专利名称：一种改善外源基因在大肠杆菌中可溶性表达的方法
技术领域：
本发明属生物工程技术领域。
背景技术：
大肠杆菌表达体系是基因工程的首选表达体系，具有生长周期短，方法简便，价格低廉，表达水平高等诸多优点。但外源基因在大肠杆菌中表达时，往往以不溶性、无生物活性的包涵体形式存在。尽管包涵体产物形式为分离纯化提供了不少便利，但产物必须经体外变、复性才能获得生物活性。蛋白质体外复性过程复杂，而且得率低。对多硫键的蛋白质(尤其是药用蛋白质)，存在二硫键错配的异构体，从而为下游的分离纯化加大了难度，带来了困难。为了获得有生物活性的重组表达产物，科学家们尝试使用分子伴侣蛋白质、二硫键异构酶、脯氨酸异构酶等蛋白质在细胞内共表达，或者体外共复性以帮助外源基因表达产物的折叠、或者使用低温表达促进表达产物的折叠，或者采用融合表达的方法将外源基因与能在大肠杆菌中高水平表达、且产物溶解性很好的蛋白质(如金黄色葡萄球菌蛋白A，谷胱甘肽-S-转移酶，大肠杆菌麦芽糖结合蛋白malE，大肠杆菌硫氧还蛋白等)构建成融合蛋白的形式，借助于溶解性能好，高水平表达的融合伙伴蛋白使所需要的目标蛋白质(即外源基因产物)亦获得可溶性的大量表达，从而避免包涵体产物的生成。同时借助于融合蛋白的性质，方便目标产物的分离纯化。以上这些方法都为国外科学家所发现和建立、并大多都获得了发明专利，目前已在生物工程制药业及基因工程、生物化学和分子生物学研究人员中广泛应用。
发明内容
本发明的目的在于发明一种有效避免或尽量减少包涵体产物形成的新方法，丰富和增强研究人员改善外源基因在大肠杆菌中表达产物可溶性的知识、手段和能力，类似方法在国内外从未见过报道。
本发明的目的可以通过以下措施来达到将人工化学合成烟草花叶病毒5’非翻译前导序列，即Ω前导序列插入在大肠杆菌表达载体的启动子和核糖体结合位点之间，由此将通用的大肠杆菌表达质粒改造成一个新的表达质粒，所调控的外源基因在大肠杆菌中经诱导表达，大部分表达产物以可溶性的生物活性形式存在，有效避免或改善了包涵体产物的形成。含Ω前导序列的表达载体可以和现有的其它方法混合使用，例如与LysS，LysE或含分子伴侣，二硫键异构酶等基因的相容性质粒共同转化大肠杆菌，并共同表达，从而达到抑制目标产物诱导前的泄漏表达，或借助于分子伴侣或二硫键异构酶的作用，进一步改善目标产物的可溶性，减少包涵体产物的形成等目的。
作为本发明实施例的表达质粒pTORG就是将Ω前导序列插入在大肠杆菌表达载体pET32a(Novagen公司)的启动子和核糖体结合位点之间，同时将谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因克隆在多克隆位点中而获得，pTORG调控表达的核心区域(包括GST编码基因)共有1035个碱基，其序列为5′TAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGATATTTTTACAACAATTACCAACAACACAAACAACAAACAACATTACAATTACTATTTACAATAACAATGGCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGAAACAGTATTCATGTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTAAGGGCCTTGTGCAACCCACTCGACTTCTTTTGGAATATCTTGAAGAAAAATATGAAGAGCATTTGTATGAGCGCGATGAAGGTGATAAATGGCGAAACAAAAAGTTTGAATTGGGTTTGGAGTTTCCCAATCTTCCTTATTATATTGATGGTGATGTTAAATTAACACAGTCTATGGCCATCATACGTTATATAGCTGACAAGCACAACATGTTGGGTGGTTGTCCAAAAGAGCGTGCAGAGATTTCAATGCTTGAAGGAGCGGTTTTGGATATTAGATACGGTGTTTCGAGAATTGCATATAGTAAAGACTTTGAAACTCTCAAAGTTGATTTTCTTAGCAAGCTACCTGAAATGCTGAAAATGTTCGAAGATCGTTTATGTCATAAAACATATTTAAATGGTGATCATGTAACCCATCCTGACTTCATGTTGTATGACGCTCTTGATGTTGTTTTATACATGGACCCAATGTGCCTGGATGCGTTCCCAAAATTAGTTTGTTTTAAAAAACGTATTGAAGCTATCCCACAAATTGATAAGTACTTGAAATCCAGCAAGTATATAGCATGGCCTTTGCAGGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTGGTGGCGACCATCCTCCAAAATCGGATCTGATCGAAGGTCGTGGGATCCCCGGGAATTCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG3′本发明的特色在于将一个植物病毒来源的前导序列引入到常用的大肠杆菌表达载体中，其结果不但不影响原有质粒的表达效率，保持了表达质粒的原有特点和性能，而且能够明显、有效地改善了表达产物的可溶性和折叠，提高了有生物活性的表达产物的产率。本发明的用途是能够作为一个通用、有效、简便的方法应用于常用的大肠杆菌表达体系，有效避免或减少包涵体产物的形成，提高有生物活性的重组蛋白质的产量，适用于生物工程制药业及基因工程、生物化学、分子生物学等研究。
四
图1.重组表达质粒pTORG示意图。
1大肠杆菌colE1质粒复制起始点；2Lac I基因；3T7启动子；4Ω前导序列；5核糖体结合位点及SD序列；6谷胱甘肽-S-转移酶基因；7多克隆位点及六个组氨酸编码序列；8f1复制起始点；9氨苄青霉素抗性基因。
图2.重组GST在不同表达质粒中表达状况的SDS-PAGE分析图谱。
1.分子量标准蛋白质；2.经IPTG诱导的pTORG/BL21(DE3)；3.经IPTG诱导的pTRG/BL21(DE3)；4.经IPTG诱导的pET32a/BL21(DE3)；5.经IPTG诱导的pALEX/BL21(DE3)；A菌体总蛋白质；B菌体超声裂解上清液；C菌体超声裂解沉淀；箭头指示重组GST的蛋白质条带位置。
五具体实施例方式1.合成寡核苷酸片断，经退火、连接，得到含有Ω前导序列的DNA片断，将该合成片断插入到通用的商业化表达载体pET32a(Novagen公司)中，同时将谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因克隆在多克隆位点中，所构建的表达质粒pTORG如图1所示，Ω前导序列插入在T7启动子和核糖体结合位点之间，载体pTORG调控表达的核心区域包括T7启动子及其lac操纵子、Ω前导序列、核糖体结合位点SD序列、GST编码基因、多克隆位点、组氨酸短肽标签编码序列以及T7终止子之间的所有序列，其结构为T7启动子-LacO-TCTAGATATTTTTACAACAATTACCAACAACACAAACAACAAACAACATTACAΩ前导序列起始密码子ATTACTATTTACAATAACAATGGCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGAA核糖体结合位点及SD序列ACAGTATTC-GST编码基因- GGGATCCCCGGGAATTCGAGCTCCGTCGACAAGC因子Xa识别位点编码序列 多克隆位点终止密码子TTGCGGCCGCACTCGAG TGA---T7终止子组氨酸短肽标签编码序列为了便于比较，我们还将谷胱甘肽-S-转移酶基因克隆在pET32a质粒的多克隆位点中，构建了不含有Ω前导序列的对照质粒pTRG，此外还使用了一个通用的T7启动子控制的GST融合表达质粒pALEX(Panagiotidis，C.A.，Silverstein，S.J.Gene 16445-47.1995)。
2.重组表达质粒转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3)中，经IPTG诱导表达，表达产物经SDS-PAGE(分离胶12％，浓缩胶为5％，考马斯亮蓝R250染色)(见附图2)。SDS-PAGE定量扫描分析结果显示0.3ml培养液中pTORG、pTRG、pALEX质粒所产生的GST蛋白质总量分别大约为17.36微克、19.19微克、10.64微克；在菌体经超声波破碎细胞，离心分离获得的细胞裂解上清液中，pTORG、pTRG、pALEX质粒所产生的可溶性的GST蛋白质产量(20ml培养液中)分别为14.09微克、9.6微克、6.09微克。pTORG、pTRG、pALEX质粒GST表达产物中分别有81.2％、50％、57.2％的GST为可溶性表达产物。GST在pTORG中的表达水平为占菌体总蛋白质的28％、占细胞裂解上清总蛋白质的35％。含有Ω前导序列的质粒pTORG和不含有Ω前导序列的pTRG表达水平相当，Ω前导序列插入到表达载体中对表达载体的表达水平无影响。含有Ω前导序列的质粒pTORG产生的可溶性GST的产量是不含有Ω前导序列的pTRG的1.5倍。
为了更精确地比较和验证SDS-PAGE凝胶定量扫描分析结果，我们用GST酶活性测定的方法测定了三种表达质粒细胞裂解上清液中有生物活性的GST的相对含量，结果显示pTORG、pTRG、pALEX质粒所产生的有生物活性的GST蛋白质含量分别为115.277.672.1。含有Ω前导序列的质粒pTORG产生的有生物活性的GST的产量是不含有Ω前导序列的pTRG的1.5倍。这个结果进一步验证了SDS-PAGE凝胶定量扫描分析结果，并且证明可溶性的GST产物同时也是正确折叠的、有生物活性的。
我们又进一步用Glutathione-Sepharose 4B亲和层析柱对有生物活性的GST进行了分离纯化，从200ml培养液的菌体裂解上清液中，我们分别纯化获得26.6毫克(pTORG)、14.6毫克(pTRG)的GST表达产物。从含有Ω前导序列的质粒pTORG中纯化的GST产量是不含有Ω前导序列的质粒pTRG的1.8倍。
从本实例中，我们用了SDS-PAGE凝胶定量扫描分析、GST酶活性测定及GST分离纯化产率三种方法，对含有Ω前导序列的质粒pTORG、不含有Ω前导序列的质粒pTRG、以及通用GST融合表达质粒pALEX的产生可溶性、有生物活性的表达产物的生产能力进行了详细的比较和分析，得出的一致结果是Ω前导序列确实能够有效提高可溶性、有生物活性的重组表达产物的产量、明显降低或减少包涵体产物的形成，因此在生物技术研究和应用等方面具有良好的实用价值。和通用的GST融合表达质粒pALEX相比较，本发明实例中构建的质粒pTORG是一个性能明显优于pALEX的，高效的GST融合表达载体，应用该载体可以将任何其他外源基因与GST基因融合表达从而获得与GST融合的、具有生物活性的、高可溶性的外源蛋白表达产物。
权利要求
1.一种改善外源基因在大肠杆菌中可溶性表达的方法，其特征在于利用烟草花叶病毒Ω前导序列提高外源基因在大肠杆菌中的可溶性表达，即将烟草花叶病毒Ω前导序列添加到大肠杆菌表达载体中，Ω前导序列能够显著改善外源基因在大肠杆菌中表达产物的可溶性，减少包涵体产物的形成，提高正确折叠的生物活性产物的产率，同时保持了大肠杆菌表达载体的高效表达性质；含有烟草花叶病毒Ω前导序列的表达载体能和现有的其它方法混合使用，如和其它相容性质粒共同使用，达到抑制泄漏表达或进一步改善表达产物可溶性等目的。
2.根据权利要求1所述的改善外源基因在大肠杆菌中可溶性表达的方法，其特征在于该方法适用于生物工程制药业及基因工程、生物化学、分子生物学等研究。
3.一种应用烟草花叶病毒Ω前导序列改善外源基因蛋白产物在大肠杆菌中的可溶性表达的表达载体pTORG，其特征是一个能够有效提高具有生物活性的重组表达产物产率的、高效的GST融合表达载体，应用该载体可以将任何其他外源基因与GST基因融合表达从而获得与GST融合的、具有生物活性的、高可溶性的外源蛋白表达产物。pTORG用于调控表达的核心DNA序列为5′TAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGATATTTTTACAACAATTACCAACAACACAAACAACAAACAACATTACAATTACTATTTACAATAACAATGGCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGAAACAGTATTCATGTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTAAGGGCCTTGTGCAACCCACTCGACTTCTTTTGGAATATCTTGAAGAAAAATATGAAGAGCATTTGTATGAGCGCGATGAAGGTGATAAATGGCGAAACAAAAAGTTTGAATTGGGTTTGGAGTTTCCCAATCTTCCTTATTATATTGATGGTGATGTTAAATTAACACAGTCTATGGCCATCATACGTTATATAGCTGACAAGCACAACATGTTGGGTGGTTGTCCAAAAGAGCGTGCAGAGATTTCAATGCTTGAAGGAGCGGTTTTGGATATTAGATACGGTGTTTCGAGAATTGCATATAGTAAAGACTTTGAAACTCTCAAAGTTGATTTTCTTAGCAAGCTACCTGAAATGCTGAAAATGTTCGAAGATCGTTTATGTCATAAAACATATTTAAATGGTGATCATGTAACCCATCCTGACTTCATGTTGTATGACGCTCTTGATGTTGTTTTATACATGGACCCAATGTGCCTGGATGCGTTCCCAAAATTAGTTTGTTTTAAAAAACGTATTGAAGCTATCCCACAAATTGATAAGTACTTGAAATCCAGCAAGTATATAGCATGGCCTTTGCAGGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTGGTGGCGACCATCCTCCAAAATCGGATCTGATCG~GGTCGTGGGATCCCCGGGAATTCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG3′
全文摘要
本发明属生物工程技术领域,所述利用烟草花叶病毒Ω前导序列改善外源基因在大肠杆菌中可溶性表达的方法,其特点在于:1.将烟草花叶病毒Ω前导序列添加到大肠杆菌表达载体中;2.含有烟草花叶病毒Ω前导序列的表达载体能和现有的其它改善表达的方法混合使用;3.该方法适用于生物工程制药业及基因工程、生物化学、分子生物学等研究;4.表达载体pTORG,是能有效提高具有生物活性的重组表达产物得率的GST高效融合表达载体。
文档编号C12N1/21GK1336436SQ0112717
公开日2002年2月20日 申请日期2001年9月5日 优先权日2001年9月5日
发明者华子春, 张红霞 申请人:南京大学