专利名称：家蚕基因工程植酸酶工业化感染控制方法
技术领域：
本发明属于转基因物质，尤其是畜禽用转基因酶制剂制造领域。
中国专利CN99103564公开了一种应用重组BmNPV载体-家蚕宿主表达系统生产植酸酶的基因工程方法，用植酸酶基因替换家蚕核型多角体病毒基因组中的多角体蛋白基因，并使其处于多角体蛋白基因启动子的控制下，再将此重组质粒与野生型BmNPV-DNA共转染于家蚕细胞，通过体内同源重组得到带有外源植酸酶基因的重组病毒，再利用多角体蛋白基因的启动子启动植酸酶基因，并将此重组家蚕核型多角体感染家蚕，在蚕体内繁殖产生目标物植酸酶蛋白。但如何将家蚕基因工程植酸酶生产在较大的工业化程度上实现，或者更具体地说在畜禽用转基因酶制剂工业中高产量、低成本的生产出具有商业竞争力的产品仍是需要解决的问题。
本发明的目的是，研究一种家蚕基因工程植酸酶工业化感染控制方法，使之能改善现有技术的不足，使蚕体取得较高且稳定的目标植酸酶表达量。为低成本、批量化生产畜禽饲料用基因工程植酸酶商品化制剂创立有利条件。
本发明的目的使通过如下的方法实现的。
家蚕基因工程植酸酶工业化感染控制方法，应用重组BmNPV载体-家蚕宿主表达系统生产植酸酶，用植酸酶基因替换家蚕核型多角体病毒基因组中的多角体蛋白基因，并使其处于多角体蛋白基因启动子的控制下，再将此重组质粒与野生型BmNPV-DNA共转染于家蚕细胞，通过体内同源重组得到带有外源植酸酶基因的重组病毒，再利用多角体蛋白基因的启动子启动植酸酶基因，并将此重组家蚕核型多角体感染家蚕，在蚕体内繁殖产生目标物植酸酶蛋白，以以下的手段实现病毒的工业化感染及生长控制，A)扩增的重组BmNPV滴度标定达106PFU；注射接种深度为皮下2mm；B)蛹体用乙醇浸泡，蚕幼虫用70％乙醇棉球体表消毒；接种后蚕体喷洒氯霉素；C)接种后严格控制温度在25±1℃；一般收蚕时间病蚕接种后4-5天；病蛹接种后5-6天。
采用本发明的方法，与常规方法相比，在较小的生产成本下可保证较大批量的蛹(蚕)获得平均较高的酶活量，从而使基因工程植酸酶制剂能在较大的工业化程度上实现商品化。
权利要求
1.家蚕基因工程植酸酶工业化感染控制方法，应用重组BmNPV载体-家蚕宿主表达系统生产植酸酶，用植酸酶基因替换家蚕核型多角体病毒基因组中的多角体蛋白基因，并使其处于多角体蛋白基因启动子的控制下，再将此重组质粒与野生型BmNPV-DNA共转染于家蚕细胞，通过体内同源重组得到带有外源植酸酶基因的重组病毒，再利用多角体蛋白基因的启动子启动植酸酶基因，并将此重组家蚕核型多角体感染家蚕，在蚕体内繁殖产生目标物植酸酶蛋白，其特征在于，以以下的手段实现病毒的工业化感染及生长控制，A)扩增的重组BmNPV滴度标定达106PFU；注射接种深度为皮下2mm；B)蛹体用乙醇浸泡，蚕幼虫用70％乙醇棉球体表消毒；接种后蚕体喷洒氯霉素；C)接种后严格控制温度在25±1℃；一般收蚕时间病蚕接种后4-5天；病蛹接种后5-6天为宜。
2.根据权利要求1所述之家蚕基因工程植酸酶工业化感染控制方法，其特征在于，所述扩增的重组BmNPV滴度预实验表达量蛹≥300U/克，蚕幼虫≥200U/克。
3.根据权利要求1所述之家蚕基因工程植酸酶工业化感染控制方法，其特征在于，所述接种注射量蛹2-3μl，蚕幼虫3-5μl。
4.根据权利要求1所述之家蚕基因工程植酸酶工业化感染控制方法，其特征在于，蛹体用70％的乙醇浸泡30秒；蚕幼虫用70％乙醇棉球体表消毒，氯霉素溶液浓度为600-800U/ml，每48小时喷洒一次。
全文摘要
本发明涉及一种家蚕基因工程植酸酶工业化感染控制方法,应用重组BMNPV载体－家蚕宿主表达系统,在蚕体内繁殖产生目标物植酸酶蛋白,以以下的手段实现病毒的工业化感染及生长控制:A)扩增的重组BmNPV滴度标定达10
文档编号C12N15/866GK1384191SQ0110739
公开日2002年12月11日 申请日期2001年4月30日 优先权日2001年4月30日
发明者秦俭, 陈英, 杨忠生 申请人:四川华神集团股份有限公司