专利名称：一种新的分子量为140kDa的活化T细胞表面抗原的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及生物技术。
机体免疫系统是由中枢淋巴器官、外周淋巴器官、免疫细胞和免疫分子所组成。免疫应答过程有赖于免疫系统中细胞间的相互作用，包括细胞间直接接触和通过释放细胞因子或其它介质的相互作用。免疫细胞间或细胞与介质间相互识别的物质基础是免疫细胞膜分子。免疫细胞膜分子的研究对于深入了解免疫应答机制，以及对临床某些疾病的诊断、预防和治疗都具有十分重要的意义。截止2000年8月份，美国FDA已经批准了5种识别免疫细胞膜分子的单克隆抗体用于临床疾病的治疗，另有几十种单克隆抗体正在进行临床试验。
本发明一种新的分子量为140kDa的活化T细胞表面抗原，独特分布于混合淋巴细胞反应活化的CD4+、CD8+、TCRγδ+T细胞和活化的NK细胞，而在其它活化途径(如固相CD3刺激、PHA、PMA及PMA+A23187刺激)中，活化T细胞表面不表达该分子。其能够和CD3分子协同刺激T细胞活化。其独特的分布、表达规律和功能表明它是一种新分子。
本发明的技术路线混合淋巴细胞培养获取的活化T细胞免疫BALB/c鼠，在加强免疫后3天，取脾，制备脾细胞悬液，和骨髓瘤细胞NS-1融合，用HAT选择性培养。通过间接免疫荧光标记和流式细胞术，筛选能够和混合淋巴细胞培养获取的活化T细胞结合的杂交瘤上清，分泌阳性抗体的融合细胞被克隆化，得到了A2单克隆抗体。通过免疫荧光染色、流式细胞术和重导向细胞毒实验分析A2单克隆抗体所识别的活化T细胞表面抗原，表明其具有独特的分布、表达规律和功能。经生物素标记、免疫沉淀及化学发光鉴定其分子量为140kDa。
木发明分子量为140kDa的活化T细胞表面抗原表达于活化的T细胞亚群TCRγδ+T细胞，因此，可作为TCRγδ+T细胞的一个活化标志，在移植免疫的研究和临床治疗移植排斥反应中具有重要意义。
本发明技术路线的
具体实施例方式1．混合淋巴细胞培养(MLC)无菌抽取正常人外周血10毫升，肝素抗凝，采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)，按2ml完全培养基中含有1.5×106PBMC和0.5×1063000Rad照射过的Daudi细胞培养于24孔板中，37℃、5％CO2孵箱培养7天，获取活化的T细胞。
2．细胞免疫混合淋巴细胞培养获取的活化T细胞1×107腹腔内注射免疫BALB/c鼠，4周内同法免疫2次，1周后，尾静脉内注射活化T细胞1×107加强免疫，3天后，取脾融合。
3．单克隆抗体的制备加强免疫后3天，取脾，制备脾细胞悬液，和骨髓瘤细胞NS-1融合，用HAT选择性培养。通过间接免疫荧光标记和流式细胞术，筛选能够和混合淋巴细胞培养获取的活化T细胞结合的杂交瘤上清，分泌阳性抗体的融合细胞被克隆化，得到了A2单克隆抗体。
4．研究A2单克隆抗体所识别膜分子p140的分布4.1人PBMC的活化同1.方法获取人PBMC，按2ml完全培养基中含有2×106细胞培养于24孔板，分别加入PHA(4μg/ml)、PMA(40ng/ml)、PMA(40ng/ml)+A23187(0.9μg/ml)，另有一孔为已包被有CD3mAb(用8μg/ml浓度进行包被)。其中PMA、PMA+A23187两组培养48h，PHA、CD3 mAb两组培养72h，另有PHA刺激的PBMC通过加入rHuIL-2(100u/ml)维持培养至12天。同时还有一组混合淋巴细胞培养的细胞通过加入rHuIL-2(100u/ml)维持培养至12天。用于下面免疫双色分析的混合淋巴细胞培养细胞在刺激第一天时便加入rHuIL-2(100u/ml)。
4.2免疫荧光染色和流式细胞术分析用含10％小牛血清的完全培养基调整各种细胞浓度至1×107/ml，各取50μl细胞悬液加入预先加有50μl 1∶20稀释(用DPBS稀释)灭活正常兔血清的管中，再加入不同的mAb，充分振摇，4℃作用30min，用洗涤液洗2次。弃上清，加入工作浓度的羊抗鼠FITC标记二抗(1∶20稀释)，充分振摇，4℃作用30min，用洗涤液洗2次，加适量固定液，FCM检测。在直接免疫荧光双色实验中，调整细胞浓度至1×107/ml，取50μl细胞悬液加入预先加有50μl 1∶20稀释灭活正常兔血清中，4℃孵育10min后再每管加入PE和FITC标记特异性抗体，再继续4℃孵育30min，最后洗3次后加适量固定液，FCM检测。
4.3所获结果A2单克隆抗体所识别的免疫细胞膜分子p140在静止外周血单个核细胞(PBMC)没有表达，选择性表达于混合淋巴细胞培养所活化的T细胞表面，其它活化途径如固相CD3刺激、PHA、PMA及PMA+A23187刺激，不能诱导它的表达。PHA刺激的PBMC直至12天时还没有表达p140，而混合淋巴细胞培养所活化的T细胞从第3天开始即有较高表达。经流式细胞术分析发现，p140分子表达于活化的T和NK细胞表面，尤其在TCRγδ+T细胞表达较高。
5．研究p140分子所参与的功能5.1重导向细胞毒试验收集对数生长期P815细胞，标记51Cr(100μCi/1×106细胞)，37℃孵育2h，每隔15min晃动一次。标记完毕后洗涤3次，调整靶细胞浓度为1×106/ml，加入96孔U型板，100μl/孔。收集MLC后7天的活化淋巴细胞作为效应细胞，调整细胞浓度为1×106/ml。每组取600μl细胞悬液并分别加入相应的抗体在37℃孵育30min，离心，用600μl完全培养基重悬，进行倍比稀释后分别加入含已标记的P815细胞的96孔U型板中，100μl/孔，37℃、5％CO2孵箱培养4h，收集上清，用γ记数仪检测cpm值。
5.2所获结果p140分子具有和CD3分子的协同作用，在效靶比为10∶1和5∶1时，分别提高CD3刺激的细胞毒活性12.1％和9.2％。
6．鉴定p140分子的分子量6.1生物素标记、免疫沉淀及化学发光收集处于对数生长期的JM细胞1×107，按照生物素标记和免疫沉淀试剂盒所述步骤进行操作，所得样品经SDS-PAGE电泳后，转移至PVDF膜上，用POD标记Avidin化学发光试剂盒进行曝光显色。
6.2所获结果最终鉴定p140分子的分子量为120-140kDa。
权利要求
1．一种新的分子量为140kDa的活化T细胞表面抗原，其特征是混合淋巴细胞培养获取的活化T细胞免疫BALB/c鼠，在加强免疫后3天，取脾，制备脾细胞悬液，和骨髓瘤细胞NS-1融合，用HAT选择性培养；通过间接免疫荧光标记和流式细胞术，筛选能够和混合淋巴细胞培养获取的活化T细胞结合的杂交瘤上清，分泌阳性抗体的融合细胞被克隆化，得到了A2单克隆抗体通过免疫荧光染色、流式细胞术和重导向细胞毒实验分析A2单克隆抗体所识别的活化T细胞表面抗原，表明其具有独特的分布、表达规律和功能，经生物素标记、免疫沉淀及化学发光鉴定其分子量为140kDa。
2．根据权利要求1所述的一种新的分子量为140kDa的活化T细胞表面抗原，其特征是该细胞表面抗原独特分布于混合淋巴细胞反应活化的CD4+、CD8+、TCRγδ+T细胞和活化的NK细胞，而在其它活化途径(如固相CD3刺激、PHA、PMA及PMA+A23187刺激)中，活化T细胞表面不表达该分子，其能够和CD3分子协同刺激T细胞活化，其分子量为140kDa。
全文摘要
一种新的分子量为140kDa的活化T细胞表面抗原,涉及生物技术。免疫细胞膜分子已广泛应用于临床某些疾病的诊断、预防和治疗。本发明用混合淋巴细胞培养获取的活化T细胞免疫BALB/c鼠,制备脾细胞悬液,和骨髓瘤细胞NS－1融合,用HAT选择性培养。经过筛选杂交瘤上清得到了A2单克隆抗体。分析该单抗所识别的活化T细胞表面抗原,表明其具有独特的分布、表达规律和功能,分子量为140kDa。
文档编号C12P21/02GK1314414SQ0110679
公开日2001年9月26日 申请日期2001年3月16日 优先权日2001年3月16日
发明者金伯泉, 张继帅, 贾卫, 张赟, 欧阳为明, 韩卫宁, 刘雪松 申请人:中国人民解放军第四军医大学