专利名称：番茄花叶病毒弱毒株k的病毒表达载体的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及植物病毒基因工程领域，特别是涉及烟草花叶病毒属的番茄花叶病毒弱毒株K的病毒表达载体及其构建方式。
植物病毒表达载体可简单地用电击和机械感染方法接种，适用多种植物，可在短时间内建立多种植物的表达系统。因为病毒复制快，有可能在短时间内使其所携带的目的基因产生较高的表达量，具有潜在的经济价值。植物病毒表达载体不仅具有在植物中生产药用蛋白的能力，还可以成为研究植物病毒学和植物分子生物学的有效工具。迄今为止，用于构建表达载体的植物病毒已有几十种，其中包括双链非整合的DNA病毒，单链DNA病毒和正链RNA病毒。主要包括花椰菜花叶病毒(CaMV)、烟草花叶病毒(TMV)和豇豆花叶病毒(CPMV)等，其中超过150多种的蛋白多肽在TMV载体中成功表达(Grill LK.1998)。
植物病毒表达载体的构建可以通过以下四种方法基因替换、基因插入、融合抗原及基因互补(Cholthof，etal.，1996)。病毒基因组 基因替换 基因插入 融合抗原 基因互补 白色框为病毒基因组，黑色部分代表外源基因基因插入载体是将外源基因插入病毒的一特定位点而构建的。玉米线条病毒(maize streak virus，MSV)可以表达它携带的抗除草基因bar，使得接种叶片能抗除草剂Bastar，但在系统扩散中却回复成野生型(Shenand Hehn，1995)。烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，TMV)被广泛用于插入型载体的研究，虽然它也能表达插入的基因，但外源基因在随后的扩散中也很快丢失(Dawson et al.，1989；Dawson and Lento1990)，后来采用源于其他病毒的同源性表达元件替换本身的外壳蛋白表达框，以减少其同源重组的可能性，构建了新的载体，确比单纯的插入要稳定得多。马铃薯X病毒(potato virus X，PVX)和烟草蚀纹病毒(tobacco etchvirus，TEV)等也用于构建插入型载体。到目前为止，植物病毒载体均采用强病毒构建，因此还不能用于农业作物的性状改良或增加其营养和药用价值，这其中最主要的原因是大部分已知植物病毒能引起寄主植物产量的明显下降。此外，在田间，病毒能通过它们的天然媒介传播给其它植物，引起病毒扩散(Matthews，1991)。要使植物病毒载体用于农业作物的性状改良，就必须使其不影响植物的生长和产量，且不引起病毒扩散。因此，寻找一种环境安全的病毒载体来表达各种外源基因势在必行。植物病毒弱毒株在防治植物攻击病毒侵害中发挥着重要作用，它能够在植物体内生存和繁殖，却不危害植物的正常生长、开花和种子生产，而对攻击病毒侵染植物具有防御作用。
利用植物病毒弱毒株来构建表达载体，是本发明的独特之处，本发明的意义在于利用弱毒插入型载体来表达外源蛋白多肽，将为目的蛋白生产开辟一条新的经济有效的途径，若利用可食植物，将为口服疫苗生产提供广阔的应用前景，同时具有生物安全性。利用本发明构建的载体进行病毒与宿主关系的机理研究也具有重要的理论意义。
为了更好地理解本发明，通过以下附图
进一步予以详细说明。
图二体外转录表达载体pTOMV-KA构建流程图番茄花叶病毒弱毒株K侵染性cDNA克隆pN14为本实验室收藏或制备(杨恭等，2000)。
图三农杆菌介导表达载体pTOMV-KB构建流程图pNBS(1-3330，pUC18插入位点BamH I/Sma I)为本实验室收藏或制备(杨恭等，2000)；pBI121为中国科学院植物生物技术开放实验室赠送。
1.2以带有弱毒疫苗ToWK的cDNA克隆的质粒pNBH(5.7kb)为模板进行PCR。
1.2.1 PCR扩增ToMV-K基因(5461-5711)序列片段按已发表的ToMV-K基因组全序列设计引物，并在上游引物的5’端设计Kpn I酶切位点，在下游引物5’端设计Xho I酶切位点并引入一点突变(AGG)，引物序列如下上游引物(Primer1) (24bases，下划线为Kpn I酶切位点，方框内为Ncol I酶切位点)下游引物(Primer2) (26bases，下划线为Xho I酶切位点，方框内为点突变碱基)1.2.2 PCR扩增循环条件为94℃预变性2分钟后；94℃ 30秒，45℃30秒，72℃ 1分钟，30个循环后；72℃延伸10分钟。
1.3 PCR扩增ToMV-K基因(5712-6103)序列片段1.3.1按已发表的ToMV-K基因组全序列设计引物，并在下游引物的5’端设计 Sac I酶切位点，引物序列如下上游引物(Primer3)TCAATCACTTCTCCATCG(18bases)下游引物(Primer4) (29bases，下划线为Sac I酶切位点，方框内为Spe I酶切位点)1.3.2 PCR扩增循环条件为94℃预变性2分钟后；94℃ 30秒，52℃30秒，72℃ 1分钟，30个循环后；72℃延伸10分钟。
2.以含有TMV(3334-6395)序列cDNA克隆的质粒pTBH为模板，设计引物，PCR扩增TMV CP启动子区(5553-5720)2.1在上游引物5’端加上His-Tag和SacII酶切位点上游引物(Primer5)(44bases，下划线为Sac II酶切位点，斜体为His-Tag)CTCCGCGGATGATGATGATGATGATGAGTGATGTCCGTAAAGGG下游引物(Primer6)GTAAGACATATTTAAAACG(19bases)2.2 PCR扩增循环条件为94℃预变性2分钟后；94℃ 30秒，45℃ 30秒，72℃ 1分钟，30个循环后；72℃延伸10分钟。
3.对1.2、1.3、2中的PCR产物分别进行琼脂糖凝胶电泳、鉴定。
4.用Sac I酶切1.3的PCR产物，用Sac II酶切2的PCR产物，用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收后，用T4DNA连接酶连接。
5.用Kpn I和Xho I双酶切1.2的PCR产物；用Kpn I和Xho I酶切1.1得到的pBluescriptΔBamH I-Spe I质粒；将上述酶切产物用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收后，用T4DNA连接酶连接。
6.用Sac II和Sac I双酶切4的连接产物；用Sac II和Sac I双酶切5的连接产物；将上述酶切产物用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收后，用T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5a后提取质粒，得到中间克隆载体pTOMV-KC。
7.体外转录表达载体pTOMV-KA的构建用Nco I、Soe I双酶切6得到的中间载体pTOMV-KC；用Nco I、Spe I双酶切pN14；将构建的表达盒克隆进pN14载体，转化大肠杆菌DH5a后，提取质粒，得到体外转录表达载体pTOMV-KA，用Sph I将其线形化，进行体外转录。
8.农杆菌介导的表达载体pTOMV-KB的构建8.1用Sac I酶切pNBS并用DNA聚合酶I Klenow片段将其补成平端，再用BamH I酶切；用Xba I酶切pBI121并用DNA聚合酶I Klenow片段将其补成平端，再用BamH I酶切；将上述酶切产物用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收后，用T4DNA连接酶连接。
8.2用Nco I、Spe I双酶切6得到的中间载体pTOMV-KC，用Nco I、Spe I双酶切pNBH，将构建的表达盒克隆进pNBH；用Sph I酶切该产物并用DNA聚合酶I Klenow片段将其补成平端，之后用BamH I酶切；用Sma I酶切8.1的连接产物后，再用BamH I酶切，将上述酶切产物用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收后，用T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5a后，提取质粒，得到农杆菌介导的表达载体pTOMV-KB。
9.体外转录及感染烟草按转录试剂盒的操作说明进行体外转录，转录产物不经DNase处理，直接用于侵染烟草。先接种枯斑三生烟，出现枯斑后，转接普通烟，观察系统症状和枯斑形成情况。
10.用农杆菌注射烟草叶片用8.2中得到的表达载体pTOMV-KB转化农杆菌LBA4404，阳性克隆经培养后注射烟草叶片，观察其感染症状。
参考文献Ahlquist P，French R，janda M，et al，(1983).Multicomponent RNA plantvirus infection derived from cloned viral cDNA.Proc.Natl.Acad.sci USA817066-7070Cholthof，H B.et a1.，1996.Annu，Rev.Phytopathol，34299-323Dawson W O，Lehto K M(1990).The regulation of tabacomovirus geneexpression.Adv.Virus.Res.38307-342Dawson W O，Lewandowski D J，Hilt ME，et al.(1989).A tobacco mosaicvirus hybrid expresses and losses as added gene.Virology172285-292Gopinath.K.et al.，2000.Engineering cowpea mosaic virus RNA-2 into avector to express heterologous proteins in plants.Virology267，159-173.Grill L K.PBI Bulletin，1998，113-14Hendy.S，Chen，Z.C.et al.，1999.Rapid production of single-chain Fvfragments in plants using a potato virus X episomal vector.J.Immunol.Meth.231，137-146.Kumagai，M.H，et al.，2000.Rapid，high-level expression of glycosylated ricealpha-amylase in transfected plants byan RNA viral vector.Gene 245，169-174.Matthews，R.E.F.，1991.Plant Virology，3rd.Academic Press，New York.McCormick，A.A.et al.，1999.Rapid production of specific vaccines forlymphoma by expression of the tumor-derived single chain Fv epitopes intobacco plants.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，703-708.Shen W-H，Hohn B(1995).Vectors based on maize streak virus can reficate tohigh copy numbers in maize plants.J Gen.Virol.76965-969Zhang，G.，et al.，2000.In planta expression of HIV-1 p24 protein using anRNA plant virus-based expression vector.Mol.Biotechnol.14，99-107.杨恭，邱并生，生物工程学报，2000，16(2)207-210杨恭，刘相国，邱并生，生物工程学报，2000，16(4)437-44权利要求
1.一种以番茄花叶病毒弱毒株K的cDNA基因组为基础构建的植物病毒表达载体，其特征在于，它是由SP6启动子、番茄花叶病毒弱毒株K的复制酶基因、运动蛋白基因、番茄花叶病毒弱毒株K的外壳蛋白启动子及调控区、表达盒、TMV外壳蛋白启动子及调控区、番茄花叶病毒弱毒株K的外壳蛋白基因组成的体外转录表达载体pTOMV-KA。
2.一种以番茄花叶病毒弱毒株K的cDNA基因组为基础构建的植物病毒表达载体，其特征在于，它是由35S启动子、番茄花叶病毒弱毒株K的复制酶基因、运动蛋白基因、番茄花叶病毒弱毒株K的外壳蛋白启动子及调控区、表达盒、TMV外壳蛋白启动子及调控区、番茄花叶病毒弱毒株K的外壳蛋白基因组成的农杆菌介导表达载体pTOMV-KB。
3.一种便于外源目的基因插入的中间克隆载体pTOMV-KC，由以下两部分pBluescriptΔBamH I-Spe I和表达盒组成。
4.根据权利要求1或2或3所述载体的表达盒，其DNA序列如下所示
5.根据权利要求1或2或3所述的表达载体，在茄科、豆科和藜科植物的生物防治，或者在生物制药中的应用。
全文摘要
本发明涉及植物病毒基因工程领域，通过基因插入重组的方式，将具有弱毒保护功能的番茄花叶病毒弱毒株K的cDNA基因组进行重组，构建成高效、稳定表达外源基因的重组病毒载体。经体外转录成RNA后直接感染植物或用转化的农杆菌感染植物后获得重组病毒。重组病毒经分离、纯化后可再次接种寄主植物，并在植物体内连续、多代高效表达外源基因。以天然形式表达的目的蛋白可以制成口服制剂；以融合形式表达的目的蛋白，经纯化后可制成高纯度的生物制剂。
文档编号C12N7/01GK1412314SQ01136130
公开日2003年4月23日 申请日期2001年10月16日 优先权日2001年10月16日
发明者邱并生, 李勇, 刘广超 申请人:中国科学院微生物研究所