专利名称：含有携带剪接受体的基因工程细胞非编码序列的高效逆转录病毒载体的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种用于基因治疗的高效安全的逆转录病毒载体，它来源于鼠白血病病毒(MLV)，含有一个突变的异源剪接受体并且无MLV编码序列。
本发明涉及对这种逆转录病毒的进一步改进，即在剪接受体的周围的区域中导入突变。导入这些突变使逆转录病毒载体产生接近于对照水平的病毒滴度，而同时仍产生很高水平的基因表达。因此，该载体应当比在逆转录病毒基因治疗中应用的其它载体要有效的多。
按照本发明的这一方面，来源于鼠白血病病毒(MLV)的逆转录病毒载体包括1)一种插入多克隆位点上游的、作为来源于外源基因的非编码序列的延伸因子EF1α的非编码序列的区域，和2)一种导入EF1α非编码序列中的剪接受体的下游的突变。
发明详述本发明提供一种基于MLV(鼠白血病病毒)的逆转录病毒载体，其没有任何病毒编码序列，但的确包括一部分插入到多克隆位点的上游的延伸因子EF1α的非编码序列，以便提供一个剪接受体，以及一种导入EF1α的非编码序列中的剪接受体下游的突变。
在本发明中，“非编码序列”指含有一种可以被转录但不能被翻译的内含子和外显子区域的基因组区域。
特别地说，在本发明的逆转录病毒载体中的EF1α的非编码序列来源于人细胞。它含有一部分内含子和外显子2序列，优选地，刚好在外显子2的翻译起始密码子的前面的序列，更具体地说，是SEQ ID NO.1的核苷酸序列，其对应人EF1α基因的3’末端到刚好在外显子2的翻译起始密码子前面的部分(如果EF1α基因的转录起始密码子的位点定为+1，那么它对应于+773到+1006的序列)。
本发明的逆转录病毒载体还具有一个导入来源于外源基因的非编码序列中的突变，以便在基因表达、剪接、和翻译效率之间达到最优化的平衡。
突变发生在剪接受体下游是理想的，具体地说刚好在剪接受体之后是理想的。已经确定了剪接受体周围的序列，尤其是接近剪接受体的外显子区域的序列在剪接中发挥重要作用。例如，一种优选的突变是用CC(胞嘧啶-胞嘧啶)碱基对取代SEQ ID NO.1序列中的第205位和第206位(分别对应于+977和+978)的GT(鸟嘌呤-胸腺嘧啶)碱基对。
本发明的逆转录病毒载体还可以进一步地在多克隆位点的下游包括一种异源启动子或IRES(内部核糖体进入位点，internal ribosomal entrysite)，目的在于表达两个或更多外源基因。
而且，本发明的逆转录病毒载体的基于MLV的5’LTR中的U3，或其部分，可以用异源启动子取代，优选地用HCMV IE(人巨细胞病毒立即早期(immediately-early))启动子。
本发明的逆转录病毒载体可以进一步含有一个可筛选的标记基因，例如NEO(新霉素抗性)基因，和MDR(多药抗性，multidrug resistance)基因。人MDR基因用作可筛选的标记的有利之处在于它容易地制备一种生产细胞系，并防止有害副作用，例如CTL(细胞毒性T淋巴细胞)反应。
“野生型”或“野生型载体”用作对照，以便与本发明的具有突变的逆转录病毒载体作比较。该野生型载体由多克隆位点上游的EF1α非编码序列的未修饰的部分组成，其目的在于通过提供剪接能力增加基因表达水平。在本发明中用作对照的是野生型MT4，其具有
图1显示的下列序列。
本发明提供的逆转录病毒载体的理想实施例包含1)来源于起始的MLV载体的核苷酸序列，其对应于5’LTR，最小包装序列，该最小包装序列包括在起始的gag基因的上游的剪接受体，一种多嘌呤示踪(track)，和一种3’LTR；2)多克隆位点；3)EF1α的核苷酸序列的区域，该区域是从内含子3’末端开始到刚好在外显子2的翻译起始密码子之前，被插入到最小包装序列和多克隆位点之间；和4)仅当需要第二基因表达时，则在多克隆位点下游的一种SV40最小启动子或一种个内部核糖体进入位点(IRES)。
更优选的是，本发明提供了一种包含以下元件的逆转录病毒载体MT51)来源于起始的MLV载体的核苷酸序列，它是5’LTR，最小包装序列，该最小包装序列含有在起始的gag基因的上游的剪接供体，多嘌呤示踪，和3’LTR；2)一种多克隆位点；3)一部分的EF1α的核苷酸序列，它从内含子的3’末端开始到刚好在外显子2的翻译起始密码子之前，被插入到最小包装序列和多克隆位点之间；4)在多克隆位点下游的一种内部核糖体进入位点(IRES)；和5)在剪接受体下游，在+977～+978位点上有取代GT碱基对的GC碱基对。
下面将详细描述本发明。
1.无病毒编码序列但含有人EF1α的非编码序列的基于MLV的逆转录病毒载体MIN-EI的构建在韩国专利申请
发明者金善荣, 柳承信, 李准台 申请人:百疗医株式会社