专利名称：建立abc1基因细胞靶标筛药系统筛选第三代心血管病药的方法
技术领域：
本发明涉及细胞靶标筛药系统，具体涉及一种建立ABC1筛药系统及筛选第三代升HDL抗动脉粥样硬化心血管药的方法。
ATP结合的盒式(ABC1)转运基因是90年代中后期发现的一个控制动脉粥样硬化心血管病的重要因子(Hobbs，1999；Owen，1999；Gura，1999；Marcil；Brook-Wilson，1999)。ABC1与HDL中的APOAI载脂蛋白(Rothblat，1999；Lawn，1999；Takahashi，1999)协同作用，将胆固醇从巨噬细胞运出到肝脏分解，达到医治动脉粥样硬化心血管病的作用。缺失ABC1基因或基因表达障碍将导致血浆HDL缺失含量降低(Rothblat，1999；bodzilch，1999)，导致动脉粥样硬化心血管病的形成。所以ABC1基因就成为筛选抗动脉粥样硬化心血管药的重要靶点。本发明在国际上首次将ABC1基因的Promoter克隆进HepG2细胞株，建立筛选第三代抗动脉粥样硬化心血管病药的筛药靶标系统。
动脉粥样硬化心脑血管疾病(如冠心病，中风)是中国和西方国家致死疾病中的主要杀手。其主要病因是高血清总胆固醇(Gordon et al.1981；Stamleret al.1986；Pooling Project Research Group 1978；Anderson etal.1987)。流行病学调查揭示，血清总胆固醇每增加1％，冠心病危险因素增加2％(NCEPR1991)。临床研究发现，降低血清胆固醇水平可以减少冠心病的发病率，阻滞动脉粥样硬化的发展(LPCP 1984；Frick 1987)。胆固醇不溶于水，不能在血液里转运。它们必需与脂蛋白结合才能在血液里运转。人血液里有四种脂蛋白负责胆固醇的运载。它们是低密度脂蛋白(LDL)，高密度脂蛋白(HDL)，极低密度脂蛋白(VLDL)和中间密度脂蛋白(IDL)。在正常人中，三分之二的总胆固醇由LDL运载。LDL携带内源或外源胆固醇，穿过血管壁，进入内皮下(subendothelium)。在内皮下，LDL胆固醇被氧化成氧化型LDL胆固醇，并通过清道夫受体被巨噬细胞以胆固醇酯的形式在细胞内积聚。大量胆固醇酯积聚在巨噬细胞内形成了泡沫细胞。积聚了大量胆固醇酯的泡沫细胞沉积在血管内皮下，形成了动脉粥样硬化斑块核心。资料表明，由LDL运载的胆固醇是导致动脉粥样硬化冠心病的主要根源(Goldstein1989；Vega1986；Innerarity 1990；Rauth 1992)。所以LDL胆固醇被称为坏胆固醇。胆固醇引起的动脉粥样硬化不但是冠心病的主要根源，同时也是脑血管疾病，如脑血栓形成，中风的重要病因。此外人脑细胞内积聚的高胆固醇酯还可能和老年性痴呆症的形成有关。体内胆固醇来源有内源和外源。外源胆固醇来自于饮食，内源胆固醇是自体合成的结果。内源胆固醇合成亢进和家族性高胆固醇血症在西方国家较为普遍。这种疾病必须通过药物控制。在美国，40％以上的成年人的LDL胆固醇(坏胆固醇)含量超过正常水平。由于胆固醇在形成心脑血管疾病中的重要作用，近十多年来，美国及欧洲药厂都把其抗动脉粥样硬化药的研究和开发放到降低血清总胆固醇及LDL胆固醇上。这些药中疗效最显著的有Merck药厂的Zocor和Warner-Lambert/Parke-Davis去年上市的Lipitor。这些药的作用机理都是抑制人体胆固醇合成的关键酶HMG-COA-还原酶。虽然HMG-COA-还原酶抑制剂能显著的降低血清总胆固醇，防止、阻止及降低动脉粥样硬化和冠心病发病，发展和死亡，但它只能减少内源性胆固醇合成及降低家族性高胆固醇血症引起的冠心病的发展或恶化。对于治疗外源性胆固醇增多引起的动脉粥样硬化，对于消除已进入巨噬细胞内的胆固醇和抑制由此导致的动脉粥样硬化形成，对于去除动脉粥样硬化斑块中积聚的胆固醇，使动脉粥样硬化血管回复正常，则作用不大或无能为力。换句话说，目前欧美市场流行的抑制内源性胆固醇生成药物不能从根本上治疗广义的动脉粥样硬化心脑血管疾病。
医学研究证明，巨噬细胞吞噬和积聚胆固醇，转换成泡沫细胞，沉积在血管壁内皮下是动脉粥样硬化斑块形成的基础。清除积聚在血管壁巨噬细胞/泡沫细胞内的胆固醇，将其转运到肝脏分解，是治疗单纯降血清胆固醇所不能达到的，根治动脉粥样硬化心脑血管疾病的最新的有效手段，清除巨噬细胞/泡沫细胞及动脉粥样硬化斑块内胆固醇的唯一的有效武器是HDL。近年来，西方心血管疾病研究人员及制药公司开始把研究方向放到新一类抗动脉粥样硬化药，升高密度脂蛋白(HDL)药上来。高密度脂蛋白(HDL)是一重要的胆固醇载体，它在运载胆固醇方面的功能与LDL截然相反。HDL可以刺激血管内皮下巨噬细胞内胆固醇酯水解，并将水解的非酯化胆固醇从巨噬细胞内转运至肝脏分解。更为重要的是，HDL能刺激沉积于血管壁和血管壁动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞/泡沫细胞内胆固醇酯水解。非酯化胆固醇被HDL从泡沫细胞转运至肝脏分解(Alan et al.1996)。从而去除了动脉粥样硬化赖以形成的基础。所以HDL的重要功能被称为胆固醇逆相转运(Reverse Cholesterol Transportation)。胆固醇逆相转运的结果是①抑制胆固醇酯在巨噬细胞内累积，阻止其转化为泡沫细胞，从而防止了动脉粥样硬化的形成；②因为HDL具有独特的转运动脉粥样硬化斑块内泡沫细胞里胆固醇至肝脏分解的作用，从而使动脉粥样硬化血管壁逐步回复正常。HDL的此二项功能一直是西方医学界在治疗动脉粥样硬化病中梦寐以求的效果。此外，HDL含有paraoxonase，可以抑制低密度脂蛋白氧化，防止LDL被巨噬细胞吞噬，产生泡沫细胞。HDL还可以刺激内皮细胞释放前列环素(PI)增加胆固醇酯水解和胆固醇转运出细胞。HDL的作用对象不分内源或外源胆固醇。基础及临床研究证实，每增加1mg/dl HDL胆固醇，冠心病死亡危险即下降2.5％(Alan et al.1996)。低血浆HDL是比高血浆胆固醇更重要的致动脉粥样硬化及冠心病的危险因子(Alan et al.1996)。
虽然HDL在转运血管壁巨噬细胞/泡沫细胞内胆固醇的作用关键，但HDL转运作用仍需一种称之为胆固醇外流调节蛋白(CETP)的协调。CETP在细胞内协调将胆固醇运到内膜上，胆固醇再通过膜通道转运到细胞表面，HDL将运到细胞表面的胆固醇载运到肝脏分解。控制CETP的基因称为ABC1基因。流行病学调查发现，一种先天患有严重动脉粥样硬化心血管病，Tangier病病人中，ABC1基因有严重缺陷，这种病人血浆含HDL量大大低于正常人。以致于存积在细胞内的胆固醇无法运出血管壁细胞进入肝脏分解而沉积在血管壁内致病。鉴于ABC1基因在协调HDL转运血管壁巨噬/泡沫细胞内胆固醇的重要作用，ABC1基因就成为另一筛选抗动脉粥样硬化心脑血管病药中一个重要的筛药靶标。如果将ABC1基因功能与HDL的功能结合在一起，就构成一个完整的将胆固醇从细胞内转运出细胞，再载运到肝脏的运载体系。因为构成HDL结构和功能的重要成分是ApoAI(见龚邦强专利，专利申请号00125733.1)，ABC1-ApoAI靶标体系就是一个完整的筛选第三代抗动脉粥样硬化心血管病药的靶标筛选系统。
本发明的目的是提供一种PGL 3B/ABC1-neo质粒与PRL-TK质粒转染人HepG2细胞。
本发明另一目的提供了制备PGL 3B/ABC1-neo质粒的方法。
本发明的再一目的建立转染了ABC1-promoter细胞靶标筛药系统并应用它来筛选HDL抗动脉粥样硬化心血管病药物的方法。
一种含有如下DNA序列的ABC1 Promoter 克隆入由pGK neo+质粒以Xho I酶切可得到约2Kb neo DNA片段克隆入PGL3-B的Sal I酶切位点。所得PGL 3/neo vector中经Xho I和Bgl II酶切位点构建得pGL3B/neo vector再与pRL-TK质粒共转染HepG2细胞，形成含ABC1-promoter的供筛选用细胞。
本发明采用提取人基因组DNA然后以人基因组DNA为模板用PCR技术复制得ABC1-promoterDNA序列，用琼脂糖(1％)凝胶电泳鉴定PCR产物，再将ABC1-promoter DNA的目的基因克隆入PGEM-T Easy vectors中，细菌转化再将克隆目的基因的PGEM-T/ABC1质粒提取测序，再用G418的neo基因和克隆目的基因的PGEM-T/ABC1克隆进PGL3-B/中，通过酶切，重组质粒转入大肠杆菌再酶切琼脂糖凝胶电泳回收得ABC1 promoter DNA与PGL3-B/neo作连接反应酶切鉴定得PGL3B/ABC1-neo质粒，再将PGL3B/ABC1-neo质粒和PRL-TK质粒瞬转染入HepG2细胞，将它用作对ABC1基因细胞靶标筛药系统来筛选第三代升HDL抗动脉粥样硬化心血管疾病药物的方法，即双报告基因法测定不同药物刺激靶细胞ABC1 Promoter的表达。
本发明具有如下优点1、本发明首次建立瞬转染的ABC1-promoter细胞，并用该细胞靶标筛药系统来筛选转运和降低细胞及血管斑块内胆固醇的第三代抗动脉粥样硬化心血管病药。
2、本发明的细胞靶标筛药系统可用于筛选合成的化合物或复合化合物筛选植物提取的单体或混合物，筛选各种微生物代谢产物中的具有转运及降低细胞及血管斑块胆固醇作用的活性化合物。
3、适合于做高通量药物筛选。筛药作用机理明确、速度快，灵敏度高(可测得10-13luciferase基因表达量)，价廉。
本发明提供了建立ABC1 Promoter细胞靶标的技术方案，该方案包括下列步骤I人基因组DNA的提取1)取抗凝血2ml，用2倍的生理盐水稀释混匀。
2)在离心管中加入2ml淋巴细胞分离液，在液面上轻轻加入4ml已稀释混匀的。
血液，室温下离心200g 20分钟，(注此时红细胞沉于管底，白色的淋巴细胞及其它有核细胞分布于上层血浆与下层淋巴细胞分离液的界面)。
吸弃上清液，小心吸出中间有核细胞层。转入1.5ml Eppendorf管中，用生理盐水洗涤1次。
4)将细胞悬浮于TE缓冲液中，加SDS至终浓度为0.5％，蛋白酶K至终浓度为200μg/ml，50℃水浴3小时，其间振摇2-3次。
加入等体积平衡酚混匀，室温离心，10000g离心5分钟。
小心吸取上清液，并转移至另一Eppendorf管，勿将蛋白层吸出。
加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀，离心10000g，5分钟。
转移上清液至另一Eppendorf管中，加入1/10体积3M乙酸钠(PH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，混匀，-80℃放置30分钟。
离心12000g，15分钟，弃上清液，加1ml冷75％乙醇轻洗管壁，10000g5分钟，弃尽上清液，37℃静置干燥10分钟。
5)用100μlTE(pH8.0)溶解Genomic DNA。
II以人基因组DNA为模板用PCR技术复制获取ABC1 PromoterDNA序列引物上游5’TGCTCGAGTTACACGACTGCAATTCTCTGG 3’下游5’ACAGATCTGTTTGCGTCTCTTTCTCCTACC 3’上下游引物各 0.5μl浓度为 10μmol/L10×LA PCR反应缓冲液 5μldNTP(2.5mmol/L) 1μl 浓度为 200μmol/LGenomicDNA模板 1μl 总量1μgTaKaRa LA Taq(5U/ul) 0.5μl去离子水 补至50μl以MJ Research公司PTC-150 PCR仪扩增94℃变性1分钟开始循环(1)98℃ 20秒68℃ 20分钟重复14循环开始循环(2)98℃ 20秒68℃ 20分钟(每次循环延长15秒)重复16循环72℃ 10分钟III Agarose(1％)胶电泳鉴定PCR产物Agarose DNA快速回收(Gibco BRL，Concert Gel Extraction System)
准备a.50℃水浴装置b.预热TE缓冲液至65-70℃1)切胶以洁净、锋利刀片切下含DNA片段的Agarose胶，修净边缘。
2)称重胶浓度小于2％，重量小于400mg者，装入1.5ml Eppendorf管中，每10mg胶加入30ml L1(Gel.Solubilization Buffer，见Gibco公司操作手册)。
3)溶解50℃水浴15分钟以上，每隔3分钟混匀一次，溶解后继续水浴5分钟。
4)装柱取一洗脱柱放入一2ml洗涤管中，把“3”中的混和物倒入洗脱柱中，离心12000g 1分钟，弃去洗涤管中液体。
洗涤(可选)洗脱柱放回2ml洗涤管中，加500μl L1，室温放置1分钟，离心12000g 1分钟，弃去洗涤管中液体。
洗涤洗脱柱放回2ml洗涤管中，加700μl L2(Wash Buffer，含乙醇，见Gibco公司操作手册)，室温放置5分钟，离心12000g 1分钟，弃去洗涤管中液体，重复离心1分钟，弃去洗涤管。
DNA回收把洗脱柱放入一新的1.5ml Eppendorf管中，加入50μl预热的TE缓冲液，室温放置1分钟，离心12000g 2分钟，可得回收DNA。
IV目的基因克隆入pGEM-T Easy Vectors(Promega公司)在一新的0.5ml Eppendorf管中先后加入如下试剂2×快速连接缓冲液 5μlpGEM-T Vector(50ng)1μlPCR产物(胶回收产物)3μlT4 DNA连接酶(3U/μl) 1μl总体积10μl，4℃连接反应过夜。
V细菌转化取JM109感受态菌200μl于Eppendorf管中加入上述已连接了目的基因的T载体(pGEM-T/ABC1)4μl，轻轻混匀，放置冰上30分钟。
42℃水浴，热休克90秒，不摇动试管。
管中加入无抗生素之LB培养基800μl，37℃温和摇动(150rpm)45分钟。
5000g离心30秒，吸去上清液约800μl，加入X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷IPTG异丙基β硫代半乳糖苷(Promega购得)混匀后，用无菌涂布器将菌液全部铺于含氨苄青霉素的琼脂平板表面，37℃平放20分钟后倒置培养10-14小时(过夜)。
次日挑取白色菌落接种于3ml含氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃摇床摇菌(180rpm)12小时。
VI质粒提取取菌液，加入至Eppendorf管中，4℃ 4000g离心10分钟，弃上清液，倒置试管，滴尽残存液体。
加入100μl SI，漩涡振荡后完全重悬菌体。
加入200μl SII，颠倒Eppendorf管4次。
加入150μl SIII，12000g离心10分钟。
附① SI50mm葡萄糖，25mmol Tris-Hcl(pH8.0)，10mmol EDTA(pH8.0)，配制200ml。
②SII0.2mol NaOH，1％SDS，配制100ml。
③SIII5mol乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，双蒸去离子水28.5ml。
将上清液移到另一Eppendorf管中，加入等体积(450μl)苯酚氯仿异戊醇，混匀后，12000g离心10分钟。
小心吸取上层水相，加入冰无水乙醇，混匀后-70℃放置30分钟，12000g离心15分钟。
弃上清液，加500μl冷75％乙醇轻洗管壁，10000g 5分钟，弃尽上清液，37℃静置干燥10分钟。
用50μlTER(PH7.4)(50μlTE pH8.0，RNaseA 10mg/ml，5μl)溶解质粒。
VII酶切鉴定及序列测定于一新Eppendorf(EP)管中依次加入以下反应物及试剂ddH2O 6μl10×缓冲液2μl限制酶(Bgl II及Xho I)各 1μl质粒DNA 10μl总体积20μl，离心混合。
37℃水浴1-1.5小时。
Agarose凝胶电泳，可见大小约1.1kb的目的基因片段。用前述快速胶回收法回收此片段。
克隆目的基因的pGEM-T/ABC1质粒载体保存于甘油菌中，并送BioAsia公司测序，结果与原设计DNA序列一致，结果如下 VIII抗抗菌素G418的neo基因和目的基因克隆进pGL3-B(pGL3-BasicDNAVector)1)pGKneo+质粒以Xho I酶切可得到约2Kb的含neo的DNA片段。
2)将上述以Xho I酶切得到的neo基因片段克隆入PGL3-B的Sal I酶切位点中pGL3-B质粒以SalI酶切。
PGL3-B 10μl，10×CIP(小牛肠硷性磷酸酶)Buffer 2μl，CIP 1μl，去离子水补足20μl。37℃水浴30分钟。
DNA纯化以一次苯酚/氯仿(1∶1)抽提，一次氯仿抽提，乙醇沉淀，晾干。
3)neo片段与经Sal I酶切后线性化的PGL3-B连接在0.5ml Eppendorf管中目的基因片段0.5μg载体DNA(pGL3-B)0.1μg10×连接Buffer 2μlT4DNA连接酶1μl加去离子双蒸水补至20μl，16℃水浴12-16小时。
4)将重组质粒转化大肠杆菌。制备含neo抗性基因的pGL3-B质粒(pGL3-B/neo)。
ABC1 promoter克隆入pGL3-B/neo质粒①将pGL3-B/neo以Xho I酶切反应(5-10μgDNA，10-20U酶，0.1-0.2μg电泳鉴定)；②再以Bgl II作一次酶切反应。
③Agarose电泳并回收酶切片段。
将双酶切后的pGL3-B/neo与上述回收得到的ABC1 promoter DNA作连接反应。酶切鉴定并获得克隆了ABC1 promoter DNA的pGL3-B/neo(PGL3B/ABC1-neo)。PGL3B/ABC1-neo质粒用于转染人HepG2细胞株(ATCC公司)。
IX PGL3B/ABC1-neo质粒转染人HepG2细胞株(转染细胞用Gibco公司的LipofectAmine药盒)转基因前试剂准备工作备好无菌的Eppendorf管(1.5m)。
溶液A将2μg DNA质粒加入100μl不含有血清和抗菌素的MEM培养基。
溶液B将12μl lipofectamine加入100μl不含血清和抗生素的MEM培养基。
A液和B液小心混合，于室温搁置40分钟。混合物可能会形成雾絮状，这并不妨碍细胞转染。
X转基因操作步骤1)转染细胞前一天，HepG2细胞以3×105数进6孔培养板中的每一孔。加入1ml含10％胎牛血清的MEM完全培养液。
2)转染时，先用2mlMEM洗HepG2细胞一次。
3)加0.8ml MEM培养液入A+B混合液，加以混合，将混合液加入细胞上。此时的混合液不包含胎牛血清。
4)细胞与质粒在培养箱中于5％CO2和37℃条件下转染24小时。
5)培养24小时后，将培养液换成正常培养液，即包含1×胎牛血清和抗生素(终浓度青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml)的培养液，另培养48小时，形成瞬转染细胞。
XI瞬转基因细胞luciferase报告基因测定方法(所有检测试剂购之于Promega公司)A配制Luciferase测定试剂将Luciferase Assay Substrate冻干粉全部溶于10ml Luciferase Assay BufferII，混匀，即可。LAR反复冻融将降低效价，-70℃可保存一年。故应分装冻存。
每次反应需100μl。使用前必须置室温平衡。
B配制PBS缓冲液C配制1×CCLR(Cell Culture Lysis Reagent)以4倍体积之双蒸水稀释5×CCLR即得1×CCLR。使用前必须置室温平衡。
操作步骤1)吸去细胞培养液，用PBS Buffer(1ml)洗2遍，注意不要移动细胞。
2)加入1×CCLR覆盖细胞。
多孔板1×PLB6孔板 500μl12孔板250μl24孔板100μl48孔板65μl96孔板20μl3)充分吹打细胞，将细胞碎片和液体转入离心管，12000g离心5秒，将上清液转入新管中。如时间来不及，需将之保存于-70℃。
4)将20μl细胞抽提液与100μl的Luciferase Assay Reagent(室温平衡)用枪头混匀。
5)设置Luminometer(型号Turner Designs-2010，Turner DesignsInstrument公司，Sunnyvale，CA)STD模式，2秒delay，10秒检测。
6)将管子放入Luminometer中，进行检测(检测需在10秒内进行，时间过长，光密度会衰变)。
7)吸取细胞裂解物20ul在LAR II中用枪头混匀2-3次(不要振荡，以免粘附于管壁，影响第二报告基因检测)。
8)将管子放入Luminometer中，按Go开始检测。
9)第一报告基因检测完毕，Luminometer自动停止，加入100ul Stop&GloReagent，并充分混匀(vortex)，放回Luminometer中，按Go继续检测。
图1.发明者设计的ABC1 Promoter DNA序列(字母下双线为Xho I和Bgl II的酶切位点)。
图2.文献报道的ABC1 PromoterDNA序列。
图3.pGL3-Basic Vector质粒图。
图4.克隆了neo基因的pGL3-Basic Vector质粒图。
图5.克隆了neo和ABC1 Promoter基因的pGL3-Basic Vector的质粒6.含有Renilla Luciferase基因的pRL-tk Vector质粒图。
图7-1、图7-2.建立ABC1细胞靶标及测定Luciferase路线图。
图8.用PCR方法复制获得的ABC1 Promoter琼脂糖电泳鉴定图谱。图谱左列为DNA长度标记，右列为ABC1 Promoter电泳条带。该条带大小为1.1kb，同于我们设计的DNA长度。
图9.ABC1 Promoter和neo基因共同克隆入pGL3后琼脂糖电泳鉴定图谱。左起第一列为DNA标记，第二列条带显示neo基因和ABC1Promoter(1.1kb)。
图10.双报告基因法测定不同药物刺激靶细胞ABC1 Promoter的表达双报告基因法测定不同药物刺激靶细胞ABC1 Promoter的表达方法(使用Promega Dual-LuciferaseTM Reporter Assay System)(1)1×104瞬转细胞接种于48孔培养板中，每孔0.5ml MEM完全培养液，含10％胎牛血清和抗生素(终浓度青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)。加入溶解于DMSO，浓度为250,500，1000μg/ml的待测药物于细胞培养液内，加药后细胞在培养箱中于5％ CO2和37℃条件下培养24小时。
(2)倾去培养液，以PBS缓冲液洗涤细胞二次，快速转一下除去死细胞，完全除去残留液体，待测定。
(3)加入1×PLB覆盖板中细胞，室温摇床摇15分钟。吸取全部细胞裂解物于一1.5ml的离心管中。
(4)用13000rpm×30秒离心后，取上清检测。
(5)取100ul LAR II加入一新的1.5ml离心管中。
(6)设置LuminometerDLR模式，2秒delay，10秒检测。
(7)吸取细胞裂解物20ul在LAR II中用枪头混匀2-3次(不要振荡，以免粘附于管壁，影响第二报告基因检测)。
(8)将管子放入Luminometer中，按Go开始检测。
(9)第一报告基因检测完毕，Luminometer自动停止，加入100ul Stop&GloReagent，并充分混匀(vortex)，放回Luminometer中，按Go继续检测。
结果图10显示，药物1与药物2在250μg/ml浓度下可以显著地升高ABC1 Promoter表达，药物1可提高Promoter活性4.75倍，而药物2达10.94倍。与空白对照组相比均有显著性差异(P＜0.05)。Luciferase表达强度随药物浓度而变化。
实施例提取人基因组DNA，取抗凝血2ml，用2倍生理盐水稀释混匀，在离心管中加入2ml淋巴细胞分离液，在液面上轻轻加入4ml上述已稀释混匀的血液，室温下离心200g 20分钟，(此时红细胞沉于管底，白色的淋巴细胞及其它有核细胞分布于上层血浆与下层淋巴细胞分离液的界面)吸弃上清液并小心吸出中间有核细胞层。转入1.5ml Eppendorf管中，用生理盐水洗涤一次，再将所得细胞悬浮于TE缓冲液中，加SDS至终浓度为0.5％蛋白酶K至终浓度为200μg/ml，50℃水浴3小时，其间振摇2-3次，再加入等体积平衡酚混匀，室温10000g离心5分钟。小心吸取上清液并转移到另一Eppendorf管中，勿将蛋白层吸出，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)溶剂，混匀，转移上清液至另一Eppendorf管中，加入1/10体积3M乙酸钠(PH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，混匀。-80℃放置30分钟，然后离心12000g，15分钟，弃上清液，加1ml冷75％乙醇轻洗管壁，10000g离心5分钟，弃尽上清液，离心10000g，5分钟。37℃静置干燥10分钟。再用100μlTE(pH8.0)溶解基因组DNA。
将上述人基因组DNA作为模板用PCR技术复制获取ABC1 PromoterDNA序列引物上游5’TGCTCGAGTTACACGACTGCAATTCTCTGG 3’下游5’ACAGATCTGTTTGCGTCTCTTTCTCCTACC 3’上下游引物各0.5μl，浓度为10μmol/升，10×LAPCR反应缓冲液dNTP(2.5mmol/L)1μl，浓度为200μmol/升，基因组DNA模板1μl，总量1μg。
TaKaRa LA Taq(5U/ul)0.5μl再用去离水加至50μl，采用MJ Research公司PTC-150 PCR仪扩增，扩增条件为94℃变性1分钟，开始循环(1)98℃ 20秒，68℃ 20分钟，重复14循环，开始循环(2)98℃ 20秒，68℃ 20分钟(每次循环延长15秒)重复16循环，72℃ 10分钟，采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，快速回收琼脂糖DNA首先准备50℃水浴加热，将TE缓冲液至65-70℃，用干净锋利刀片切下含DNA片段的琼脂糖胶，修净边缘。
5)将胶浓度小于2％，重量小于400mg的放于1.5ml Eppendorf管中，每100mg胶加入30ml L1(Gel.Solubilization Buffer，见Gibco公司操作手册)。在50℃水浴加热15分钟以上，每隔3分钟混匀一次，待全部溶解，50℃水浴再加热5分钟，取一洗脱柱放入一个2ml洗涤管中，将上述加温后的混和物倒入洗脱柱中，然后12000g离心1分钟，弃去洗涤管中液体，洗脱柱重新放回到2ml洗涤管中，再加500μl L1室温放置1分钟，12000g离心1分钟，弃去洗涤管中液体，洗脱柱放回2ml洗涤管中，加入700μl L2(WashBuffer含乙醇见Gibco公司操作手册)，室温放置5分钟，12000g离心1分钟，弃去洗涤管中液体，重复离心1分钟，弃去洗涤管。将洗脱柱放入一新的1.5ml Eppendorf管中，加入50μl预热的TE缓冲液，室温放置1分钟，12000g离心2分钟，可得回收DNA。
在一新的0.5ml Eppendorf管中先后加入2×快速连接缓冲剂(2×RapidLigation Buffer)5μl，从Promega公司购得的pGEM-T Vector(50ng)1μl，上述用PCR技术回收的DNA 3μl T4 DNA连接酶(3U/μl)1μl总体积为10μl，4℃连接反应过夜。取JM109感受态菌200μl于Eppendorf管中，加入上述已连接好的目的基因的T载体(即pGEM-T/ABC1)4μl，轻轻混匀，放置冰上30分钟，然后42℃水浴热休克90秒，不摇动试管，加入无抗生素的LB培养基800μl，37℃温和振摇(150rpm)45分钟，然后5000g离心30秒，吸去上清约800μl，再加入X-半乳(5溴-4-氨-3-吲哚基-D-半乳糖苷)加入由Promega购得的IPTG(异丙基β-硫代半乳糖苷)混匀后，用无菌涂布器将菌液全部铺于含氨苄青霉素的琼脂平板表面，37℃平放20分钟后倒置培养10-14小时(过夜)，次日挑取白色菌落接种于3ml含氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃摇床摇菌(180rpm)12小时，取上述菌液放入Eppendorf管中，4℃ 4000g离心10分钟，弃上清液，倒置试管，滴尽残存液体，再加入100μl SI(SI组成为50mm葡萄糖，25mmol Tris-Hcl(pH8.0)，10mmolEDTA(pH8.0)，配制200ml，再加入200μl的SII(SII由0.2mol NaOH，1％SDS，配制100ml组成)，再加入150μl的SIII(SIII 5mol乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，双蒸去离子水28.5ml组成)，将上清液移到另一Eppendorf管中加入等体积(450μl)苯酚、氯仿、异戊醇，混匀后，12000g离心10分钟，小心吸取上层水相，加入冰无水乙醇，混匀后-70℃放置30分钟，12000g离心15分钟。弃上清液，加500μl冷75％乙醇轻洗管壁，10000g 5分钟，弃尽上清液，37℃静置干燥10分钟，再用50μl TER(PH7.4)(50μl TE pH8.0，RnaseA10mg/ml，5μl)溶解质粒，用一新Eppendorf管中依次加入以下反应物及试剂ddH2O6μl10×缓冲液2μl限制酶Bgl II及Xho I各 1μl上述质粒DNA 10μl总体积20μl，离心混合37℃水浴加热1-1.5小时。
用琼脂糖凝胶电泳，可见大小约1.1kb的目的基因片段。再用前述的快速胶回收法回收此片段、克隆有目的基因的pGEM-T/ABC1质粒载体保存于甘油菌中，并送BioAsia公司测序结果与原设计DNA序列一致，结果如下 将抗菌素G418的neo基因和上述目的基因克隆进入pGL3-B(pGL3-BasicDNA Vector)采用PGKneo+质粒以Xho I酶切得约2Kb的含neo的DNA片段将上述Xho I酶切所得的neo基因片段克隆入PGL3-B的Sal I酶切位点中，PGL3-B质粒以Sal I酶切，然后PGL3-B 10μl，10×CIP(小牛肠硷性磷酸酶)缓冲液2μl，CIP 1μl去离子水加至20μl，37℃水浴30分钟，将DNA纯化，通过一次苯酚∶氯仿(1∶1)提取，一次氯仿抽提，乙醇沉淀，晾干，再将0.5mg neo基因片段放于0.5ml Eppendorf管中，再加入载体DNA加入10×连接缓冲液2μl，T4DNA连接酶1μl加去离子重蒸水至20μl，16℃水浴加热12-16小时，进行连接反应。再将上述重组质粒转化大肠杆菌制备含neo抗性基因的PGL3-B质粒0.1μl(Sal I酶切后线性化的PGL3-B)，(pGL3-B/neo)，将ABC1 promoter克隆入pGL3-B/neo质粒中去，通过以下方法完成将pGL3-B/neo以Xho I酶切反应(5-10μg DNA，10-20U酶，0.1-0.2μg电泳鉴定)再以Bgl II作一次酶切反应，用琼脂糖凝胶电泳并回收酶切片断，然后将双酶切后的pGL3-B/neo与前述得到的ABC1 promoterDNA作连接反应。用酶切鉴定得到克隆了ABC1 promoter DNA的pGL3-B/neo即PGL3B/ABC1-neo，然后将PGL 3B/ABC1-neo质粒用于转染人HepG2细胞株(ATCC公司得到)首先准备转基因前的试剂准备工作，配制溶液A将2μg PGL 3B/ABC1-neo DNA质粒和0.1μg PRL-TK质粒共同加入100μl不含有血清和抗菌素的MEM培养基中，配制溶液B，将12μl阳离子脂质体(lipofectamine)加入100μl不含血清和抗生素的MEM培养基，然后将溶液A与溶液B小心混合，于室温放置40分钟(混合物可能会形成雾絮状，这不影响细胞转染)。
转基因操作步骤是转染细胞前一天，HepG2细胞以3×105数进6孔培养板中的每一孔，加入1ml含10％胎牛血清的MEM完全培养液。转染时，先用2ml MEM洗HepG2细胞一次，然后加入0.8ml MEM培养液到上述A+B的混合液中，加以混合，再将混合液加到细胞上，此时的混合液不包含胎牛血清。上述细胞与质粒在培养箱中于5％CO2和37℃条件下转染24小时、培养24小时后，将培养液换成正常培养液即含1×胎牛血清和抗生素(终浓度青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml)的培养液，再培养48小时、形成含PGL-3B/ABCI-neo质粒和PRL-TK质粒的瞬转染细胞供筛选化合物用。
采用荧光素酶双报告基因检测法筛选有效化合物，所有检测试剂购于promega公司。
荧光素酶检测试剂II(LAR II)的配制。
将荧光素酶检测试剂Substrate冻干粉全部溶于10ml荧光素酶测试缓冲液II，混匀，即成LAR II，分装冻存-20℃可保存一月，-70℃可保存一年、LARII反复冻，融将降低效价，LAR II对热稳定可用室温水浴解，用前应混匀。
准备stop & Glo试剂吸取200μl stop & Glo Substrate溶剂用于溶解全部的stop & Glo Substrate并冻干粉应充分溶解，分装注明为“50X”在-20℃可保存一月，-70℃可保存一年，stop & Glo试剂(Substrate+Substrate，Solvent+Buffer)应临用前配制，用stop & Glo缓冲液稀释以上“50X”溶液即得stop & Glo试剂，根据用量配制一个反应需要100μl stop & Glo在-20℃试剂在可保存2周，-70℃可保存一个月。
配制1×CCLR(Cell Culture Lysis Reagent)以4倍体积之双蒸水稀释5×CCLR即得1×CCLR。使用前必须置室温平衡。
操作步骤1)吸去细胞培养液，用PBS Buffer(1ml)洗2遍，注意不要移动细胞。
2)加入1×CCLR覆盖细胞。
多孔板 1×PLB6孔板 500μl12孔板 250μl24孔板 100μl48孔板 65μl96孔板 20μl3)充分吹打细胞，将细胞碎片和液体转入离心管，12,000×g离心5秒，将上清转入新管中。如时间来不及，需将之保存于-70℃。
4)将20μl细胞抽提液与100μl的Luciferase Assay Reagent(室温平衡)用枪头混匀。
5)设置Luminometer(型号Turner Designs-2010，Turner DesignsInstrument公司，Sunnyvale，CA)STD模式，2秒delay，10秒检测。
10)将管子放入Luminometer中，按Go开始检测(检测需在10秒内进行，时间过长，光密度会衰变)。
11)吸取细胞裂解物20ul在LAR II中用枪头混匀2-3次(不要振荡，以免粘附于管壁，影响第二报告基因检测)。
12)将管子放入Luminometer中，按Go开始检测。第一报告基因检测完毕，Luminometer自动停止，加入100ul Stop & GloReagent，并充分混匀(vortex)，放回Luminometer中，按Go继续检测获得筛药结果，结果如图10显示。
权利要求
1.一种由PGL 3B/ABC1-neo载体与PRL-TK质粒共转染HepG2细胞形成含如下DNA序列ABC1 Promoter的转染的HepG2细胞
2.根据权利要求1所述的含ABC1 Promoter的转染的HepG2的细胞，其特征在于具有如下DNA序列的ABC1 Promoter
3.根据权利要求1所述的含ABC1 Promoter的转染的HepG2的细胞，其特征在于PGL 3B/ABC1-neo载体由ABC1 Promoter克隆入由PGK-neo加质粒以Xho I酶切得neo DNA片段，克隆入PGL3-B的Sal I酶切位点构建成PGL 3B/neo vector中再经Xho I和Bgl II酶切位点构成PGL 3B/ABC1-neo vector。
4.一种由PGL 3B/ABC1-neo Vector与PRL-TK质粒共转染HepG2细胞形成含ABC1 Promoter的共转染细胞的方法，其特征在于构建PGL3B/ABC1 neo vector步骤职下1)人基因组DNA的提取；2)以人基因组DNA为模板用PCR技术复制得ABC1 Promoter DNA序列；3)琼脂凝胶电泳鉴定PCR产物；4)具有上述序列的ABC1 Promoter克隆入由PGK-neo加质粒以Xho I酶切得2Kb neo DNA片段克隆入PGL3-B的Sal I酶切位点构建的PGL3B/neo Vector中，经Xho I和Bgl II酶切位点构建成PGL 3B/ABC1-neoVector。
5.根据权利要求4所述含有ABC1 Promoter的共转染细胞的方法，其特征在于ABC1 Promoter由人基因组DNA提取为抗凝血用生理盐水稀释混匀，加入淋巴细胞分离液室温离心，细胞悬浮于TG缓冲液中，加入SDS至终浓度为0.5％，蛋白酶K至终浓度为200μg/ml，振摇50℃水浴3小时，加入等体积平衡酚混匀，室温离心，上清液移入另一管中加十分之一体积的3M醋酸钠和无水乙醇混匀，-80℃放置30分钟。离心弃上清液，加入75％乙醇离心，弃上清液，37℃静置干燥，得基因组DNA，以基因组DNA为模板用PCR技术复制用引物引物上游5’TGCTCGAGTTACACGACTGCAATTCTCTGG 3’下游5’ACAGATCTGTTTGCGTCTCTTTCTCCTACC 3’94℃变性1分钟，开始循环98℃ 20秒，68℃ 20分钟，重复14循环，开始循环98℃ 20秒，68℃ 20分钟，重复16循环72℃ 10分钟，用琼脂糖凝胶泳鉴定、回收测序得具有如下序列的ABC1 Promoter 从PGK-neo加质粒以Xho I酶切得I的neo的DNA片段，再将重组质粒转化大肠杆菌制得neo-DNA片段，克隆入PGL3-B的Sal I酶切位点中得PGL 3B/neo Vector，再将上述得到的ABC1 promoter克隆入PGL3-B/neo的质粒中去经Xho I酶切反应和Bgl II酶切位点通过琼脂糖凝胶电泳并回收酶切片段，再将双酶切后的PGL3-B/neo与回收所得ABC1 prowoter DNA作连接反即得PGL 3B/ABC1-neo质粒。
6.根据权利要求4所述含有ABC1 Promoter的共转染细胞的方法，其特征在于PGL 3B/ABC1-neo质粒和PRL质粒共转染人HepG2细胞的步骤a.配制溶液A将2μg PGL3B/ABC1-neo DNA质粒和0.1μg PRL-TK质粒共同加入100μl不含血清和抗菌素的MEM培养基；b.配制溶液B将12μl lipofectamine加入100μl不含血清和抗菌素的MEM培养基；c.溶液A和B小心混合，室温放置；d.在转染细胞前一天HepG2细胞以3×105数放入6孔培养板中的每一孔，加入10％胎牛血清MEM完全培养液，加入0.8ml MEM培养液入A+B混合液，加以混合，然后加到细胞上；e.细胞与质粒在培养箱中于5％CO237℃条件下转染24小时；f.24小时培养后，将培养液换成含1×胎牛血清和抗生素的培养液再培养48小时，形成含PGL3B/ABC1-neo质粒和PRL-TK质粒的瞬转染细胞。
7.一种由PGL3B/ABC1-neo载体与PRL-TK质粒共转染HepG2细胞形成含ABC1 promoter的共转染细胞，其特征在于该含ABC1 promoter的共转染细胞在筛选第三代升HDL抗动脉粥样硬化心血管药物的方法中应用。
8.根据权利要求7所述筛选第三代升HDL抗动脉粥硬化心血管药物的方法，其特征在于(1)含ABC1 promoter的共转染细胞接种于培养板中，每空0.5ml MEM完全培养液含10％胎牛血清和抗生素，加入溶解于DMSO浓度为250，500，100μg/ml的待测药物于细胞培养液内，加药后细胞在培养箱中于5％CO237℃下培养24小时；(2)倾去培养液以PBS缓冲液洗涤细胞数次，除去死细胞完全除去残留液体，待测定；(3)加入1×PLB覆盖板中细胞，室温摇床振摇15分钟，吸取全部细胞裂解物于一离心管中离心13000rpm 30秒离心后取上清液检测；(4)取100μl LAR II加入另一Eppendorf中，再吸取细胞裂解物20μl在LAR中用抢头混匀几次，将管子放入Luminomenter检测器中检测，第一报告基因检测完毕；(5)加入100μl stop & glo试剂，充分混匀，再放回Luminometer检测器中进行检测第二报告基因。
全文摘要
本发明公开了建立ABC1细胞靶标筛药系统及筛选第三代抗动脉粥样硬化心血管药的方法。本发明建立的ABC1细胞靶标是运用分子克隆技术,将控制动脉粥样硬化的细胞内胆固醇转运蛋白,ABC1的Promoter基因部分克隆进肝细胞株,建立基因水平上表达的ABC1细胞靶标筛药系统。通过测定被筛选化合物所激发ABC1 Promoter的程度来筛选第三代抗动脉粥样硬化心血管药。
文档编号C12N15/63GK1368551SQ0110530
公开日2002年9月11日 申请日期2001年2月7日 优先权日2001年2月7日
发明者龚邦强 申请人:龚邦强