专利名称：Pcr扩增、杂交同步法的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种PCR技术，具体地说涉及一种可以把PCR的扩增和产物检测二步合为一步的方法。
目前在中国市场上所使用的同类TaqmanR技术是一种把PCR扩增和检测二步合为一的方法，这种方法操作比较简便，但其灵敏仅104copy/ml，又必需使用可以做“即时法”的PCR仪，约要花60万人民币购买此类设备，其配套的易耗物品也比较昂贵，又没有自主的知识产权。为了使PCR技术在商业上的应用能越来越广泛，发展一种更经济、有效的方法将适应我国广大人民的基本需求，并覆盖普及到全国各地，达到低廉收费、优质服务的目标。
本发明的目的是提供一种可以把PCR扩增和产物检测二步合为一步的方法。由于本发明具有成本较低、灵敏度高、特异性强、操作简便等特点，将对临床检测、用血安全、抗药性和单核苷酸多态性(SNP)等方面的测定带来革命性的变化。
本发明的目的是这样实现的一种PCR扩增、杂交同步法，它选自于下列方法之一通用捕集测定法或固相引物测定法。
其中通用捕集测定法包括a)将通用捕集探针包被到微孔板上；b)在上述条板中，每孔加入1体积的2×PCR主反应液，再加入1体积的样品液进行常规PCR反应；c)PCR完成后，加入含接头分子的变性液5-10μl；d)在同一孔中继续加入杂交液100μl，37℃保温1小时；e)洗板、酶联、第二次洗板、显色、测定；f)判读。
其中步骤C中所述接头液分子为接头液分子为a)乙型肝炎病毒接头液分子；或b)丙型肝炎病毒接头液分子；或c)丙种球蛋白接头液分子；或d)爱滋病毒接头液分子；或e)结核菌接头液分子；或f)沙眼衣原体接头液分子；或其它病原体接头液分子，其接头液分子的结构为一条单链的寡核苷酸，分别由长2 5个碱基的通用的部分、长5到4毫微米的“空间”部分及约22-26个碱基的特异性部分构成，其特异性部分为只能与带有乙型肝为病毒PCR产物起杂交反应的乙型肝炎病毒特异性顺序、或与带有丙型肝炎病毒PCR产物起杂交反应的丙型肝炎病毒特异性顺序、或与带有丙种球蛋白PCR产物起杂交反应的丙种球蛋白特异性顺序，或与带有爱滋病毒PCR产物起杂交反应的爱滋病毒特异性顺序、或与带有结核菌PCR产物起杂交反应的结核菌特异性顺序、或与带有沙眼衣原体PCR产物起杂交反应的沙眼衣原体特异性顺序或与任一种待测的特异性顺序；上述接头分子的结构为一条单链的寡核苷酸，其长度在50到60个碱基对左右，通过PE公司的392型DNA合成仪，采用固相亚磷酸三脂法进行DNA合成。它包括三个组成部分(1).通用部分通用部分共长25个碱基，恰好和固定在磁粉或微量板上的通用探针互补，能很快地与通用探针杂交；(2).“空间”介于通用部分和特异部分之间，为了留出“空间”给二个分子形夹心式的杂交链，我们的“空间”长度是5至4nm；(3).特异性部分特异性部分紧接着“空间”，约为22-26个碱基。它的长短是由它本身的G/C％，Tm是否与通用部分配合所决定的，也决定于它自身是否有二级级构，它的顺序是选用在PCR产物，介于一对引物的中间顺序，因而只能和PCR的产物杂交而与生物素标记的引物无反应，所以保证了该部分杂交的特异性；接头液的分子结构 1)其中通用部分长25个碱基对，其顺序或用人为排列的(dA)25或5’-ACg，Acg，gAA，cgA，AAc ggA，Acg，Acgg-3’或从pBlue KS-质粒顺序中选取一段顺序。pBlue KS-质粒顺序已发表在Short，J.et al(1988)NucleicAcids Research 16(15)7583具体顺序为3’-CCg，AgA，TAg，ggT，TgA，TTg，TTCC-5’2)空间由二个空间分子(spacer-phosphoramidite)组成，每个空间为18个碳原子组成的一个长臂，可以在DNA合成仪上加入到接头分子中；
具体结构为 (已发表在Nelson、P、et、(1989)Nucleic Acids Res。177187)3)特异性部分都选自各待测病原体核酸的全序列中，HBV，HCV，HIV，TB，CT，β-globin等都可在“基因文库”中查找出来。例它们的具体结构为(1)HBV 5’-TAAAGAGAGGTGCGCCCCGTGGTC-3’(2)HCV 5’-AGCCATAGTGGTCTGCGAAC-3’(3)HIV 5’-GTTAAAAGAGACCATCAATGAGGAA-3’(4)TB 5’-GCGCTTTAGCGGTGTGGGATGA-3’(5)CT 5’-GATGAAAGACAGGAAATACGCAGA-3’(6)丙种球蛋白5’-ACTTTCTTGCCATGAGCCTTCACCT-3’其中步骤a所述的通用捕集探针为其通用部分。
其中步骤b)的PCR主反应液氯化钾200mM、三羟甲基氨基甲烷40mM，Taq DNA聚合酶0.5/10ul，尿嘧啶糖基化酶(UNG)1U/10ul、dNTP0.5mM、引物40μg/ml；样品液制备过程如下取50μl裂解液加入50μl待测血清，37℃保温1小时，加入100ul样品中和液(主要成分Tris)混匀后用样品稀释液(主要成分二价Mg离子和鱼精DNA载体分子)稀释5倍。
其中步骤C)的变性液为0.5M NaOH溶液，步骤d的杂交液为0.9MNaCL柠檬酸缓冲液。
其中步骤C)中测定可用可见光、荧光或化学发光进行检测。
其中固相引物测定法包括a)在耐热且透明的反应孔表面包被特异于待测病毒体的DNA引物(寡核苷酸，长度为20到30个核苷酸)；b)在上述反应孔中加入1体积(10ul-20ul)的2×PCR主反应液和1体积的样品液，进行固相引物PCR反应；c)PCR完成后，洗板、酶联、第二次洗板，显色测定，测定方法可用可见、荧光或化学发光检测；d)判读。
其中步骤b)的PCR主反应液为
KCL 200mM，Tris 40mM，Taq DNA聚合酸0.5单位/10ulHK-UNG 0.1单位/10ul，dUTP 0.5mM，生物素标记的引物400ng/10ul；样品液的制备如下取50ul裂解液，加入50ul待测血清，37℃保温1小时，加入100ul样品中和液(主要成分Tris)混匀后用样品稀释液稀释5倍。
PCR扩增/杂交同步法可以选用下面二种方式之一来实现一.通用捕集法a)在耐热(可加热到120℃不变型)且透明的反应孔表面(8×12，96孔微量板，原料可以用纳米聚苯乙烯或polycarbonate等)包被通用捕集探针。
b)在上述反应孔中加入1体积(10ul至20ul)2×PCR的主反应液和1体积样品液进行常规PCR反应；c)PCR反应完成后，加入含接头分子的变性液5-10ul同时使PCR产物双链DNA分子变性为单链分子，d)在同一孔中继续加入杂交液100ul，37℃保温1小时，e)洗板、酶联、第二次洗板、显色、测定。测定所使用的方法除可见光以外，还可适用于荧光或化学发光检测。
在上述步骤c)中接头液分子为a)乙型肝炎病毒接头液分子；或b)丙型肝炎病毒接头液分子；或c)丙种球蛋白接头液分子；或d)爱滋病毒接头液分子；或e)结核菌接头液分子；或f)沙眼衣原体接头液分子；或其它病原体接头液分子，其接头液分子的结构为一条单链的寡核苷酸，分别由长25个碱基的通用的部分、长5到4毫微米的“空间”部分及约22-26个碱基的特异性部分构成，其特异性部分为只能与带有乙型肝为病毒PCR产物起杂交反应的乙型肝炎病毒特异性顺序、或与带有丙型肝炎病毒PCR产物起杂交反应的丙型肝炎病毒特异性顺序、或与带有丙种球蛋白PCR产物起杂交反应的丙种球蛋白特异性顺序，或与带有爱滋病毒PCR产物起杂交反应的爱滋病毒特异性顺序、或与带有结核菌PCR产物起杂交反应的结核菌特异性顺序、或与带有沙眼衣原体PCR产物起杂交反应的沙眼衣原体特异性顺序或与任一种待测的特异性顺序；上述接头分子的结构为一条单链的寡核苷酸，其长度在50到60个碱基对左右，通过PE公司的392型DNA合成仪，采用固相亚磷酸三脂法进行DNA合成。它包括三个组成部分1.通用部分通用部分共长25个碱基，恰好和固定在磁粉或微量板上的通用探针互补，能很快地与通用探针杂交。
2.“空间”介于通用部分和特异部分之间，为了留出“空间”给二个分子形夹心式的杂交链，我们的“空间”长度是5至4nm。
3.特异性部分特异性部分紧接着“空间”，约为22-26个碱基。它的长短是由它本身的G/C％，Tm是否与通用部分配合所决定的，也决定于它自身是否有二级级构，它的顺序是选用在PCR产物，介于一对引物的中间顺序，因而只能和PCR的产物杂交而与生物素标记的引物无反应，所以保证了该部分杂交的特异性。
接头液的分子结构 1)其中通用部分长25个碱基对，其顺序或用人为排列的(dA)25或5’-ACg，Acg，gAA，cgA，AAc ggA，Acg，Acgg-3’或从pBlue KS-质粒顺序中选取一段顺序。pBlue KS-质粒顺序已发表在Short，J.et al(1988)NucleicAcids Research 16(15)7583具体顺序为3’-CCg，AgA，TAg，ggT，TgA，TTg，TTCC-5’2)空间由二个空间分子(spacer-phosphoramidite)组成，每个空间为18个碳原子组成的一个长臂，可以在DNA合成仪上加入到接头分子中。
具体结构为 (已发表在Nelson、P、et、(1989)Nucleic Acids Res。177187)3)特异性部分都选自各待测病原体核酸的全序列中，HBV，HCV，HIV，TB，CT，β-globin等都可在“基因文库”中查找出来。例它们的具体结构为(1)HBV 5’-TAAAGAGAGGTGCGCCCCGTGGTC-3’(2)HCV 5’-AGCCATAGTGGTCTGCGAAC-3’(3)HIV 5’-GTTAAAAGAGACCATCAATGAGGAA-3’
(4)TB 5’-GCGCTTTAGCGGTGTGGGATGA-3’(5)CT 5’-GATGAAAGACAGGAAATACGCAGA-3’(6)丙种球蛋白5’-ACTTTCTTGCCATGAGCCTTCACCT-3’通用捕集孔为具有活性基团的聚苯乙烯微孔板，其活性基团与接头液分子的通用部分(即通用捕集探针)的互补寡核苷酸共价键地联接固下；杂交液为0.9M NaCl柠檬酸缓冲液，使变性后的PCR产物或接头分子液加入孔中后杂交反应的PH值维持在最适范围内，它的离子浓度和保持温度恰好与形成的二种杂交链(即通用杂交链和特异性杂交链)的Tm(融点温度)配合而使杂交效率维持在一个稳定的水平上；变性液为0.2M NaOH溶液。
步骤a)中的通用捕集探针为接头分子的通用部分。
固相引物法a)在耐热且透明的反应孔表面包被特异性的DNA引物(寡核苷酸，长度为20到30个核苷酸)。利用该固相化的引物来进行PCR扩增反应，使PCR产物中的一条链直接固化在反应孔壁上。该链就可作为被扩增另一条互补链的模板。在将PCR产物变性后的条件下，又可作为被扩增另一条互补链的捕集探针，例乙型肝炎下游引物5’-ccaataccacatcatccac-3’b)在上述反应孔中加入1体积(10ul-20ul)的2×PCR主反应液和1体积的样品液，进行固相引物PCR反应(另一个带生物素的引物存在于PCR主反应液中)，c)PCR完成后，进行洗板、酶联、洗板、显色测定与方法一所述相同，但测定用方法除可见光外还适用于荧光或化学发光检测。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例1通用捕集法对HBV PCR定性测定1)包被通用捕集探针到8×12微孔板上2)在上述板中，每孔加入10ul HBV2×PCR主反应液KCl 200mM，Tris 40mM，Taq DNA聚合酶0.5单位/10ul，HK-UNG 0.1单位/10ul，dUTP 0.5mM，HBV引物每种40ug/ml。
再加入10ul样品液，样品液制备过程如下取50ul裂解液(主要成份NaOH)加入50ul待测血清，37℃保温1小时，加入100ul样品中和液(主要成份Tris)混匀后用样品稀释液(主要成份二价Mg离子和鱼精DNA载体分子)稀释5倍，即为制备完成的样品液。
其中裂解液的制备如下称取一定量的氢氧化钠(NaOH)和叠氮钠(NaN3)，溶于超滤水，氢氧化钠的终溶度为0.5Mol/L，叠氮钠的终溶度为0.05％。
样品中和液的配方的制备如下称取一定量的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tirs.HCL)和叠氮钠(NaN3)，溶于超滤水，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的终溶度为0.5Mol/L，叠氮钠的终溶度为0.05％。
样品稀释液的配方的制备如下称取一定量的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tirs.HCL)和叠氮钠(NaN3)，溶解后量入一定量的DNA，氯化镁(MgCL2)，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的终溶度10nMol/L，叠氮钠的终溶度为0.05％。DNA终溶度为2微克/毫升，氯化镁终溶度为2.5mMol/L。
3)PCR完成后加溶入变性液(成份0.5M NaOH溶液)中的HBV接头液5ul(内含HBV接头分子20ng)，再加入杂交液100ul(0.9M MaCL柠檬酸缓冲液)37℃保温1小时。
4)洗板、酶联、第二次洗板和显色，测定，测定方法除可见光外还可适用荧光或化学发光法。
5)判读从待测样品光密度读数减去本底，判别检测结果。步骤(4)中洗板用洗涤液对孔中反应产物进行洗涤5次，每次用量300微升，然后弃去洗涤液；酶联取50毫微克/毫升的酶联液100微升加入到上述孔中，37℃保温15分钟进行酶联反应；第二次洗板用洗涤液对孔中反应产物进行洗涤5次，每次用量300微升，然后弃去洗涤液；显色孔中加入显色液100微升，25℃保持10分钟后加入停显液100微升；测定上述样品移至在波长450毫微米的酶标仪上测定光密度数。
判别测得光密度数与内对照物光密度数参比，判别检测结果。
其中洗涤液为0.15MNaCL溶液，其盐浓度对维护杂交链起了保护作用有效地洗去非特异性的吸附，保证了杂交反应的特异性；酶联液为过氧化酶和亲和素的交联物；显色液为四甲基联苯胺与过氧化氢的重量比1∶1混合液。
停显液为5％硫酸溶液。
本发明中所述的试剂、仪器均由国内生产厂家提供，如上海生工物工程公司、上海浩源生物科技术有限公司及化工化学试剂商店。实施例2 固相引物模式HBV YMDD变异株的测定1)包被PCR下游引物5’-ccaataccacatcatccac-3’到8×12微孔板上。
2)在上述条板中，每孔加入10ul YMDD2×PCR主反应液(KCL200mM，Tris 40mM，Taq DNA聚合酶0.5单位/10ul，HK-UNG0.1单位/10ul，dUTP 0.5mM，生物素标记的YMDD的上游引物400ng/10ul)YMDD的上游引物5’-CCTCAGTCCGTTTCTCA-3’17个碱基再加入10ul样品液。
样品液制备过程如下取50ul裂解液(同实施例1)加入50ul待测血清，37℃保温1小时，加入100ul样品中和液(同实施例1)混匀后用样品稀释液(同实施例1)稀释5倍，即为制备完成的样品液。
混合后进行常规PCR。
3)PCR完成后可直接洗板，再进行酶联、第二次洗板和显色、测定，各步步骤及溶液配方和实施例1所述相同，但测定方法除可见光外可适用荧光或化学发光。
4)判读从待测样品光密度读数减去本底，当该数值大于本底2.5倍时可判读为HBV YMDD变异株阳性结果。
现将上述实施例数据列入下表中
参考文献
1)蔡剑平、杨振华″人类基因组单核苷酸多态性研究对未来检验医学的影响″临床检验信息导报2000年第4期第3页。
2)Newton et.al.″Analysis of any point mutation in DNA″TheAmplification Refractroy Mutation Systen(ARMS)Nucleic AcidsRes.1989 17(7)2503-2516.
3)Allen et.al.″Identofication and Characterization ofMutations in Hepatitis B Virus Resistant toLamivudine″Hepatology 1998 27(6)1670-1677.
权利要求
1.一种PCR扩增、杂交同步法，它选自于下列方法之一通用捕集测定法或固相引物测定法。
2.根据权利要求1所述的方法，其中通用捕集测定法包括a)将通用捕集探针包被到微孔板上；b)在上述条板中，每孔加入1体积的2×PCR主反应液，再加入1体积的样品液进行常规PCR反应；c)PCR完成后，加入含接头分子的变性液5-10μl；d)在同一孔中继续加入杂交液100μl，37℃保温1小时；e)洗板、酶联、第二次洗板、显色、测定；f)判读。
3.根据权利要求1所述的测定法，其中步骤C中所述在含接头液分子的变性液中接头液分子为a)乙型肝炎病毒接头液分子；或b)丙型肝炎病毒接头液分子；或c)丙种球蛋白接头液分子；或d)爱滋病毒接头液分子；或e)结核菌接头液分子；或f)沙眼衣原体接头液分子；或其它病原体接头液分子，其接头液分子的结构为一条单链的寡核苷酸，分别由长25个碱基的通用的部分、长5到4毫微米的“空间”部分及约22-26个碱基的特异性部分构成，其特异性部分为只能与带有乙型肝为病毒PCR产物起杂交反应的乙型肝炎病毒特异性顺序、或与带有丙型肝炎病毒PCR产物起杂交反应的丙型肝炎病毒特异性顺序、或与带有丙种球蛋白PCR产物起杂交反应的丙种球蛋白特异性顺序，或与带有爱滋病毒PCR产物起杂交反应的爱滋病毒特异性顺序、或与带有结核菌PCR产物起杂交反应的结核菌特异性顺序、或与带有沙眼衣原体PCR产物起杂交反应的沙眼衣原体特异性顺序或与任一种待测的特异性顺序；上述接头分子的结构为一条单链的寡核苷酸，其长度在50到60个碱基对左右，通过PE公司的392型DNA合成仪，采用固相亚磷酸三脂法进行DNA合成；它包括三个组成部分(1).通用部分通用部分共长25个碱基，恰好和固定在磁粉或微量板上的通用探针互补，能很快地与通用探针杂交；(2).“空间”介于通用部分和特异部分之间，为了留出“空间”给二个分子形夹心式的杂交链，我们的“空间”长度是5至4nm；(3).特异性部分特异性部分紧接着“空间”，约为22-26个碱基。它的长短是由它本身的G/C％，Tm是否与通用部分配合所决定的，也决定于它自身是否有二级级构，它的顺序是选用在PCR产物，介于一对引物的中间顺序，因而只能和PCR的产物杂交而与生物素标记的引物无反应，所以保证了该部分杂交的特异性；接头液的分子结构 1)其中通用部分长25个碱基对，其顺序或用人为排列的(dA)25或5’-ACg，Acg，gAA，cgA，AAc ggA，Acg，Acgg-3’或从pBlue KS-质粒顺序中选取一段顺序；pBlue KS-质粒顺序已发表在Short，J.et al(1988)NucleicAcids Research 16(15)7583具体顺序为3’-CCg，AgA，TAg，ggT，TgA，TTg，TTCC-5’2)空间由二个空间分子(spacer-phosphoramidite)组成，每个空间为18个碳原子组成的一个长臂，可以在DNA合成仪上加入到接头分子中；具体结构为 (已发表在Nelson、P、et、(1989)Nucleic Acids Res。177187)3)特异性部分都选自各待测病原体核酸的全序列中，HBV，HCV，HIV，TB，CT，β-globin等都可在“基因文库”中查找出来；例它们的具体结构为(1)HBV 5’-TAAAGAGAGGTGCGCCCCGTGGTC-3’(2)HCV 5’-AGCCATAGTGGTCTGCGAAC-3’(3)HIV 5’-GTTAAAAGAGACCATCAATGAGGAA-3’(4)TB 5’-GCGCTTTAGCGGTGTGGGATGA-3’(5)CT 5’-GATGAAAGACAGGAAATACGCAGA-3’(6)丙种球蛋白5’-ACTTTCTTGCCATGAGCCTTCACCT-3’其中步骤a所述的通用捕集探针为其通用部分。
4.根据权利要求2所述的方法，其中步骤b)的PCR主反应液氯化钾200mM、三羟甲基氨基甲烷40mM，Taq DNA聚合酶0.5/10ul，尿嘧啶糖基化酶(UNG)1U/10ul、dNTP0.5mM、引物40μg/ml；样品液(HBV)制备过程如下取50μl裂解液加入50μl待测血清，37℃保温1小时，加入100ul样品中和液(主要成分Tris)混匀后用样品稀释液(主要成分二价Mg离子和鱼精DNA载体分子)稀释5倍。
5.根据权利要求2所述的方法，其中步骤C)的变性液为0.5M NaOH溶液，步骤d的杂交液为0.9M NaCL柠檬酸缓冲液。
6.根据权利要求2所述的方法，其中步骤C)中测定可用可见光、荧光或化学发光进行检测。
7.根据权利要求1所述的方法，其中固相引物测定法包括a)在耐热且透明的反应孔表面包被特异于待测病毒体的DNA引物(寡核苷酸，长度为20到30个核苷酸)；b)在上述反应孔中加入1体积(10ul-20ul)的2×PCR主反应液和1体积的样品液，进行固相引物PCR反应；c)PCR完成后，洗板、酶联、第二次洗板，显色测定，测定方法可用可见、荧光或化学发光检测；d)判读。
8.根据权利要求7所述的方法，其中步骤b)的PCR主反应液为KCL 200mM，Tris 40mM，Taq DNA聚合酸0.5单位/10ulHK-UNG 0.1单位/10ul，dUTP 0.5mM，生物素标记的引物400ng/10ul；样品液(HBV)的制备如下取50ul裂解液，加入50ul待测血清，37℃保温1小时，加入100ul样品中和液(主要成分Tris)混匀后用样品稀释液稀释5倍。
全文摘要
本发明公开了一种将PCR对核酸(DNA或RNA)扩增以及扩增产物的检测合为一步的方法，包括固相化引物的PCR反应技术和洗板、显色(或荧光)终点测定三个步骤，大大减少了试剂消耗及检测时间，使整个检测能在3－4小时内完成，灵敏度也达到10
文档编号C12Q1/68GK1398984SQ0112350
公开日2003年2月26日 申请日期2001年7月26日 优先权日2001年7月26日
发明者黄道培 申请人:黄道培