中国棉铃虫病毒几丁质酶基因的利记博彩app

文档序号:570723阅读:270来源:国知局
专利名称:中国棉铃虫病毒几丁质酶基因的利记博彩app
技术领域
本发明涉及分子生物学领域,是一种具有广泛应用前景的病毒新基因即中国棉铃虫病毒几丁质酶(Chitinase)基因(简称chiA基因)。
杆状病毒广泛用于农林害虫的生物防治。同时杆状病毒—昆虫(细胞)系统还是十分优良的真核表达系统,已用于外源基因、诊断试剂和疫苗等的研究和生产。和其它杆状病毒一样,中国棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒(Helicoverpa armigera single nucleocapsid nucleopolyhedrovirus,以下简称野生型病毒或HaSNPV)作为杀虫剂由于存在杀虫速度慢的缺点,致使其大面积控制棉铃虫危害的作用受到限制;而不断提高病毒表达系统的表达量也一直是当今生物工程领域的研究热点。对杆状病毒分子生物学的研究,特别是对病毒基因的结构与功能的研究将有助于揭示病毒的复制和侵染规律,为重组病毒杀虫剂和表达载体的开发和应用奠定基础。
本发明的目的是利用分子生物学技术对野生型病毒基因的结构与功能进行研究,以提供一种杆状病毒新基因即中国棉铃虫病毒几丁质酶基因,该基因可用于杆状病毒表达系统及重组病毒杀虫剂的构建、开发和应用。
本发明的目的是按下述方案实现的所提供的中国棉铃虫病毒几丁质酶基因是通过克隆和序列测定方法获得的。该基因位于HaSNPV基因组的96.1~97.8Kb处,编码区全长为1713bp,编码一个大小为570个氨基酸的蛋白质产物。将该基因克隆入原核表达载体,可以在大肠杆菌中表达出一种分子量为57~65KDa的蛋白质产物。它具有真核穿膜信号肽,催化活性区及内质网定位序列。
本发明提供的中国棉铃虫病毒几丁质酶基因及其获得方法,可以为揭示病毒的复制和侵染规律,以及为表达载体和重组病毒杀虫剂的开发和应用奠定基础。
下面结合附图及实施例对本发明作进一步说明图1是棉铃虫病毒HaSNPV基因组的物理图谱及chiA基因在基因组上定位的示意图。
图2是棉铃虫chiA基因的全序列及编码的氨基酸序列的示意图。
图3是原核表达载体pProEXHT/chiA的克隆过程及其结构示意图。
图4显示了利用原核表达载体表达几丁质酶蛋白的电泳图谱。一.


1.图1说明(1)线性化的HaSNPV基因组的BamH I物理图谱,表明了BamH I的酶切位点,酶切所产生的片段依据其大小分别以英文大写字母表示。图中同时用 表明了多角体蛋白基因(ph)及p10基因(p10)的位置及转录方向。(2) 为chiA基因在HaSNPV基因组中的位置,箭头的方向表明该基因的转录方向。(3)该基因编码区全长为1713bp,编码一个大小为570个氨基酸的蛋白质产物。在转录起始密码子ATG上游-29bp处有一个杆状病毒保守的晚期转录起始序列ATAAG。HaSNPV几丁质酶和已知的其它杆状病毒几丁质酶具有相似的一级结构,即具有真核穿膜信号肽,位于第1~20个氨基酸残基;具有催化活性区,位于第308~316个氨基酸残基;具有内质网定位序列(HDEL)。2.图2说明(1)HaSNPV chiA基因完整的核苷酸序列,起始密码子(ATG)和终止密码子(TAA)以下划线表明。
(2)HaSNPV chiA基因完整的氨基酸序列,位于核苷酸序列的下方,真核穿膜信号肽、催化活性区及内质网定位序列以黑框表明。3.图3说明
本附图显示了chiA基因原核表达载体pProEXHT/chiA的构建过程。载体pProEXHT可选用美国GIBCO公司的产品。4.图4说明本附图显示了在大肠杆菌中诱导表达的几丁质酶蛋白的电泳图谱,箭头所指为表达的几丁质酶蛋白条带,其分子量约为57~65KDa。二.实施例本发明提供的中国棉铃虫病毒几丁质酶基因,它编码的蛋白具有内切几丁质酶的活性及潜在的抗真菌活性及杀虫增效活性。该基因位于HaSNPV基因组的96.1kb-97.8kb处,将该基因克隆入原核表达载体,可以在大肠杆菌中表达出一种分子量为57~65KDa的表达产物即几丁质酶蛋白。
上述chiA基因及其表达产物是通过下述克隆和序列测定方法获得的在对HaSNPV基因文库的随机测序过程中,我们发现EcoR I-J片段的一端含有chiA基因的序列(见图1),进而通过引物延伸法对EcoR I-J片段进行了双向测序,最终获得本发明提供的中国棉铃虫核多角体病毒chiA基因的完整序列(见图2)。将chiA基因的序列亚克隆至原核表达载体,得到原核表达载体pProEXHT/chiA(见图3),将该表达载体电转化至大肠杆菌DH5α细胞,经IPTG诱导可表达出特异的几丁质酶蛋白(见图4)。
上述几丁质酶基因及其表达产物,可由以下步骤获得(1)HaSNPV基因组DNA以BamH I和EcoR I酶切,将酶切片段随机克隆到通用载体pTZ19R获得HaSNPV基因组随机文库。
(2)对所得文库进行双向末端测序,在EcoRI-J片段上发现chiA基因,以引物延伸法对该片段进行测序并获得其编码区的全序列。
(3)运用PCR技术从HaSNPV基因组随机文库中调出chiA基因的序列,克隆至原核表达载体pProEXHT的多克隆位点,获得原核表达载体pProEXHT/chiA(见图3)。
(4)将该表达载体转化至大肠杆菌DH5α细胞。该细胞经IPTG诱导可表达出特异的几丁质酶蛋白(见图4)。
上述几丁质酶基因及其表达产物,还可由以下更简单步骤获得(1)根据图2所示的核苷酸序列的两个末端设计PCR引物,用PCR的方法从HaSNPV基因组中一次性扩增出完整的chiA基因,然后克隆到通用的克隆载体上,并通过序列测定验证所获得的基因。
(2)运用PCR技术从HaSNPV基因组随机文库中调出chiA基因的序列,克隆至原核表达载体pProEXHT的多克隆位点,获得原核表达载体pProEXHT/chiA(见图3)。
(3)将该表达载体转化至大肠杆菌DH5α细胞。该细胞经IPTG诱导可表达出特异的几丁质酶蛋白(见图4)。
上述几丁质酶基因可用于重组原核表达载体、杆状病毒表达载体以及重组病毒杀虫剂的构建。
上述几丁质酶基因的表达产物可用于新型抗真菌制剂和病毒杀虫剂的增效剂的生产。
权利要求
1.一种中国棉铃虫病毒几丁质酶基因,其特征是所述的几丁质酶基因具有编码、内切几丁质酶活性、潜在的抗真菌活性和病毒杀虫剂增效活性的蛋白质的功能,其核苷酸序列及预计的氨基酸序列如下ATAAGTACTATAAATTACACAAAATAAATATGAATAATTATTGTTTGTATTTGTTTGCTTTTAGTATTTTAATATT ACATAGCTACGCTGCTCCACCCGGCGTTCCCACATTAGACTGGGCCGATCACAGTTACGCTTTAGTGCAAATAAAT A P P G V P T L D W A D H S Y A L V Q I NCATCAAGCCACCGCTTACGAATCATTAGTAAACTCTCAACCGTTTGTAACTATCAAAGTATCATGGAGCGTATGGTH Q A T A Y E S L V N S Q P F V T I K V S W S V W SCGGGCGAACAAGGCGAAATCGCTCAAGTGTATCTAGAAAATAAACTAGACTGCAAAGTAATCAACGTTTGGACTGGG E Q G E I A Q V Y L E N K L D C K V I N V W T GTCCGACGCAAGATCGTTTTGCTACTTTTGATTACAATACGAGCGGTCGTTATTCGATGTATGTAAAACTGTGCAATP T Q D R F A T F D Y N T S G R Y S M Y V K L C NGCCGACGGCTGTTCGGCTAGTCAAACCGTAGAAGTCGTGATCGCAGACACCGATGGTAAACATTTAAAACCGTTACA D G C S A S Q T V E V V I A D T D G K H L K P L QAATACACGTGGCAAGAAAACAATAAACCGTATACGTACAACACTGATCACACCGTAGCGGCCTATTTTGTCGAATGY T W Q E N N K P Y T Y N T D H T V A A Y F V E WGGGCGTTTACGGTCGATCTTTTCCCGTGGACAAAGTGCCCACGCCGAACCTTTCGCACATTTTATACGGATTTATAG V Y G R S F P V D K V P T P N L S H I L Y G F ICCGATTTGCGGCGGTGACGGTATAAACGACAGTTTAAAATCTATCACGGGGAGTTTTGAAGCGTTGCAAAGATCGTP I C G G D G I N D S L K S I T G S F E A L Q R S CGCGCTGGCAGGGACAATTTTAAAGTTTCCATACACGATCCGTGGGCGGCGCTCCAAAAACCACAAACAGGCGTTAGA G R D N F K V S I H D P W A A L Q K P Q T G V SCGCATGGAACGAACCCTACAAAGGCAATTTTGGTCAATTAATGGCAGCAAAATTGGCCAATCCCAATCTAAAAGTGA W N E P Y K G N F G Q L M A A K L A N P N L K VTTGGCATCAATCGGCGGTTGGACACTGTCCGATCCCTTCTATCATATGCACGATGCGCGAACGCGACAAATTTTTGL A S I G G W T L S D P F Y H M H D A R T R Q I F VTCGAATCCGTGCGTGAATTTGTGTTGACATGGAAATTTTTCGACGGCATCGATATTGATTGGGAATTTCCGGGCGGE S V R E F V L T W K F F P G GCAAAGGCGCCAATCCAAACGTTGGCGATGTGGAACGCGACAATAACACGTATATCGCTTTATTGGGCGAATTGCGCK G A N P N V G D V E R D N N T Y I A L L G E L RGCCATGCTCGATCAAGTTCAAATACAAACGAATCGTACTTTAGAACTCACCACAGCGATTAGCGCTGGCATAGACAA M L D Q V Q I Q T N R T L E L T T A I S A G I D KAGATCGCCGCGGTTAATTACGACCGAGCACAACAGTATTTAGATAAAATTTTCGTGATGAGTTATGATTTCAAAGGI A A V N Y D R A Q Q Y L D K I F V M S Y D F K GAGCTTGGTCTAATACCGATCTCGGTCATCAGACGGCACTGTACGGTTCCGCGTGGAAACCTAACGAACCGTACACCA W S N T D L G H Q T A L Y G S A W K P N E P Y TGCCAACGTGGCCGTGGACGCTTTGCTCGCGCAACGAGTGAATCCAAAAAAACTCGTGTTGGGCGTAGCAATGTACGA N V A V D A L L A Q R V N P K K L V L G V A M Y GGCCGCGGTTGGACGGGCGTCCACAACTACAACAGTGACAATCCATTCAGTGGCGTAGCCGTCGGACCGATCACGGGR G W T G V H N Y N S D N P F S G V A V G P I T GTACATGGGAAAACGGCGTGGTCGACTACAGACAGATTGCTAAAAACATTTCGCGTTACGAATACGCATTCGACGACT W E N G V V D Y R Q I A K N I S R Y E Y A F D DGTGGCCAAGGCTGCGTACGTATTCGACCGCGCCTCTGGCGACTTAATATCGTATGACAGCGAAAGATCGGTACTGGV A K A A Y V F D R A S G D L I S Y D S E R S V L ACCAAAGGCGAATACGTGCTTCAGCGTAGACTCGGCGGATTATTCGCATGGGAAATCGATGCGGACAACGGCGATTTK G E Y V L Q R R L G G L F A W E I D A D N G D LGCTCAACGCTATGCATATTGGCTTGATGAAAACAGGTACAAACAGTAGATTGATTCATAACGAATTGTAAL N A M H I G L M K T G T N S R L I 上述编码区全长1713核苷酸,编码一个大小为570个氨基酸的蛋白质产物,几丁质酶基因位于HaSNPV基因组的96.1kb-97.8kb处,具有真核穿膜信号肽,位于第1~20个氨基酸残基区;具有催化活性区,位于第308~316个氨基酸残基区;具有内质网定位序列。
2.根据权利要求1所述的几丁质酶基因,其特征是从杆状病毒科中分离得到的与该基因序列同源性高于50%的同源基因。
3.含有权利要求1所述几丁质酶基因的重组原核表达载体,其特征在于将几丁质酶基因克隆至原核表达载体后所获得的原核表达载体。
4.含有权利要求3所述几丁质酶基因编码的蛋白,其特征在于将原核表达载体转化至大肠杆菌DH5α细胞中,经诱导后表达出的几丁质酶蛋白。
5.根据权利要求1所述几丁质酶基因的应用,其特征在于它是一种用于构建新型病毒杀虫剂的杆状病毒基因。
6.根据权利要求1所述几丁质酶基因的应用,其特征在于它的表达产物用于制造新型抗真菌制剂和病毒杀虫剂的增效剂。
7.一种得到权利要求1或2所述的几丁质酶基因、或3所述的原核表达载体、或4所述的几丁质酶蛋白、或5所述的杆状病毒基因、或6所述的病毒基因表达产物应用的方法,包括以下步骤(1)根据chiA基因核苷酸序列的两个末端设计PCR引物,用PCR的方法从HaSNPV基因组中一次性扩增出完整的chiA基因,(2)将chiA基因的序列克隆至原核表达载体pProEXHT的多克隆位点,获得原核表达载体pProEXHT/chiA,(3)将pProEXHT/chiA转化至大肠杆菌DH5α细胞,通过序列测定验证,该细胞经IPTG诱导可表达出特异的几丁质酶蛋白。
全文摘要
本发明通过克隆和序列测定获得中国棉铃虫病毒几丁质酶基因,它位于HaSNPV基因组的96.1kb-97.8kb处,编码区全长为1713bp,编码一个大小为570个氨基酸的蛋白质产物,它具有真核穿膜信号肽、催化活性区及内质网定位序列。将其克隆入原核表达载体,可以在大肠杆菌中表达出一种分子量为57~65KDa的几丁质酶蛋白。该基因可用于新型杆状病毒表达载体及病毒杀虫剂的构建,其表达产物可用于抗真菌制剂及病毒杀虫剂增效剂的生产。
文档编号C12N15/56GK1308126SQ01106469
公开日2001年8月15日 申请日期2001年2月13日 优先权日2001年2月13日
发明者吴东, 彭辉银, 孙修炼, 陈新文, 张双民, 胡志红 申请人:中国科学院武汉病毒研究所
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