专利名称：高效表达干扰素的肿瘤细胞内特异性增殖的腺病毒及其构建方法
技术领域：
本发明涉及生命科学领域，具体涉及一种能高效表达干扰素的肿瘤细胞内特异性增殖的腺病毒，及其构建和增殖的方法。
恶性肿瘤严重危及人类的生命健康。目前对恶性肿瘤的常规治疗仍为手术及放、化疗，这种常规治疗对极大多数肿瘤的疗效仍不十分理想，对于极大多数化疗药物而言，其治疗指数仍较低，即其治疗剂量与毒性剂量较为接近。故这种治疗方案通常伴有明显的毒性作用，包括危及生命的骨髓抑制等。因此，研究选择性杀灭肿瘤细胞而不影响正常细胞的方法对肿瘤治疗非常重要，这种选择性杀灭肿瘤细胞的方法主要依赖于肿瘤细胞的特异性标记，其疗效也决定于该肿瘤标记是否严格限制于肿瘤细胞内。
干扰素可分为I及II型两类干扰素。
I型干扰素包括干扰素-α及干扰素-β。干扰素-α主要由单核吞噬细胞产生，此外，B淋巴细胞和成纤维细胞也能合成干扰素-α；干扰素-β则主要由成纤维细胞产生。人干扰素-α和干扰素-β基因连锁位于9号染色体。干扰素-α家族的基因至少有20个，约1-2kb长，无内含子，可编码约20个结构相关的、分子量约18-26kDa不等的多肽，含189-195个氨基酸残基，包括23个氨基酸的信号肽。干扰素-β基因只有一个，约777bp，无内含子，编码187个氨基酸残基组成的蛋白，包括21个氨基酸的信号肽。I型干扰素可抑制部分肿瘤细胞增殖，促进组织相容性复合体(MHC)-I类分子表达，增强细胞毒T细胞的杀伤效应，增强自然杀伤细胞(NK细胞)及巨噬细胞杀伤活性。抑制肿瘤新生血管生成。
II型干扰素即干扰素-γ。主要由活化的T细胞(包括TH0、TH1细胞)和NK细胞。人干扰素-γ基因位于12号染色体，6kb长，含4个外显子和3个内含子，编码166个氨基酸组成的蛋白，包括23个氨基酸的信号肽。干扰素-γ干扰素促进组织相容性复合体(MHC)-I类及MHC-II分子表达，激活单核/巨噬细胞系统，促进静止的CD4+T细胞分化为TH1细胞，并抑制TH2细胞的增殖，增强细胞毒T细胞的成熟及杀伤活性，增强自然杀伤细胞(NK细胞)，抑制肿瘤新生血管生成。
肿瘤特异性增殖的病毒的根据肿瘤细胞与正常细胞某些生物学特性的差异，经过改造的病毒只能特异性地在肿瘤细胞内增殖、裂解肿瘤细胞，然后释放出病毒颗粒，再次感染其它肿瘤细胞，再次增殖、裂解，如此产生放大效应，由于病毒能够弥散到全身各个组织及脏器，因而能感染所有肿瘤细胞，从而杀灭局部及转移的肿瘤，而不影响正常细胞。
但迄今为止，尚未见到应用肿瘤特异性增殖的病毒系统高效表达干扰素的报告。
本发明的目的在于提供一类能高效表达干扰素的肿瘤细胞内特异性增殖的腺病毒及其构建方法。
本发明的目的在于提供一类能高效表达干扰素的肿瘤细胞内特异性增殖的腺病毒的复合物。
本发明的目的在于研究上述能高效表达干扰素的肿瘤细胞内特异性增殖的腺病毒的应用。
本发明提供一类能高效表达干扰素的肿瘤细胞内特异性增殖的腺病毒，将编码干扰素的核苷酸序列插入肿瘤细胞内特异性增殖的腺病毒基因组中的非增殖必需区域，该腺病毒选择性地在肿瘤细胞内增殖，而在正常细胞内基本不增殖，通过腺病毒在肿瘤细胞内复制增殖，导致编码干扰素的核苷酸序列拷贝数增加，从而干扰素基因表达量增加，该肿瘤细胞内特异性增殖的病毒可以是以下任何一种(1)腺病毒增殖必需基因的转录起始点与编码起始位点之间插入肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件；(2)腺病毒可以是下述任何一种蛋白功能缺失腺病毒E1B 55Kda蛋白功能缺失，腺病毒E1B 19Kda蛋白功能缺失，腺病毒E1A蛋白功能缺失。
上述重组病毒可以是腺病毒中任何一种型，编码干扰素的核苷酸序列可以是编码干扰素-α的核苷酸序列等。
本发明提供一类能高效表达干扰素的肿瘤细胞内特异性增殖的腺病毒的构建方法，(1)将编码干扰素的核苷酸序列直接插入肿瘤细胞内特异性增殖的腺病毒基因组中的非增殖必需区域；(2)腺病毒增殖必需基因的转录起始点与编码起始位点之间插入肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件；顺式作用元件可以是下述任何一种(a).甲胎蛋白(AFP)增强子及启动子；(b).癌胚抗原(CEA)增强子及启动子；(c).酪氨酸酶增强子及启动子；(d).ErbB2增强子及启动子；(e).ErbB3增强子及启动子；(f).ErbB4增强子及启动子；(g).DF3乳腺癌相关抗原(MUC1)增强子；(h).前列腺素特异性抗原增强子及启动子；(i).腺血管舒缓素增强子及启动子；(j).EB病毒爱泼斯坦氏-巴尔氏病毒(Epstein-Barr virus，按常规简称为EB病毒)中的Orip；(k).EB病毒Orip中的family of 30bp repeats(按常规简称为FR)；(1)EB病毒BamHI C-启动子；(m).EB病毒中的Orip联合EB病毒BamHI C-启动子；(n).EB病毒Orip中的FR联合单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本启动子或SV40基本启动子；(3)腺病毒的蛋白功能缺失可以是下述任何一种腺病毒E1B 55Kda蛋白功能缺失，腺病毒E1B 19Kda蛋白功能缺失，腺病毒E1A蛋白功能缺失。
腺病毒在肿瘤细胞内特异性增殖及复制，而在正常细胞不增殖及复制，主要通过以下方法实现(1)选择性对腺病毒增殖必需基因的控制基因转录激活的调节受反式作用因子(如转录因子)与顺式作用元件相互作用的影响。当缺乏或出现某些转录因子会影响基因的转录水平。应用肿瘤组织特异性激活顺式作用元件(包括启动子或增强子)控制目的基因，使该目的基因特异性在肿瘤细胞内表达，而在正常的细胞内不表达或低水平表达。本发明应用肿瘤组织特异性启动子或增强子来控制腺病毒增殖及复制的必需基因，从而使腺病毒增殖必需基因只能在肿瘤的细胞中表达，导致腺病毒只能在肿瘤的细胞内增殖，而在正常细胞内基本不增殖。
本发明采用细胞专一的反应元件是由肿瘤细胞特异性激活顺式作用元件组成，其顺式作用元件可以是下述任何一种甲胎蛋白(AFP)增强子及启动子为肝癌细胞特异性激活增强子及启动子。
癌胚抗原(CEA)增强子及启动子为胃癌及结肠癌细胞特异性激活增强子及启动子。
酪氨酸酶增强子及启动子为黑色素瘤细胞特异性激活增强子及启动子。
ErbB2增强子及启动子为乳腺癌细胞特异性激活增强子及启动于。
ErbB3增强子及启动子为乳腺癌细胞特异性激活增强子及启动子。
ErbB4增强子及启动子为乳腺癌及胃癌细胞特异性激活增强子及启动子。
DF3乳腺癌相关抗原(MUC1)增强子为乳腺癌细胞特异性激活增强子及启动子。
前列腺素特异性抗原增强子及启动子，该前列腺素特异性抗原增强子位于前列腺素特异性抗原起始转录位点的nt-5322～nt-3739，启动子位于前列腺素特异性抗原起始转录位点的nt-540～nt+12，该增强子与启动子特异性激活于前列腺细胞及前列腺癌细胞。
腺血管舒缓素增强子及启动子特异性激活于前列腺细胞及前列腺癌细胞。
爱泼斯坦氏-巴尔氏病毒(Epstein-Barr virus，按常规简称为EB病毒)中的Orip、EB病毒Orip中的FR、EB病毒BamHI C-启动子、EB病毒中的Orip联合EB病毒BamHI C-启动子、EB病毒Orip中的FR联合单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本启动子或SV40基本启动子、在EB病毒感染或潜伏感染细胞中特异性激活的顺式作用元件。
本发明提出的在于提供一类能特异性杀灭肿瘤细胞的增殖型重组腺病毒，它至少有一个腺病毒增殖所必需的基因的肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件制。它由在腺病毒增殖必需基因的转录起始位点与编码起始位点之间区域插入某种顺式作用元件而构成。该顺式作用元件特异性在肿瘤细胞内激活，产生转录活性，而在正常细胞内不激活，不能产生转录活性。该顺式作用元件可以是下述顺序之一甲胎蛋白(AFP)增强子及启动子，癌胚抗原(CEA)增强子及启动子，酪氨酸酶增强子及启动子，ErbB2增强子及启动子，ErbB3增强子及启动子，ErbB4增强子及启动子，DF3乳腺癌相关抗原(MUC1)增强子，前列腺素特异性抗原增强子及启动子，腺血管舒缓素增强子及启动子，EB病毒中的Orip、EB病毒Orip中的FR、EB病毒BamHI C-启动子、EB病毒中的Orip联合EB病毒BamHI C-启动子、EB病毒Orip中的FR联合单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本启动子或SV40基本启动子、在EB病毒感染或潜伏感染细胞中特异性激活的顺式作用元件。
本发明中，采用腺病毒增殖必需基因至少含有以下一个腺病毒的早期表达基因E1A、E1B、E2、E4。
(2).腺病毒在正常细胞复制必需而在肿瘤细胞中非必需的基因编码的蛋白功能选择性地缺失正常细胞与肿瘤存在着某些基因表达上的差异，某些腺病毒在正常细胞内复制所必需的基因，在肿瘤细胞内并不需要，因此，去除这些基因编码的蛋白功能有望使在肿瘤细胞内特异性复制，而不能在正常细胞中复制。
腺病毒蛋白功能缺失可以是以下任何一种腺病毒E1B 55kDa的基因点突变、缺失突变、插入突变导致E1B 55kDa蛋白质功能异常。腺病毒E1B 19kDa的基因点突变、缺失突变、插入突变导致E1B 19kDa蛋白质功能异常。腺病毒E1A的基因点突变、缺失突变、插入突变导致E1A蛋白质功能异常。
(3).依赖于肿瘤细胞某个信号转导途径异常而产生的病毒复制，呼吸道肠道过滤性病毒(Reovirus)感染后其早期病毒基因转录可激活双链RNA依赖的蛋白激酶(PKR)，而该激酶可抑制该病毒的其它基因的转录，从而使病毒不能有效复制，而当细胞中Ras处于激活状态则可抑制该激酶，从而使该病毒活跃复制。Ras基因是一个癌基因，当它被不正常激活时，即可能发生癌变。呼吸道肠道过滤性病毒复制及增殖依赖于Ras异常激活的信号途径，即在Ras高表达的肿瘤细胞内复制及增殖。
(4).选择性进入肿瘤细胞改变它们表面的结合蛋白可使其与某些特定的肿瘤组织结合，从而使病毒只能感染特定的肿瘤组织。目前这方面改造主要集中于腺病毒外壳蛋白--纤维蛋白(Fiber)、五邻体(penton)及六邻体蛋白(hexon)，尤其在纤维蛋白中头部HI环中或C末端最常见，包括插入肿瘤膜表面具有高亲和力的某种配体、短肽及抗体Fab区域。
干扰素广泛应用于抗病毒治疗，具有抑制肿瘤细胞生长及抑制肿瘤新生血管形成，激活多种抗肿瘤免疫机制。研究表明干扰素在体内有明显抑制肿瘤的作用。
本发明提供一类能高效表达干扰素的肿瘤细胞内特异性增殖的腺病毒，其编码干扰素的核苷酸序列为编码干扰素-α的核苷酸序列。
本发明提供一类能高效表达干扰素的肿瘤细胞内特异性增殖的腺病毒，其编码干扰素的核苷酸序列为编码干扰素-β的核苷酸序列。
本发明提供一类能高效表达干扰素的肿瘤细胞内特异性增殖的腺病毒，其编码干扰素的核苷酸序列为编码干扰素-γ的核苷酸序列。
本发明提供一类能高效表达干扰素的肿瘤细胞内特异性增殖的腺病毒，其编码干扰素的核苷酸序列受启动子控制。该启动子可以为以下启动子之一猴病毒40(Simian virus40，按常规简称为SV40)启动子、劳斯氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus，按常规简称为RSV)LTR启动子及人巨细胞病毒(按常规简称为HCMV)IE启动子等。
本发明在上述这种修饰病毒基因组中非增殖必需区域插入编码干扰素的核苷酸序列，本发明所述的编码干扰素的核苷酸序列为干扰素-α(interferon-α，简记为IFN-α)、干扰素-β(interferon-β，简记为IFN-β)及干扰素-γ(interferon-γ，简记为IFN-γ)基因。随着病毒在肿瘤细胞内复制，使编码干扰素的核苷酸序列拷贝数增加，使肿瘤细胞高效表达干扰素，抑制肿瘤细胞生长及血管形成，激发免疫反应，从而抑制肿瘤形成、生长及转移。同时，这种修饰后的病毒载体可被用于在某些细胞混合物中杀灭某种特殊靶细胞，通过给予修饰后的病毒能选择性地在该种靶细胞中增殖，从而使这种靶细胞被增殖的病毒选择性的杀灭；在体外培养或在动物体内通过将修饰后的病毒与细胞复合物混合，病毒只能在靶细胞增殖，也就是说除了靶细胞，其它细胞不能被这种病毒杀死。由于病毒在靶细胞内增殖及扩增，从而使混合细胞中的该靶细胞被杀灭，一旦靶细胞被破坏，病毒不能够再增殖。
本发明提出的高效表达干扰素的肿瘤细胞内特异性增殖的腺病毒与化学治疗药物(如顺铂、5-氟脲嘧啶丝裂霉素C等)、生物毒素(如蛇毒素)、单克隆抗体一起可以组成复合物，其作为抗肿瘤药物效果更好。与X-线联合应用可产生更为有效的抗肿瘤效应。
本发明提供一类能高效表达干扰素的肿瘤细胞内特异性增殖的腺病毒，用于抑制肿瘤细胞的生长。
本发明提供一类能高效表达干扰素的肿瘤细胞内特异性增殖的腺病毒，用于体外感染肿瘤细胞，病毒在肿瘤细胞内复制及增殖，导致编码干扰素的核苷酸序列拷贝数增加及干扰素表达量增加。
本发明提供一类能高效表达干扰素的肿瘤细胞内特异性增殖的腺病毒，可用于体内选择性地在肿瘤细胞内复制及增殖，导致编码干扰素的核苷酸序列拷贝数增加及其表达量增加，抑制肿瘤细胞生长及血管形成，激发免疫反应，从而抑制肿瘤形成、生长及转移。同时该病毒能在而且仅限于肿瘤细胞内增殖，也能特异性直接杀灭肿瘤细胞。
本发明具有如下有益效果1.本发明提供一类治疗肿瘤的能高效表达干扰素的肿瘤细胞内特异性增殖的腺病毒，动物实验证明，这种重组腺病毒可用于治疗肿瘤。
2.本发明提供一类高效表达干扰素的肿瘤细胞内特异性增殖的腺病毒的构建方法。该方法通常易行可用于构建高效表达干扰素的肿瘤细胞内特异性增殖的腺病毒。
3.本发明提供一种在体内及体外杀灭肿瘤细胞、而不影响正常细胞，并在体内及体外肿瘤细胞内高效表达干扰素，与化学抗肿瘤药物结合，更有效地杀灭肿瘤细胞，达到高效低毒应用于治疗肿瘤的目的。
人类腺病毒有6个不同亚属，分为A、B、C、D、E及F。它们对宿主细胞的亲嗜性、致瘤性及疾病性史并不相同。本发明以腺病毒C亚属中的5型(Ad5)作为例证对本发明加以进一步具体说明，本发明构建手段均是现有技术人员能够实现。
例一、携带人干扰素-α(hIFN-α)、小鼠干扰素-α(mIFN-α)、人干扰素-β(hIFN-β)、小鼠干扰素-β(mIFN-β)、人干扰素-γ(hIFN-γ)基因及小鼠干扰素-γ(mIFN-γ)的E1区缺失的腺载体的构建pCA13及pCA14载体购于加拿大Microbix BiosystemInc.(Toronto)，pCA13及pCA14含有5型腺病毒序列bp22-5790并缺失E1区342至3523bp片段，在E1缺失区插入了人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)及SV40 poly A加尾信号。人与小鼠的干扰素-α(IFN-α)基因、人与小鼠的干扰素-β(IFN-β)基因、人与小鼠的干扰素-γ(IFN-γ)基因购于美国InvivoGen公司，人干扰素-α(hIFN-α)基因来源于美国InvivoGen公司质粒pORF-hIFN-α、小鼠的干扰素-α(mIFN-α)基因来源于美国InvivoGen公司质粒pORF-mIFN-α、人干扰素-β(hIFN-β)基因来源于美国InvivoGen公司质粒pORF-hIFN-β、小鼠的干扰素-β(mIFN-β)基因来源于美国InvivoGen公司质粒pORF-mIFN-β、人干扰素-γ(hIFN-γ)基因来源于美国InvivoGen公司质粒pORF-hIFN-γ及小鼠的干扰素-γ(mIFN-γ)基因来源于美国InvivoGen公司质粒pORF-mIFN-γ。
携带人干扰素-α(hIFN-α)及小鼠干扰素-α(mIFN-α)、的E1区缺失的腺载体的构建。
将pORF-hIFN-α质粒用Age I+Nhe I双酶切，得含有人IFN-α基因的588bp片段，将其定向插入pUC19质粒(购于美国ATCC公司)的Xma I及Xba I位点，命名为pUC19-hIFN-α。应用EcoR I+Sal I双酶切pUC19-hIFN-α，获得含有人IFN-α基因的602bp片段，将其定向插入pCA14质粒EcoR I+SalI酶切位点中，命名pCA14-hIFN-α。
应用多聚酶链反应(PCR)技术扩增小鼠IFN-α基因，以pORF-mIFN-α质粒为模板进行PCR，
引物1(含EcoR I酶切位点5’-mIFN-α引物)TTG GAA TTC ACC ATGGCT AGG CTC TGT GC引物2(含BamH I酶切位点3’-mIFN-α引物)GCG GGA TCC TTA TCACTC CTC CTT GCT CAPrimer1与primer2进行PCR扩增，回收5 70bp片段，应用EcoRI+BamH I酶切，将该基因插入pUC19载体(购于美国ATCC公司)中进行测序，其测序结果表明小鼠IFN-α基因正确，命名为pUC19-mIFN-α。应用EcoR I+BamH I双酶切，获得含有mIFN-α基因的570bp片段，将其定向插入pCA13质粒EcoR I+BamH I酶切位点中，命名pCA13-mIFN-α。
携带人干扰素-β3(hIFN-β)及小鼠干扰素-β(mIFN-β)的E1区缺失的腺载体的构建。
应用多聚酶链反应(PCR)技术扩增人IFN-β基因，以pORF-hIFN-β质粒为模板进行PCR，引物3(含EcoR I酶切位点5’-hIFN-β引物)CCG GAA TTC CGG ATGACC AAC AAG TGT CTC引物4(含BamH I酶切位点3’-hIFN-β引物)CGC GGA TCC GCG TCAGTT TCG GAG GTA ACCPrimer3与primer4进行PCR扩增，回收570bp片段，应用EcoRI+BamH I酶切，将该基因插入pUC19载体(购于美国ATCC公司)中进行测序，其测序结果表明人IFN-β基因正确，命名为pUC19-hIFN-β。应用EcoR I+BamH I双酶切，获得含有hIFN-β基因的574bp片段，将其定向插入pCA13质粒EcoR I+BamH I酶切位点中，命名pCA13-hIFN-β。
将pORF-mIFN-β质粒用SgrAI+Nhe I双酶切，得含小鼠IFN-β基因的601bp片段，将其定向插入pUC19质粒(购于美国ATCC公司)的Xma I及Xba I位点，命名为pUC19-mIFN-β。应用EcoR I+SalI双酶切pUC19-mIFN-β，获得含有小鼠IFN-β基因的615bp片段，将其定向插入pCA14质粒EcoR I+Sal I酶切位点中，命名pCA14-mIFN-β。
携带人干扰素-γ(hIFN-γ)基因及小鼠干扰素-γ(mIFN-γ)的E1区缺失的腺载体的构建。
将pORF-hIFN-γ质粒用SgrAI+Nhe I双酶切，得含人IFN-γ基因的522bp片段，将其定向插入pUC19质粒(购于美国ATCC公司)的Xma I及Xba I位点，命名为pUC19-hIFN-γ。应用EcoR I+Sal I双酶切pUC19-hIFN-γ，获得含有人IFN-γ基因的537bp片段，将其定向插入pCA14质粒EcoR I+Sal I酶切位点中，命名pCA14-hIFN-γ。
应用多聚酶链反应(PCR)技术扩增人鼠IFN-γ基因，以pORF-mIFN-γ质粒为模板进行PCR，引物5(含EcoR I酶切位点5’-mIFN-γ引物)CCG GAA TTC ATG GCTGTT TCT GGC TGT TAC TGC C引物6(含BamH I酶切位点3’-mIFN-γ引物)AAT GGA TCC TCA GCAGCG ACT CCT TTT CCG CTT CPrimer5与primer6进行PCR扩增，回收4 50bp片段，应用EcoRI+BamH I酶切，将该基因插入pUC19载体(购于美国ATCC公司)中进行测序，其测序结果表明小鼠IFN-γ基因正确，命名为pUC19-mIFN-γ。应用EcoR I+BamH I双酶切，获得含有mIFN-γ基因的450bp片段，将其定向插入pCA13质粒EcoR I+BamH I酶切位点中，命名pCA13-mIFN-γ。例二、腺病毒E1b 55Kda蛋白基因部分缺失及在缺失区插入终止密码子载体的构建pXC.1载体购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，pXC.1含有5型腺病毒序列bp22-5790。应用内切酶Bgl II将该载体在3329bp中切开，然后用内切酶Hind III再作部分酶切，回收9372bp DNA片段，应用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段对3’凹端补平，即为pXC.1载体中缺失2809bp-3329bp区域(具体方法参见分子克隆实验指南，科学出版1992出版)。
合成两个DNA寡核苷酸片段做一个连接头，其DNA寡核苷酸序列为primer7 TAATGAGTAACTAAprimer8 TTAGTTACTCATTA将两个DNA寡核苷酸片段各0.1μg混合，100℃变性5分钟，然后缓慢降温复性，复性后应用T4噬菌体多核苷酸激酸进行磷酸化。将该磷酸化后的连接头与缺失2809-3329bp区域的pXC.1载体片段进行连接，命名为pXC-del Elb(方法参见分子克隆实验指南，科学出版社1992出版)。在插入连接头两端附近位置中合成引物，分别为primer 9 CTG GCC AAT ACC AAC CTT Aprimer10 ATA TGA GCT CAC AAT GCT TC对pXC-del Elb进行聚合酶链式反应(PCR)进行体外扩增(方法参见分子克隆实验指南，科学出版社1992出版)，其PCR产物进行测序。结果显示CTGGCCAATACCAACCTTATCCTACACGGTGTAAGCTTAATGAGTAACTAAGATCTGGAAGGTGCTGAGGTACGATGAGACCCGCACCAGGTGCAGACCCTGCGAGTGTGGCGGTAAACTATTAGGAACCAGCCTGTGATGCTGGATGTGACCGAGGAGCTGAGGCCCGATCACTTGGTGCTGGCCTGCACCCGCGCTGAGTTTGGCTCTAGCGATGAAGATACAGATTGAGGTACTGAAATGTGTGGGCGTGGCTTAAGGGTGGGAAAGAATATATAAGGTGGGGGTCTTATGTAGTTTTGTATCTGTTTTGCAGCAGCCGCCGCCGCCATGAGCACCAACTCGTTTGATGGAAGCATTGTGAGCTCATAT，这表明pXC-del E1b为pXC.1载体中缺失了2809-3329区域并在该区域中插入TAATGAGTAACTAA，并在两个终止密码子后保留了Bgl II酶切位点。例三、携带人干扰素-α(hIFN-α)、小鼠干扰素-α(mIFN-α)、人干扰素-β(hIFN-β)、小鼠干扰素-β(mIFN-β)、人干扰素-γ(hIFN-γ)基因及小鼠干扰素-γ(mIFN-γ)的E1b 55Kda蛋白基因部分缺失的腺病毒载体的构建应用Bgl II分别酶切pCA14-hIFN-α、pCA13-mIFN-α、pCA13-hIFN-β、pCA14-mIFN-β、pCA14-hIFN-γ及pCA13-mIFN-γ，分别回收1188bp(含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含有人干扰素-α及SV40 poly A加尾信号)、1139bp(人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、小鼠干扰素-α及SV40 poly A加尾信号)，1143bp(人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、人干扰素-β及SV40 poly A加尾信号)，1201bp(人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、小鼠干扰素-β及SV40 poly A加尾信号)，1123bp(人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、人干扰素-γ及SV40 poly A加尾信号)及1019bp(人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、小鼠干扰素-γ及SV40 poly A加尾信号)，将其插入pXC-del Elb Bgl II酶切位点。
应用PCR技术分别验证其插入的正方向其Bgl II上游引物primer9CTG GCC AAT ACC AAC CTT A，分别与人干扰素-α(hIFN-α)、小鼠干扰素-α(mIFN-α)、人干扰素-β(hIFN-β)、小鼠干扰素-β(mIFN-β)、人干扰素-γ(hIFN-γ)基因及小鼠干扰素-γ(mIFN-γ)3’-primer进行扩增引物11(3’-hIFN-α引物)TCA AGA TGA GCC CAG GTC引物12(3’-mIFN-α引物)TTA TCA CTC CTC CTT GCT CA引物13(3’-hIFN-β引物)GCG TCA GTT TCG GAG GTA ACC引物14(3’-mIFN-β引物)GCT CAG TTT TGG AAG TTT C引物15(3’-hIFN-γ引物)TTA CTG GGA TGC TCT TCG引物16(3’-mIFN-γ引物)GCA GCG ACT CCT TTT CCG CTT C其PCR扩增长度分别为1080bp、1031bp、1035bp、1123bp、1015bp及1001bp。表明含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子+人干扰素-α+SV40 poly A加尾信号、人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子+小鼠干扰素-α+SV40 poly A加尾信号、人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子+人干扰素-β+SV40 poly A加尾信号、人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子+小鼠干扰素-β+SV40 poly A加尾信号、人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子+人干扰素-γ+SV40 poly A加尾信号及人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子+小鼠干扰素-γ+SV40 poly A加尾信号，正向插入pXC-delElb Bgl II酶切位点，分别命名为pXC-del Elb-hIFN-α、pXC-delElb-mIFN-α、pXC-del Elb-hIFN-β、pXC-del Elb-mIFN-β、pXC-del Elb-hIFN-γ及pXC-del Elb-mIFN-γ。例四、携带人干扰素-α(hIFN-α)、小鼠干扰素-α(mIFN-α)、人干扰素-β(hIFN-β)、小鼠干扰素-β(mIFN-β)、人干扰素-γ(hIFN-γ)基因及小鼠干扰素-γ(mIFN-γ)的Elb 55Kda蛋白基因部分缺失的腺病毒载体的重组E1转化人胚胎肾细胞株293细胞株购于加拿大MicrobixBiosystem Inc.(Toronto)，是由剪切的5型腺病毒DNA转化人胚胎肾细胞而成，它含有及表达5型腺病毒E1区，腺病毒DNA对其具有高转染率。将含有5型腺病毒左臂的质粒联合含有5型腺病毒右臂的质粒共转染293细胞，通过同源重组可产生具有感染力的腺病毒。我们将pXC-del Elb-hIFN-α、pXC-del Elb-mIFN-α、pXC-delElb-hIFN-β、pXC-del Elb-mIFN-β、pXC-del Elb-hIFN-γ及pXC-delElb-mIFN-γ分别与含有5型腺病毒右臂的质粒pBHGE3通过Lipofectamine共转染至293细株，其具体方法参见GIBCO BRL公司的操作说明。pBHGE3 购于加拿大Microbix BiosystemsInc.(Ontario)。共转染后9-14天出现病毒空斑，经过三次病毒空斑纯化，该腺病毒命名为CNHK200-hIFN-α、CNHK200-mIFN-α、CNHK200-hIFN-β、CNHK200-mIFN-β、CNHK200-hIFN-γ及CNHK200-mIFN-γ，具体方法参见Gene Transfer and ExpressionProtocols，Murray EJ主编，Humana Press 1991出版。
病毒的产生及基因组结构重组腺病毒方法参见例一内容。其名称见下病毒名称 含Ad5左臂质粒含Ad5右臂质粒Ad5-del Elb- PXC-del Elb-CNHK200-hIFN-αPBHGE3hIFN-α hIFN-αAd5-del Elb- PXC-del Elb-CNHK200-mIFN-αPBHGE3mIFN-α mIFN-αAd5-del Elb- PXC-del Elb-CNHK200-hIFN-β PBHGE3hIFN-β hIFN-βAd5-del Elb- PXC-del Elb-CNHK200-mIFN-β PBHGE3mIFN-β mIFN-βAd5-del Elb- PXC-del Elb-CNHK200-hIFN-γ PBHGE3hIFN-γ hIFN-γAd5-del Elb- PXC-del Elb-CNHK200-mIFN-γ PBHGE3mIFN-γ mIFN-γ腺病毒在293细胞中大量繁殖，应用氯化铯梯度离心的方法大量纯化腺病毒(具体方法参见Gene Transfer and ExpressionProtocols，Murray EJ主编，Humana Press 1991出版)。Ad5-del Elb-hIFN-α(CNHK200-hIFN-α)为5型腺病毒，在2809-3329bp区域(Elb 55Kda蛋白基因部分序列)缺失突变，并在缺失突变区域中插入含有两个终止密码子的序列TAATGAGTAACTAA，并在终止密码子后BglI I酶切位点中正向插入含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含有人干扰素-α及SV40 poly A加尾信号基因序列，病毒其他DNA序列与5型腺病毒相同。
Ad5-del Elb-mIFN-α(CNHK200-mIFN-α)为5型腺病毒，在2809-3329bp区域(Elb 55Kda蛋白基因部分序列)缺失突变，并在缺失突变区域中插入含有两个终止密码子的序列TAATGAGTAACTAA，并在终止密码子后Bgl II酶切位点中正向插入含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含有小鼠干扰素-α及SV40 poly A加尾信号基因序列，病毒其他DNA序列与5型腺病毒相同。
Ad5-del Elb -hIFN-β(CNHK200-hIFN-β)为5型腺病毒，在2809-3329bp区域(Elb 55Kda蛋白基因部分序列)缺失突变，并在缺失突变区域中插入含有两个终止密码子的序列TAATGAGTAACTAA，并在终止密码子后Bgl II酶切位点中正向插入含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含有人干扰素-β及SV40 poly A加尾信号基因序列，病毒其他DNA序列与5型腺病毒相同。
Ad5-del Elb-mIFN-β(CNHK200-mIFN-β)为5型腺病毒，在2809-3329bp区域(Elb 55Kda蛋白基因部分序列)缺失突变，并在缺失突变区域中插入含有两个终止密码子的序列TAATGAGTAACTAA，并在终止密码子后Bgl II酶切位点中正向插入含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含有小鼠干扰素β及SV40 poly A加尾信号基因序列，病毒其他DNA序列与5型腺病毒相同。
Ad5-del Elb-hIFN-γ(CNHK200-hIFN-γ)为5型腺病毒，在2809-3329bp区域(Elb 55Kda蛋白基因部分序列)缺失突变，并在缺失突变区域中插入含有两个终止密码子的序列TAATGAGTAACTAA，并在终止密码子后Bgl II酶切位点中正向插入含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含有人干扰素-γ及SV40 poly A加尾信号基因序列，病毒其他DNA序列与5型腺病毒相同。
Ad5-del Elb-mIFN-γ(CNHK200-mIFN-γ)为5型腺病毒，在2809-3329bp区域(Elb 55Kda蛋白基因部分序列)缺失突变，并在缺失突变区域中插入含有两个终止密码子的序列TAATGAGTAACTAA，并在终止密码子后Bgl II酶切位点中正向插入含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含有小鼠干扰素γ及SV40 poly A加尾信号基因序列，病毒其他DNA序列与5型腺病毒相同。例五、携带人干扰素-α(hIFN-α)、小鼠干扰素-α(mIFN-α)、人干扰素-β(hIFN-β)、小鼠干扰素-β(mIFN-β)、人干扰素-γ(hIFN-γ)基因及小鼠干扰素-γ(mIFN-γ)的Elb 55Kda蛋白基因部分缺失的腺病毒体外肿瘤细胞复制、增殖并高效表达人干扰素-α(hIFN-α)、小鼠干扰素-α(mIFN-α)、人干扰素-β(hIFN-β)、小鼠干扰素-β(mIFN-β)、人干扰素-γ(hIFN-γ)基因及小鼠干扰素-γ(mIFN-γ)，并在体外特异性杀灭肿瘤细胞将CNHK200-hIFN-α、CNHK200-mIFN-α、CNHK200-hIFN-β、CNHK200-mIFN-β、CNHK200-hIFN-γ及CNHK200-mIFN-γ分别感染肝癌细胞株Hep 3B、293及正常人成纤维细胞，细胞按2×105/孔接种6孔板，分别感染重组腺病毒CNHK200-hIFN-α、CNHK200-mIFN-α、CNHK200-hIFN-β、CNHK200-mIFN-β、CNHK200-hIFN-γ、CNHK200-mIFN-γ及野生型5型腺病毒4×105pfu，48小时后应用293细胞株测定其病毒滴度，具体方法参见前述文献2，结果为正常成纤维细293 Hep3B胞野生型5型腺病毒1×1057×1045×104CNHK200-hIFN-α1×1058×1041×10CNHK200-mIFN-α1×1057.5×1041.5×10CNHK200-hIFN-β1×1056.0×1041.5×10CNHK200-mIFN-β1×1057.8×1042×10CNHK200-hIFN-γ1×1054.9×1042×10CNHK200-mIFN-γ1×1059×1042×10将肝癌细胞株Hep3B及正常人成纤维细胞分别感染重组腺病毒CNHK200-hIFN-α、CNHK200-mIFN-α、CNHK200-hIFN-β、CNHK200-mIFN-β、CNHK200-hIFN-γ及CNHK200-mIFN-γ，MOI为1，37℃孵育1小时，感染后7天收集细胞，应用QIAamp DNA Blood mini kit(德国QIAGEN公司)提取病毒DNA，方法参见QIAGEN公司操作说明。应用Nhe I和Xho I双酶切，用0.8％的琼脂糖电泳，将其转至尼龙膜，用32P标记人5型腺病毒1178bp BstXI加Xho I片段(位于腺病毒nt4611-5789)，进行souther blot杂交，以pXC.1作为病毒拷贝数对照(方法参见分子克隆实验指南，科学出版1992出版)，CNHK200-hIFN-α、CNHK200-mIFN-α、CNHK200-hIFN-β、CNHK200-mIFN-β、CNHK200-hIFN-γ及CNHK200-mIFN-γ在肝癌细胞株Hep3B及正常人成纤维细胞的每个细胞病毒拷贝数分别为2×104、2×104、2×104、3×104、3×104、2×104及＜10、＜10、＜10、＜10、＜10、＜10。
将上述CNHK200-hIFN-α、CNHK200-mIFN-α、CNHK200-hIFN-β、CNHK200-mIFN-β、CNHK200-hIFN-γ及CNHK200-mIFN-γ提取的DNA分别应用Bgl II酶切，用1％的琼脂糖电泳，将其转至尼龙膜，用32P分别标记人干扰素-α(hIFN-α)、小鼠干扰素-α(mIFN-α)、人干扰素-β(hIFN-β)、小鼠干扰素-β(mIFN-β)、人干扰素-γ(hIFN-γ)基因及小鼠干扰素-γ(mIFN-γ)的cDNA片段作为探针，进行souther blot杂交，以pCA14-hIFN-α、pCA13-mIFN-α、pCA13-hIFN-β、pCA14-mIFN-β、pCA14-hIFN-γ或pCA13-mIFN-γ作为病毒拷贝数对照(方法参见分子克隆实验指南，科学出版1992出版)，CNHK200-hIFN-α、CNHK200-mIFN-α、CNHK200-hIFN-β、CNHK200-mIFN-β、CNHK200-hIFN-γ及CNHK200-mIFN-γ在肝癌细胞株Hep3B及正常人成纤维细胞的每个细胞病毒拷贝数分别为2×104、2×104、2×104、3×104、2×104、3×104及＜10、＜10、＜10、＜10、＜10、＜10。例七、携带人干扰素-α(hIFN-α)、小鼠干扰素-α(mIFN-α)、人干扰素-β(hIFN-β)、小鼠干扰素-β(mIFN-β)、人干扰素-γ(hIFN-γ)基因及小鼠干扰素-γ(mIFN-γ)的Elb 55Kda蛋白基因部分缺失的腺病毒载体在裸鼠体内治疗移植肿瘤的任用.将4-5周龄的SCID小鼠皮下接种肝癌细胞株Hep 3B细胞1×107，两周后给予1×109pfu CNHK200-hIFN-α、CNHK200-mIFN-α、CNHK200-hIFN-β、CNHK200-mIFN-β、CNHK200-hIFN-γ及CNHK200-mIFN-γ或用相同剂量的对照腺病毒Ad5-Lac Z，其未治疗组及对照腺病毒治疗组4周后肿瘤体增加4倍以上，而治疗组则肿瘤明显缩小，部分肿瘤完全消失。
权利要求
1.一种能高效表达干扰素的肿瘤细胞内特异性增殖的腺病毒，其特征在于将编码干扰素的核苷酸序列插入肿瘤细胞内特异性增殖的病毒基因组中的非增殖必需区域，该病毒选择性地在肿瘤细胞内增殖，而在正常细胞内基本不增殖，通过病毒在肿瘤细胞内复制增殖，导致编码干扰素的核苷酸序列拷贝数增加，从而干扰素基因表达量增加，该肿瘤细胞内特异性增殖的腺病毒可以是以下任何一种(1)腺病毒增殖必需基因的转录起始点与编码起始位点之间插入肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件；(2)腺病毒可以是下述任何一种蛋白功能缺失腺病毒E1B55Kda蛋白功能缺失，腺病毒E1B 19Kda蛋白功能缺失，腺病毒E1A蛋白功能缺失
2.根据权利要求1所述能高效表达干扰素的肿瘤细胞内特异性增殖的腺病毒的构建方法，其特征在于(1)将编码干扰素的核苷酸序列直接插入肿瘤细胞内特异性增殖的腺病毒基因组中的非增殖必需区域；(2)腺病毒增殖必需基因的转录起始点与编码起始位点之间插入肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件；顺式作用元件可以是下述任何一种(a).甲胎蛋白增强子及启动子；(b).癌胚抗原增强子及启动子；(c).酪氨酸酶增强子及启动子；(d).ErbB2增强子及启动子；(e).ErbB3增强子及启动子；(f).ErbB4增强子及启动子；(g).DF3乳腺癌相关抗原增强子；(h).前列腺素特异性抗原增强子及启动子；(i).腺血管舒缓素增强子及启动子；(j).EB病毒中的Orip；(k).EB病毒Orip中的FR增强子；(1).EB病毒BamHI C-启动子；(m).EB病毒中的Orip联合EB病毒BamHI C-启动子；(n).EB病毒Orip中的FR联合单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本启动子或SV40基本启动子；(3)腺病毒的蛋白功能缺失可以是下述任何一种腺病毒E1B55Kda蛋白功能缺失，腺病毒E1B 19Kda蛋白功能缺失，腺病毒E1A蛋白功能缺失。
3.根据权利要求1所述的能高效表达干扰素的肿瘤细胞内特异性增殖的腺病毒，其特征在于它由要腺病毒增殖必需基因的转录起始点与编码起始位点之间区域插入某种肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件构成，该种顺式作用元件可以是下述任何一种甲胎蛋白增强子及启动子，癌胚抗原增强子及启动子，酪氨酸酶增强子及启动子，ErbB2增强子及启动子，ErbB3增强子及启动子，ErbB4增强子及启动子，DF3乳腺癌相关抗原增强子，前列腺素特异性抗原增强子及启动子，腺血管舒缓素增强子及启动子，EB病毒中的Orip，EB病毒Orip中的FR增强子，EB病毒BamHI C-启动子，EB病毒中的Orip联合EB病毒BamHI C-启动子，EB病毒Orip中的FR联合单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本启动子或SV40基本启动子，在EB病毒感染或潜伏感染细胞中特异性激活的顺式作用元件，腺病毒增殖必需基因为腺病毒早期基因。
4.根据权利要求3所述的能高效表达干扰素的肿瘤细胞内特异性增殖的腺病毒，其特征在于所述腺病毒增殖必需基因至少含有以下一个腺病毒的早期表达基因E1A、E1B、E2、E4。
5.根据权利要求1所述的能高效表达干扰素的肿瘤细胞内特异性增殖的腺病毒，其特征在于所述腺病毒E1B55Kda通过基因点突变、缺失突变及插入突变导致E1B 55Kda蛋白功能缺失。
6.根据权利要求1所述的能高效表达干扰素的肿瘤细胞内特异性增殖的腺病毒，其特征在于所述腺病毒E1B19Kda通过基因点突变、缺失突变及插入突变导致E1B 19Kda蛋白功能缺失。
7.根据权利要求1所述的能高效表达干扰素的肿瘤细胞内特异性增殖的腺病毒，其特征在于所述腺病毒E1A通过基因点突变、缺失突变及插入突变导致E1A蛋白功能缺失。
8.根据权利要求1所述的能高效表达干扰素的肿瘤细胞内特异性增殖的腺病毒，其特征在于所述编码干扰素的核苷酸序列为编码干扰素-α的核苷酸序列。
9.根据权利要求1所述的能高效表达干扰素的肿瘤细胞内特异性增殖的腺病毒，其特征在于所述编码干扰素的核苷酸序列为编码干扰素-β的核苷酸序列。
10.根据权利要求1所述的能高效表达干扰素的肿瘤细胞内特异性增殖的腺病毒，其特征在于所述编码干扰素的核苷酸序列为编码干扰素-γ的核苷酸序列。
11.根据权利要求1所述的能高效表达干扰素的肿瘤细胞内特异性增殖的腺病毒，其特征在于所述编码干扰素的核苷酸序列受启动子控制。
12.根据权利要求11所述的启动子，其特征在于所述启动子为SV40启动子。
13.根据权利要求11所述的启动子，其特征在于所述启动子为RSVLTR启动子。
14.根据权利要求11所述的启动子，其特征在于所述启动子为人巨细胞病毒IE启动子。
15.根据权利要求1所述的能高效表达干扰素的肿瘤细胞内特异性增殖的腺病毒，其特征在于该病毒与化学抗肿瘤药物组成复合物。
16.根据权利要求1所述的能高效表达干扰素的肿瘤细胞内特异性增殖的腺病毒，其特征在于将该重组病毒用于抑制肿瘤细胞的生长。
17.根据权利要求1所述的能高效表达干扰素的肿瘤细胞内特异性增殖的腺病毒的应用，其特征在于将该重组病毒用于体外感染肿瘤细胞，病毒在肿瘤细胞内复制及增殖，导致编码干扰素的核苷酸序列拷贝数增加及干扰素表达量增加。
18.根据权利要求1所述的能高效表达干扰素的肿瘤细胞内特异性增殖的腺病毒，其特征在于将该重组病毒用于体内选择性地在肿瘤细胞内复制及增殖，导致编码干扰素的核苷酸序列拷贝数增加及其表达量增加，抑制肿瘤血管的形成，抑制肿瘤形成、生长及转移，同时该病毒能在而且基本上限于肿瘤细胞内增殖，也能特异性直接杀灭肿瘤细胞。
全文摘要
本发明提供一类高效表达干扰素的肿瘤细胞内特异性增殖的腺病毒及其构建方法。该腺病毒选择性地在肿瘤细胞内增殖,而在正常细胞内基本不增殖,通过将编码干扰素的核苷酸序列插入肿瘤细胞内增殖的腺病毒基因组中的非增殖必需区域,随着腺病毒在肿瘤细胞内复制,使编码干扰素的核苷酸序列拷贝数增加,在肿瘤细胞高效表达干扰素,抑制肿瘤细胞的生长及血管形成,激发免疫反应,从而抑制肿瘤形成、生长及转移。同时该病毒能在而且基本上限于肿瘤细胞内增殖,也能特异性直接杀灭肿瘤细胞。
文档编号C12N15/861GK1388248SQ0111300
公开日2003年1月1日 申请日期2001年5月25日 优先权日2001年5月25日
发明者钱其军, 车小燕, 岑信棠, 吴孟超 申请人:钱其军