专利名称：厚壁孢子及其生产方法
技术领域：
本发明涉及厚壁孢子和大量生产Trichoderma herzianum SK-55的厚壁孢子或菌丝体、分生孢子和厚壁孢子的混合物的方法。
本发明中使用的Trichoderma herzianum SK-55菌于1992年12月9日保藏于位于日本国茨城县筑波市东1丁目1番3号的日本国经济产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，保藏号为“微工研菌寄第13327号”，保藏人为株式会社北海道绿兴产。由该原保藏向基于布达佩斯条约的保藏的移管请求在1992年12月9日进行，保藏编号为BP-4346。
前述的天然存在的厚壁孢子因为极微量，所以将其收集起来使用非常困难。上述公知发明公开的培养基中，一般很难高效地大量生产菌丝体微生物。
具体而言，将SK-55的菌丝体接种于和椎茸等培养基近似的培养基，通气搅拌，进行培养，在养分消耗时从外部给以强刺激，促进厚壁孢子化后，利用离心分离法或其他方法使培养基与体、分生孢子和厚壁孢子分离。
上述与椎茸等培养基近似的培养基是指，以葡萄糖、酵母提取液和聚胨为主材料，向其中加入必要的微量成分(如硫酸镁、氯化钙等)，此时不调整pH。
在上述培养中，温度为27-29℃，通气量为0.3vvm，接种后的搅拌速度为100-200rpm，接种量为0.5-0.8％，不进行pH的调整。
即，本发明的厚壁孢子的特征在于，将Trichoderma herzianumSK-55的菌丝体接种于含有葡萄糖、酵母提取液和聚胨的培养基，进行培养，得到含有分生孢子的厚壁孢子。培养基含有葡萄糖2.0-3.5％(质量)，酵母提取液0.3％(质量)，聚胨0.3％(质量)，硫酸镁0.05％(质量)，氯化钙0.05％(质量)和消泡剂0.001％(质量)。
本发明的厚壁孢子的生产方法的特征在于，将Trichodermaherzianum SK-55的菌丝体接种于含有葡萄糖、酵母提取液和聚胨的培养基，保持适度的温度并通气，继续搅拌，使菌丝体增殖，然后提高搅拌强度，促进孢子形成，继续通气培养后，分离上述培养液和生成的菌丝体、分生孢子和厚壁孢子。另外，适度温度为27-29℃，通气量为0.3vvm，搅拌速度为100-200rpm，接种量为0.7％，消耗掉培养基内的葡萄糖后，增加搅拌速度15-30％的同时继续通气培养。
上述发明中的培养基即使不调整pH，也不会影响菌丝体的增殖。
上述发明中，将培养温度调整为27-29℃，是因为该温度为Trichoderma herzianum SK-55菌丝体(以下成为SK-55)的增殖适宜温度。
上述发明中，从培养基中回收菌丝体和厚壁孢子时，使用常用于菌丝体分离的离心分离机或压榨过滤法。
本发明中，培养2日后加快搅拌速度(振荡速度)，是为了增加菌丝体增殖的困难性，促进厚壁孢子的生成。主要是在消耗尽葡萄糖时(2日后)增加搅拌速度，判断SK-55菌丝体发生自卫上的厚壁孢子化，在实际上也确实如此，促进了厚壁孢子的生成。
在上述发明中的培养基容量为100ml，通气量为0.3vvm，容量越大，当然通气量就越多。
根据本发明，可以大量获得耐热性优良且均质的SK-55的厚壁孢子。
利用本发明方法，可以得到大量生产SK-55的厚壁孢子的效果。
图2是同样的培养天数与厚壁孢子数等的图。
图3是同样的其他实施例的培养天数与厚壁孢子数等的图。
将上述成分15升加入到容积为30升的罐内，然后向其中加入上述(1)得到的种培养液100ml，在温度28℃，通气量0.3vvm，200rpm条件下振荡培养。在上述培养基内的葡萄糖消耗后(培养2日后)，在240rpm下振荡培养，促进孢子形成，再继续5天通气培养。如前所述，培养7日后，用离心分离机分离培养液中的菌丝体、分生孢子和厚壁孢子。
在上述分离物中添加干燥助材(硅藻土、沸石等)20-30％，加入30-40℃的减压干燥机中，边搅拌边干燥水分至6-12％，得菌丝体、分生孢子和厚壁孢子的混合制品。
将上述混合物用匀浆器无菌地破碎处理菌丝体，在50-60℃风干，可得干燥制剂。
除上述之外，从混合物中利用离心分离之外的方法分离厚壁孢子，以任意比例加入另外制得的分生孢子，根据使用目的规制分生孢子的比例，制成适用于不同植物或不同场所的制剂。
上述分离的分生孢子为1.7×107(CFU/ml)，厚壁孢子为1.2×107(CFU/ml)。
上述实施例中的葡萄糖的消耗状态如
图1所示。
上述得到的制品中的厚壁孢子的耐热性好，例如在-5℃-+70℃下保存也没有被破坏的危险。如果将分生孢子和厚壁孢子混合后包装，可以提高分生孢子的耐热性，同时可以提高厚壁孢子的发芽率。(试验例)对SK-55的土壤病害的评价试验供试菌verticillium dahliae供试植物生长20天的萝卜供试药剂SK-55分生孢子制剂、同厚壁孢子制剂、同分生孢子原末对照剂venlet(住友化学株式会社制)病原土壤北海道污染土壤(北海道绿兴产提供)接种发病方法在250ml的杯(Anmitucup)中加入150ml灭菌土，在其上加入50ml病原土壤，分别均匀散布一定量的试验药剂(对照剂灌注处理一定量)，3天后，在每一杯中播种10粒种子。之后覆盖过8目筛的灭菌土，普通灌水栽培。调查方法在覆土附近位置切取萝卜的茎叶，调查纤管束部分的褐变-黑变，调查发病苗率。
试验在3个区反复实施。结果如表1所示。表1表1评价 试验日接种菌、药剂处理在1999年11月19日，播种在1999年11月22日，调查在2000年1月11日结果未处理区发病率高。分生孢子制剂、厚壁孢子制剂的使用量分别为10g/m2和30g/m2时，无法确认效果，为100g/m2时确认与对照剂venlet有同等活性。
分生孢子原末因菌量较多，为30g/m2和100g/m2时有显著的防除效果。
以下说明本发明的其他实施例。(1)罐培养(培养基组成)
条件温度28℃、搅拌200rpm、通气量0.3vvm将上述培养基在液体通气(搅拌)状态下通气培养3天，经过3天后取1升的样品，在容积为500ml的三角烧瓶中加入100ml该样品，在以下条件下培养7天(全部培养10天)，与继续在上述罐内进行培养的进行比较，结果在表2中给出。表2表2培养比较
利用托马氏血球计只对厚壁孢子进行测定。
(a)孢子化的温度条件，培养温度28℃为最好。
(b)与最近的孢子形成不同，无钙添加效果。
(c)厚壁孢子的形成推定与菌体自消化酶有关，在碱性区有若干增加倾向。
(d)培养液的pH调整为5的区内孢子化极差，证实了与自消化酶的关系。
(e)罐培养的孢子浓度在5×107/ml处有再现性，糖消耗完之后通过调整pH可促进孢子率，为1×108/ml时有液体培养的临界可能性。(2)培养在28℃、200rpm、0.3vvm、0.2kg/cm2的条件下进行，9日后在20℃、60rpm下进行时的结果在表3中给出。表3表3培养比较
根据上述实施例，厚壁孢子数在培养7天后达到最高(4×107/ml)，之后未见增加(图2)。第2次的样品490ml用匀浆器处理(10000rpm，10分钟)，产生的死细胞(厚壁孢子)稳定在1.0％，所以也可以不考虑因匀浆器处理产生的死细胞。上述匀浆器处理后取490ml调查厚壁孢子数时，为5.5×108/ml。
上述厚壁孢子使用时的浓度为5×106/ml时可确认有效果，所以使用时可稀释100倍。(3)培养在28℃、200rpm、0.3vvm、0.2kg/cm2的条件下进行，10日后在15℃、60rpm下进行时的结果在表4中给出(图3)。表4
表4培养比较
根据上述实施例，厚壁孢子数在培养9天后达到最高(5×107/ml)，之后未见增加(图3)。第2次的样品490ml用匀浆器处理(10000rpm，10分钟)，产生的死细胞(厚壁孢子)稳定在1.5％，所以也可以不考虑因匀浆器处理产生的死细胞。上述匀浆器处理后取490ml调查厚壁孢子数时，为5.5×108/ml。
上述厚壁孢子使用时的浓度为5×106个/ml时可确认有效果，所以使用时可稀释100倍。(使用例)Trichoderma herzianum SK-55的厚壁孢子5.5×108/ml稀释200倍，对切断的每个种用马铃薯平均喷雾或浸渍20ml，干燥后种植。收获时，在惯行区和厚壁孢子区分别采取10株，计量，得到表5的结果。表5表5成绩表
如上所述，增收率为124％。处理后的干燥不充分，枯衰剂处理延迟7-10天可以进一步增收。这是因为延迟了最初的发育，但是是在同日收获的原因。
权利要求
1.厚壁孢子，其特征在于，将Trichoderma herzianum SK-55的菌丝体接种于含有葡萄糖、酵母提取液和聚胨的培养基，进行培养，得到的含有分生孢子的厚壁孢子。
2.权利要求1记载的厚壁孢子，其特征在于，在培养基中含有2.0-3.5质量％的葡萄糖，0.3质量％的酵母提取液，0.3质量％的聚胨，0.05质量％的硫酸镁，0.05质量％氯化钙和0.001质量％消泡剂。
3.厚壁孢子的生产方法，其特征在于，将Trichoderma herzianumSK-55的菌丝体接种于含有葡萄糖、酵母提取液和聚胨的培养基，保持适度的温度并通气，继续搅拌，使菌丝体增殖，然后提高搅拌强度，促进孢子形成，继续通气培养后，分离上述培养液和生成的菌丝体、分生孢子和厚壁孢子。
4.权利要求3记载的厚壁孢子的生产方法，其中适度温度为27-29℃，通气量为0.3vvm，接种后的搅拌速度为100-200rpm，接种量为0.7％。
5.权利要求3或4记载的厚壁孢子的制造方法，其中消耗掉培养基内的葡萄糖后，增加搅拌速度15-30％的同时继续通气培养。
全文摘要
本发明的目的在于有效地大量生产TrichodermaherzianumSK－55的菌丝体的厚壁孢子。是将Trichodermaherzianum SK－55的菌丝体接种于含有葡萄糖、酵母提取液和聚胨的培养基,进行培养,得到含有分生孢子的厚壁孢子。
文档编号C12N1/14GK1380901SQ01801392
公开日2002年11月20日 申请日期2001年3月30日 优先权日2000年3月31日
发明者佐佐木康晴, 佐佐木进 申请人:佐佐木康晴, 株式会社北海道绿兴产