一种细胞(例如对照细胞)的mRNA群与由另一种细胞(例如接触PDGF的细胞)的mRNA制备的cDNA群杂交。该步骤将把eDNA制备物中两种细胞共有的序列全部去除。由其表达在接触PDGF的细胞中上调的mRNA产生的cDNA将没有对应的对照mRNA与其杂交，可以分离。通常，还将所述cDNA与同一细胞的mRNA杂交，以证实它们代表编码序列。此方法详述于WO90/11361，其中使用得自用化学物质N-(氨基羰基)-2-氯苯磺酰胺处理的植物根部细胞的mRNA产生cDNA文库，然后将该文库与未处理根细胞的mRNA杂交。该方法鉴定出大量其表达受所述化学物质上调的基因。
聚合酶链反应(PCR)已经导致了许多其它方法的发展。首先由Liang和Pardee(1992)描述了RT-PCR差异展示。该技术包括使用寡脱氧胸苷酸引物和随机寡核苷酸10聚物对不同细胞群的反转录RNA进行PCR。经常使用放射性标记核苷酸进行PCR，以使产物在凝胶电泳和放射自显影后可以显色。Wilkinson等(1995)使用PCR差异展示鉴定出5种在草莓成熟过程中被上调的mRNA。Zhang等(1998)提供了差异展示RT-PCR(也叫做mRNA差异展示)的综述，最近的使用“长距离”PCR的改进描述于Zhao等(1999)。
另一种技术称作cDNA文库筛选。Maser和Calvet(1995)提供了该技术以及以上提及的其它两种差异表达筛选技术的综述。
差异展示竞争性PCR是一种相当新的技术，已经成功用于研究在仅有少数基因改变表达水平的条件(例如MCF17细胞接触雌二醇)下和更复杂条件(例如人NTERA2细胞的神经元差异)下的基因表达总体变化(Jorgensen等，1999)。
其它适于分析特定细胞类型转录组(transcriptome)的技术包括基因表达连续分析(SAGE；Velculescu等，Science(1995)270；484-487)，经抗生物素介导和限制介导的富集选择性扩增(SABRE)(Lavery等，(1997)，PNAS USA 946831-6836页)、差异展示(例如指标化差异展示反转录酶聚合酶链式反应(DDRT-PCR；Mahadeva等(1998)J.Mol.Biol.284，1391-1398))、代表性差异分析(RDA)(Hubank(1999)Methodsin Enzymology 303325-349；参见Kozian和Kirschbaum(1999)的综述和其中的参考文献)、差异筛选cDNA文库(参见Sagerstrom等(1997)Annu.Rev.Biochem.，66751-783；“Advanced Molecular Biology”，R.M.Twyman(1998)Bios Scientific Publisher，Oxford；“Nucleic AcidHybridization”，M.L.M.Anderson(1999)Bios Scientific Publisher，Oxford)、RNA印迹、RNA酶保护测定、S1核酸酶保护测定、RT-PCR、实时RT-PCR(Taq-man)、EST测序、整体平行特征测序(MPSS)和杂交测序(SBH)(参阅Drmanac R.等(1999)，Methods in Enzymology 303165-178)。这些技术中的大部分综述于“Comparative gene-expressionanalysis”Trends Biotechnol.1999年2月；17(2)73-8。
可以许多方式对其表达在两种细胞群中不同的基因产物进行实际鉴定。扣除方法固有鉴定其表达不同的基因产物，因为其表达相同的基因产物已由样品中去除。其它方法包括仅对比一种细胞的表达产物和另一种细胞的表达产物，并任选借助于计算机程序观察任何差异(用基于PCR的技术，每个样品中的产物数量可限制在合理的大小)。例如使用基于PCR的技术，显色对比不同泳道上出现的条带，可鉴定只有一个泳道才有的条带。这些条带可由凝胶中切除，随后进行分析。
DNA芯片技术的出现使得可以通过使用微阵列方便地进行对比(参阅Kozian和Kirschbaum，1999的综述和参考文献)。通常使用固定在基体(例如尼龙滤膜、玻璃片或硅片)上的cDNA(包括EST)、PCR产物、克隆的DNA和合成寡核苷酸制备阵列。为测定基因表达差异，将标记的cDNA或PCR产物与阵列杂交并对比杂交图谱。使用荧光标记探针可以同时分析一个芯片上的两种不同细胞群的mRNA，以不同的波长检测结果。基于微阵列的差异表达筛选技术描述于US-A-5,800,992。蛋白质组技术蛋白质组学大规模研究蛋白的特性，以在蛋白水平上获得对疾病过程、细胞活动及其联系的整体、综合看法。关于蛋白质组中使用技术的综述描述于Blackstock和Weir(1999)-另见其中提供的参考文献。本发明方法主要涉及表达蛋白质组学，表达蛋白质组学使用分辨蛋白质的电泳技术和成像分析研究细胞中蛋白表达的整体变化。鉴于核酸分析突出信息，蛋白质组学更多地涉及产物。两种方法有时是互补的，因为蛋白质组技术可用于检测由于蛋白稳定性改变所引起的多肽水平(不是mRNA水平)变化。
蛋白质组学领域使用的一种广为人知的独特技术是使用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测细胞的多肽含量，并对比其与另一种细胞的多肽含量。电泳的结果通常为用染料(如银染或考马斯亮蓝)显色的凝胶，或者由凝胶产生的放射自显影，所有斑点对应于各种蛋白的印迹。还可以使用荧光染料。
因此，目标是鉴定在两种凝胶/放射自显影之间有差异的斑点，即其中一种没有、强度减弱或强度增强。因此，在蛋白质组学中，对比基因表达仅包括对比一种细胞和另一种细胞的蛋白谱。可利用商业软件包进行自动斑点检测。
可将目的斑点由凝胶中切除，并使用诸如基体加速激光解吸电离飞行时间(matrix-assisted-laser-desorption-ionisation-time-of-flight)(MALDI-TOF)质谱分析法和电喷射质谱分析法的技术鉴定蛋白质(参阅“Proteomics to study genes and genomes”Akhilesh Pandey andMatthias Mann，(2000)，Nature 405837-846)。
可能需要进行一些预分离检测，例如离心或自由流动电泳，以改善对低丰度蛋白的鉴定。还开发了对碱性蛋白、膜蛋白和其它低溶解性蛋白的特殊方法(Rabilloud等，1997)。
另外，蛋白和抗体阵列领域的新进展现在可以同时检测大量的蛋白质。例如，在滤膜上的低密度蛋白阵列如通用蛋白阵列系统(Ge H，(2000)Nucleic Acids Res.28(2)，e3)使得可以用标准ELISA技术和扫描电荷耦合装置(CCD)检测仪使阵列抗原成像。还开发了免疫传感器阵列，能够同时检测临床分析物。现在，有可能使用蛋白阵列剖析体液蛋白表达，例如健康或患病个体的血清以及药物治疗前和治疗后的患者的体液蛋白表达。
抗体阵列也促进了推定影响疾病或特定生理状态的众多蛋白的大范围平行分析。近来已经报道了许多制备抗体阵列的方法(参阅Cahill，Trends in Biotechnology，2000 747-51)。
以上论述描述了技术人员可利用的在先技术方法，以在一般意义上对两种或多种细胞群进行差异表达筛选。还描述了为检测总体基因表达变化而引入异源基因(Busch and Bishop，J Immunol，19991622555-2561；Robinson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1997 947170-7175)。然而，本发明与这些先有技术方法的区别之处在于本发明需要进一步的步骤，即由实验者改变细胞中特定内源生物分子的水平，使得对细胞微扰(如信号转导事件)起反应并受到生物分子影响的基因产物水平变得更容易检测。换句话说，目的是放大和/或增加通常获得的差异反应的信噪比，使其细胞水平低和/或其表达通常仅小量改变的基因产物的检测可能性增加。
举例来说，转录因子HIF-1α对胞内氧水平起反应。降低氧水平增加HIF-1α活性，并导致受控于低氧反应因子(HRE)的基因转录增加。如果例如通过用控制HIF-1α表达的病毒载体感染细胞人为将细胞中的HIF-1α水平增加，那么预期HIF-1α介导的转录反应增加。因此，其表达对低氧敏感并由HIF-1α诱导介导的基因表达改变，应当大于表达生理水平HIF-1α的正常细胞。B.生物分子生物分子可以为由于细胞合成代谢或分解代谢过程或以任何方式由胞外环境摄取而在细胞中可见的任何化合物。术语“生物分子”是指在生物学意义上具有活性的分子。生物分子最好在细胞中合成(即是细胞内源性的)或在多细胞生物情况下在生物体的任何细胞中合成。
因此生物分子的实例包括蛋白、肽、核酸、碳水化合物、脂质、类固醇、辅因子、拟态物、辅基(如血红素)、无机分子、离子(如Ca2+)、肌醇磷脂、激素、生长因子、细胞因子、趋化因子、炎性因子、毒素、代谢物、药物因子、浆质携带的营养物(包括葡萄糖、氨基酸、辅因子、无机盐、蛋白和脂质)、外源或病理胞外组分、胞内或胞外病原体(包括细菌、病毒、真菌或支原体)。适当时还可以包括以上物质的前体、单体、寡聚和多聚形式以及分解产物。
多肽生物分子的实例包括酶、转录因子、激素、细胞结构组分和受体(包括膜结合受体)。
最好已知所述生物分子涉及令人感兴趣的细胞活动。
在本发明的一个实施方案中，所述生物分子对细胞环境条件(本文也称作信号)变化起反应。这种环境条件或信号的实例包括细胞微环境的改变、接触激素、生长因子、细胞因子、趋化因子、炎性因子、毒素、代谢物、pH、药物因子、低氧、缺氧、局部缺血、任何浆质携带营养物(包括葡萄糖、氨基酸、辅因子、无机盐、蛋白和脂质)的不平衡、渗透压、温度(低温或高温)、机械应力、辐射(电离或非电离辐射)、细胞-胞外基体的相互作用、细胞-细胞的相互作用、外源或病理性胞外组分的累积、胞内和胞外病原体(包括细菌、病毒、真菌或支原体)以及遗传微扰(均为后生或由突变或多态性介导)。由以上的罗列可清楚看出，信号可以是外部施加的信号如环境信号，例如氧化还原压力、胞外配体与细胞表面受体的结合，该结合导致由信号转导信号介导的细胞反应。另一方面，所述信号可以为内部施加的信号，例如由于细胞代谢水平下降而使激酶活性增加。
可以直接或间接地改变生物分子水平。直接改变可通过例如在培养基中温育细胞使细胞吸收分子实现，所述培养基含有的分子水平与生理水平不同例如高于生理水平。其它方法包括载体介导的传递和微注射。在核酸和多肽的情况下，可通过将控制核酸或多肽表达的异源核酸引入到细胞中而使细胞中的生物分子水平升高。
本文的术语“异源核酸”是指其天然不存在的核酸，即对细胞进行修饰，使其含有除了其引入形式之外其它形式不存在的核酸。例如，所述核酸可以为染色体外核酸，例如在以下物质上编码的核酸细菌质粒、噬菌体、转座子、酵母附加体、插入元件、酵母染色体元件、病毒(包括例如杆状病毒和SV40病毒(猿猴病毒)、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒和反转录病毒)或其组合，如得自质粒和噬菌体遗传因子的物质，包括粘粒和噬菌粒。所述核酸可以通过例如使用反转录病毒载体(包括小鼠或猫白血病病毒或慢病毒人免疫缺陷病毒和马传染性贫血病病毒)掺入到染色体中。还可以使用人、细菌和酵母人工染色体(分别为HAC、BAC和YAC)传递比其它载体可包含或表达的DNA片段大的DNA片段。还可以通过例如病毒转导或同源重组(参见例如国际专利申请WO99/29837号)或用于产生转基因动物胚胎或干细胞的微注射技术将所述核酸整合入基因组中。尽管如此，部分或全部异源核酸分子仍可以与对应的基因组序列相同，因为引入额外拷贝基因对于增加该基因的表达水平是一个便利的方法。
改变生物分子水平的间接方法为数众多，包括使用以上描述的方法增加抑制或刺激性分子的水平。抑制性分子包括针对编码生物分子的mRNA的反义核酸、核酶或EGS(外部向导序列)、针对生物分子的转显性失活突变体、转录因子、酶抑制剂和胞内抗体如scFv。刺激性分子的实例包括酶激活剂和转录激活剂。因此，可以以多种方式处理细胞，使得生物分子的水平最终发生改变。可通过表达反义RNA降低表达。
按照本发明，应当使生物分子的水平相对于生理水平发生改变。因此它们可以增强或者减弱。术语“相对于生理水平”是指在转变这些水平之前，相对于在正常生理条件下通常存在于细胞类型中的生物分子的浓度或活性。因此，本发明通过慎重的方法，将生物分子的活性改变至在正常生理条件范围下细胞中可见的水平之上或之下。“生理条件”包括通常体内存在的条件和一般体外使用的细胞培养条件。
作为实施例，所述活性或浓度可以比例如引入异源核酸之前于细胞中存在的正常生理活性或浓度增加或降低2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍。
本发明还允许鉴定参与细胞活动的遗传因子。如上所述，术语“遗传因子”是指包括基因、基因产物(如RNA分子和多肽)和顺式作用调节元件(如启动子元件和增强子元件)。相比于常规的差异筛选技术，本发明显著易化了对参与细胞活动的基因和基因产物的鉴定，因为使用所述方法显著提高了信号水平和/或信噪比。
特别值得注意的是，本发明能够鉴定参与细胞活动的基因和基因产物并因此进一步研究这些基因和基因产物的作用。例如，如果已知一种特定的多肽在细胞活动中起作用，那么这就为开发修饰或调节多肽并由此影响细胞活动本身的药物铺平了道路。这种信息显然与疾病的分析、诊断和治疗、鉴定侯选切入点具有极大关联，并为开发能够预防或纠正任何细胞活动中任何导致不需要效应(例如疾病)的生理不平衡的药物铺平道路。
除了鉴定基因和基因产物之外，本发明还允许鉴定其它与影响特定细胞活动的基因相关的元件。这些元件的实例包括调节细胞活动中表达的基因转录的启动子元件和增强子元件。鉴定这些元件对于研究细胞活动具有极大价值，并且例如为开发对特定细胞活动中产生的生物信号起反应的合成调节元件铺平了道路。
本发明在此方面包括鉴定基因及其调节元件中的突变和多态性，这些突变和多态性影响所述基因对所研究的细胞活动的反应。这类信息对于评价和剖析在不同生物条件下于不同个体之间发现的表达模式差异具有极大价值。
本发明的差异表达筛选方法还允许根据需要通过改变所研究途径的特定方面，在分子水平剖析生物途径。这样，本发明方法比本领域已知的常规差异表达筛选方法有优势。这些先有技术方法对比不同生物条件下细胞群之间的基因表达模式，并因此获得对两种细胞群基因表达模式的总体判断，即使使用的异源核酸与具体的生物途径和反应无关。相反，本发明方法通过将异源核酸引入一个细胞群，改变影响所研究途径的特定生物分子的水平，可以仔细分析生物途径的精确分子组分。
本发明在此方面可以用对低氧起生物反应的特别实施例阐述，尽管专业技术读者理解类似的细胞活动同样可用此方法研究。对低氧的生物应答是复杂的，具有大量的参与分子组分。两种重要的组分为蛋白HIF1α和EASP1。通过将编码HIF1α的异源核酸引入一个细胞群，可以评价由HIF1α自身产生的基因表达模式差异。使用编码EPAS1的异源核酸进行一个相似实验，可以在此特别方面剖析对低氧的分子应答。通过鉴定受一个途径(HIF1α)调节而不受另一个途径(EASP1)调节的分子组分，可以使用例如对HIF1α途径组分特异性的因子选择性调节该细胞活动。本发明对低氧反应的应用能够发现受HIF1α和EASP1差异性调节的新基因，并因此提升了组织和细胞特异性治疗调节对低氧的细胞应答的可能性。
HIF1α激动剂或拮抗剂潜在地具有分别上调或下调低氧反应(诸如血管生成和红细胞生成)的应用。例如，已知肾脏促红细胞生成素的产生受HIF1α调节(Bunn等(1998)EPO研究氧依赖性调节的模型系统，J Exp Biol 2011197-1201)，因此HIF1α拮抗剂可通过下调EPO而引起贫血。本发明鉴定受HIF1α和EASP1差异性调节的基因和清楚识别这两种密切相关的转录因子的不同作用的应用使得可以开发EPAS1激动剂或拮抗剂或者特异性差异调节基因的活性调节剂，以克服HIF1α调节的任何潜在临床副作用，并因此能够鉴定和开发用于诊断和治疗低氧相关疾病的诊断和治疗产品。
而在本发明的一个优选的实施方案中，通过引入异源核酸(通常为控制多肽表达的核酸)改变生物分子水平，所述异源核酸应当包含有效连接至控制序列的编码序列，该控制序列能够保证宿主细胞表达所述编码序列，即载体是表达载体。术语“有效连接”是指所述组分处于允许其以其预定方式起作用的关系。“有效连接”至编码序列的调节序列可以这样的方式与编码序列连接在与控制序列匹配的条件下实现编码序列表达。
例如可以通过加入另外的转录调节元件修饰控制序列，以使控制序列控制的转录水平对转录调节物的反应更强。
适于有效连接至本发明蛋白编码序列的控制序列包括启动子/增强子和其它表达调节信号。可以选择那些与其中的表达载体设计使用的宿主细胞相容的控制序列。术语“启动子”是本领域众所周知的，包括在大小和复杂性方面由最小启动子至包括上游元件和增强子的启动子的核酸区段。
启动子通常从在哺乳动物细胞中有功能的启动子中选择，尽管在合适的时候可以使用在原核细胞和其它真核细胞中有功能的启动子。因此，启动子通常得自病毒或真核生物基因的启动子序列。例如，可以是得自其中发生表达的细胞基因组的启动子。真核生物启动子可以是以遍在方式(例如α-肌动蛋白、β-肌动蛋白、微管蛋白启动子)或以组织特异性方式(例如丙酮酸激酶基因启动子)起作用的启动子。可以使用特定细胞特有的组织特异性启动子。还可以是对特定刺激物起反应的启动子，例如结合甾类激素受体的启动子。还可以使用病毒启动子，例如莫洛尼鼠类白血病病毒长末端重复序列(MMLV LTR)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子或人巨细胞病毒(CMV)IE启动子。
诱导型启动子可能有优势，可在细胞生存期间调节异源核酸表达水平。可诱导是指使用所述启动子获得的表达水平可以调节。
另外，这些启动子中的任何一个都可以通过加入另外的调节序列(例如增强子序列)进行修饰。还可以使用包含得自上述两种或多种不同启动子的序列元件的嵌合启动子。
合适载体的实例包括质粒、人工染色体和病毒载体。病毒载体包括腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体和反转录病毒载体。可以使用各种本领域已知技术，如转染、转化、电穿孔、重组病毒载体(如反转录病毒、单纯疱疹病毒和腺病毒)感染、直接注射核酸和biolistic转化，将载体/多核苷酸引入到合适的宿主细胞中。特别优选使用重组病毒载体介导技术。病毒载体按照本发明将异源核酸引入到细胞中使用的病毒载体可得自任何合适病毒。已经鉴定了无数不同的病毒，存在的亚类包括反转录病毒、慢病毒(为反转录病毒的亚类)、腺病毒和单纯疱疹病毒。反转录病毒实例包括鼠类白血病病毒(MLV)、人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)、人免疫缺陷病毒2型(HIV-2)、猿猴免疫缺陷病毒、人T细胞白血病病毒(HTLV)、马传染性贫血病病毒(EIAV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、Jembrana病毒、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、长臂猿白血病病毒(GALV)、脾病灶形成病毒(SFFV)、小鼠乳瘤病毒(MMTV)、Rous肉瘤病毒(RSV)、Fujinami肉瘤病毒(FuSV)、莫洛尼鼠类白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠类骨肉瘤病毒(FBR MSV)、莫洛尼鼠类肉瘤病毒(Mo-MSV)、Abelson鼠类白血病病毒(A-MLV)、禽类髓细胞组织增生病毒-29(MC29)和禽类成红细胞增多病毒(AEV)。反转录病毒的详细清单可见Coffin等，1997，“Retroviruses”，Cold Spring Harbor Laboratory Press，主编JM Coffin，SM Hughes，HE Varmus，758-763页。
可在本领域获得许多反转录病毒基因组结构的细节。作为实施例，有关HIV、EIAV和Mo-MLV的细节可见NCBI Genbank(基因组登录号分别为AF033819、U01866和AF033811)。
反转录病毒的慢病毒亚型甚至可再分为“灵长类”和“非灵长类”病毒。灵长类慢病毒的实例包括获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的致病因子人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。非灵长类慢病毒类包括原型“慢病毒”维斯那/梅迪病毒(VMV)以及相关性山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病病毒(EIAV)和最新描述的猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和Jembrana病毒。
反转录病毒基因组基本结构是5′LTR和3′LTR，位于它们之间或之中的是能够包装基因组的包装信号(psi)、引物结合位点、能够整合入宿主细胞基因组的整合位点以及编码包装组分(为病毒颗粒组装所需要的多肽)的gag、pol和env基因。更复杂的反转录病毒具有其它特征，例如HIV中的rev和RRE序列，它们能够将整合原病毒的RNA转录物由细胞核有效输送至感染靶细胞的细胞质中。HIV-1基因组具有的其它特征为编码辅助蛋白的tat、vif、vpu、vpr和nef，辅助蛋白是病毒感染性必须的或调节病毒的感染性。慢病毒基因组具有的另一个特征是促进非分裂细胞感染的中心多嘌呤段/中心终止序列(cPPT/CTS)。
在原病毒中，这些基因和其它元件位于称作长末端重复序列(LTR)的区域两端的侧翼。LTR负责原病毒整合和转录。因此，它们含有增强子一启动子序列，并可以控制病毒基因表达。反转录病毒RNA依靠位于病毒基因组5′末端附近的psi序列包衣壳。
LTR本身是相同的序列，可以分为三种元件，叫做U3、R和U5。U3得自RNA 3′末端独有的序列。R得自RNA两个末端重复的序列，而U5得自RNA 5′末端独有的序列。三种元件的大小在不同的反转录病毒中可显著不同。病毒RNA两端的R区为重复序列，而U5和U3分别代表RNA基因组5′末端和3′末端独有的序列。
对于一个用于本发明筛选方法的典型反转录病毒载体，至少可以去除病毒复制必须的一个或多个gag、pol和env蛋白编码区中的一部分。这产生了复制缺陷型反转录病毒载体。其它修饰，如去除U3区的启动子/增强子元件或缺失辅助蛋白基因，也可以使载体复制缺陷。去除的部分甚至可以由目的核苷酸序列(NOI)代替，如编码上述生物分子的核苷酸序列，以产生能够将其基因组整合入宿主基因组的载体，但其中修饰的病毒基因组由于缺少结构蛋白而不能自身繁殖。
在整合入宿主基因组时，NOI或者由于载体LTR转录或者由于位于合适位置(例如LTR之间的合适位置和相对于NOI的合适位置)的启动子序列转录而发生表达。应当注意的是，还可以用不同的启动子替代LTR中存在的病毒启动子。所述启动子序列通常在哺乳动物细胞中有活性。控制一个或多个第一核苷酸序列表达的启动子序列可以是例如组成型或调节型启动子。所述启动子可以是例如病毒启动子，如天然病毒启动子或CMV启动子，或者可以是哺乳动物启动子。特别优选使用在特定细胞类型或组织类型中具有优选活性或可调节的启动子。因此，在一个实施方案中，可以使用组织特异性调节序列。哺乳动物细胞可调节启动子系统的实例是四环素诱导型启动子系统(Clontech，Palo Alto，CA)。
因此，通常通过以下方法将NOI转移入目的位点将NOI整合入重组病毒载体；将修饰的病毒载体包装为病毒体颗粒；并允许目的位点转导-例如靶细胞或靶细胞群。
因此，用于本发明的反转录病毒载体的最小基因组包括(5′)R-U5-包装信号(psi)和一种或多种第一核苷酸序列-U3-R(3′)。然而，用于产生宿主细胞/包装细胞载体基因组的质粒载体还包括转录调节控制序列，这些转录调节控制序列有效连接至控制基因组在宿主细胞/包装细胞中转录的载体基因组。这些调节序列可以为与转录的反转录病毒序列相关的天然序列，即5′U3区，或者它们可以为异源启动子，例如另一种病毒启动子，例如CMV启动子。制备反转录病毒载体可通过使用生产细胞系、包装细胞系或者瞬时转染的合适细胞系生产复制缺陷型反转录病毒载体。
生产细胞系是表达能够转导的载体颗粒装配所需的所有组分的细胞系。即它们表达形成载体颗粒所需的gag/pol和包膜蛋白，并产生包装入载体颗粒的载体基因组转录物。通常，生产细胞与包装细胞的不同之处仅在于它们还可以稳定表达载体RNA这一事实。通过能够控制载体RNA表达的质粒转染，或者整合入宿主细胞核DNA后通过能够控制载体RNA合成的载体基因组转导，可以将载体RNA引入包装细胞中制备生产细胞。还可以通过控制载体RNA转录的质粒瞬时转染，将包装细胞转变为一过性生产细胞。还可以由仅包含形成可转导载体颗粒必须的三种组分中的两种的细胞系制备生产细胞。例如，在MLV载体领域，TelCEB细胞系稳定表达MLV gag/pol和MLV载体基因组MFGnlsLacZ。通过引入控制包膜基因表达的质粒可以将TelCEB细胞系转变为生产细胞系。在这方面，应当注意的是尽管gag/pol基因得自同一病毒，但env可以得自相同病毒，也可得自不同病毒。当由于利用不同病毒的包膜功能而形成感染性颗粒时，据认为载体颗粒已经假型化。例如，在慢病毒载体领域，通常制备由棒状病毒、水泡性口炎病毒G蛋白假型化的载体。
还可以通过用表达转导颗粒形成所需组分的质粒转染合适细胞系瞬时制备载体颗粒。例如，可通过用控制gag/pol、载体基因组和包膜表达的质粒转染人细胞系HEK 293T生产MLV、EIAV或HIV载体颗粒(Soneoka等，1995)。例如为增加滴度，还可以共转染另一种质粒。
瞬时转染方法正开发载体时可有利地用于检测载体产生水平。在这一点上，瞬时转染避免了产生稳定载体生产细胞系所需的时间长的缺点，还可以在载体或反转录包装组分对细胞有毒时使用。通常用于产生反转录病毒载体的组分包括编码gag/pol蛋白的质粒、编码env蛋白的质粒和包含NOI的质粒。载体产生包括将这些组分中的一种或多种瞬时转染入含其它需要组分的细胞中。如果载体编码毒性基因或干扰宿主细胞复制的基因(例如细胞周期抑制剂或诱导凋亡的基因)，则可能难以产生稳定的载体生产细胞系，但瞬时转染可用于在细胞死亡前产生载体。此外，用瞬时转染产生的细胞系产生的载体滴度水平与由稳定载体生产细胞系获得的水平相当。
现在，排列单独编码的颗粒形成组分编码基因已成为反转录病毒载体领域的标准操作。例如，FLYA13 MLV包装细胞系具有表达MLV gag/pol和env的单独转录单元。该策略降低了可复制病毒的生产可能性，因为野生型病毒生产需要三个重组事件。因为同源性非常有益于重组，所以降低或消除载体和辅助病毒基因组之间的同源性还可以用于减少可复制辅助病毒产生的问题。
生产细胞/包装细胞可以是任何合适的细胞类型。最通常使用的是哺乳动物生产细胞，但其它细胞如昆虫细胞并没有被排除在外。显然，生产细胞必须能够有效翻译env和gag、pol mRNA。许多合适的生产包装细胞系是本领域已知的。技术人员还能够通过例如将编码包装组分的核苷酸构建物稳定引入细胞系中来制备合适的包装细胞系。
非常理想的是，在实验和实际应用时都使用高滴度病毒制备物。一种增加病毒的技术是浓缩病毒母液。通过离心可以很便利地达到此目的，但也可以使用其它方法如柱层析。
基于慢病毒的载体系统特别适用于本发明。这是因为它们能够感染分裂细胞或非分裂细胞。可实现基因转移的非分裂细胞实例包括神经元和造血干细胞。另外，可以构造慢病毒载体，以便它们在靶细胞中仅表达NOI。实际上它们是表型沉默。因此，引入转基因的过程对宿主细胞产生的微扰最小。已经开发了基于HIV-1、EIAV和FIV的载体系统，并已经开发至据说最小的程度。HIV-1和EIAV的最小载体系统描述于WO 98/17815和WO 99/32646以及Kim等(1998)J.Virol，72，811-816和Mitrophanous等(1996)Gene Therapy，6，1808-1818。在这些最小系统中，载体组分被工程为在靶细胞中仅表达NOI，而且生产使用细胞的病毒蛋白表达降低至最小。对于HIV-1和EIAV两个系统来说，为形成感染性颗粒必须表达的慢病毒基因仅仅是gag/pol和rev。与Rev反应元件(RRE)组合起作用的Rev必须达到形成高水平颗粒所需的Gag/Pol水平。一种甚至更进一步降低慢病毒蛋白要求的途径是密码子优化gag/pol。这使得Rev/RRE成为表达无关型。慢病毒gag/pol的密码子优化过程描述于WO 99/41397、Kotsopoulou等，(2000)J.Virol.74，4839-4852。EIAV gag/pol的密码子优化过程描述于英国专利申请0009760.0。
本文通过解释给出了有关密码子优化过程的更多信息。不同物种细胞的具体密码子使用不同。这种密码子偏倚反映出细胞类型中特定tRNA相对丰度的偏差。通过改变序列中的密码子使得它们与对应的tRNA的相对丰度匹配，有可能增加表达。基于同样理由，通过故意选择已知对应的tRNA在特定细胞类型中罕有的密码子，有可能降低表达。因此，可获得另外的翻译控制度。
许多病毒，包括HIV和其它慢病毒，使用大量罕有密码子，通过将这些密码子改变为哺乳动物通常使用的相应密码子，可以增加包装组分在哺乳动物生产细胞中的表达。哺乳动物细胞以及各种其它生物的密码子使用表是本领域已知的。
密码子优化具有许多其它优势。利用其序列中的改变，生产细胞/包装细胞中编码病毒颗粒组装所需的病毒颗粒包装组分的核苷酸序列具有由其中除去的RNA不稳定序列(INS)。与此同时，仍保留包装组分编码序列，使得由所述序列编码的病毒组分保持相同，或至少保持足够相似，以确保包装组分的功能未失效。密码子优化还解决了Rev/RRE的输出需要，使得优化序列与Rev无关。密码子优化还降低了载体系统中不同构建物之间(例如gag-pol重叠区和env可读框之间)的同源重组。因此，密码子优化的总体作用是显著增加病毒滴度和改善安全性。
在一个方案中，仅有与INS相关的密码子进行密码子优化。然而，在高度优选的实施方案中，序列整体进行密码子优化，除了包含移码部位的序列。gag-pol基因包含两个分别编码gag和pol蛋白的重叠读框。两种蛋白的表达依赖于翻译过程中的移码。这种移码是由于翻译过程中核糖体“滑动”造成。这种滑动据认为至少部分是由于核糖体失速(stalling)RNA二级结构引起。这种二级结构存在于gag/pol基因的移码部位下游。对于HIV，重叠区由gag起始处下游的核苷酸1222(其中核苷酸1为gag ATG的A)延伸至gag末端(核苷酸1503)。因此，跨越移码部位和两个读框重叠区的281bp片段最好不进行密码子优化。保留此片段能够更有效地表达gag-pol蛋白。对于EIAV，重叠区的起始处已经到了核苷酸1262(其中核苷酸1为gag ATG的A)。重叠区的末端在核苷酸1461。为了确保保留下移码部位和gag-pol重叠区，保留野生型序列的核苷酸1156至1465。
可以对最优密码子使用进行衍化，例如为了提供便利的限制位点，可以将保守氨基酸变化引入到gag-pol蛋白中。
在一个高度优选的实施方案中，密码子优化基于高度表达的哺乳动物基因。可以改变第三个碱基，有时可以改变第二和第三个碱基。
由于遗传密码的简并性，应当认识到，专业技术人员可以获得众多gag/pol序列。还存在许多据描述可用作产生密码子优化的gag/pol序列起点的反转录病毒变异体。慢病毒基因组可变性相当大。例如存在许多仍有功能的HIV-1准物种。对EIAV也有同样的情况。这些变异体可用于增强转导过程的特定部分。HIV-1变异体的实例可见于http//hiv-web.lanl.gov。EIAV克隆的详述可见于NCBI数据库http//www.ncbi.nlm.nih.gov。
任何反转录病毒均可以使用密码子优化gag/pol序列的策略。这应适用于所有的慢病毒，包括EIAV、FIV、BIV、CAEV、Maedi/Visna、SIV、HIV-1和HIV-2。另外，此方法还可用于增加HTLV-1、HTLV-2、HFV、HSRV以及人内源性反转录病毒(HERV)、MLV和其它反转录病毒基因的表达。
可以几种方式增强慢病毒载体的性能。最值得注意的是，对病毒基因组的修饰改善了转导效率和NOI表达水平。这两种类型的修饰可改善慢病毒载体用于本文所述用途的适用性。可通过加入称作中心多嘌呤段/中心终止序列(cPPT/CTS)的元件改善转导效率。该元件约200个核苷酸，天然地位于病毒基因组中心附近，并显示改善HIV-1型载体的转导(Follenzi等，(2000)Nat Genet.2000年6月；25(2)217-22；Sirven等，Blood，2000年12月15日；96(13)4103-10)。可利用旱獭肝炎病毒转录后调节元件(WHPRE)改善NOI表达。该元件为600bp，通过涉及增强聚腺苷酸化的机制增加mRNA半寿期来增强蛋白表达。其有益作用已在许多载体中得到证实，包括HIV-1型载体(Zuffeerey，J Virol.(1999)4月；73(4)2886-92；Ramezani等，Mol Ther.2000年11；2(5)458-69)。使用该元件的这种方法和其它方法描述于WO 99/14310号。
还可以使用得自痘病毒的载体(包括得自牛痘病毒、禽类痘病毒和昆虫痘病毒的载体)在广泛的靶细胞类型中表达NOI。其应用综述于B Moss.1996(痘病毒科病毒及其复制，载于Virology，BN Fields等主编，83章，2637-2671页，Lippincott-Raven Publishers；PA USA)。得自α-病毒和痘病毒的载体的应用综述于MW Carroll等，2001(哺乳动物表达系统和免疫接种；载于Genetically Engineered Viruses，107-158页，C Ring & E Blair主编，BIOS Scientific Publishers Ltd OxfordUK)。还可以将腺伴随病毒载体用作基因转移载体，其应用综述于以下的出版物“用于基因转移和基因治疗的腺伴随病毒载体”(Bueler，H AUTHOR AFFILIATIONInstitut fur Molekularbiologie，UniversitatZurich，Switzerland，来源Biol Chem 1999年6月；380(6)613-22)。C.目的细胞目的细胞可以为任何细胞，例如原核细胞、真菌细胞(例如酵母)、植物细胞或动物细胞(例如昆虫细胞或哺乳动物细胞，包括人细胞)。在多细胞生物细胞时，细胞可以为灵长类细胞或无限增殖细胞系，可以包含组织样品，或者它们可以为活体生物的组成部分。尽管细胞经常是指单个细胞，但一般意义上的细胞为细胞群组成部分。
在本发明方法中，需要对比至少两种不同细胞之间的基因表达。通常两种或多种细胞中的第一种细胞叫做参比细胞。在本发明的一个优选实施方案中，用于对比的细胞基本上在所有方面都相同。例如，它们可以都是相同细胞系的细胞，或者可以得自一个生物体的同一组织。然后，可以操作其中一种或两种细胞，使它们包含如B节所述的相对于生理水平来说水平改变的生物分子。在一个实施方案中，第一种细胞未改变，而第二种细胞改变。特别优选这种情况，因为这应当改善信噪比。但在另一个实施方案中，两种细胞都改变。
尽管如此，用作研究起点的细胞也不一定要大致相同。例如，在本发明的一个方面，可以使用患病生物(例如哺乳动物患者)的细胞研究参与疾病过程的基因。这可以与正常生物细胞或得自相同或不同患病个体的类似细胞进行对比。在使用正常生物细胞或患病生物细胞时，正常细胞一般相当于第一种目的细胞，而患病细胞相当于第二种目的细胞。因此，至少如以上B节所述，患病细胞发生改变，使得这些细胞包含水平改变的生物分子。
在本发明的另一个实施方案中，一种细胞是含突变基因的细胞，而另一种细胞含野生型形式的同一基因。
本发明包含的另一种可能性是细胞得自不同组织或得自发育或分化的不同阶段。D.应用本发明提供许多利用差异表达筛选技术鉴定基因的改进方法。
在第一方面，提供一种鉴定参与细胞活动的基因的方法。大体上是操作一种细胞类型，使得细胞中参与细胞活动的生物分子水平发生改变。通常，这可以通过将控制多肽表达的异源核酸引至所述细胞中实现。所述多肽可以和生物分子相同，或者可以如上所述调节生物分子的水平。
一般来说，仅调节两种相同细胞中的一种细胞的生物分子水平然后检测基因转录不是本发明方法的目的，因为是检测细胞中生物分子对基因表达的作用，而不是改变生物分子水平以增强或降低对目的事件的反应。
但是，在生物分子为细胞天然产生的基因产物(如多肽)时，通过引入异源核酸改变基因产物水平可同时用于微扰细胞活动和增强对这种微扰的反应，所以易于使用差异表达技术鉴定参与细胞活动的基因产物。作为实施例，HIF-1α过表达增强了低氧反应下游的元件，因为其增强了HIF-1α介导的转录的调节作用。
尽管如此，在本发明的较广泛方面，存在两种最大的可能性。第一种可能性是两种细胞类型不同，并具有固有的差异基因表达模式。在此情况下，生物分子水平改变可用于增强这些差异。所述两种细胞例如可得自不同组织，或者可得自不同的发育或分化阶段。所述两种细胞还可以因为一种细胞得自患病组织而另一种细胞得自正常组织而不同。在以上C节中给出了设想的其它配置。
第二种可能性是两种细胞类型相同，但一种细胞以某种方式受刺激，而另一种细胞没有(或一种细胞的受刺激程度高于另一种)。例如，一种细胞可以在生长因子存在下温育，而另一种没有。因此，在此实例中，生长因子不是生物分子，而是用来微扰细胞中基因表达的刺激物或信号，其作用可通过所述生物分子增强，而其又被由异源核酸表达的多肽改变水平。
因此，本发明在此方面提供以下方法通过使两种不同的细胞群经受不同水平的信号或环境条件，鉴定其表达受信号或环境变化调节的基因，通过操作任一种或两种细胞群，以改变其活性对信号或环境条件起反应的生物分子的水平，并鉴定其表达不同的基因产物。术语“其活性对信号或环境条件起反应”包括任何其在细胞中的浓度根据信号或环境条件而变化的生物分子，以及其特性(如酶活性或对另一种细胞组分的亲和性)根据信号或环境条件而变化的生物分子。
因此，回到以上生长因子的实例，可以改变接触生长因子的细胞，以表达增加水平的转录因子，该转录因子参与涉及该特定生长因子的信号转导级联。因此，转录因子之后的生长因子的作用增强(或者负面意义或者正面意义)，所以易于鉴定其表达受转录因子并最终受生长因子调节的差异表达基因。
如上所述，信号或环境条件或者为物理信号，例如氧化还原条件的变化、CO2水平、光、渗透压、温度[低温或高温]、机械压力、辐射[电离或非电离]、暴露于低氧、缺氧、局部缺血，或者为化学信号，例如细胞微环境变化，接触结合细胞表面受体并触发信号转导途径的配体，包括激素、正常附着于其他细胞的细胞表面分子、扩散或转运到细胞中的酶反应底物、生长因子、细胞因子、趋化因子、炎性因子、毒素、代谢物、pH、药物因子、浆质携带营养物的不平衡、细胞-胞外基体的相互作用、细胞-细胞的相互作用、外源或病理性胞外组分的累积、胞内或胞外病原体(包括细菌、病毒、真菌和支原体)以及遗传微扰。
第一种细胞可以以第一种水平经受信号，而第二种细胞以第二种水平接触信号。在一个实例中，第一种水平可仅缺乏信号，而第二种水平可存在所述信号，或相反。信号水平可以调节，以便提供可分辨差异的基因表达。在一个替代实施方案中，第一种和第二种细胞都可以于第一种和第二种两种信号水平进行对比。在第二种细胞中存在异源核酸将放大由信号改变引起的基因表达差异。
两种信号水平最好都为生理相关水平。
在本发明的一个方面，可以使用已经获得的有关参与疾病或其它生物过程的基因的知识，得到有关其表达在疾病或其它生物过程中改变的其它基因的进一步信息。为此，修饰一种细胞，以便改变已知参与疾病或其它生物过程的基因产物水平，这种改变或者通过例如引入编码基因产物的异源核酸直接进行，或者如B节所述间接进行。然后检测两种细胞中的基因表达，对比结果以鉴定其表达改变的基因产物。
在本发明的这一方面，两种细胞可以相同，只是已知参与疾病或其它目的生物过程的基因产物水平有变化。因此，两种细胞可以都是和本身表现疾病或其它过程的细胞类型相同的正常细胞，或者它们可以都是患病细胞。或者，一种细胞可以是正常细胞，而另一种细胞是患病细胞。如果仅有一种细胞被修饰，那么最好是患病细胞被修饰。
在本发明的再一方面，差异表达筛选方法以两步法用于鉴定参与疾病或其它进程的基因。首先，对比第一种目的细胞(例如正常患者细胞)和第二种目的细胞(例如患病患者的相应细胞)之间的基因表达。如上所述，第一种细胞和第二种细胞在某些方面是不同的，使得它们作用出不同的表达模式。这可能是因为细胞得自不同组织，或者是因为它们得自不同的个体(例如得自正常患者和患病患者)。所述细胞可能来源相似，但在某些方面进行了不同的处理。
然后鉴定其表达在第一种细胞和第二种细胞之间不同的基因产物。其次，在此筛选方法中使用基本与第一种细胞相同的第三种目的细胞，其中将侯选基因引入到第三种细胞使基因水平改变(通常上升)。对比该细胞的基因表达和第一种细胞的基因表达，鉴定在第一种细胞和含有水平改变的侯选基因的第三种细胞之间表达不同的基因产物。如果其表达在第二种细胞中改变的基因产物在第三种细胞中还具有改变的基因表达，那么选择该侯选基因继续研究。
最好在两种或多种基因产物之间存在相关性，优选至少4种或5种基因产物，以使假阳性最小化。
现在，引用仅仅是说明性和非限制性的实施例描述本发明。在以下的实施例中，将以上描述的本发明方法称为“Smartomics”，。
附图简述

图1进行RNA印迹，以证实使用腺病毒基因转移的HIF-1α和EPAS1在转导巨噬细胞中过表达。如下所述进行RNA上样1、2道用腺病毒AdApt ires-GFP转导的巨噬细胞。3、4道用腺病毒AdApt HIF-1α-ires-GFP转导的巨噬细胞。4、5道用腺病毒AdAptEPAS1-ires-GFP转导的巨噬细胞。在泳道1、3、5中，以正常含氧量(20％O2)保持巨噬细胞。在泳道2、4、6中，以低含氧量(0.1％O2)保持巨噬细胞。RNA大小梯度的条带位置以千碱基(kb)标在每个印迹的右侧。杂交探针与基因HIF-1α(A)、EPAS1(B)和28s核糖体RNA(C)互补。
图2使用Research Genetics GeneFilters分析两种典型RNA样品的散点图。正常含氧量(Y轴)和低含氧量(X轴)中的非转导巨噬细胞RNA与两个Research Genetics GeneFilters GF200阵列杂交。分析以对阵列上每个基因的归一化密度表示，每个基因具有两个对应于正常氧含量和低氧含量信号的两个值。将这些值作图为散点图，每个点代表阵列上的一个基因。RNA样品之间以相似水平表达的基因位于x＝y线上。在此图中清楚显示了检测的动态范围。
图3用Smartomics分析乳酸脱氢酶A的表达。在A图中，显示了对应于乳酸脱氢酶A(LDH-A)基因的点的微型图象。对照水平设定在使该基因显色最佳但在整个图中为恒定设置的水平。6个图象的每个条图都对应于RNA样品范围内的离散阵列位置或实验。位于各个点图像下面的数字为该点对参比条件(gfp；20％O2)的归一化密度比。阵列位置Research Genetics定义的点标识。克隆IMAGE鉴定。直方图(B图)显示所示数值的平均值，误差范围为标准差。gfp用AdApt ires-GFP转导的细胞。Hif-1α用AdApt Hif-1α-ires-GFP转导的细胞。Epas1用AdApt Epas1-ires-GFP转导的细胞。
图4用Smartomics分析甘油醛3-磷酸脱氢酶的表达。在A图中，显示了对应于甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因的点的微型图象。对照水平设定在使该基因显色最佳但在整个图中为恒定设置的水平。6个图象的每个条图都对应于RNA样品范围内的离散阵列位置或实验。位于各个点图像下面的数字为该点对参比条件(gfp；20％O2)的归一化密度比。阵列位置Research Genetics定义的点标识。克隆IMAGE鉴定。直方图(B图)显示所示数值的平均值，误差范围为标准差。gfp用AdApt ires-GFP转导的细胞。Hif-1α用AdApt Hif-1α-ires-GFP转导的细胞。Epas1用AdApt Epas1-ires-GFP转导的细胞。
图5用Smartomics分析血小板衍生生长因子β的表达。在A图中，显示了对应于血小板衍生生长因子β(PDGFβ)基因的点的微型图象。对照水平设定在使该基因显色最佳但在整个图中为恒定设置的水平。6个图象的每个条带都对应于RNA样品范围内的离散阵列位置或实验。位于各个点图像下面的数字为该点对参比条件(gfp；20％O2)的归一化密度比。阵列位置Research Genetics定义的点标识。克隆IMAGE鉴定。对于该基因，对应于同一基因存在不同的IMAGE克隆。直方图(B图)显示所示数值的平均值，误差范围为标准差。gfp用AdApt ires-GFP转导的细胞。Hif-1α用AdApt Hif-1α-ires-GFP转导的细胞。Epas1用AdApt Epas1-ires-GFP转导的细胞。
图6用Smartomics分析单核细胞趋化蛋白-1的表达。在A图中，显示了对应于单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)基因的点的微型图象。对照水平设定在使该基因显色最佳但在整个图中为恒定设置的水平。6个图象的每个条带都对应于RNA样品范围内的单独实验。位于各个点图像下面的数字为该点对参比条件(gfp；20％O2)的归一化密度比。阵列位置Research Genetics定义的点标识。克隆IMAGE鉴定。直方图(B图)显示所示数值的平均值，误差范围为标准差。gfp用AdApt ires-GFP转导的细胞。Hif-1α用AdApt Hif-1α-ires-GFP转导的细胞。Epas1用AdApt Epas1-ires-GFP转导的细胞。
图7使用Smartomics发现新基因(Hs.16335)。在A图中，显示了对应于UniGene簇Hs.16335 EST的点的微型图象。对照水平设定在使该基因显色最佳但在整个图中为恒定设置的水平。对于该基因，对照水平为最大。6个图象的每个条带都对应于RNA样品范围内的单独实验。位于各个点图像下面的数字为该点对参比条件(gfp；20％O2)的归一化密度比率。阵列位置Research Genetics定义的点标识。克隆IMAGE鉴定。直方图(B图)显示所示数值的平均值，误差范围为标准差。gfp用AdApt ires-GFP转导的细胞。Hif-1α用AdApt Hif-1α-ires-GFP转导的细胞。Epas1用AdApt Epas1-ires-GFP转导的细胞。
图8用有效RNA印迹(Virtual Northern blot)杂交来证实Smartomics发现的Hs.16335。A)杂交探针＝Hs.16335。B)杂交探针＝β肌动蛋白。1-6泳道为图3-7中使用的得自腺病毒转导细胞的RNA样品。泳道7-10为有(泳道9、10)或没有(泳道7、8)预先激活的非转导巨噬细胞。直方图显示得自磷成像仪的、与位于其上的RNA印迹相关的相对mRNA表达水平。数字为相对于gfp(20％O2)的相对表达比。
图9pONY8Z的质粒图谱。
图10pONY8.1SM的质粒图谱。
图11pSMART CMV-HIF的质粒图谱。
图12pSMART CMV-空白型质粒图谱。
实施例实施例1Smartomics用于在巨噬细胞中发现基因巨噬细胞与各种疾病状态有关，包括癌症、动脉粥样硬化和炎性疾病(如关节炎)。在许多这样的病症中，巨噬细胞分泌恶化疾病状态的因子。这些因子包括血管发生因子、趋化因子和炎性细胞因子。这些因子中有一些是已知的，但可能存在目前未知的其它因素，而它们可能是治疗的重要靶点。在许多病症中，巨噬细胞存在于低氧区域，就是这种生理状态起启动众多基因的信号作用。已知这种背景，那么就有理由提出，在心血官疾病、癌症和炎性疾病领域可以于低氧环境下诱导药物开发的重要靶。
代表本领域当前水平的一个简单方法是采用单核细胞/巨噬细胞群，将它们分为两组，一组置于正常氧浓度下，另一组置于低氧条件下。然后可以将两组的RNA或蛋白分子用于合适的差异分析。目标是鉴定在低氧条件下存在但在保持在正常氧浓度下的细胞中不存在的蛋白或cDNA分子。
如果本发明用于鉴定巨噬细胞中的低氧诱导基因和蛋白，应当试图扩大低氧和正常氧之间的差异，以便增加信噪比。这可以通过以下方法实现将Hif1α基因传递至其中Hif1α基因过表达配置的巨噬细胞中，增强对低氧信号的反应。Hif1α是对低氧反应的调节过程的一部分。低氧诱导途径中的Hif1α和其它蛋白与称为低氧反应元件(HRE)的增强子元件相互作用，以开启低氧诱导基因的转录。各种形式的HRE存在于许多已知在低氧条件下被开启的基因的上游位置。Hif1α过表达导致许多低氧诱导基因大量过表达，并因此在差异筛选中增加了低氧特异性cDNA或蛋白的水平。这又增加了检测那些可能为药物开发靶的分子种类的可能性。因此，在此情况下，按照本发明使用的方法将对比在正常氧条件下未过表达Hif1α的巨噬细胞和在低氧条件下过表达Hif1α的巨噬细胞。
Hif1α的传递和表达可通过多种方式实现。
在此，我们描述组成表达转录因子HIF1α的腺病毒载体的构建。使用以下的PCR引物由Jurkat mRNA分离HIF1αcDNA，所述引物在5′突出端分别具有NheI和HpaI限制位点正向引物5′-CG -GACCGATTCACCATGGAG-3′反向引物5′-CG -GCTCAGTTAACTTGATCC-3′用NheI和HpaI限制酶消化PCR产物，并插入含人CMV启动子和SV40聚腺苷酸序列的Introgene AdAptTM转移载体的NheI-HpaI位点。该载体可以用PmlI线性化，然后和腺病毒血清型5基因组的右臂共转染入E1表达细胞系PerC6(还可以用911或293细胞)。
使用PerC6无RCA系统产生AdCMVHIF1α腺病毒描述于www.introgene.com(Introgen，Leiden，the Netherlands)。用腺病毒有效转导初级人巨噬细胞的方法描述于Griffiths等，2000。
以如下所述的多种可能方式比较转导和未转导巨噬细胞群的基因表达，以获得在Hif1α控制下表达的基因读数。另外，对比在低于0.5％氧浓度下温育的转导细胞和非转导细胞。
制备总RNA样品进行差异基因表达分析。这些样品或者放射标记，或者荧光标记，并与固相支持物上的cDNA阵列杂交。低氧和/或各种HIF蛋白表达上调的基因定量地产生更强的杂交信号。阵列方案可以包括尼龙或玻璃支持物的任一种，这综述于Bowtell，1999。涉及玻璃支持物方案的方法学细节详述于Eisen和Brown，1999。在此，使用荧光标记探针，并使用激光共聚焦扫描仪检测杂交。对于尼龙支持物方法，包括点印迹和杂交的标准分子生物学方法，详述于Molecular CloningA Laboratory Manual，Sambrook，J等，Cold SpringHarbor Laboratory Press。在此，放射标对比的RNA样品，并使用磷成像仪检测杂交。
阵列可购自Research Genetics，Huntsville，AL，或使用扣除克隆产生的cDNA克隆自己制作(PCR选择法，由Clontech，Palo Alto，CA拥有)。制作包括应用点阵机器人(MicroGrid，BioRobotics Ltd，Cambridge，UK)。实施例2使用Smartomics鉴定巨噬细胞中的低氧调节基因本发明用于鉴定巨噬细胞中低氧诱导的基因和蛋白。
Smartomics用于改善发现初级人巨噬细胞中受低氧作用激活或抑制的基因。如实施例1所述，Smartomics涉及通过实验性引入低氧反应的关键调节物即低氧诱导型因子1α(HIF-1α)，增强对低氧的天然反应。或者单独实现HIF-1α过表达，或者与细胞暴露于低氧组合实现HIF-1α过表达。这使得可以检测用其他方法还不能检测到的在单独低氧作用下产生的基因表达改变。
尽管HIF-1α介导低氧反应广为人知，但还已知或猜测其它转录因子参与其中。这些因子包括叫做内皮PAS结构域蛋白1(EPAS1)或HIF-2α的蛋白，HIF-2α与HIF-1α具有48％序列同一性(“内皮PAS结构域蛋白1(EPAS1)，一种在内皮细胞中选择性表达的转录因子”，Tian H，McKnight SL，Russell DW.Genes Dev.1997年1月；11(1)72-82)。有证据提示，EPAS1对介导某些细胞类型的低氧反应特别重要，在人巨噬细胞中可清楚检测出EPAS1，表明其在该细胞类型中起作用(“巨噬细胞—基因治疗病理性低氧的新系统”，Gene Ther.2000年2月；7(3)255-62，Griffiths L，Binley K，Iqball S，Kan O，Maxwell P，Ratcliffe P，Lewis C，Harris A，Kingsman S，Naylor S.)。按照该文献，本实施例还利用EPAS1过表达作为独立于HIF-1α过表达的改善低氧反应型基因寻找的方法。还阐述了本发明的实施方案，其中可以鉴定对HIF-1α和EPAS1(或其它低氧反应介导物)反应的差异，目的是鉴定更适于特异性和有效治疗疾病的治疗靶分子。
如实施例1所述，可利用重组腺病毒将外源基因序列(即HIF-1α或EPAS1)引入初级巨噬细胞。如实施例1所述，可利用商用系统生产包含腺病毒转移载体AdApt、腺病毒基因组质粒AdEasy和包装细胞系Per-c6(Introgen，Leiden，The Netherlands)的腺病毒颗粒。按照标准的生产商说明书操作。
已经制备了AdApt转移载体的三种衍生物，叫做AdApt ires-GFP、AdApt HIF-1α-ires-GFP和AdApt EPAS1-ires-GFP。在这些载体中，为便利起见，修饰AdApt，使由强巨细胞病毒(CMV)启动子表达的插入基因(即HIF-1α或EPAS1)借助于内部核糖体结合位点(ires)连接至绿色荧光蛋白(gfp)标记物。因此，出现绿色荧光成为病毒在转导的哺乳动物中表达HIF-1α或EPAS1的便利指示剂。
使用标准分子生物学方法构建AdApt衍生物，所述方法包括反转录酶PCR(RT-PCR)、通过限制酶消化在质粒之间转移DNA片段、琼脂糖凝胶DNA片段分离、“末端修复”具有突出端的双链DNA片段以产生平端，以及DNA连接。由DNA测序确认亚克隆步骤。这些技术是本领域众所周知的，但特别可参考Sambrook等，MolecularCloningA Laboratory Manual(1989)和Ausubel等，Short Protocols inMolecular Biology(1999)，第4版，John Wiley & Sons，Inc。
简而言之，通过将脑心肌炎病毒(EMCV)ires和绿色荧光蛋白基因(GFP)紧接着CMV启动子下游并与其同一方向先后插入到AdApt的末端修复的HpaI限制位点中，制备AdApt ires-GFP。EMCV ires和gfp序列都广泛使用，并可由常用的质粒获得。SEQ ID NO1列出了插入到AdApt质粒的连接的ires-GFP的确切核苷酸序列。
通过将人HIF-1α蛋白编码序列插入到AdApt ires-GFP的CMV启动子和ires-GFP元件之间，由AdApt ires-GFP获得质粒AdAptHIF-1α-ires-GFP。为此，通过RT-PCR由人mRNA克隆人HIF-1αcDNA，通过与公开的HIF-1αcDNA核苷酸序列(Genbank登录号U22431)对比验证所述序列。HIF-1α序列以末端修复的片段连接入AdApt ires-GFP的末端修复的AgeI限制位点[还可以是紧接着CMV启动子下游的亲代载体AdApt的AgeI限制位点]。SEQ ID NO2显示了含插入到AdApt ires-GFP中的编码HIF-1α的确切DNA序列。
通过将人EPAS 1蛋白编码序列插入到AdApt ires-GFP的CMV启动子和ires-GFP元件之间，由AdApt ires-GFP获得质粒AdAptEPAS1-ires-GFP。为此，通过反转录酶PCR(RT-PCR)由人mRNA克隆人EPAS1 cDNA，通过与公开的EPAS1 cDNA核苷酸序列(Genbank登录号U81984)对比验证所述序列。EPAS1序列以末端修复的片段连接入AdApt ires-GFP的末端修复的AgeI限制位点[还可以是紧接着CMV启动子下游的亲代载体AdApt的AgeI限制位点]。SEQ ID NO3显示了含插入到AdApt ires-GFP中的编码EPAS1的确切DNA序列。
在生产腺病毒颗粒之前，验证腺病毒转移载体AdApt HIF-1α-ires-GFP和AdApt EPAS1-ires-GFP在哺乳动物细胞中控制CMV启动子表达具功能活性的HIF-1α或EPAS1蛋白的能力。这可如文献所述通过瞬时转染荧光素酶报导基因测定实现(Boast K，Binley K，IqballS，Price T，Spearman H，Kingsman S，Kingsman A，Naylor S.Hum GeneTher.1999年9月1日；10(13)2197-208，“用于治疗局部缺血疾病的生理调节载体的特征”)。
使用前述的Introgene腺病毒系统，生产每个载体AdApt ires-GFP、AdApt HIF-1α-ires-GFP和AdApt EPAS1-ires-GFP的铯带纯腺病毒颗粒。按照Introgene的说明书，通过分光光度测定法定量腺病毒制备物，获得每ml的病毒颗粒(VP)值。
为分离人巨噬细胞，由健康献血人的外周血获得单核细胞。将得自Bristol输血中心(Bristol，UK)的100ml袋装血沉棕黄层与等体积的RPMI1640培养基(Sigma)混合。混合物在50ml离心管中的10mlficol-paque(Pharmacia)顶部分层，以800xg离心25分钟。取出交界层，用MACS缓冲液(磷酸缓冲盐水pH7.2，0.5％牛血清白蛋白，2mmEDTA)清洗，并以80μl/10n7细胞重悬浮。向其中加入20μl CD14微珠(Miltenyi Biotec)，将离心管于4℃温育15分钟。此后，用MACS缓冲液以400×g进行1次清洗，将细胞重悬浮于3ml MACS缓冲液中，用位于midi-MACS磁体(Miltenyi Biotec)上的LS+MACS分离柱(Miltenyi Biotec)分离。用3×3ml MACS缓冲液清洗该柱。将该柱由磁体上取下，用注射器以5ml MACS缓冲液洗脱。用补加2％人AB血清(Sigma)的培养基(AIM V(Sigma))清洗细胞，以2×10n5细胞/ml重悬浮于同一培养液中，并置于特氟隆包被的大培养袋(Sud-LaborbedarfGmbH，82131 Gauting，Germany)中，转移至组织培养箱(37℃，5％CO2)培养7-10天。在此过程中，单核细胞自然地分化为巨噬细胞。通过使用相差显微镜检测细胞形态进行确认。通过于4℃放置30分钟并排空内容物取出细胞。
用补加4％胎牛血清(Sigma)的DMEM(Gibco，Paisley，UK)清洗并重悬浮巨噬细胞。将4×106细胞置于各个10cm的Prineria(Falcon)组织培养皿中，每板的总体积为8ml，6×109腺病毒颗粒/ml。培养16小时后(在此过程中，巨噬细胞附着于板上并受到腺病毒颗粒感染)，去除培养基并代之以补加2％人AB血清的AIM V培养基。在实验前再培养24小时，以使转导的腺病毒进行基因表达。
使用绿色荧光作为基因转移标记测定以上腺病毒颗粒的剂量，为大部分(超过80％)巨噬细胞群实现转导所需的最小量。这可使用含LacZ报告基因的单独腺病毒构建物证实。通过选择最小剂量的病毒，使可能存在的病毒转移的非特异性作用最小化。
对于低氧实验，将相同的培养皿分处于两个单独的培养箱中一个为37℃、5％CO2、95％空气(＝正常氧含量)，而另一个为37℃、5％CO2、94.9％氮气、0.1％氧气(＝低氧含量)。在这些条件下培养8小时后，由培养箱中取出培养皿，置于冷冻平台上，用冷PBS清洗，使用RNazol B(Tel-Test，Inc；Biogenesis Ltd分销)按照生产商的说明提取总RNA。
设计此实验是为了获得6个细胞群(简称“细胞类型”)，它们的差异仅在于用如下所示的腺病毒和/或低氧处理“细胞类型”腺病毒表达基因氧条件1 AdApt ires-GFP无 常 (20％氧气)2 AdApt ires-GFP无 低氧(0.1％氧气)3 AdApt HIF-1α-ires-GFPHIF-1α 正常(20％氧气)4 AdApt HIF-1α-ires-GFPHIF-1α 低氧(0.1％氧气)5 AdApt EPAS1-ires-GFP EPAS1正常(20％氧气)6 AdApt EPAS1-ires-GFP EPAS1低氧(0.1％氧气)可通过比较这些“细胞类型”之间的基因表达模式进行基因寻找。按照文献使用的常规方法，应当比较细胞类型1和细胞类型2。通过实施本发明(Smartomics)，注意到其它几种可能性。首先，可对比细胞类型3或5和细胞类型1。此时，对参与低氧反应的关键分子过表达的刺激可能超出天然的低氧反应，如细胞类型2所见。其次，在本发明的一个优选实施方案中，可对比细胞类型4或6和细胞类型1。在此情况下，通过过表达参与低氧反应的关键分子，使对低氧的天然反应增强或加强。应当注意的是，以上阐述的实验设计使用对照腺病毒代替未处理的细胞。这样做应当使病毒转导的任何非特异性作用在整个分析过程中都同等发生，并将消失。
尽管由转导巨噬细胞中的绿色荧光蛋白指示有效的腺病毒基因转移，但使用RNA印迹证实了HIF-1α和EPAS1的过表达。通过RNA印迹(图1)分析如上所述由细胞类型1-6中提取的RNA样品。将RNA样品(每泳道8μg总RNA样品)在甲醛变性的1％琼脂糖凝胶上电泳，然后转移至尼龙膜(Hybond-N，Amersham，UK)，并先后和核苷酸序列与HIF-1α(图1a)、EPAS1(图1b)或28S核糖体RNA(图1c)互补的33p-标记的DNA探针杂交。用于RNA印迹、严格条件下的探针杂交以及去除杂交探针的方法学是本领域众所周知的。
在图1a中，可以看到所有的泳道都含有对应于内源HIF-1αmRNA的约4kb模糊条带。在含有AdApt HIF-1α-ires-GFP转导细胞RNA的泳道3，4中，观察到相似大小的较强条带，表明HIF-1α成功过表达。
在图1b中，可以看到所有的泳道都含有对应于内源EPAS1mRNA的非常模糊的约5kb条带。在含有AdApt EPAS1-ires-GFP转导细胞RNA的泳道5，6中，观察到约4kb的较强条带，表明EPAS1成功过表达。内源和过表达EPAS1大小的不同是由于内源基因存在长非翻译区，该区并不重要。
在图1c中，可以看到所有的泳道都检测出28S核糖体RNA，表明凝胶上的RNA上样量相同。
通过图1a和1b的磷成像定量分析，显然HIF-1α和EPAS1的过表达水平超出内源水平约80倍。低氧没有再增强由腺病毒控制的这些基因的mRNA过表达。例如，在图1a中，泳道4的条带强度没有超过泳道3。但是在蛋白和功能水平上，低氧加强了这些mRNA编码蛋白的作用(Semenza GL.Annu.Rev.Cell Dev Biol.1999；15551-78，“低氧诱导因子1调节哺乳动物O2稳态”)。
使用Research Genetics Human GeneFilters Release 1(GF200)(Research Genetics，Huntsville，AL)获得分离自6种“细胞类型”的RNA样品的总体mRNA表达模式。该方法使用预先制备的与包含一系列特征水平的5,300种基因互补的DNA阵列，包括仅与未注解EST或未知功能cDNA序列匹配的序列。
所述阵列为尼龙组成，用得自特异性IMAGE联合cDNA克隆的DNA点阵(http//image.llnl.gov/image/)。所述阵列与已经用同位素33p放射性标记的RNA样品杂交，以检测RNA样品中各个基因的丰度。标记多个RNA样品，平行与单独拷贝的所述阵列杂交，比较RNA样品之间的点杂交信号。
基于阵列的mRNA表达分析的关键问题是敏感性和可靠性。目前可利用其它两种方法玻璃微阵列和DNA芯片，它们都使用荧光标记的RNA(Bowtell DD.Nat Genet.1999年1月；21(增刊1)25-32，“可通过微阵列获得表达数据的选项—由开始到结束”)。尽管这些方法经常被认为比尼龙型方法敏感性增加，但这种观点缺乏权威性的证据。相反，细心比较三种方法显示，对于相似量的未扩增RNA，尼龙型放射性方法较好(Bretucci F，Bemard K，Loriod B，Chang YC，Granjeaud S，Birnbaum D，Nguyen C，Peck K，Jordan BR，Hum MolGenet.1999年9月；8(9)1715-22，“基于DNA阵列的表达检测的敏感性问题和尼龙微阵列对小样品的性能”)。微阵列和DNA芯片法需要更大量的RNA，而RNA经常难以由初级细胞获得，或者易于产生错误的复杂扩增方法。
为证明用于所述Smartomics实施例的基于阵列的基因表达方法的敏感性，在我们的实验室中用Research Genetics GeneFilters分析两种代表性RNA样品的散点图，显示约4对数的检测范围(图2)。相比之下，可以论证地指出最复杂的基于阵列的方法DNA芯片具有3对数的检测范围(Affymetrix)。
因此，有理由假定，本文实施例阐述的由Smartomics提供的与敏感性问题有关的改进，能够容易地通过使用替代的基于阵列的方法获得。在任何情况下，任何潜在有利的阵列方法都可通过使用本文描述的Smartomics发明进一步改善。本发明的一个重要的用途是高通量方法，例如可使用阵列鉴定通常仅可用很敏感的低通量方法(例如RT-PCR或RNA印迹)检测的表达改变。
放射性标记如上所述由6种“细胞类型”中提取的RNA，将其与单独拷贝的Research Genetics Human GeneFilters GF200杂交(实验1)。按照生产商提供的方法进行操作(http//www.resgen.com/products/GF200 ptotocol.php3)。使用MolecularDynamics Storm磷成像仪获得杂交阵列的图象。然后按照前述方法由阵列上剥离RNA。
为确保重复性，用相同的RNA样品重复该步骤(实验2)。然后使用Research Genetics Pathways 3.0软件按照Pathways 3.0说明书的讲解输入和分析全部数据集。该分析的关键方面概述如下程序结构(project tree)设置使用“条件对”模式同时分析多个实验。“条件”是指与得自相同“细胞类型”的相似RNA样品杂交的几个阵列。条件 “细胞类型” 腺病毒 氧实验号1 1 AdApt ires-GFP 正常 11 1 AdApt ires-GFP 正常 22 2 AdApt ires-GFP 低氧 12 2 AdApt ires-GFP 低氧 23 3 AdApt HIF-1 α-ires-GFP 正常 13 3 AdApt HIF-1α-ires-GFP 正常 24 4 AdApt HIF-1α-ires-GFP 低氧 14 4 AdApt HIF-1α-ires-GFP 低氧 25 5 AdApt EPAS1-ires-GFP 正常 15 5 AdApt EPAS1-ires-GFP 正常 26 6 AdApt EPAS1-ires-GFP 低氧 16 6 AdApt EPAS 1-ires-GFP低氧 2归一化设置按照Pathways 3.0说明书的解释选择“所有数据点”选项和默认设置的Y.Chen算法。作为两个单独的归一化组处理两个实验，以校正相同实验的不同阵列的杂交信号之间的总体差异。对比分析在条件2和条件1、条件3和条件1、条件4和条件1、条件5和条件1、条件6和条件1之间进行成对比较。
换句话说，使用条件1(即细胞类型1)作为参比条件进行成对对比。这相当于用对照腺病毒AdApt ires-GFP转导细胞，并置于正常氧浓度(正常氧含量)下。以此方式对Research Genetics GF200阵列上存在的所有基因进行对比。通过对比条件，该分析判断实验1和实验2二者的数据。过滤设定然后对以上列明的5个成对比较中的至少一个进行过滤，选择表达比率高于2.0的基因。使用最小0.2最大1000的Intensity II滤器自动去除全部6种条件中信号强度低的基因。使用Students t-检验滤器(90％可信度)自动去除在实验1和实验2中不以可重复方式反应的基因。
结果以各个基因的表达模式输出，显示归一化信号强度和表达比率。Pethways 3.0分析的关键优势在于显示各个点的高倍放大的微型图象。这使得可以目测鉴定所检测部位精确覆盖了含杂交阵列点的区域，并且该点是真实的而不是背景假象。
即使取样部位明显为真实的阵列点，有时也会观察到定量数据和对应的微型图象之间的微小差异。例如，肉眼可能观察到两个点之间有小差异，而定量分析可能提示有较大差异。应当注意的是，微型图象没有归一化来补偿总体差异，并受限于图象质量。灰度图象固有地受限于其定量描述密度差异的能力。由Strom磷成像仪产生的数码图象单个像素包含的线性动态范围为100,000，而打印的图象仅可以256色灰度绘图。三种代表性的已知低氧调节基因的结果就发现的真实低氧调节基因来说，证实HIF-1α或EPAS1过表达连同低氧接触一起优于使用非转导低氧细胞，显示了本领域已知受低氧调节的基因的结果。
选择了三种在Research Genetics GF200阵列上以双点呈现的基因。因此，由于整个实验是重复的，所有可以对这些基因进行总共4次重复对比。
本领域已知乳酸脱氢酶A(LDH-A)基因由低氧激活(Webster KA.Mol Cell Biochem.1987年9月；77(1)19-28，“在骨骼肌细胞中通过氧利用度调节糖酵解酶RNA转录速率”)。在图3中，可以看出在单独的低氧(gfp 0.1％O2)作用下，mRNA表达相比于正常氧含量(gfP20％O2)平均增加2.24倍。
通过过表达HIF-1α，LDH-A表达平均增加3.39倍，比天然反应明显改善(图3；HIF-1α20％O2)。通过使用Smartomics法的一个优选实施方案，同时在低氧下过表达HIF-1α，LDH-A的平均反应进一步提高至4.50倍(图3；HIF-1α0.1％O2)。
在先有技术中已经确立HIF-1α负责介导LDH-A的低氧诱导激活(Iyer NV，Kotch LE，Agani F，Leung SW，Laughner E，Wenger RH，Gassmann M，Gearhart JD，Lawler AM，Yu A Y Semanza GL，Genes Dev.1998年1月15日；12(2)149-62，“由低氧诱导因子1α进行O2稳态的细胞和发育控制”)。但是从没有设想或证明同时有或没有低氧时使用病毒基因转移技术以稳定方式过表达HIF-1α引起基因表达的次级变化，该变化明显大于天然低氧反应。LDH-A对低氧的反应还可由EPAS1过表达改善(图3；EPAS1)，尽管没有HIF-1α过表达显著。
同LDH-A一样，本领域已知甘油醛3-磷酸脱氢酶(GADPH)基因由低氧激活(Webster KA.Mol Cell Biochem.1987年9月；77(1)19-28，“在骨骼肌细胞中通过氧利用度调节糖酵解酶RNA转录速率”)。在图4中，可以看出在单独低氧(gfp 0.1％O2)作用下，mRNA表达相比于正常氧含量平均增加1.52倍。
通过过表达HIF-1α，GAPDH表达平均增加3.33倍，比天然反应明显改善(图4；HIF-1α20％O2)。通过使用Smartomics法的完整实施方案，同时在低氧下过表达HIF-1α，GAPDH的平均反应进一步提高至4.57倍(图4；HIF-1α0.1％O2)。
在已公开的文献中，已经确立HIF-1α负责介导GAPDH的低氧诱导激活(Iyer NV，Kotch LE，Agani F，Leung SW，Laughner E，WengerRH，Gassmann M，Gearhart JD，Lawler AM，Yu A Y Semanza GL，GenesDev.1998年1月15日；12(2)149-62，“由低氧诱导因子1α进行O2稳态的细胞和发育控制”)。但本领域从没有设想或证明同时有或没有低氧时使用病毒基因转移技术以稳定方式过表达HIF-1α引起基因表达的次级变化，该变化明显大于天然低氧反应。
对于GAPDH，可以看出EPAS1过表达(图4；EPAS1 20％O2和0.1％O2)的作用明显小于HIF-1α过表达的作用。证实Smartomics法的一个鉴定对EPAS1或HIF-1α过表达选择性或优选反应的基因的单独实施方案。
本领域还已知血小板衍生生长因子β(PDGFβ)由低氧激活(Kourembanas S，Hannan RL，Faller DV.J Clin Invest，1990年8月；86(2)670-4，“氧含量调节人内皮细胞血小板衍生生长因子-B链基因表达”)。在图5中，可以看出在单独低氧作用(gfp 0.1％O2)下，mRNA表达比正常氧含量平均增加2.14倍。
通过过表达EPAS1，PDGFβ表达平均增加9.28倍(图5；EPAS120％O2)，比天然反应有极大改善。在此情况下，低氧和EPAS1过表达组合没有超过单独的EPAS1过表达的反应，表明剂量-反应饱和作用(图5；EPAS1 0.1％O2)。
由图5可明显看出，在PDGFβ对EPAS1和HIF-1α的反应中存在显著的特异性，对GAPDH观察到相反的方式。单独的HIF-1α过表达对PDGFβ没有明显作用，而EPAS1过表达产生很大的作用。这解释了Smartomics法的一个单独实施方案，通过该实施方案鉴定对以相同方式起作用的不同基因过表达选择性或优选反应的基因。
本领域已知单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)编码基因通过降低mRNA表达以反向方式对低氧起反应(Negus RP，Turner L，Burke F，Balkwill FR，J Leukoc Biol.，1998年1月；63(6)758-65，“低氧下调MCP-1表达与肿瘤中巨噬细胞分布有关”)。在图6中，可以看出在单独低氧作用(gfp 0.1％O2)下，mRNA表达比正常氧含量平均变化0.47倍(即降低2.46倍)。
通过过表达HIF-1α，MCP-1表达平均变化0.243倍(即降低4.11倍)，比天然反应明显改善(图6；HIF-1α20％O2)。通过使用Smartomics法的一个优选实施方案，同时在低氧下过表达HIF-1α，MCP-1的平均反应变化进一步改善至0.112倍(即降低8.93倍)(图6；HIF-1α0.1％O2)。通过过表达EPAS1甚至更显著地改善了低氧诱导抑制的MCP-1表达(图6；EPAS1 20％O2和0.1％O2)。这证明使用Smartomics改善了对受疾病信号抑制的基因的寻找。
以MCP-1作为例证，HIF-1α或EPAS1过表达加强低氧诱导基因抑制，这一发现在本领域完全没有先例。HIF-1α和EPAS1蛋白的结构都含有反式激活结构域而没有已知的转录阻抑结构域(Pugh CW，O′Rourke JF，Nagao M，Gleadle JM，Ratcliffe PJ，J Biol Chem.，1997年4月25日；272(17)11205-14，“低氧诱导因子-1的活化；鉴定α亚单位中的调节结构域”)。
以上阐述的结果涉及阵列基因表达分析，其中，在阵列上总共约5300个基因中鉴定出超过50个基因受低氧调节。通过关注本领域已知受低氧调节的基因并显示Smartomics法如何可以明显增强反应，提出一个观点Smartomics提供了一个用于鉴定真实的新低氧调节基因的改进方法。在本研究中，如下所示，也可以直接显示使用Smartomics法发现新基因。因为该分析包括了常规分析得到的表达改变(即没有病毒过表达时对比低氧/正常氧含量)，清楚显示了Smartomics发明的优势。
表1列出了在此分析中鉴定的未注解基因或EST，这些基因或EST在病毒控制的过表达作用下激活，但还没有被先有技术中进行的低氧/正常氧含量对比鉴定出。表1的最后5列显示了相比于正常氧含量下Adapt-ires-GFP转导细胞的表达比率。这5列的第一列为没有Smartomics的反应，在此处显示的所有情况下，水平都在显著性以下。其它4列提供了使用本发明获得的结果，由此可看出显著的应答。特别是，在该表的最后几行，鉴定出显示对EPAS1过表达反应大的新基因。
表1Smartomics鉴定的新基因
列1是2001年2月16日UniGene数据库使用的基因名称。核苷酸和蛋白登录号得自Genbank数据库。最后5列显示以对正常氧含量下Adapt ires-GFP转导细胞的比率表示的表达水平。gfp H低氧下AdApt ires-GFP转导细胞的表达。Hif N正常氧含量下AdAptHif-1α-ires-GFP转导细胞的表达。Hif H低氧下AdApt Hif-1α-ires-GFP转导细胞的表达。EPAS N正常氧含量下AdApt Epas1-ires-GFP转导细胞的表达。EPAS H低氧下AdApt Epas1-ires-GFP转导细胞的表达。
图7显示这些基因中一种对应于EST(GenBank登录号N64734；IMAGE克隆293336)的基因的表达模式。在UniGene EST数据库(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/)中，该EST目前仅与两个其它EST(登录号为AI051607(IMAGE 1674154)和T87161(IMAGE 293336))成簇。UniGene簇号为Hs.16335，在该数据库中完全没有注解。序列分析显示该稀有序列是不完整的，缺少关于蛋白编码序列的信息。在人类基因组计划基因注解的Ensembl数据库(http//www.ensembl.org/)中，预测或证实cDNA序列的blast检索没有鉴定出该EST。因此，由公用信息显然可知，对应于EST IMAGE293336的基因确实是新的未注解基因。
在图7中，以最大对比度显示微型阵列点图象，使背景信号明显。可以看到，在单独低氧作用下(gfp 0.1％O2)，mRNA表达水平相比于正常氧含量平均增加1.4倍。但是，这是不显著的，因为其得自各个实验的巨大比率差异(2.41和0.46)。根据gfp 20％O2和gfp 0.1％O2的微型图象，显然在这些条件下的基因表达低于阵列型方法检测阈。但是，在使用Smartomics发明并使用病毒基因转移方法过表达EPAS1时，观察到清晰的可检测应答，诱导比率超过8倍(图7；EPAS1 20％O2或0.1％O2)。图7的表达模式还解释了Smartomics的一个用于鉴定选择性应答于HIF-1α或EPAS1的基因的单独实施方案。
为证实图7提供的结果，使用更敏感的方法研究对应于IMAGE克隆293336基因的表达，即有效RNA印迹。应当指出的是，该方法已经不适于最初发现得低氧诱导的IMAGE克隆293336，因为有效RNA印迹和类似的方法不能同时筛选大量的基因。该技术类似于常规的RNA印迹，只是对应于表达基因mRNA群的双链cDNA用电泳分离，并印迹在尼龙膜上。这依赖于产生全长cDNA分子的cDNA合成方法，该方法可由商业渠道购买(SMART PCR eDNA SynthesisKit；Clontech Laboratories Inc，Palo Alto，CA，USA)。
按照SMART PCR cDNA Synthesis Kit说明书的描述实施有效RNA印迹方法。简单地说，由6个用于阵列杂交的RNA样品合成600ng cDNA。还加工了另外4个RNA样品，它们得自在正常氧含量和低氧(6小时，0.1％O2)下培养的非转导巨噬细胞，它们都用或不用100ng/ml脂多糖(大肠杆菌026B6 Sigma，UK)和1000u/ml人γ干扰素(Sigma，UK)预处理16小时。该组合因素引起巨噬细胞激活，这是巨噬细胞生理和病理作用的关键过程。所有的10个cDNA样品都在琼脂糖凝胶上分离，并按照Hybond N+说明将其碱转移至Hybond N+膜(AmershamPharmacia，UK)上。按照本领域众所周知的标准RNA印迹杂交与33P标记的克隆cDNA探针严格杂交。使用市售试剂盒(Prime-a-Gene，Promega，UK)放射标记cDNA探针。首先让有效RNA印迹与UniGene簇Hs.16335的IMAGE克隆1674154的cDNA插入片段杂交(图8a)。然后通过高温/低盐清洗剥离印迹，并用人β-肌动蛋白基因的蛋白编码区再探测(图8b)。
由图8a可见，检测到对应于Hs.16335的mRNA为约4.5kb的双联条带。该基因受腺病毒控制的EPAS1过表达强烈诱导(泳道5，6)，与图7的阵列数据一致。在该非阵列分析中的高诱导比率缘于有效RNA技术敏感性增加。与阵列数据不同，Hs.16335的表达在所有RNA样品的检测范围内。重要之处在于，可见单独的低氧产生约60倍的诱导比率(图8a；泳道2，8)。因此，Hs.16335被鉴定为真实的低氧调节基因，尽管其在未用本发明(Smartomics)的阵列筛选检测水平之下。
图8a的检测结果还解释了Smartomics法的一个用于鉴定对EPAS1或HIF-1α过表达选择性或优选反应的基因的单独实施方案。HIF-1α过表达产生18.9倍的诱导比率(泳道3)，而EPAS1过表达产生141倍的大得多的诱导比率(泳道5)。
在图8a的泳道9中，显示LPS和THFα激活巨噬细胞使对应于Hs.16335的基因表达增加10.8倍。因此，该新基因可能与巨噬细胞的炎性功能相关。
在图8b中，发现人β-肌动蛋白基因表达在整个实验中都大致恒定，与图8a中由于基因表达的特异性变化而产生的差异一致。
可根据有效RNA印迹上cDNA的大小进行cDNA末端快速扩增(RACE)，以克隆对应于Hs.16335的全长型基因。对该基因的测序和功能分析可能导致鉴定出新治疗靶分子。该过程的至关重要之处是开始使用Smartomics发明。实施例3EIAV载体构建本实施例描述了在CMV启动子下游具有4种独特克隆位点的EIAV载体(pONY8.1SM)的产生。根据其包含的EIAV序列(约1.1kb)和其表达的EIAV蛋白(无)，pONY8.1SM是迄今为止最小的EIAV载体。该载体是基因转移系统的一个实例，可用于按照本发明的差异表达筛选方法。但是，可以使用其它基于任何其它慢病毒、反转录病毒、疱疹病毒、腺病毒、α病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒或任何合适制品的DNA的基因转移系统。构建EIAV型载体pONY8.1SM起点是pONY4.0Z(GB9727135.7和Mitophanous等，1999)。用ATTG替换EIAV gag区中的前两个ATG三联体，以消除EIAV基因组的gag表达，同时保持载体中的gag序列。发现gag序列对于保持产生高滴度载体很重要。
通过PCR进行ATG至ATTG的变化。使用引物ATTG1和PS2对EIAV前导序列/gag序列进行PCR扩增。其模板是质粒pONY3.1(GB9727135.7和Mitophanous等，1999)。该PCR片段在5′和3′末端分别包含NarI和XbaI位点。将该片段插入到用NarI和XbaI切割的pONY4Z中，产生pONY8.0Z。
ATTG1引物AGTTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAGAGGGGCGCAGACCCTACCTGTTGAACCTGGCTGATCGTAGGATCCCCGGGACAGCAGAGGAGAACTTACAGAAGTCTTCTGGAGGTGTTCCTGGCCAGAACACAGGAGGACAGGTAAGATTGGGAGACCCTTTGACATTGGAGCAAGGCGCTCAAGAA下划线＝NarI位点PS2引物TAGTTCTAGAGATATTCTTCAGAG下划线＝XbaI位点pONY8.1SM是含内部CMV启动子的EIAV载体基因组，由该启动子可表达任何目的基因。该载体通过缺失pONY8Z的一部分env序列制备。用SbfI切割pONY8Z(位置5885)。接着用SapI部分切割(在pONY8Z中有两个SapI位点，参看图9)。然后纯化于位点8056切割的分子，平端并再连接，获得pONY8.1Z。为产生pONY8.1SM，用SacII和SphI切割pONY8.1Z、平端并再连接。这去除了lacZ基因，并产生了4个用于插入任意基因或基因文库的独特位点BsmBI、SbfI、EcoRI和HindIII(图10)。SbfI具有一个8碱基识别序列，使其用于插入未知基因。实施例4产生表达HIF1-α的EIAV载体本实施例描述了产生能够由内部CMV启动子表达HIF-1α的EIAV载体(pONY8.1SMHIF1)。人HIF-1α的登录号为U22431。为制备pONY8.1SMHIF1，由分离自Jurkat细胞的mRNA产生的cDNA对HIF-1α进行PCR扩增。其引物为下述的HIFPM1和HIFPM2。它们含有用于克隆的SbfI位点，并使用Kozak序列增强翻译。该途径产生的PCR产物含有SbfI克隆位点，该位点位于HIF-1α可读框的侧翼。用SbfI切割该产物，并插入到SbfI切割的pONY8.1SM中。以该途径产生的质粒叫做pONY8.1SMHIF1。
HIFPM1引物ATCGCCTGCAGG GAGGGCGCCGGCGGCGCGSbfI位点＝下划线，Kozak序列＝粗斜体，ATG起始密码子＝下划线斜体HIFPM2引物ACTGCCTGCAGGTCAGTTAACTTGATCCAAAGCTCTGAGSbfI位点＝下划线该质粒用于和gag-pol和env表达质粒连接，产生如Mitrophanous等，1999所述的EIAV型载体颗粒。然后在基因受Hif1途径直接或间接控制的情况下，使用这些颗粒转导各种可能感兴趣的细胞类型。
一个实例是初级人骨骼肌细胞。对比转导和未转导的细胞群。另外，对比低氧浓度下的转导细胞和正常氧浓度下的未转导细胞。
制备用于差异基因表达分析的RNA样品。这些样品或者放射标记，或者荧光标记，并与固相支持体上的cDNA阵列杂交。受低氧和/或各种HIF蛋白表达上调的基因产生数量上更强的杂交信号。阵列方案可包括综述于Bowtell，1999的尼龙或玻璃支持物。涉及玻璃支持物方案的方法学细节详述于Eisen和Brown，1999。在此使用荧光标记探针，并使用激光共聚焦扫描仪检测杂交。对于尼龙支持物方案，所涉及的点印迹和杂交的标准分子生物学方法见MolecularCloningA Laboratory Manual，Sambrook，J等，Cold Spring HarborLaboratory Press详述。在此，放射标记对比的RNA样品，并使用磷成像仪检测杂交。
阵列可购自Research Genetics，Huntsville，AL，或者可使用通过扣除克隆产生的cDNA克隆自己制备(PCR选择法，由Clontech，PaloAlto，CA拥有)。制备包括使用点阵机器人(MicroGrid，BioRobotics Ltd，Cambridge，UK)。实施例5产生表达HIF1-α的密码子优化的EIAV载体本实施例描述了产生EIAV衍生载体pSMART CMV-HIF，其中HIF-1α表达由位于载体内部的CMV启动子驱动(图11)。为本专利所述的差异筛选目的，可以使用相似的载体骨架获得其它基因的表达。
构建pSMART CMV-HIF的起点是pONY4.0Z(WO 99/32646和Mitophanous等，Gene Ther.1999年11月；6(11)1808-18)。在第一步中，通过引入突变将质粒pONY4.0Z转变为pONY8.0Z(参见以上的实施例3)，所述突变1)通过在tat的外显子2产生一个83nt的缺失防止TAT表达；2)通过一个51nt的缺失防止S2 ORF表达；3)通过缺失rev外显子1中的单个碱基防止REV表达；和4)通过在gag区的第一个和第二个ATG密码子中插入T残基，从而将序列由ATG变为ATTG，防止gag的N末端部分表达。相对于野生型EIAV序列(登录号U01866)，这些缺失对应于以下缺失1)核苷酸5234-5316，首尾均包括在内；2)核苷酸5346-5396，首尾均包括在内；和3)核苷酸5538。插入的T残基(4)在核苷酸526和核苷酸543之后。使用本领域技术人员容易实施的技术进行这些改变。获得的载体pONY8.0Z不表达任何EIAV辅助蛋白或任何EIAV gag蛋白。
在第二步中，用增强的绿色荧光蛋白(eGFP)报告基因替换pONY8.0Z中存在的β-半乳糖苷酶报告基因，产生pONY8G。这可通过将对应于GFP基因的SacII-KpnI片段和pONY2.13GFP的侧翼序列(WO 99/32646)转移至用相同酶切割的pONY8.0Z中进行。
已经表明，叫做中央多嘌呤段的序列和中央终止序列(cPPT/CTS)的存在改善了基因通过HIV-1型载体传递至非分裂细胞的效率(Zennou等，Cell，2000年4月14日；101(2)173-85，Follenzi等，Nat Genet.2000年6月；25(2)217-22)。类似的EIAV顺式作用元件位于多聚酶编码区，并可作为功能元件如下通过使用PCR扩增由任何含有EIAV多聚酶编码区(例如pONY3.1，WO 99/32646)的质粒获得。PCR产物包括中央多嘌呤段和中央终止序列(CTS)。用于PCR反应的寡核苷酸引物是EIAV cPPT POSCAGGTTAT GTCGACGCTCTCATTACTTGTAACEIAV cPPT NEGCGAATGCGT GTCGACCATGTTCACCAGGGATTTTGXbaI的识别序列以粗体显示，并将其插入到pONY8G骨架中。在插入如上所述制备的cPPT/CTS PCR产物之前，修饰pONY8G，以去除已经存在于pONY8G载体中的中央终止序列(CTS)。这可通过将含pONY8.0Z的CTS和RRE区的SalI至ScaI片段亚克隆入用SalI和EcoRV消化连接制备的pSP72中实现。然后通过用KpnI和PpuMI消化提取CTS区，突出端用T4 DNA聚合酶处理‘平端’，接着再连接末端。然后使用SalI和NheI提取修饰的EIAV载体片段，并连接入用同样的酶消化连接制备的pONY8G中。此新EIAV载体叫做pONY8G del CTS。pONY8G del CTS具有两个XbaI位点，位于CMV-GFP表达盒侧翼，代表cPPT/CTS的PCR产物在用XbaI消化后可连接入部分消化后的任一个位点中。连接至这些位点产生具有或者正义或者反义的cPPT/CTS元件的质粒。其中cPPT/CTS在5′或3′-位置为正义(功能活性)的克隆分别叫做pONY8G 5′POS del CTS和pONY8G 3′POS del CTS。还按照与制备pONY8G 5′POS del CTS相似的策略制备了另一个叫做pONY8Z 5′POS del CTS的载体。因此，以相同的方式去除存在于pONY8.0Z中的CTS序列，以制备pONY8Zdel CTS，并将cPPT/CTS序列引入到恰好在pONY8Z del CTS的CMV启动子上游的唯一XbaI位点中。
通过用HIF-1α的编码区替换eGFP的编码区，由pONY8G 5′POSdel CTS产生pSMART CMV-HIF载体质粒。这可通过用SacII和NotI消化pONY8G 5′POS del CTS(SacII和NotI位点位于eGFP基因侧翼)并连接至由质粒AdApt HIF-1α-ires-GFP获得的SacII-NotI片段实现。按以上实施例2所述构建质粒AdApt HIF-1α-ires-GFP。
还制备了pONY8G 5′POS del CTS的另一个衍生物，以便获得在转导实验中用做‘阴性对照’的载体制备物。该载体叫做pSMARTCMV-空白型载体(图12)，通过用BsmBI和NotI消化pONY8G 5′POSdel CTS(BsmBI和NotI位点位于eGFP基因侧翼)然后再连接制备。根据由内部启动子产生的转录物的序列分析，预期该载体转导的细胞仅产生一个3氨基酸的肽。
使用磷酸钙沉淀法，通过用载体质粒pONY3.1(表达EIAVgag/pol蛋白)和包膜表达质粒pRV67(编码疱疹性口腔炎病毒蛋白G，VSV-G)中的任一种瞬时共转染293-T人胚肾细胞，获得上述的EIAV载体。
转染前24小时将293T细胞以每皿3.6×106细胞接种在装有10ml补加谷氨酰胺、非必需氨基酸和10％胎牛血清的DMEM的10cm培养皿中。在第二天下午进行转染，将细胞过夜温育，然后用补加丁酸钠(5mM)的6ml新鲜培养基替换原培养基。7小时后收集培养基，并将6ml未补加的新鲜培养基加入到细胞中。通过低速离心澄清收集的培养基，然后通过0.4μm滤膜过滤。
然后于4℃通过过夜低速离心(6,000g，JLAl0.500转子)浓缩载体颗粒，倾去上清液，留下管底部的沉淀。第二天早晨收获剩余的组织培养液，澄清并过滤。然后将其置于先前收集的沉淀顶部，再进行过夜离心。此后倾析上清液，排掉多余的液体。然后将沉淀重悬浮在配制缓冲液中，达到起始上清液体积的1/1000。然后以等份储存于-80℃。配制缓冲液(100ml)组织培养级水 28.65ml19.75mM Tris/HCl缓冲液pH7.019.75ml的0.1M溶液40mg/ml乳糖26.6ml的150mg/ml溶液37.5mM NaCl24.4ml的154mM溶液1mg/ml的人血清白蛋白a500μl的20％溶液
5μl/ml的硫酸鱼精蛋白b100μl的5mg/ml溶液a人血清白蛋白(20％)(Albuteinv，Alpha therapeutics UK Ltd，Thetford，Norfolk)。
b硫酸鱼精蛋白5mg/ml(Prosulf，CP Pharmaceuticals，Wrexham，UK)。
SED ID NO4中提供了pSMART CMV-HIF的序列。
SED ID NO5中提供了pSMART CMV-空白型的序列。实施例6使用Smartomics鉴定海马神经元中的基因如以上实施例1和2所述，低氧是中风(脑局部缺血)的重要组成部分。现在利用本发明(Smartomics)改善了对初级大鼠海马神经元中低氧作用激活或抑制的基因的寻找。这涉及通过实验性引入低氧反应的关键调节物，即低氧诱导因子1α(HIF-1α)，增强对低氧的天然反应。HIF-1α过表达与细胞接触低氧相组合使得可以检测出在单独的HIF-1α过表达或单独的低氧作用下尚不能检测的基因表达变化。
按照标准方法由胚胎大鼠建立初级大鼠海马神经元培养物(Dunnett SB，Bjorkland A(主编)1992，Neural Transplantation，APractical Approach，IRL Press)。简而言之，在妊娠第18天用0.7ml异荧烷麻醉记录怀孕时间的Wistar大鼠，并通过颈部脱位处死。取出子宫中的幼鼠并去头。解剖海马并在含DNAse(0.05％)和葡萄糖(2mM)的Hanks缓冲盐溶液(HBSS)中储存在冰上，然后在胰蛋白酶(0.1％)和DNAse(0.05％)中温育5分钟。温育后，通过加入大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI，0.1％)使胰蛋白酶失活，轻柔地研制溶液。通过离心(3,000rpm，5分钟)沉淀细胞并去除胰蛋白酶。然后用含SBTI和DNAse(0.05％)的HBSS清洗细胞两次，再沉淀，然后最终悬浮于含胎牛血清(10％)、谷氨酰胺(2mM)和庆大霉素(0.1mg/ml)的Dulbecco改良型Eagle培养基(DMEM)中。将细胞(3×106细胞/皿)平板接种在包被聚-D-赖氨酸(50μg/ml)和纤连蛋白附着促进肽(10μg/ml)的60mm皿上。将培养物放置在含5％CO2的37℃湿润培养箱中，平板接种后12小时，用补加B27和谷氨酰胺(2mM)的神经基础培养基(Brewer GJ，(1995)“无血清B27/神经基础培养基支持纹状体、黑质、隔膜、大脑皮质、小脑和齿状回的神经元差异生长”，Journal of NeuroscienceResearch 42674-83)替换50％的平板接种培养基。每两天用补加的神经基础培养基供给培养物，并在第3天体外转导。
在含聚凝胺(2μg/ml)的补加神经基础培养基中以0.5体积的典型培养基体积进行转导。转导开始后5小时，将培养基体积增加2倍，12小时后更换。按照以上详述的方法平行产生病毒pSMART CMV-HIF(携带HIF-1α基因；参见实施例5)、pSMART CMV-空白型(用作对照的空基因组；参见实施例5)和pONY8Z 5′POS del CTS(含β-半乳糖苷酶基因)。使用pONY8Z 5′POS del CTS计算D17细胞和海马神经元中的病毒滴度。通过对三种病毒制备物进行定量RT-PCR(Taqman)对比RNA包装信号，这种对比可以建立相对于pONY8Z5′POS del CTS的pSMART CMV-HIF和pSMART CMV-空白型病毒的生物滴度。所有的转导都使用对两种病毒大约相等的感染复数(MOI)进行，用于每个实验的MOI至少为10。
转导后36小时，将相同的培养皿分放入两个单独的培养箱中，一个为37℃、5％CO2、95％空气(＝正常氧含量)，而另一个为37℃、5％CO2、94.9％氮气、0.1％氧(＝低氧)。在这些条件下培养6小时后，由培养箱中取出培养皿，防止于冰冷的平台上，用冷PBS清洗，使用RNazol B(Tel-Test，Inc；由Biogenesis Ltd经销)按照厂商的说明提取总RNA。
实验提供4个样品，其差异仅在于它们用慢病毒和/或低氧处理，如下所示样品慢病毒表达基因氧条件1 pSMART CMV-空白型 无 正常氧含量2 pSMART CMV-空白型 无 低氧3 pSMART CMV-HIF HIF-1α 正常氧含量4 pSMART CMV-HIF HIF-1α 低氧可以通过对比这些样品之间的基因表达模式实现基因寻找。按照本领域公开的常规方法，人们应对比细胞类型1和细胞类型2。通过实施本发明(Smartomics)，看出其它几种可能性。首先，可以对比细胞类型1和3。在此，对涉及低氧反应的关键分子过表达的刺激可以超出对低氧的天然反应，如细胞类型2所见。其次，可以对比细胞类型1和4。在此情况下，对低氧的天然反应通过过表达涉及低氧反应的关键分子而被放大或加强。
使用Research Genetics Rat GeneFilter GF300(Research Genetics，Huntsville，AL)获得分离自4个样品的RNA的总体mRNA表达模式。该方法使用预先制备的DNA尼龙阵列，所述DNA得自含基因的3′末端的I.M.A.G.E./LLNL cDNA克隆。所述阵列包括5,000个以上的基因，含有一系列的特征水平，包括代表未注解的EST的序列或未知功能的cDNA序列。
放射标记由上述4个样品中提取的RNA，并与单独拷贝的Research Genetics Rat GeneFilter GF300杂交。对生产商提供的方法(http//www.resgen.com/products/GF200_protocol.php3)进行以下修改后进行操作将RNAsin加入到标记反应物中，在标记后通过与45mMEDTA/18mM NaOH于65℃温育30分钟使mRNA/cDNA杂交体变性。
使用Molecular Dynamics Storm磷成像仪获得杂交阵列的图象。然后按照前述方法由阵列中剥离RNA。为确保重现性，用相同的RNA样品重复该方法。然后输入两组数据，并使用Research GeneticsPathways 3.0软件按照Pathways 3.0说明书的解释进行分析。以下概述该分析的关键方面程序结构设置“条件对”模式用于同时分析多个实验。在此情况下一个条件等于一个样品(例如样品3，在正常氧含量下过表达HIF-1α)。归一化设置按照Pathways 3.0说明书的解释选择数据点归一化。该技术通过将所有的样品强度除以阵列上所有克隆(对照点除外)的平均样品强度产生归一化强度。两个实验作为单独的归一化组处理，使得同一实验不同阵列之间的杂交信号总体差异得到校正。对比分析条件1(即样品1)对应于用对照慢病毒转导并置于正常氧浓度(正常氧含量)下的细胞。该条件在与条件2、3和4(即样品2、3和4)的成对对比中用作参比条件。
以此方式对Research Genetics GF300阵列上存在的所有基因进行对比。通过对比这些条件，该分析判断两个实验的数据。4个代表性的已知HIF-1α/低氧调节基因的结果就发现的真实低氧调节基因来说，证实在低氧细胞中过表达HIF-1α优于使用非转导低氧细胞或在正常氧含量细胞中过表达HIF-1α，本领域已知受低氧和HIF-1α调节的基因的结果示于以下。比率表示为归一化强度的平均比率。
表2.已知的HIF-1α/低氧调节基因的反应
列于表2的全部4个基因都是本领域已知的低氧调节基因，并已经RNA印迹分析证实在HIF1-α敲除时下调(Iyer等，(1998)，低氧诱导因子1α对O2稳态的细胞和发育控制，Genes Dev 12149-162)。在烯醇化酶1α的情况下，通过阵列杂交未检测到正常氧含量下对低氧或Hif-1α过表达的反应。仅在Hif-1α于低氧下过表达时检测到表达水平比正常氧含量增加。在葡萄糖转运蛋白的情况下，低氧下Hif-1α过表达使检测的低氧反应增加。在甘油醛-3-磷酸脱氢酶和乳酸脱氢酶A的情况下，检测到低氧反应，但正常氧含量下Hif-1α过表达增加反应，低氧下Hif-1α过表达甚至更是如此。过滤设置然后进行数据过滤，以减少数据组，并选择以上详述的三对对比中至少一对的表达比率在2.0以上的基因。使用最小0.2的IntensityII滤器将在所有4种条件下信号强度都低的基因自动去除。使用Students t检验滤器(90％可信度)将在两个实验中都以重复方式不反应的基因自动去除。
结果以各个基因的表达模式输出，显示归一化信号强度和表达比率。Pathways 3.0分析的一个重要优势在于显示的原始图象的各个点的高放大倍数微型图象。这使得可以目测鉴别确实覆盖包含杂交阵列点区的检测部位。已知基因和新基因的注解就发现的新低氧调节基因来说，证实在低氧细胞中过表达HIF-1α优于使用非转导低氧细胞或在正常氧含量细胞中过表达HIF-1α，本领域已知受低氧调节但不受HIF-1α调节的基因和未注解基因的结果示于以下。比率表示为归一化强度的平均比率。
表3.新HIF-1α调节基因的反应
a代表性的金属硫蛋白EST在阵列上点样两次，所以数据是两个点的平均值。
由文献可知金属硫蛋白-I受低氧调节(Murphy等(1999)，低氧激活金属硫蛋白基因表达涉及金属效应元件和金属转录因子-1，CancerRes 59(6)1315-22)，但不知道受HIF-1α调节。表3的数据显示，对低氧下HIF-1α过表达的反应远超过对单独低氧的反应和对正常氧含量下HIF-1α过表达的反应。该EST(表达序列标签)是完全没有注解的DNA序列。同样，表3的数据显示，对低氧下HIF-1α过表达的反应远超过对单独低氧的反应和对正常氧含量下HIF-1α过表达的反应。
该数据显示，上述方法使已知基因的其它功能注解和功能未知的完全未注解新基因的功能注解成为可能。实施例7使用Smartomis鉴定细胞因子调节的基因嗜酸性粒细胞与诸如哮喘的变应性疾病有关，哮喘的特征为在患病组织有大量的嗜酸性粒细胞。IL-5是涉及嗜酸性粒细胞分化和存活的关键细胞因子。IL-5刺激嗜酸性粒细胞生成作用，并由骨髓释放，还延长了外周血嗜酸性粒细胞的存活。因此，IL-5在哮喘的发生机理中可能扮演起因的角色。
在IL-5刺激作用下激活的基因作为哮喘治疗的潜在标靶引人瞩目。
代表本领域发展水平的简单方法涉及采用嗜酸性粒细胞群，将其分为两组，一组置于存在IL5的条件下，而另一组置于没有IL5的条件下。然后将两组的RNA或蛋白用于合适的差异分析中。目标是鉴定在IL5存在的条件(IL5+)下存在但在无IL5培养基保持细胞(IL5-)中不存在的蛋白或cDNA。
用于在嗜酸性粒细胞中鉴定IL5诱导基因和蛋白的本发明试图放大IL5+和IL5-之间的差异，以便增加信噪比。这可以通过将IL5受体基因传递至处于过表达形态的嗜酸性粒细胞中来增加对IL5信号的反应实现。
IL5α受体以两种同种型存在，一种为起IL5激动剂作用的膜结合形式，一种为起IL5拮抗剂作用的溶解形式。因为细胞通常表达两种同种型，所以似乎它们以保持二者之间平衡的方式调节其反应。一种或另一种的表达应当以一种不可能仅改变外源IL5浓度的方式‘强行影响’嗜酸性粒细胞的反应。
预期膜结合形式的IL5α受体过表达应使细胞对细胞因子反应过强。在差异筛选中，该形式受体的过表达将导致IL-5特异性cDNA或蛋白水平增加。检测药物开发靶的可能性因此而增加。本发明应用于该情况时包括对比在IL5配体不存在时没有过表达膜结合形式的IL5α受体的嗜酸性粒细胞和接触IL5并过表达膜结合形式的IL5α受体的嗜酸性粒细胞。
同样，预期起IL-5拮抗剂作用的溶解形式受体过表达将减弱嗜酸性粒细胞对IL-5刺激的反应。对比在IL5配体不存在时过表达溶解形式的IL5α受体的嗜酸性粒细胞和接触IL5(但不过表达溶解IL5α受体)的嗜酸性粒细胞的表达模式。这些方法中的任一种都可用于辨别在IL5作用下表达、其产物是治疗诸如哮喘的变应性疾病的潜在标靶的基因。
可以使用任何表达IL5受体的细胞系，例如AML14.3D10、TF1.8或HL-60。可通过各种方式实现膜结合形式和溶解形式的IL5α受体的传递和表达。例如，可以用以上实施例和以下实施例8描述的表达构建物转染或转导嗜酸性粒细胞。
以如下所述的众多方式对比转导和未转导嗜酸性粒细胞群的基因表达，以获得在IL5作用下表达的基因读数。对比IL5不存在时用表达溶解性IL5α受体的构建物转染的细胞和IL5存在时的未转染细胞。对比IL5存在时用表达膜结合IL5α受体的构建物转染的细胞和IL5不存在时的未转染细胞。
制备总RNA样品用于差异基因表达分析。这些样品或者放射标记或者荧光标记，并与固相支持物上的cDNA阵列杂交。IL5上调的基因产生数量上更强的杂交信号。阵列方案可以包括尼龙或玻璃支持物的任一种，综述于Bowtell，1999。涉及玻璃支持物方案的方法学细节详述于Eisen和Brown，1999。在此情况下使用荧光标记探针，并使用激光共聚焦扫描仪检测杂交。对于尼龙支持物方法，包括点印迹和杂交的标准分子生物学方法详述于Molecular CloningALaboratory Manual，Sambrook，J等，Cold Spring Harbor LaboratoryPress。在此情况下，放射标记对比的RNA样品，并使用磷成像仪检测杂交。
阵列可购自Research Genetics，Huntsville，AL，或使用通过扣除克隆产生的cDNA克隆自己制作(PCR选择法，由Clontech，Palo Alto，CA拥有)。制作包括应用点阵机器人(MicroGrid，BioRobotics Ltd，Cambridge，UK)。
可以将分离自细胞的RNA反转录为cDNA，并由此筛选cDNA。或者，如上所述，可以使用蛋白质组学方法(例如双向凝胶电泳)鉴定差异表达产物。可以参考B1ackstock和Weir(1999)和其中提到的参考文献，其中论述了各种各样的蛋白质组学技术。
还可以使用以上方法测定对IL5起反应的其它细胞(例如嗜碱性粒细胞和骨髓前体细胞)的差异表达模式。还可以使用通常对IL5无反应的其它细胞，只要IL5的β链与α链共表达。对此，应当注意的是，IL-5、IL-3和GM-CSF受体共用相同的β链。实施例8过表达人IL5αR同种型本实施例描述了两种EIAV载体(pONY8.1SMIL5Rm和pONY8.1SMIL5Rs)的产生，这两种载体能够由内部CMV启动子表达IL5α膜受体(pONY8.1SMIL5Rm)或IL5α溶解性受体(pONY8.1SMIL5Rs)。人IL5αR的登录号为A26251。。
为制备pONY8.1SMIL5Rm，由分离自人外周血嗜酸性粒细胞的mRNA产生的cDNA对IL5αR进行PCR扩增。PCR引物为下述的IL5R1和IL5R2。它们包含SbfI克隆位点，并使用Kozak序列增强翻译。该方式产生的PCR产物包含位于IL5αR可读框侧翼的SbfI克隆位点。用SbfI切割所述PCR引物，并插入到用SbfI切割的pONY8.1SM中。重要的是检查IL5αR以正确的方向插入。该方式产生的质粒叫做pONY8.1SMIL5Rm。
该构建物表达野生型IL5αR。修饰IL5αR可读框，以制备表达溶解形式的IL5αR的pONY8.1SMIL5Rs。
这可通过PCR扩增进行，以去除所述受体的C末端(表位标记的溶解性人IL-5受体，亲和交联标记、IL-5结合和生物活性，BrownPM，Tagari P，Rowan KR，Yu VL，O′Neill GP，Middaugh CR，Sanyal G，Ford-Hutchinson AW，Nicholson DW)。前332个氨基酸保留，同时去除包含跨膜区和胞内区的后88个氨基酸。PCR引物为下述的IL5R1和IL5R3。它们包含SbfI克隆位点，并使用Kozak序列增强翻译。该方式产生的PCR产物包含位于IL5αR可读框侧翼的SbfI克隆位点。用SbfI切割所述PCR引物，并插入到用SbfI切割的pONY8.1SM中。重要的是检查IL5αR以正确的方向插入。该方式产生的质粒叫做pONY8.1SMIL5Rs。IL5R1引物ATCGCCTGCAGG ATGATCATCGTGGCGCATGTATTACSbfI位点＝下划线Kozak序列＝粗斜体ATG起始密码子＝下划线斜体IL5R2引物ACTGCCTGCAGGTCAAAACACAGAATCCTCCAGGGTCSbfI位点＝下划线IL5R3引物ACTGCCTGCAGGTCATCCCACATAAATAGGTTGGCTCSbfI位点＝下划线其它实施例·在多巴胺能细胞系中过表达抗凋亡基因(即Bcl-2、Bcl-x)产生抗诸如MPTP的神经毒素的神经保护。因为最有代表性的多巴胺能神经元(初级细胞)为培养的有丝分裂期后细胞，所以可以使用慢病毒载体将所述基因引入这些神经元中并过表达，然后筛选发生差异表达的细胞标靶。
·还可以通过在神经元中过表达(凋亡)死亡受体如Fas，并提供限制量的配体(FasL)，鉴定抗凋亡标靶。这些细胞将通过诱导其神经保护基因试图存活。
·可以在细胞系中过表达类似的生长因子(NGF、GDNF等)及其受体，使所述细胞对生长因子的存活作用敏感。
·在几种不同的神经系统伤害模型中，刺激性伤害神经系统之后表达诸如HSP70的热激蛋白(HSP)及其过量产生产生保护作用。HSP涉及脑部局部缺血、神经变性疾病、癫痫和创伤。HSP是通常结合热激因子(HSF)的分子伴侣，其在神经系统损伤后于细胞溶胶中解离、磷酸化并三聚化，然后进入细胞核中，它们在其中结合热激基因启动子中的热激元件(HSE)，导致其转录激活。因此，HSP在神经元、神经胶质或内皮细胞中的过表达可以和Hif1相似的方式进行差异筛选。
·APP(淀粉样前体蛋白)为Aβ肽前体的一种跨膜蛋白，于Alzheimer病的神经斑中发现。已鉴定出引起某些家族(早期发生)形式疾病的突变。
·早老蛋白1和2对加工APP和某些其它膜蛋白很重要的跨膜蛋白。已经在某些家族形式疾病中分离出几种突变。
·α-synuclein一种与神经元突触结合的细胞质蛋白。已经在一些Parkinson病家系、部分Lewy体(Parkinson病的胞内病灶特征，还见于Alzheimer病和Lewy体痴呆)中发现了突变。
·Tau一种微管结合蛋白。已经在与染色体17连锁的Parkinson综合征前颞性痴呆和Pick病中发现突变。
·Parkin未知功能的蛋白，与遍在蛋白在N端具有一定同源性，在C端具有环指基序。在青少年型Parkinson病中鉴定出缺失。
·遍在蛋白(UCH-L1)形成部分Lewy体的巯基蛋白酶。已经在德国Parkinson病家系中鉴定出突变。
以上说明书中提及的所有出版物都通过引用结合到本文中。在不背离本发明范围和精神的情况下对本发明所述方法和系统进行各种修改和变化对本领域技术人员来说是显而易见的。尽管结合特别优选的实施方案描述了本发明，但显然要求保护的本发明不应当不恰当地限于这些具体的实施方案。实际上，用于实施本发明的所述模式的各种修改对分子生物学或相关领域技术人员是显而易见的，属于以下权利要求的范围。
参考文献Blackstock和Weir(1999)Trends in Biotech.17121-126；Bowtell(1999)Nature Genetics 2125-32；
Eisen和Brown(1999)，Methods Enymol.303179-205Griffiths L等，(2000)，Gene Therapy 7255-262；Jorgensen等，(1999)，Electrophoresis 2230-40；Kirschbaum和Kozian(1999)，Trends in Biotech 17；73-78；Mitophanous等，(1999)，Gene Therapy 61808-1818；Pardee和Liang(1992)，Science 257；967-971；Rabilloud等，(1997)，Electrophoresis 18307-316；Soneoka等，(1995)，Nucleic Acids Res.23628-33；Wilkinson等，(1995)，Plant Mol Biol 61097-108；Zhang等，(1998)，Mol Biotechnol 10(2)155-65；Zhao等，(1999)，J Biotechnol.73(1)35-41。
序列表SEQ ID NO1ires-GFP DNA片段的核苷酸序列CTAGAGTGTGATTTTAAGGGCGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCGCACTAGAGGAATTCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGTGTTTGTCTATATGTGATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTAGTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGAATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAGCTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAAGCGGCCGCGACTSEQ ID NO2含人HIF-1α蛋白编码序列的DNA片段的核苷酸序列CTAGCCGTAGAATCCGACCGATTCACCATGGAGGGCGCCGGCGGCGCGAACGACAAGAAAAAGATAAGTTCTGAACGTCGAAAAGAAAAGTCTCGAGATGCAGCCAGATCTCGGCGAAGTAAAGAATCTGAAGTTTTTTATGAGCTTGCTCATCAGTTGCCACTTCCACATAATGTGAGTTCGCATCTTGATAAGGCCTCTGTGATGAGGCTTACCATCAGCTATTTGCGTGTGAGGAAACTTCTGGATGCTGGTGATTTGGATATTGAAGATGACATGAAAGCACAGATGAATTGCTTTTATTTGAAAGCCTTGGATGGTTTTGTTATGGTTCTCACAGATGATGGTGACATGATTTACATTTCTGATAATGTGAACAAATACATGGGATTAACTCAGTTTGAACTAACTGGACACAGTGTGTTTGATTTTACTCATCCATGTGACCATGAGGAAATGAGAGAAATGCTTACACACAGAAATGGCCTTGTGAAAAAGGGTAAAGAACAAAACACACAGCGAAGCTTTTTTCTCAGAATGAAGTGTACCCTAACTAGCCGAGGAAGAACTATGAACATAAAGTCTGCAACATGGAAGGTATTGCACTGCACAGGCCACATTCACGTATATGATACCAACAGTAACCAACCTCAGTGTGGGTATAAGAAACCACCTATGACCTGCTTGGTGCTGATTTGTGAACCCATTCCTCACCCATCAAATATTGAAATTCCTTTAGATAGCAAGACTTTCCTCAGTCGACACAGCCTGGATATGAAATTTTCTTATTGTGATGAAAGAATTACCGAATTGATGGGATATGAGCCAGAAGAACTTTTAGGCCGCTCAATTTATGAATATTATCATGCTTTGGACTCTGATCATCTGACCAAAACTCATCATGATATGTTTACTAAAGGACAAGTCACCACAGGACAGTACAGGATGCTTGCCAAAAGAGGTGGATATGTCTGGGTTGAAACTCAAGCAACTGTCATATATAACACCAAGAATTCTCAACCACAGTGCATTGTATGTGTGAATTACGTTGTGAGTGGTATTATTCAGCACGACTTGATTTTCTCCCTTCAACAAACAGAATGTGTCCTTAAACCGGTTGAATCTTCAGATATGAAAATGACTCAGCTATTCACCAAAGTTGAATCAGAAGATACAAGTAGCCTCTTTGACAAACTTAAGAAGGAACCTGATGCTTTAACTTTGCTGGCCCCAGCCGCTGGAGACACAATCATATCTTTAGATTTTGGCAGCAACGACACAGAAACTGATGACCAGCAACTTGAGGAAGTACCATTATATAATGATGTAATGCTCCCCTCACCCAACGAAAAATTACAGAATATAAATTTGGCAATGTCTCCATTACCCACCGCTGAAACGCCAAAGCCACTTCGAAGTAGTGCTGACCCTGCACTCAATCAAGAAGTTGCATTAAAATTAGAACCAAATCCAGAGTCACTGGAACTTTCTTTTACCATGCCCCAGATTCAGGATCAGACACCTAGTCCTTCCGATGGAAGCACTAGACAAAGTTCACCTGAGCCTAATAGTCCCAGTGAATATTGTTTTTATGTGGATAGTGATATGGTCAATGAATTCAAGTTGGAATTGGTAGAAAAACTTTTTGCTGAAGACACAGAAGCAAAGAACCCATTTTCTACTCAGGACACAGATTTAGACTTGGAGATGTTAGCTCCCTATATCCCAATGGATGATGACTTCCAGTTACGTTCCTTCGATCAGTTGTCACCATTAGAAAGCAGTTCCGCAAGCCCTGAAAGCGCAAGTCCTCAAAGCACAGTTACAGTATTCCAGCAGACTCAAATACAAGAACCTACTGCTAATGCCACCACTACCACTGCCACCACTGATGAATTAAAAACAGTGACAAAAGACCGTATGGAAGACATTAAAATATTGATTGCATCTCCATCTCCTACCCACATACATAAAGAAACTACTAGTGCCACATCATCACCATATAGAGATACTCAAAGTCGGACAGCCTCACCAAACAGAGCAGGAAAAGGAGTCATAGAACAGACAGAAAAATCTCATCCAAGAAGCCCTAACGTGTTATCTGTCGCTTTGAGTCAAAGAACTACAGTTCCTGAGGAAGAACTAAATCCAAAGATACTAGCTTTGCAGAATGCTCAGAGAAAGCGAAAAATGGAACATGATGGTTCACTTTTTCAAGCAGTAGGAATTGGAACATTATTACAGCAGCCAGACGATCATGCAGCTACTACATCACTTTCTTGGAAACGTGTAAAAGGATGCAAATCTAGTGAACAGAATGGAATGGAGCAAAAGACAATTATTTTAATACCCTCTGATTTAGCATGTAGACTGCTGGGGCAATCAATGGATGAAAGTGGATTACCACAGCTGACCAGTTATGATTGTGAAGTTAATGCTCCTATACAAGGCAGCAGAAACCTACTGCAGGGTGAAGAATTACTCAGAGCTTTGGATCAAGTTAACTGAGCGGATCCGACGGGGATCCTSEQ ID NO3含人EPAS1蛋白编码序列的DNA片段的核苷酸序列AGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCAGCGACAATGACAGCTGACAAGGAGAAGAAAAGGAGTAGCTCGGAGAGGAGGAAGGAGAAGTCCCGGGATGCTGCGCGGTGCCGGCGGAGCAAGGAGACGGAGGTGTTCTATGAGCTGGCCCATGAGCTGCCTCTGCCCCACAGTGTGAGCTCCCATCTGGACAAGGCCTCCATCATGCGACTGGAAATCAGCTTCCTGCGAACACACAAGCTCCTCTCCTCAGTTTGCTCTGAAAACGAGTCCGAAGCCGAAGCTGACCAGCAGATGGACAACTTGTACCTGAAAGCCTTGGAGGGTTTCATTGCCGTGGTGACCCAAGATGGCGACATGATCTTTCTGTCAGAAAACATCAGCAAGTTCATGGGACTTACACAGGTGGAGCTAACAGGACATAGTATCTTTGACTTCACTCATCCCTGCGACCATGAGGAGATTCGTGAGAACCTGAGTCTCAAAAATGGCTCTGGTTTTGGGAAAAAAAGCAAAGACATGTCCACAGAGCGGGACTTCTTCATGAGGATGAAGTGCACGGTCACCAACAGAGGCCGTACTGTCAACCTCAAGTCAGCCACCTGGAAGGTCTTGCACTGCACGGGCCAGGTGAAAGTCTACAACAACTGCCCTCCTCACAATAGTCTGTGTGGCTACAAGGAGCCCCTGCTGTCCTGCCTCATCATCATGTGTGAACCAATCCAGCACCCATCCCACATGGACATCCCCCTGGATAGCAAGACCTTCCTGAGCCGCCACAGCATGGACATGAAGTTCACCTACTGTGATGACAGAATCACAGAACTGATTGGTTACCACCCTGAGGAGCTGCTTGGCCGCTCAGCCTATGAATTCTACCATGCGCTAGACTCCGAGAACATGACCAAGAGTCACCAGAACTTGTGCACCAAGGGTCAGGTAGTAAGTGGCCAGTACCGGATGCTCGCAAAGCATGGGGGCTACGTGTGGCTGGAGACCCAGGGGACGGTCATCTACAACCCTCGCAACCTGCAGCCCCAGTGCATCATGTGTGTCAACTACGTCCTGAGTGAGATTGAGAAGAATGACGTGGTGTTCTCCATGGACCAGACTGAATCCCTGTTCAAGCCCCACCTGATGGCCATGAACAGCATCTTTGATAGCAGTGGCAAGGGGGCTGTGTCTGAGAAGAGTAACTTCCTATTCACCAAGCTAAAGGAGGAGCCCGAGGAGCTGGCCCAGTGGCTCCCACCCCAGGAGACGCCATCATCTCTCTGGATTTCGGGAATTCAGAACTTCGAGGAGTCCTCAGCCTATGGCAAGGCCATCCTGCCCCCGAGCCAGCCATGGGCCACGGAGTTGAGGAGCCACAGCACCCAGAGCGAGGCTGGGAGCCTGCCTGCCTTCACCGTGCCCCAGGCAGCTGCCCCGGGCAGCACCACCCCCAGTGCCACCAGCAGCAGCAGCAGCTGCTCCACGCCCAATAGCCCTGAAGACTATTACACATCTTTGGATAACGACCTGAAGATTGAAGTGATTGAGAAGCTCTTCGCCATGGACACAGAGGCCAAGGACCAATGCAGTACCCAGACGGATTTCAATGAGCTGGACTTGGAGACACTGGCACCCTATATCCCCATGGACGGGGAAGACTTCCAGCTAAGCCCCATCTGCCCCGAGGAGCGGCTCTTGGCGGAGAACCCACAGTCCACCCCCCAGCACTGCTTCAGTGCCATGACAAACATCTTCCAGCCACTGGCCCCTGTAGCCCCGCACAGTCCCTTCCTCCTGGACAAGTTTCAGCAGCAGCTGGAGAGCAAGAAGACAGAGCCCGAGCACCGGCCCATGTCCTCCATCTTCTTTGATGCCGGAAGCAAAGCATCCCTGCCACCGTGCTGTGGCCAGGCCAGCACCCCTCTCTCTTCCATGGGGGGCAGATCCAATACCCAGTGGCCCCCAGATCCACCATTACATTTTGGGCCCACAAAGTGGGCCGTCGGGGATCAGCGCACAGAGTTCTTGGGAGCAGCGCCGTTGGGGCCCCCTGTCTCTCCACCCCATGTCTCCACCTTCAAGACAAGGTCTGCAAAGGGTTTTGGGGCTCGAGGCCCAGACGTGCTGAGTCCGGCCATGGTAGCCCTCTCCAACAAGCTGAAGCTGAAGCGACAGCTGGAGTATGAAGAGCAAGCCTTCCAGGACCTGAGCGGGGGGGACCCACCTGGTGGCAGCACCTCACATTTGATGTGGAAACGGATGAAGAACCTCAGGGGTGGGAGCTGCCCTTTGATGCCGGACAAGCCACTGAGCGCAAATGTACCCAATGATAAGTTCACCCAAAACCCCATGAGGGGCCTGGGCCATCCCCTGAGACATCTGCCGCTGCCACAGCCTCCATCTGCCATCAGTCCCGGGGAGAACAGCAAGAGCAGGTTCCCCCCACAGTGCTACGCCACCCAGTACCAGGACTACAGCCTGTCGTCAGCCCACAAGGTGTCAGGCATGGCAAGCCGGCTGCTCGGGCCCTCATTTGAGTCCTACCTGCTGCCCGAACTGACCAGATATGACTGTGAGGTGAACGTGCCCGTGCTGGGAAGCTCCACGCTCCTGCAAGGAGGGGACCTCCTCAGAGCCCTGGACCAGGCCACCTGAGCCAGGCCTTCTACCTGGGCAGCACCTCTGCCCACGCCGAGCCCTATGCAGTCTCGGCCGCAAGCTATCAGATCTGCCGGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTCGATAAGCCAGGTTSEQ ID NO4pSMART CMV-HIF的核苷酸序列1AGATCTTGAA TAATAAAATG TGTGTTTGTC CGAAATACGC GTTTTGAGAT51TTCTGTCGCC GACTAAATTC ATGTCGCGCG ATAGTGGTGT TTATCGCCGA101TAGAGATGGC GATATTGGAA AAATTGATAT TTGAAAATAT GGCATATTGA151AAATGTCGCC GATGTGAGTT TCTGTGTAAC TGATATCGCC ATTTTTCCAA201AAGTGATTTT TGGGCATACG CGATATCTGG CGATAGCGCT TATATCGTTT251ACGGGGGATG GCGATAGACG ACTTTGGTGA CTTGGGCGAT TCTGTGTGTC301GCAAATATCG CAGTTTCGAT ATAGGTGACA GACGATATGA GGCTATATCG351CCGATAGAGG CGACATCAAG CTGGCACATG GCCAATGCAT ATCGATCTAT401ACATTGAATC AATATTGGCC ATTAGCCATA TTATTCATTG GTTATATAGC451ATAAATCAAT ATTGGCTATT GGCCATTGCA TACGTTGTAT CCATATCGTA501ATATGTACAT TTATATTGGC TCATGTCCAA CATTACCGCC ATGTTGACAT551TGATTATTGA CTAGTTATTA ATAGTAATCA ATTACGGGGT CATTAGTTCA601TAGCCCATAT ATGGAGTTCC GCGTTACATA ACTTACGGTA AATGGCCCGC651CTGGCTGACC GCCCAACGAC CCCCGCCCAT TGACGTCAAT AATGACGTAT701GTTCCCATAG TAACGCCAAT AGGGACTTTC CATTGACGTC AATGGGTGGA751GTATTTACGG TAAACTGCCC ACTTGGCAGT ACATCAAGTG TATCATATGC801CAAGTCCGCC CCCTATTGAC GTCAATGACG GTAAATGGCC 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权利要求
1.一种用于鉴定参与细胞活动的遗传因子的差异表达筛选方法，该方法包括对比(a)在第一种目的细胞中的基因表达；和(b)在第二种目的细胞中的基因表达，该细胞由于引入控制多肽表达的异源核酸而包含相对于生理水平来说水平改变的参与细胞活动的生物分子；以及鉴定差异表达的遗传因子，其中在至少两种与所述细胞活动有关的不同环境条件下对比所述第一种和/或第二种目的细胞中的基因表达。
2.按照权利要求1的方法，其中在至少两种与所述细胞活动有关的不同环境条件下对比所述第一种和第二种目的细胞中的基因表达。
3.按照权利要求1或权利要求2的方法，该方法包括对比(a)在第一种目的细胞中的基因表达；(b)在接触了第一种类型环境变化的第一种目的细胞中的基因表达；(c)在接触了第二种类型环境变化的第一种目的细胞中的基因表达；(d)在接触了或者没有接触所述第一种和/或第二种类型环境变化的条件下在第二种目的细胞中的基因表达，该细胞由于引入控制多肽表达的异源核酸而包含相对于生理水平来说水平改变的生物分子，该分子的活性对b)和c)项所述的环境变化中的一种或两种产生反应；以及鉴定差异表达的遗传因子。
4.按照权利要求1或权利要求2的方法，其中所述不同的环境条件是不同水平的生物信号。
5.按照权利要求4的方法，该方法包括对比(a)在第一种目的细胞中的基因表达；(b)在接触了与细胞活动相关的生物信号的第一种目的细胞中的基因表达，其中所述生物信号为第一种水平；(c)在触了与细胞活动相关的生物信号的第一种目的细胞中的基因表达，其中所述生物信号为第二种水平；和(d)在第二种目的细胞中的基因表达，该细胞由于引入控制多肽表达的异源核酸而包含相对于生理水平来说水平改变的生物分子，该分子的活性对所述生物信号产生反应，其中没有所述信号或者所述信号为第一种水平或第二种水平；以及鉴定差异表达的遗传因子。
6.按照权利要求4的方法，该方法包括对比(a)在第一种目的细胞中的基因表达；(b)在第一种目的细胞中的基因表达，其中该细胞接触了与所述细胞活动相关的生物信号；(c)在第一种目的细胞中的基因表达，该细胞由于引入控制多肽表达的异源核酸而包含相对于生理水平来说水平改变的生物分子，该分子的活性对所述生物信号产生反应，其中所述水平改变的生物分子为第一种水平，而其中所述生物信号存在或者不存在；(d)在第二种目的细胞中的基因表达；(e)在第二种目的细胞中的基因表达，其中该细胞接触了与所述细胞活动相关的生物信号；(f)在第二种目的细胞中的基因表达，该细胞由于引入控制所述多肽表达的异源核酸而包含相对于生理水平来说水平改变的生物分子，其中所述水平改变的生物分子为第二种水平，而其中所述生物信号存在或者不存在；以及鉴定差异表达的遗传因子。
7.按照权利要求4的方法，该方法包括对比(a)在第一种目的细胞中的基因表达；(b)在第一种目的细胞中的基因表达，其中该细胞接触了与所述细胞活动相关的生物信号；(c)在第一种目的细胞中的基因表达，该细胞由于引入控制第一种多肽表达的异源核酸而包含相对于生理水平来说水平改变的第一种生物分子，该分子的活性对所述生物信号产生反应，其中所述生物信号存在或者不存在；(d)在第二种目的细胞中的基因表达；(e)在第二种目的细胞中的基因表达，其中该细胞接触了与所述细胞活动相关的生物信号；(f)在第二种目的细胞中的基因表达，该细胞由于引入控制第二种多肽表达的异源核酸而包含相对于生理水平来说水平改变的第二种生物分子，其中所述生物信号存在或者不存在；以及鉴定差异表达的遗传因子。
8.一种用于鉴定其表达受信号调控的基因或基因产物的差异表达筛选方法，该方法包括在两种不同的信号水平上对比(a)在第一种目的细胞中的基因表达，其中所述信号为第一种水平；和(b)在第二种目的细胞中的基因表达，该细胞由于引入异源核酸而包含相对于生理水平来说水平改变的生物分子，该分子活性对所述信号产生反应，其中所述信号为第二种水平；以及鉴定差异表达的基因或基因产物。
9.按照任一项前述权利要求的方法，其中所述第一种和第二种细胞为不同的细胞类型。
10.按照任一项前述权利要求的方法，其中所述生物分子水平相对于生理水平提高。
11.按照权利要求1-9任一项的方法，其中所述生物分子水平相对于生理水平降低。
12.按照任一项前述权利要求的方法，其中所述生物分子和所述多肽相同。
13.按照任一项前述权利要求的方法，其中所述异源核酸通过病毒载体引入到所述细胞中。
14.按照权利要求13的方法，其中所述病毒载体为逆转录病毒、慢病毒(如马传染性贫血病病毒(EIAV)或1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1))、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和痘病毒(如昆虫痘病毒)。
15.按照任一项前述权利要求的方法，其中通过蛋白质组学技术测定基因表达。
16.按照权利要求1-14任一项的方法，其中使用基因组或cDNA技术测定基因表达。
17.按照任一项前述权利要求的方法，其中所述第一种目的细胞具有正常生理水平的所述生物分子。
18.按照任一项前述权利要求的方法，其中所述多肽参与所述细胞活动。
19.按照任一项前述权利要求的方法，其中所述第一种细胞得自正常患者，而所述第二种细胞得自患病患者。
20.按照权利要求1-18任一项的方法，其中所述第一种细胞得自患病患者，而所述第二种细胞得自相同患病患者。
21.按照权利要求1-7和9-20任一项的方法，其中所述遗传因子为基因、基因产物或调节元件。
22.一种用于鉴定参与疾病过程的基因产物的差异表达筛选方法，该方法包括(i)对比以下细胞的基因表达(a)第一种目的细胞；和(b)第二种目的细胞；(ii)对比以下细胞的基因表达(a)所述第一种目的细胞；和(b)第三种目的细胞，该细胞由于将控制侯选基因产物表达的异源核酸引入到所述第一种细胞中而包含相对于生理水平来说水平改变的所述侯选基因产物；以及(iii)选择使所述第三种目的细胞中的第二种基因产物的表达水平相对于所述第一种目的细胞发生改变的侯选基因产物，所述第二种目的细胞中的第二种基因产物相对于所述第一种目的细胞的表达水平也发生了改变。
23.按照权利要求22的方法，其中所述侯选基因产物为多肽。
24.按照权利要求22或23的方法，其中通过使用核酸技术鉴定其水平在所述第一种目的细胞和第二种目的细胞之间以及所述第一种目的细胞和第三种目的细胞之间发生改变的mRNA转录物，从而进行基因表达对比。
25.按照权利要求22或23的方法，其中通过使用蛋白分析技术鉴定其水平在所述第一种目的细胞和第二种目的细胞之间以及所述第一种目的细胞和第三种目的细胞之间发生改变的多肽，从而进行基因表达对比。
26.按照权利要求22-25任一项的方法，其中所述基因产物受信号调节，而在所述信号的两种不同水平上对比所述细胞中的基因表达。
27.一种增强差异表达筛选方法敏感性的方法，其中对比第一种和第二种目的细胞在两种不同信号水平作用下的基因表达，该方法包括将异源核酸引入所述第一种或第二种细胞中，以升高调节所述细胞对所述信号反应的生物分子的水平。
28.按照任一项前述权利要求的方法，其中所述异源核酸编码选自以下的生物分子HIF1α、EPAS1、膜结合形式的IL5α受体、溶解形式的IL5α受体、Bcl-2、Bcl-x、FasL、NGF、GDNF、热激蛋白(HSP)、APP、早老蛋白1、早老蛋白2、α-synuclein、Tau、Parkin和遍在蛋白。
29.按照权利要求7的方法，其中所述第一种多肽为HIF1-α，而所述第二种多肽为EPAS1。
全文摘要
本发明提供一种用于鉴定参与细胞活动的遗传因子的差异表达筛选方法，该方法包括对比(a)在第一种目的细胞中的基因表达；和(b)在第二种目的细胞中的基因表达，该细胞由于引入控制多肽表达的异源核酸而包含相对于生理水平来说水平改变的影响细胞活动的生物分子；并鉴定差异表达的遗传因子，其中在至少两种与细胞活动相关的不同环境条件下对比在所述第一种和/或第二种目的细胞中的基因表达。
文档编号C12N15/09GK1425075SQ01808359
公开日2003年6月18日 申请日期2001年2月22日 优先权日2000年2月22日
发明者A·J·金斯曼 申请人:牛津生物医学(英国)有限公司