专利名称：提高脂肪酶活性稳定性的方法
技术领域：
本发明涉及一种提高脂肪酶活性稳定性的方法。
背景技术：
在已有技术中，美国专利(专利号US5618710，申请日1997年4月8日)公开了一种交联酶结晶，其中的脂肪酶结晶，是来源于圆柱形假丝酵母发酵产生的脂肪酶。其提高酶活性稳定性的方法为将冻干的圆柱形假丝酵母脂肪酶溶解于0.5mL去离子水中，浓度为6mg/mL，将此酶溶液在低浓度盐缓冲溶液中进行透析。透析可以在多种缓冲液存在的条件下进行。如以5mM磷酸钠为缓冲液，在pH分别为6、7、8时透析；以20mM三羟甲基氨基甲烷和HCl为混合缓冲液，在pH为6.8时透析；以20mM三羟甲基氨基甲烷、HCl、1mMCaCl2、1mMMgCl2为混合缓冲液，在pH为6.8时透析。透析后经过6小时结晶得到0.05～0.1mm薄方板状结晶，用离心机分离出结晶后再用20mM缓冲液在pH为6.8下洗涤10次，离心得到的结晶再在7.5％戊二醛和20mM三羟甲基氨基甲烷和HCl为混合缓冲液，在pH为6.8、室温下交联30分钟，此结晶用20mM三羟甲基氨基甲烷和HCl为混合缓冲液，在pH为6.8下洗涤，得到最终产品。但该方法在进一步纯化原酶及工艺中如何防止结晶再溶解等方面还有待研究。
美国Vertex医药公司将交联酶结晶生物催化剂商业化专门设立了ALTUS Biologics公司。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高生物催化剂脂肪酶活性稳定性的方法，采用本发明的方法可以得到酶活性稳定性好的生物催化剂——酶微晶。
本发明是这样实现的。本发明的一种提高脂肪酶活性稳定性的方法包括如下操作步骤(1)脂肪酶溶解于磷酸盐缓冲液中，离心除去杂质得到上清液，然后通入超滤装置超滤，得到超滤浓缩液，(2)将步骤(1)得到的超滤浓缩液转入透析袋，浸入缓冲液中透析，使酶液进一步浓缩，(3)向步骤(2)中得到的酶液浓缩液中加入结晶沉淀剂使脂肪酶结晶，离心后得到脂肪酶晶体，(4)脂肪酶晶体和交联剂混合进行交联，交联结束后离心得到提高酶活性稳定性的脂肪酶。
本发明所述的方法，透析时透析袋浸入的缓冲液是硫酸铵缓冲液、磷酸盐缓冲液、分子量为6000～8000的聚乙烯醇缓冲液、2(N-吗啉代)丙烷磺酸缓冲液。
本发明所述的方法，所述的结晶沉淀剂是分子量为4000～8000的聚乙烯醇、2-丙酮、2-甲基-2，4-戊二醇、CaCl2。
本发明所述的方法，结晶时可加入微细脂肪酶晶种诱导结晶，诱导结晶时，微细脂肪酶晶种的加入量是微细脂肪酶晶种占总液体量中的0.01～0.25％(体积百分数)。
本发明所述的方法，脂肪酶晶体和交联剂交联时，交联剂加入量是交联剂占总液体量中的1～10％(体积百分数)，交联时间是30～200分钟，交联温度是10～50℃。
本发明所述的方法，脂肪酶晶体交联时加入的交联剂是溴化氰、聚乙烯亚胺、戊二醛、碳化二亚胺。
本发明与现有技术相比具有以下优点1.本发明的提高脂肪酶活性稳定性的方法采用超滤除杂质、透析增浓的纯化方法可提高酶的有效组份含量。
2.本发明的方法采用加入微细脂肪酶晶体诱导结晶，便于得到脂肪酶微晶。
3.本发明的方法采用的交联工艺，可防止脂肪酶结晶晶体自身再溶解，增加了产品的稳定性。
4.本发明采用的方法可得到酶活性稳定性更好的微细结晶，同时可提高总酶的回收率。
具体实施例方式
下面通过对本发明的具体实施例的详细描述来进一步说明本发明，但实施例不是对本发明的限制。
实施例1(1)将0.8g脂肪酶溶解于250mL磷酸盐缓冲液中，离心除去杂质得到上清液，上清液通过超滤装置超滤得到超滤浓缩液，此时酶的截留率为100％。
(2)将超滤浓缩液转入透析袋中，用磷酸盐作为缓冲液，在pH＝7.5下透析12小时使溶液平衡，得到进一步浓缩的酶液。
(3)取浓缩的脂肪酶酶液40mL，加入磷酸缓冲液40mL，磷酸缓冲液pH＝7.5，同时加入沉淀剂2-甲基-2，4-戊二醇40mL、CaCl20.03g，再加入占总液体量中0.05％(体积百分数)的脂肪酶微细结晶，在搅拌下进行诱导结晶，结晶结束后离心得到脂肪酶晶体。
(4)将所得到的脂肪酶晶体与50mL磷酸盐缓冲液混合，加入CaCl20.03g和2-甲基-2，4-戊二醇使2-甲基-2，4-戊二醇占总液体量的30％(体积百分数)，再加入交联剂戊二醛，其加入量是戊二醛占总液体量的3.5％(体积百分数)。脂肪酶晶体和交联剂在搅拌下进行交联，交联温度是25℃，交联时间是3小时。交联结束后离心分离出脂肪酶微晶，用磷酸盐缓冲液洗涤、分离脂肪酶微晶两次得最终产品。
实施例2除透析袋浸入的缓冲液是硫酸铵缓冲液，透析时间是16小时；加入的沉淀剂是2-丙酮40mL、CaCl20.03g，不加脂肪酶微细结晶；加入CaCl20.005g和2-甲基-2，4-戊二醇使2-甲基-2，4-戊二醇占总液体量的25％(体积百分数)，交联剂是溴化氰，占总液体量的1％(体积百分数)，交联时间是200分钟，交联温度是45℃，其余操作同实施例1。
实施例3除透析袋浸入的缓冲液是分子量为6000的聚乙烯醇缓冲液，透析时间是24小时；加入的沉淀剂是6000的聚乙烯醇40mL、CaCl20.03g，加入占总液体量中0.1％(体积百分数)的脂肪酶微细结晶；加入CaCl20.009g和2-甲基-2，4-戊二醇使2-甲基-2，4-戊二醇占总液体量的40％(体积百分数)，交联剂是聚乙烯亚胺，占总液体量的10％(体积百分数)，交联时间是30分钟，交联温度是30℃，其余操作同实施例1。
实施例4除透析袋浸入的缓冲液是分子量为8000的聚乙烯醇缓冲液，透析时间是18小时；加入的沉淀剂是分子量为8000的聚乙烯醇40mL、CaCl20.03g，加入占总液体量中0.2％(体积百分数)的脂肪酶微细结晶；加入CaCl20.05g和2-甲基-2，4-戊二醇使2-甲基-2，4-戊二醇占总液体量的60％(体积百分数)，交联剂是碳化二亚胺，占总液体量的5％(体积百分数)，交联时间是120分钟，交联温度是10℃，其余操作同实施例1。
实施例5除透析袋浸入的缓冲液是2(N-吗啉代)丙烷磺酸缓冲液，透析时间是8小时；加入的沉淀剂是分子量为6000的聚乙烯醇40mL、CaCl20.03g，加入占总液体量中0.25％(体积百分数)的脂肪酶微细结晶；加入CaCl20.015g和2-甲基-2，4-戊二醇使2-甲基-2，4-戊二醇占总液体量的50％(体积百分数)，交联剂是戊二醛，占总液体量的4％(体积百分数)，交联时间是150分钟，交联温度是20℃，其余操作同实施例1。
实施例6除透析袋浸入的缓冲液是磷酸盐缓冲液，透析时间是15小时；加入的沉淀剂是2-丙酮40mL、CaCl20.03g，加入占总液体量中0.01％(体积百分数)的脂肪酶微细结晶；加入CaCl20.01g和2-甲基-2，4-戊二醇使2-甲基-2，4-戊二醇占总液体量的45％(体积百分数)，交联剂是溴化氰，占总液体量的1％(体积百分数)，交联时间是200分钟，交联温度是45℃，其余操作同实施例1。
实施例7酶活性稳定性的测定以上实施例中得到的脂肪酶微晶在50％四氢呋喃溶液中，经过5天后测得酶活性仍保持90％以上。与未处理的脂肪酶相比较，其酶活性的半衰期时间延长了近百倍。
权利要求
1.一种提高脂肪酶活性稳定性的方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)脂肪酶溶解于磷酸盐缓冲液中，离心除去杂质得到上清液，然后通入超滤装置超滤，得到超滤浓缩液，(2)将步骤(1)得到的超滤浓缩液转入透析袋，浸入缓冲液中透析，使酶液进一步浓缩，(3)向步骤(2)中得到的酶液浓缩液中加入结晶沉淀剂使脂肪酶结晶，离心后得到脂肪酶晶体，(4)脂肪酶晶体和交联剂混合进行交联，交联结束后离心得到提高酶活性稳定性的脂肪酶。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于透析时透析袋浸入的缓冲液是硫酸铵缓冲液、磷酸盐缓冲液、分子量为6000～8000的聚乙烯醇缓冲液、2(N-吗啉代)丙烷磺酸缓冲液。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的结晶沉淀剂分子量为4000～8000的聚乙烯醇、2-丙酮、2-甲基-2，4-戊二醇、CaCl2。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于结晶时可加入微细脂肪酶晶种诱导结晶。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于诱导结晶时，微细脂肪酶晶种的加入量是微细脂肪酶晶种占总液体量中的0.01～0.25％(体积百分数)。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于脂肪酶晶体和交联剂交联时，交联剂加入量是交联剂占总液体量中的1～10％(体积百分数)，交联时间是30～200分钟，交联温度是10～50℃。
7.如权利要求1或6所述的方法，其特征在于脂肪酶晶体交联时加入的交联剂是溴化氰、聚乙烯亚胺、戊二醛、碳化二亚胺。
全文摘要
一种提高脂肪酶活性稳定性的方法，将脂肪酶溶解于磷酸盐缓冲液中，离心除去杂质，上清液进入超滤装置超滤，得到的超滤浓缩液用透析方法使酶液进一步浓缩，然后向酶液浓缩液中加入结晶沉淀剂使脂肪酶结晶，离心后得到脂肪酶晶体，脂肪酶晶体和交联剂交联后得到提高酶活性稳定性的脂肪酶。本发明的方法增加了结晶前的两步纯化以及对交联工艺的控制，使酶活性稳定性大大提高，并可防止结晶再溶解，增加了产品得率。
文档编号C12N9/18GK1408855SQ0112680
公开日2003年4月9日 申请日期2001年9月19日 优先权日2001年9月19日
发明者童海宝, 罗凤山, 蔡扬, 徐静安 申请人:上海化工研究院