专利名称：辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶基因及其克隆的利记博彩app
技术领域：
本发明是辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶基因及其克隆，属于生物工程领域。特别涉及到辽宁碱蓬(S.liaotungensis kitag.)编码甜菜碱醛脱氢酶的基因及其克隆。
对非生物胁迫的普遍适应是积累与细胞代谢相容的有机溶质，广泛存在的最普遍的渗透物质是甘油、甘露醇、脯氨酸、蔗糖、海藻糖和铵的四价化合物。甜菜碱就是一类季铵化合物，在细菌、藻类、动物和多种植物中普遍存在，其中藜科、禾本科等植物在干旱或盐胁迫下甜菜碱的积累更为明显。甜菜碱除定位于叶绿体外还存在于微粒体和胞浆中。对细菌和植物的研究都表明甜菜碱的存在与耐渗透胁迫有关。甜菜碱起着无毒渗透保护剂的作用，它的积累使得许多代谢中的重要酶类在渗透胁迫下能保持活性。Saneoka等人证明，含甜菜碱的玉米在盐胁迫下比缺失型所受的损伤明显下降。甜菜碱是以胆碱为底物经两步酶催氧化生成，即胆碱→甜菜碱醛→甜菜碱。在高等植物中，催化第一步反应的是胆碱加单氧酶(choline monooxygenase CMO)，催化第二步反应的是甜菜碱醛脱氢酶(betaine aldehyde dehydrogenase BADHE.C.1.2.1.8)。这两个酶的活性受盐和干旱胁迫诱导。目前只有少数几种植物的甜菜碱醛脱氢酶基因被测序克隆。辽宁碱蓬(S.Liaotungensis kitag.)是一种耐盐性很强的盐生植物，其甜菜碱醛脱氢酶活性较高。
本发明提供了辽宁碱蓬(S.Liaotungensis kitag.)编码甜菜碱醛脱氢酶的基因BADH，提供了BADH cDNA全序列及其相应的氨基酸序列。提供了含有BADH的克隆载体pMD18-T/BADH和含有这种载体的大肠杆菌(E.coli)JM109细胞JM109/pMD18-T/BADH。提供了BADH的植物表达载体pCAMBIA1301/BADH和含有这种载体的大肠杆菌(E.coli)JM109细胞JM109/pCAMBIA1301/BADH。利用本发明，可以进行植物基因转化，提高植物耐盐、耐低温及耐旱性。
本发明以菠菜(Spinacia oleraeea L.)、甜菜(Beta vulgaris)、山菠菜(Atriplex hortensis)的甜菜碱醛脱氢酶基因BADH核苷酸序列作参考，根据同源性较好的区域设计并合成两条寡核苷酸引物，提取辽宁碱蓬(S.Liaotungensis kitag.)总RNA为模板，RT-PCR方法合成BADH的部分片段，并对此PCR产物测定核苷酸序列。根据此序列，在靠近5′端一侧设计一条反转录引物，两对嵌套PCR引物，5′RACE法合成BADH的5′端片段，对此片段进行PCR产物测序。根据第一个片段的序列，在靠近3′端一侧设计一条引物，3′RACE法合成BADH的3′端片段，对此片段进行PCR产物测序。这样获得了辽宁碱蓬(S.Liaotungensis kitag.)BADH cDNA全序列，根据BADH cDNA全序列，设计两条引物，RT-PCR法合成BADH基因编码区，并将BADH基因编码区克隆到克隆载体pMD18-T，形成BADH克隆载体pMD18-T/BADH。热击法将这个克隆载体导入大肠杆菌(E.coli)JM109感受态细胞，形成含有pMD18-T/BADH的大肠杆菌细胞JM109/pMD18-T/BADH。以pMD18-T/BADH为模板进行PCR，扩增出正确的BADH编码区，酶切；同时将植物表达载体pCAMBIA1301用限制性内切酶切割，形成一平一粘两个末端，T4DNA连接酶连接，形成BADH的植物表达载体pCAMBIA1301/BADH，热击法将这个表达载体导入大肠杆菌(E.coli)JM109感受态细胞，形成含有pCAMBIA1301/BADH的大肠杆菌细胞JM109/pCAMBIA1301/BADH。
辽宁碱蓬(S.liaotungensis kitag.)BADH cDNA核苷酸序列如下gcttctcactctttcccttttctctcctcccatttttcatcgtcaactcaatttctttctgcaacaATGTCGATCCCTATACCTTCTCGTCAGCTATTCATTGATGGAGAGTGGAGAGAACCCATCAAACGAAATCGTCTCCCAATTATTAATCCTTCCACTGAAGAAACCATTGGGGAAATTCCAGCAGCAACAGCTGAGGATGTTGAAGCAGCAGTAAGTGCTGCTAGAAGAGCACTTAAGAGGAACAAAGGGAGAGATTGGGCTGCTACTTCTGGAGCTCACCGTGCTAGATACTTGCGTGCTATTGCTGCTAAGGTATCAGAAAAAAAAGACCATTTTGTTAAACTTGAAACCATGGATTCTGGGAAACCACTGGATGAAGCAGTGTTGGACATAGATGA 其中前面的小写字母表示5′端非编码区，中间大写字母为编码区(即开放阅读框架)，后面的小写字母表示3′端非编码区。 为翻译起始密码， 为翻译终止密码， 为加poly(A)信号。
根据以上核苷酸序列，推导辽宁碱蓬(S.Liaotungensis kitag.)甜菜碱醛脱氢酶蛋白的氨基酸序列如下 BADH cDNA全长1901bp，5′端非编码区66bp，3′端非编码区329bp，开放阅读框架1506bp，编码502aa。其中有醛脱氢酶的保守序列 和半胱氨酸残基 。克隆载体pMD18-T/BADH中含有BADH编码区全序列。受体大肠杆菌细胞JM109/pMD18-T/BADH中含有克隆载体pMD18-T/BADH。表达载体pCAMBIA1301/BADH中含有BADH编码区全序列。受体大肠杆菌细胞JM109/pCAMBIA1301/BADH中含有表达载体pCAMBIA1301/BADH。
BADH是首次被提取、测序和克隆的辽宁碱蓬(S.Liaotungensis kitag.)的甜菜碱醛脱氢酶基因。因其所编码的甜菜碱醛脱氢酶能够催化甜菜碱的合成，所以该基因的表达载体可用于植物的基因转化，提高植物的耐盐、耐寒、耐旱能力。
以下是本发明的最佳实施例实施例1辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶cDNA全序列的获得采集辽宁碱蓬(S.Liaotungensis kitag.)，取叶子进行液氮研磨，TRIZOL试剂盒(GIBICOL公司产品)提取总RNA。
①、BADH cDNA部分片段的获得以菠菜(Spinacia oleracea L.)、甜菜(Beta vulgaris)、山菠菜(Atriplexhortensis)的甜菜碱醛脱氢酶基因BADH核苷酸序列作参考，根据同源性较好的区域设计并合成两条寡核苷酸引物，RT-PCR法获得部分片段。
引物如下B15′-GGAGAGTGGAGAGAACCC-3′B25′-TIAAGGAGACTTGTACCAC-3′RT反应条件如下MgCl24ul10×RNA PCR Buffer 2ulRNase Free H2O 8.5uldNTP Mixture2ulRNase Inhibitor 0.5ulAMV Reverse Transcriptase 1ulOligo dT-adapter Primer 1ulTemplate RNA1ul20ul42℃ 30min99℃ 5min5℃ 5minPCR反应条件如下MgCl26ul10×RNA PCR Buffer 8ul灭菌蒸馏水 61.5ulTaKaRa Taq 0.5ulB1(10pM)2ulB2(10pM)2ulcDNA20ul100ul
94℃ 2min 72℃ 7min4℃PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，用NaI回收试剂盒(TAKARA公司产品)回收约1500bp的DNA片段，对该片段用Sanger链终止法测定其核苷酸序列，为辽宁碱蓬(S.Liaotungensis kitag.)甜菜碱醛脱氢酶基因部分序列。
②、BADH cDNA 5′端序列的获得根据①的序列，在靠近5′端一侧设计一条反转录引物，两对嵌套PCR引物，5′RACE法合成BADH的5′端片段。
引物如下RT-primer5′-(p)CTGCTTGATCAGC-3′F15′-TGCGTGCTATTGCTGCTAAG-3′R15′-CCAGAAGTAGCAGCCCAATC-3′F25′-TGGATGAAGCAGTGTTGGAC-3′R25′-TTCACCATCTCGGCTCACCA-3′RT反应条件如下总RNA1ul10×RT buffer1.5ulRnase Inhibiter(40U/ul) 0.5ulAMV Reverse Transcriptase XL(5U/ul) 1ulRT-primer(1ug/ul)1ul15ul
30℃ 10min50℃ 30min80℃ 2min4℃Hybrid RNA的分解RT反应液15ul5×Hybrid RNA degenaration buffer 15ulDEPC水 45ulRNase H(60U/ul) 1ul30℃反应1小时，然后进行乙醇沉淀。通过连接反应将单链cDNA环化乙醇沉淀的单链cDNA5×RNA Ligation Buffer 8ul40％PEG#600020ulDEPC水 12ulT4RNA ligase 1ul41ul16℃反应15～18小时。1st PCR反应上述连接液 1ul10×LA PCR Buffer 5uldNTP Mixtrue8ulTaKaRa LA Taq(5U/ul)0.5ulF1(20pmol/ul) 0.5ulR1(20pmol/ul) 0.5ulddH2O 34.5ul50ul
94℃1min 4C2nd PCR反应1st PCR反应产物 1ul10×LA PCR Buffer 5uldNTP Mixtrue 8ulTaKaRa LA Taq(5U/ul) 0.5ulF2(20pmol/ul) 0.5ulR2(20pmol/ul) 0.5ulddH2O34.5ul50ul 4℃反应得到一条约300bpDNA片段，回收，测序，为辽宁碱蓬(S.Liaotungensis kitag.)的甜菜碱醛脱氢酶基因5′端序列。
③、BADH cDNA 3′端序列的获得根据①的序列，在靠近3′端一侧设计一条引物，3′RACE法合成BADH的3′端片段。
引物如下B35′-AAGGTGTGAGAGGGTAACAAAG-3′RT反应条件如下MgCl24ul
10×RNA PCR Buffer 2ulRNase Free H2O 8.5uldNTP Mixture2ulRNase Tnhibitor 0.5ulAMV Reverse Transcriptase 1ulOligo dT-adapter Primer 1ulTemplate RNA1ul20ul42℃ 30min99℃ 5min5℃ 5minPCR反应条件如下cDNA2ulTaKaRa LA Taq 1ul10×LA PCR Buffer 10uldNTP Mixtrue16ulB3(20pM)1ulM13primer M4(20pM) 1ulddH2O 69ul100ul94℃ 1min 72℃ 7min4℃反应得到一条约500bpDNA片段，回收，测序，为辽宁碱蓬(S.Liaotungensis kitag.)的甜菜碱醛脱氢酶基因3′端序列。
将上述三个序列连接起来，既为辽宁碱蓬(S.Liaotungensis kitag.)甜菜碱醛脱氢酶基因全序列。
④、BADH基因编码区的获得根据上述全序列设计引物，RT-PCR法获取BADH基因编码区。
引物如下BADH ORF F primer5′-TCGATCCCTATACCTTCTCGTC-3′BADH ORF R primer5′-catGGTCACCTTAAGGAGACTTGTAC-3′RT反应条件如下MgCl24ul10×RNA PCR Buffer 2ulRNase Free H2O 8.5uldNTP Mixture 2ulRNase Inhibitor 0.5ulAMV Reverse Transcriptase1ulOligo dT-adapter Primer 1ulTemplate RNA 1ul20ul42℃ 30min99℃ 5min5℃ 5minPCR反应条件如下cDNA 2ulTaKaRa LA Taq1ul10×LA PCR Buffer10uldNTP Mixffue 16ulBADH ORF F primer(20pM) 1ulBADH ORF R primer(20pM) 1ulddH2O 69ul
100ul94℃ 1min 72℃ 7min4℃反应得到一条约1.5kbDNA片段，回收，测序，为辽宁碱蓬(S.Liaotungensis kitag.)的甜菜碱醛脱氢酶基因编码区全序列。
实施例2BADH与克隆载体pMD18-T的重组及转化大肠杆菌JM109BADH与克隆载体pMD18-T用T4DNA连接酶连接。连接条件如下pMD18-T(0.05ug/ul) 1ulBADH gene(0.05ug/ul) 3ul10×T4DNA连接酶Buffer 1ulT4DNA连接酶(1U/ul) 1ulddH2O 4ul16℃连接2小时，热激法转化大肠杆菌JM109，PCR法检测阳性克隆JM109/pMD18-T/BADH。从JM109/pMD18-T/BADH中提取质粒，以pMD18-T的通用引物测定外源插入序列BADH的核苷酸序列，与实施例1所述测序结果一致。
实施例3BADH与表达载体pCAMBIA1301的重组及转化大肠杆菌从JM109/pMD18-T/BADH中提取质粒pMD18-T/BADH，以pMD18-T/BADH质粒为模板，用BADH ORF F primer和BADH ORF R primer进行PCR，将PCR产物末端平滑，用BstEII酶切；同时将表达载体pCAMBIA1301用Nco I酶切，补平，再用BstEII酶切，形成一平端一粘端。将酶切处理后的BADH和表达载体pCAMBIA1301用T4DNA连接酶连接，形成JM109/pCAMBIA1301/BADH，热激法转化大肠杆菌JM109，形成JM109/pCAMBIA1301/BADH，条件同实施例2。
权利要求
1.一种甜菜碱醛脱氢酶基因BADH，其特征在于它是辽宁碱蓬(S.Liaotungensis kitag.)编码的甜菜碱醛脱氢酶基因。
2.权利要求1所述的甜菜碱醛脱氢酶基因BADH核苷酸序列
3.根据权利要求1所述的甜菜碱醛脱氢酶基因BADH克隆载体pMD18-T/BADH。
4.根据权利要求3所述克隆载体pMD18-T/BADH的大肠杆菌(E.coli)受体细胞JM109/pMD18-T/BADH。
5.根据权利要求1所述的甜菜碱醛脱氢酶基因BADH表达载体pCAMBIA1301/BADH。
6.根据权利要求5所述表达载体的大肠杆菌(E.coli)受体细胞JM109/pCAMBIA1301/BADH。
全文摘要
本发明是辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶基因及其克隆,属于生物工程领域。本发明提供了一种来自于辽宁碱蓬(Suaeda liaotungensis kitag.)编码甜菜碱醛脱氢酶的基因BADH,提供了BADH cDNA全序列及其相应的氨基酸序列。提供了含有BADH的克隆载体pMD18－T/BADH和植物表达载体pCAMBIA1301/BADH以及分别含有这两种载体的大肠杆菌(E.coli)JM109细胞JM109/pMD18－T/BADH和JM109/pCAMBIA1301/BADH。本发明可用于植物的基因转化,达到提高植物耐盐、耐低温及耐旱性的目的。
文档编号C12P19/00GK1364906SQ0110607
公开日2002年8月21日 申请日期2001年1月12日 优先权日2001年1月12日
发明者安利佳, 李秋莉, 高晓蓉 申请人:大连理工大学, 辽宁师范大学