专利名称：新型昆虫重组杂交病毒表达载体的构建技术的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种新型昆虫重组杂交病毒表达载体的构建技术。
背景技术：
通过重组DNA等基因工程的手段生产重组蛋白，是近年生物制药产业得以迅速的发展的主要原动力。目前，生产重组蛋白质主要有原核、昆虫及哺乳动物细胞三个不同级别的表达系统。其中，昆虫杆状病毒表达系统BaculovirusExpression Vector System，简称BEVS，由于高效表达、蛋白翻译后加工比较完善、可以利用昆虫个体或其培养细胞进行大规模的表达生产、安全性好等优点而成为最有效的真核表达系统之一。目前BEVS主要有苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒AcNPV和家蚕核型多角体病毒BmNPV表达系统两大类。前者在欧美国家得到了广泛应用，而后者则主要以中国和日本为代表。我国具有极为丰富的家蚕资源，目前家蚕是我国饲养量最大的经济昆虫，因此BmNPV表达系统特别适合于我国的实际情况，利用家蚕完全有可能使BmNPV表达系统在我国生物制药行业崛起中担当重任。
自1985年Maeda.S利用重组杆状病毒首次在家蚕体内成功地表达了人体干扰素以来，先后已有上百种外源目的基因得以表达而获得重组蛋白质。因此，家蚕作为极好的寄主被称为“生物工厂”。其优势在于(1)家蚕易被大量饲养。经几千年的驯化和技术积累，养蚕技术已十分成熟，且人工饲料育技术已使全年饲养成为可能，非常适合大规模产业化的要求；(2)很强的蛋白质生产能力。一头家蚕五龄幼虫在短短的7-8天内能合成约500mg的丝蛋白质。其惊人的蛋白质合成能力在生物界是罕见的。蚕体内充满着丰富的氨基酸，易被重组病毒所利用合成目的蛋白质；(3)重组蛋白质的质量高。作为真核生物表达系统，家蚕细胞对蛋白质翻译后的修饰较好，大部分产物同天然蛋白质具有相同的立体结构和生理活性。因此它比大肠杆菌原核表达系统具有无可比拟的优势；(4)安全性好。由于家蚕中不存在对人体感染的病原菌，比在哺乳动物培养细胞生产的重组蛋白质更安全。而且，重组杆状病毒由于没有多角体的保护而无法在野外生存，也就无病毒在环境中的扩散与污染之虞。然而，BmNPV表达系统也存在着缺点由于BmNPV寄主专一，只对家蚕具有感染能力，在重组病毒的构建过程中只能使用家蚕培养细胞，而家蚕细胞具有生长、继代慢的特点，这样在重组病毒的构建、筛选及用于表达的大量病毒增殖所化费时间较长。另外，在利用家蚕表达目的产物的同时，由于BmNPV本身也表达一些蛋白酶分解目的产物从而降低生产效率。
与BmNPV相对的，AcNPV感染寄主范围较广，能感染28种昆虫之多，除苜蓿银纹夜蛾外，还对来自于Spodoptera frugiperda的Sf21，Sf9及来自于Trichoplusia ni的Tn-5等昆虫细胞均具有感染性。由于这些昆虫细胞易于培养，生长旺盛、繁殖迅速，对重组病毒的构建等工作十分有利，而且非常适合于大规模用无血清培养基悬浮培养细胞生产重组蛋白。但它的缺点也很明显，即寄主昆虫个体小，饲养困难，难以适合产业化水平的开发。
发明内容
本发明的目的是利用基因重组的的原理和方法，克服BmNPV和AcNPV表达系统存在的缺点而具有BmNPV和AcNPV双重优点的新型昆虫重组杂交病毒表达载体的构建技术，较好地解决了BmNPV表达系统寄主范围狭窄及表达后期重组目的产物受蛋白酶降解两个关键问题。
本发明采用的技术方案是1.材料昆虫培养细胞Sf21、Tn-5和家蚕BmN细胞，AcNPV和BmNPV病毒，Sf21细胞培养基TC-100采用GibcoBRL产品，使用前加入l0％的胎牛血清(v/v)，Tn-5细胞则使用不含血清的ESF921培养基采用Expression system公司产品，培养温度均为27℃。家蚕幼虫1-3龄人工饲料育，29℃，4-5龄桑叶育，23-25℃。基因操作所使用的各种酶及PCR扩增试剂盒为TA克隆试剂盒，为日本宝酒造公司产品，质粒pCR2.1及昆虫杆状病毒转移质粒pBlueBacHisA，B，C购自美国Invitrogen公司，昆虫杆状病毒转移质粒pAcGP67B基因组DNA抽提采用Stratagene公司的试剂盒进行。共转染所使用的Lipofectin试剂为LIFE TECHNOLOGIES公司产品，DNA序列根据PE AppliedBiosystems提供的试剂盒在DNA序列分析仪上测定；2.杂交重组病毒的构建⑤以AcNPV基因组为模板克隆DNA解螺旋酶基因，设计的引物为Forward5-TCGTTTCTGTTCAACGCCATTGTC-3Backward5-ACACGAAAAGTACAAACACGATAGC-3；PCR反应的条件为反应液含1.0μl AcNPV基因组DNA(0.1μg)作为模板，2.0μl的dNTP(2.5 mM)，1.0μl(20pmol)的引物，0.5单位的TaqDNA聚合酶，及2.5μl的10倍PCR缓冲液(100mM Tris-HCl，pH 8.3含500mM KCl和15mM MgCl2)，并加入超纯水至25μl，反应进行30个循环(95℃变性50秒，60℃退火30秒，70℃延伸5分)，最后一个循环的延伸时间为10分，所使用的PCR仪为Gene Amp PCR System 2400(PE AppliedBiosytems)，PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析，由于PCR产物的两端带有A，因此采用为PCR产物一步直接克隆而设计的质粒载体pCR2.1(带有T)。这样构建的质粒命名为pCR2.1-AcHilcase；⑥将pCR2.1-AcHilcase与BmNPV DNA基因组在脂质体介导下共转染入BmN单层培养细胞(培养基不含血清)。24小时后更换含10％胎牛血清的培养基。5-6天后收集培养上清，低速离心后将此作10-2，10-3，10-4稀释；⑦用病毒的稀释液感染置于直径35mm培养皿的BmN单层细胞，待空斑形成后分别小心挑取并保存于专用小瓶；接着将这些挑取的空斑病毒分别接种位于4×12孔的贴壁生长的Sf21细胞，72小时后显微镜下观察病毒对细胞的感染情况，以出现多角体的作为筛选对象。然后收集这些具感染性的病毒，并在BmN和Sf21细胞中反复进行感染分析；⑧将确实对BmN和Sf21细胞具有双重感染性的病毒回收，并在家蚕幼虫中接种观察和进行病毒的DNA酶切分析；3.半胱氨酸蛋白酶基因的删除①首先从家蚕NPV基因组分别克隆cysteine proteinase(以下简称CP)基因上下游各0.8kb左右大小片段(Up-CP&Down-CP)，引物设计如下上游片段Primer 15-GGAATTCCCCAATCGATGTC-3(EcoRI)，Primer 25-TTTCTAGACCACCGCTTACG -3(XbaI)；下游片段Primer 35-GACCAAGCTTGAACGAAGTC -3(HindIII)，Primer 45-AAGCTTACGTTCACCACGCG-3(HindIII)。PCR反应的条件为反应液含1.0μlAcNPV基因组DNA(0.1μg)作为模板，2.0μl的dNTP(2.5mM)，各1.0μl(20pmol)的引物，0.5单位的TaqDNA聚合酶，及2.5μl的10倍PCR缓冲液(100mM Tris-HCl，pH 8.3含500mM KCl和15mM MgCl2)，并加入超纯水至25μl。反应进行30个循环(95℃变性50秒，57℃退火30秒，72℃延伸1分)，最后一个循环的延伸时间为10分；②随后将上述两片段分别克隆入质粒pUC18(2.7 kb)EcoRI、XbaI和HindIII位点而构建成重组质粒pUC18.Up-CP&Down-CP；③XbaI和HindIII酶切转移质粒pBlueBacHis B分离获得带有启动子和半乳糖苷酶基因的段片(ETL promoter＋LacZ)，并将此插入预先经XbaI、HindIII酶切处理的上述重组质粒；
④这样构建的重组质粒与HyNPV按常规方法共转染入Sf21单层培养细胞，5天后回收培养上清。在随后的空斑分析过程中在低融点琼脂糖(1％)中加入过滤灭菌的半乳糖苷(X-Gal)，使最终浓度为150μg/ml。通过挑取蓝色空斑分离重组病毒，进行反复筛选，直至整个培养盒出现蓝色，最终获得高度纯化的重组病毒。将此命名为HyNPV CP-。
本发明的优点是(1)寄主范围广。既能感染家蚕，又能感染目前最常用Sf21，Sf9及Tn-5培养细胞；(2)在重组病毒的构建、筛选、纯化中，由于可使用Sf21，Sf9培养细胞代替家蚕细胞而使这些工作变得容易和迅速，并大大加快重组病毒的大量快速繁殖；(3)由于HyNPV对家蚕和常用培养细胞具有双重感染性，既可利用Sf21，Sf9细胞及大型的Tn-5细胞进行无菌状态下的悬浮培养法快速生产重组蛋白，又可在家蚕幼虫中表达进行大规模生产，有利于实现产业化水平的开发；(4)比AcNPV和BmNPV表达系统具有更高的表达效率，重组蛋白生产水平提高50-60％。HyNPV杂交重组杆状病毒表达系统实现了AcNPV与BmNPV的双优组合，其潜在的应用价值非常巨大。目前我国的生物制药行业正在起步，用我国较有特色的BmNPV表达体系、利用家蚕作为生物反应器已生产了许多基因药物和一些贵重医用蛋白质。HyNPV将替代目前最常用的BmNPV或AcNPV表达系统。由于该系统在重组病毒的构建过程中不必使用家蚕培养细胞，它的应用范围将迅速扩大，在未来的基因工程生物制药产业中将发挥重要作用。
图1介于BmNPV和AcNPV间的新型重组杂交昆虫杆状病毒的构建过程；图2杂交病毒中半胱氨酸蛋白酶基因删除的流程图。
具体实施例方式
1、材料昆虫培养细胞Sf21、Tn-5和家蚕BmN细胞由浙江大学动物科学学院蚕蜂系生物工程研究室继代保存，AcNPV和BmNPV病毒为同大学的家蚕生理病理研究室保存。Sf21细胞培养基TC-100为GibcoBRL产品，使用前加入10％的胎牛血清(v/v)，Tn-5细胞则使用不含血清的ESF921培养基为Expression systems产品，培养温度均为27℃。家蚕幼虫1-3龄人工饲料育，29℃，4-5龄桑叶育23-25℃。基因操作所使用的各种酶及PCR扩增试剂盒为日本宝酒造Takara Biomedicals产品。TA克隆试剂盒、质粒pCR2.1及昆虫杆状病毒转移质粒pBlueBacHisA，B，C购自美国Invitrogen公司，昆虫杆状病毒转移质粒pAcGP67B购自美国Pharmingen公司。基因组DNA抽提采用Stratagene公司的试剂盒进行。共转染所使用的Lipofectin试剂为LIFE TECHNOLOGIES公司产品。DNA序列根据PE Applied Biosystems提供的试剂盒在DNA序列分析仪上测定。
2、杂交重组病毒的构建构建过程如图1表示。首先以AcNPV基因组为模板克隆DNA解螺旋酶基因，设计的引物为Forward5-TCGTTTCTGTTCAACGCCATTGTC-3；Backward5-ACACGAAAAGTACAAACACGATAGC-3。PCR反应的条件为反应液含1.0μl AcNPV基因组DNA(0.1μg)作为模板，2.0μl的dNTP(2.5mM)，1.0μl(20pmol)的引物，0.5单位的Taq DNA聚合酶，及2.5μl的10倍PCR缓冲液(100mM Tris-HCl，pH8.3含500mM KCl和15mM MgCl2)，并加入超纯水至25μl。反应进行30个循环(95℃变性50秒，60℃退火30秒，70℃延伸5分)，最后一个循环的延伸时间为10分。所使用的PCR仪为Gene Amp PCR System 2400(PE Applied Biosytems)。PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析。由于PCR产物的两端带有A，因此采用为PCR产物一步直接克隆而设计的质粒载体pCR2.1(带有T)。这样构建的质粒命名为pCR2.1-AcHilcase。然后将pCR2.1-AcHilcase与BmNPV DNA基因组在脂质体介导下共转染入BmN单层培养细胞(培养基不含血清)。24小时后更换含10％胎牛血清的培养基。5-6天后收集培养上清，低速离心后将此作10-2，10-3，10-4稀释。然后用病毒的稀释液感染置于直径35mm培养皿的BmN单层细胞，待空斑形成后分别小心挑取并保存于专用小瓶。接着将这些挑取的空斑病毒分别接种位于4×12孔的贴壁生长的Sf21细胞，72小时后显微镜下观察病毒对细胞的感染情况，以出现多角体的作为筛选对象。然后收集这些具感染性的病毒，并在BmN和Sf21细胞中反复进行感染分析。最后将确实对BmN和Sf21细胞具有双重感染性的病毒回收，并在家蚕幼虫中接种观察和进行病毒的DNA酶切分析。我们将此病毒命名为介于AcNPV-BmNPV的杂交重组病毒，英文名为Hybrid baculovirus of AcNPV and BmNPV，简称HyNPV。
3、半胱氨酸蛋白酶基因的删除操作过程详见图2。首先从家蚕NPV基因组分别克隆cysteine proteinase(以下简称CP)基因上下游各0.8kb左右大小片段(Up-CP&Down-CP)，引物设计如下上游片段Primer 15-GGAATTCCCCAATCGATGTC-3(EcoRI)，Primer 25-TTTCTAGACCACCGCTTACG-3(XbaI)；下游片段Primer 35-GACCAAGCTTGAACGAAGTC-3(HindIII)，Primer45-AAGCTTACGTTCACCACGCG-3(HindIII)。PCR反应的条件为反应液含1.0μl AcNPV基因组DNA(0.1μg)作为模板，2.0μl的dNTP(2.5mM)，各1.0μl(20pmol)的引物，0.5单位的Taq DNA聚合酶，及2.5μl的10倍PCR缓冲液(100mM Tris-HCl，pH 8.3含500mM KCl和15mM MgCl2)，并加入超纯水至25μl。反应进行30个循环(95℃变性50秒，57℃退火30秒，72℃延伸1分)，最后一个循环的延伸时间为10分。随后将上述两片段分别克隆入质粒pUC18(2.7 kb)EcoRI、XbaI和HindIII位点而构建成重组质粒pUC18.Up-CP&Down-CP。XbaI和HindIII酶切转移质粒pBlueBacHis B分离获得带有启动子和半乳糖苷酶基因的段片(ETL promoter＋LacZ)，并将此插入预先经XbaI、HindIII酶切处理的上述重组质粒。这样构建的重组质粒与HyNPV按常规方法共转染入Sf21单层培养细胞，5天后回收培养上清。在随后的空斑分析过程中在低融点琼脂糖(1％)中加入过滤灭菌的半乳糖苷(X-Gal)，使最终浓度为150μg/ml。通过挑取蓝色空斑分离重组病毒，进行反复筛选，直至整个培养盒出现蓝色，最终获得高度纯化的重组病毒。将此命名为HyNPV CP-。
4、含目的基因重组杂交病毒的构建可根据需要进行设计，将目的基因插入杆状病毒表达转移质粒，如pAcGP67B等，构建成含有目的基因的重组转移质粒。在Lipofectin介导下，将15μg重组转移质粒与HyNPV CP-基因组DNA共转染入Sf21细胞，5天后回收培养上清，用常规方法进行3-4轮空斑纯化，获得不形成多角体而含有目的基因的重组病毒。用这些重组病毒即可进行蛋白质的表达生产。
5、结果从206个空斑病毒中成功筛选出2个对Sf21和BmN细胞具有双重感染性的重组病毒，重组发生率为0.97％。进一步感染试验表明，这两个重组病毒对AcNPV的寄主细胞Tn-5，Sf9及家蚕幼虫均表现出良好的感染性，由此说明这两个重组病毒确实为BmNPV和AcNPV的杂交型重组病毒。半胱氨酸蛋白酶为BmNPV和AcNPV编码的一种主要蛋白酶，其基因位于病毒基因组第127个阅读框架，由323个氨基酸组成。由于半胱氨酸相互结合而形成的二硫键在蛋白质的高级结构中发挥着极为重要的作用，因此保护半胱氨酸不受降解是非常重要的。通过基因重组的方法使半胱氨酸蛋白酶基因失活，从而使NPV在感染过程中不产生该蛋白酶，根本上解决了一直困扰的重组产物受蛋白酶降解的问题。在删除半胱氨酸蛋白酶基因后，利用人成纤维细胞成长因子bFGF基因作为目的标志基因，构建了一个重组病毒HybFGFCP-，从HybFGFCP-感染的家蚕中纯化的bFGF产量提高了56.8％。而且，即使在感染后期(120小时)家蚕的组织器官也相对较为完整，没有受到剧烈降解。
权利要求
1.新型昆虫重组杂交病毒表达载体的构建技术，其特征在于它包括1)材料昆虫培养细胞Sf21、Tn-5和家蚕BmN细胞，AcNPV和BmNPV病毒，Sf21细胞培养基TC-100采用GibcoBRL产品，使用前加入10％的胎牛血清(v/v)，Tn-5细胞则使用不含血清的ESF921培养基采用Expression system公司产品，培养温度均为27℃，家蚕幼虫1-3龄人工饲料育，29℃，4-5龄桑叶育，23-25℃，基因操作所使用的各种酶及PCR扩增试剂盒为TA克隆试剂盒，为日本宝酒造公司产品，质粒pCR2.1及昆虫杆状病毒转移质粒pBlueBacHisA，B，C购自美国Invitrogen公司，昆虫杆状病毒转移质粒pAcGP67B基因组DNA抽提采用Stratagene公司的试剂盒进行，共转染所使用的Lipofectin试剂为LIFE TECHNOLOGIES公司产品，DNA序列根据PE AppliedBiosystems提供的试剂盒在DNA序列分析仪上测定；2)杂交重组病毒的构建①以AcNPV基因组为模板克隆DNA解螺旋酶基因，设计的引物为Forward5-TCGTTTCTGTTCAACGCCATTGTC-3Backward5-ACACGAAAAGTACAAACACGATAGC-3；PCR反应的条件为反应液含1.0μl AcNPV基因组DNA(0.1μg)作为模板，2.0μl的dNTP(2.5mM)，1.0μl(20pmol)的引物，0.5单位的TaqDNA聚合酶，及2.5μl的10倍PCR缓冲液(100mM Tris-HCl，pH 8.3含500mM KCl和15mM MgCl2)，并加入超纯水至25μl，反应进行30个循环(95℃变性50秒，60℃退火30秒，70℃延伸5分)，最后一个循环的延伸时间为10分，所使用的PCR仪为Gene Amp PCR System 2400(PE AppliedBiosytems)，PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析，由于PCR产物的两端带有A，因此采用为PCR产物一步直接克隆而设计的质粒载体pCR2.1(带有T)，这样构建的质粒命名为pCR2.1-AcHilcase；②将pCR2.1-AcHilcase与BmNPV DNA基因组在脂质体介导下共转染入BmN单层培养细胞，培养基不含血清，24小时后更换含10％胎牛血清的培养基，5-6天后收集培养上清，低速离心后将此作10-2，10-3，10-4稀释；③用病毒的稀释液感染置于直径35mm培养皿的BmN单层细胞，待空斑形成后分别小心挑取并保存于专用小瓶；接着将这些挑取的空斑病毒分别接种位于4×12孔的贴壁生长的Sf21细胞，72小时后显微镜下观察病毒对细胞的感染情况，以出现多角体的作为筛选对象，然后收集这些具感染性的病毒，并在BmN和Sf21细胞中反复进行感染分析；④将确实对BmN和Sf21细胞具有双重感染性的病毒回收，并在家蚕幼虫中接种观察和进行病毒的DNA酶切分析。
2.根据权利要求1所述的新型昆虫重组杂交病毒表达载体的构建技术，其特征在于半胱氨酸蛋白酶基因的删除1)首先从家蚕NPV基因组分别克隆cysteine proteinase(以下简称CP)基因上下游各0.8kb左右大小片段(Up-CP&Down-CP)，引物设计如下上游片段Primer 15-GGAATTCCCCAATCGATGTC-3(EcoRI)，Primer 25-TTTCTAGACCACCGCTTACG -3(XbaI)；下游片段Primer 35-GACCAAGCTTGAACGAAGTC -3(HindIII)，Primer 45-AAGCTTACGTTCACCACGCG-3(HindIII)，PCR反应的条件为反应液含1.0μl AcNPV基因组DNA(0.1μg)作为模板，2.0μl的dNTP(2.5mM)，各1.0μl(20pmol)的引物，0.5单位的TaqDNA聚合酶，及2.5μl的10倍PCR缓冲液(100mM Tris-HCl，pH 8.3含500mM KCl和15mM MgCl2)，并加入超纯水至25μl，反应进行30个循环(95℃变性50秒，57℃退火30秒，72℃延伸1分)，最后一个循环的延伸时间为10分；2)随后将上述两片段分别克隆入质粒pUC18(2.7 kb)EcoRI、XbaI和HindIII位点而构建成重组质粒pUC18.Up-CP&Down-CP；3)XbaI和HindIII酶切转移质粒pBlueBacHis B分离获得带有启动子和半乳糖苷酶基因的段片(ETL promoter＋LacZ)，并将此插入预先经XbaI、HindIII酶切处理的上述重组质粒；4)这样构建的重组质粒与HyNPV按常规方法共转染入Sf21单层培养细胞，5天后回收培养上清，在随后的空斑分析过程中在低融点琼脂糖(1％)中加入过滤灭菌的半乳糖苷(X-Gal)，使最终浓度为150μg/ml，通过挑取蓝色空斑分离重组病毒，进行反复筛选，直至整个培养盒出现蓝色，最终获得高度纯化的重组病毒，将此命名为HyNPV CP-。
全文摘要
一种新型昆虫重组杂交病毒表达载体的构建技术,利用同源重组的原理,构建了介于AcNPV和BmNPV间的杂交重组病毒表达载体HyNPV。为了减少表达后重组蛋白的降解,利用“基因knock－out”法删除了杆状病毒本身的一种主要蛋白酶—半胱氨酸蛋白酶基因,提高了重组蛋白的稳定性和表达效率。该表达载体较好地解决了BmNPV表达系统寄主范围狭窄及表达后期重组目的产物受蛋白酶降解的问题。它具有寄主范围广,既可感染家蚕,又能感染常用Sf21,Sf9及Tn－5培养细胞;可使用Sf21,Sf9培养细胞代替家蚕细胞加快重组病毒的大量快速制备;由于它对家蚕和常用昆虫培养细胞具有双重感染性,既可利用Sf21,Sf9细胞及大型的Tn－5细胞进行无菌状态下的细胞悬浮培养法快速生产重组蛋白,又可以在家蚕中大量表达,而且重组蛋白生产水平提高50－60%。
文档编号C12N15/86GK1336435SQ0112560
公开日2002年2月20日 申请日期2001年8月10日 优先权日2001年8月10日
发明者吴小锋 申请人:浙江大学