专利名称：将二倍体转变成单倍体用于遗传诊断的利记博彩app
技术领域：
本发明得到了美国政府基金的资助，即NIH拨款CA43460、CA57345、CA62924、CA67409、CA72851。因此，美国政府保留对本发明的某些权利。本申请要求1999年10月8日提交的临时申请流水号60/158,160的收益，而且是1999年12月15提交的专利申请流水号09/461,047的部分继续申请。
背景技术：
至少就遗传诊断而言，人类和其它哺乳动物的问题在于它们是二倍体。一个等位基因中的突变(诸如负责所有显性遗传综合症的突变)总是伴随着第二个等位基因的野生型序列。虽然在过去的十年里已经开发了用于遗传诊断的许多有力技术，但是它们都受到模板中存在的二倍性的限制。例如，与突变型条带具有相同电泳迁移率的野生型条带能够使测序梯的解释变得复杂，尤其是在突变型条带的亮度较弱的时候。DNA区段的删除甚至更成问题，因为在这种情况中只有野生型等位基因通过标准技术得到了扩增和分析。这些问题呈现了诊断单基因疾病的困难，而对多基因疾病甚至更成问题，其中作为原因的突变可发生于几种不同基因之任一种。这种多基因机制是常见易感性综合症的规则而非例外，诸如与乳腺癌和结肠癌、失明、以及血液学、神经学、和心血管疾病有关的综合症。遗传诊断这些疾病的灵敏度目前不是最佳的，其中30％-70％的情况难于遗传分析。
本领域需要简单的分离和分析来自人类和其它哺乳动物细胞的单个等位基因。
发明概述本发明的一个目的是提供用于检测人类或其它哺乳动物染色体上目的基因中的突变的方法。
本发明的另一个目的是提供用于使待测细胞适用于灵敏的遗传测试的方法。
本发明的还有一个目的是提供可用于遗传分析的融合杂交细胞群体。
下文所述一个或多个实施方案提供了本发明的这些和其它目的。在一个实施方案中，提供了用于检测人类或其它哺乳动物目的基因中的突变的方法。使人类或其它哺乳动物的细胞融合啮齿类细胞受者，以形成人类-啮齿类或其它哺乳动物-啮齿类杂交细胞。通过选择啮齿类染色体所含第一种标记和第一人类或其它哺乳动物染色体所含第二种标记来选择融合后杂交细胞，以形成融合后杂交细胞群体。在融合后杂交细胞群体中检测对于第二人类或其它哺乳动物染色体而言是单倍体的杂交细胞亚群。该第二人类或其它哺乳动物染色体与第一人类或其它哺乳动物染色体是不同的而且没有选择。测试杂交细胞亚群以检测基因、所述基因的mRNA产物、或所述基因的蛋白质产物。该基因位于第二种人类或其它哺乳动物染色体上。mRNA或蛋白质产物的量减少或者基因、mRNA、或蛋白质产物的特性改变指示人类或其它哺乳动物的该基因中存在突变。
依照另一个实施方案，公开了为遗传测试提供待测细胞的方法。待测细胞对于人类或其它哺乳动物基因而言是单倍体。使人类或其它哺乳动物的细胞融合经转化的二倍体啮齿类细胞受者，以形成人类-啮齿类或其它哺乳动物-啮齿类杂交细胞。通过选择第一人类或其它哺乳动物染色体和啮齿类染色体各自的标记来选择融合后杂交细胞，以形成在没有选择人类或其它哺乳动物染色体的情况中稳定维持一或多个人类或其它哺乳动物染色体的细胞群体。在细胞群体中检测对于第二人类或其它哺乳动物染色体而言是单倍体的细胞，该第二人类或其它哺乳动物染色体不同于该第一人类或其它哺乳动物染色体，而且没有选择。
本发明还提供了啮齿类-人类或啮齿类-其它哺乳动物杂交细胞群体，其中，在100个细胞中至少有1个细胞，在其中至少2个人类或其它哺乳动物常染色体的每种同系物以单倍体形式存在。
本发明由此通过提供对于一种或多种目的基因而言是单倍体的杂交细胞用于分析而为本领域提供了可用于提高多种诊断和分析方法的灵敏度和效力的方法。杂交细胞的人类或其它哺乳动物染色体成分是稳定的且一致的。
图的简述
图1用于生成杂交细胞的策略。使受者小鼠细胞系E2融合人类淋巴细胞，随后用HAT+遗传霉素(分别杀死未融合的E2细胞和淋巴细胞)选择克隆。所有克隆包含负责在HAT中生长的人类X染色体。测定克隆的基因型以确定保留了哪个人类染色体。标有“A”和“B”的染色体表示代表性人类染色体的两种同系物。图中指出了所分析6种染色体同系物的二者皆未保留、二者都保留、或保留二者任一的克隆所占平均比例(见正文)。对保留待测基因的一个等位基因的克隆的核酸进行突变分析。
图2杂交细胞中的等位基因状况和基因表达。(图2A)所示染色体的多态标记用于测定所示杂交细胞的基因型。“供体”指用于融合小鼠受者细胞的人类淋巴细胞。(图2B)E2和4种杂交细胞的cDNA作为模板用于扩增hMSH2、hMSH6、hMLH1、hTGF、β-RII、hPMS1、hPMS2、和APC序列。结果符合图2A中观察到的基因型，即杂交细胞5-7保留了包含所测试基因的每种染色体的至少一个等位基因，而杂交细胞8包含染色体3、5、和7的等位基因，但不含染色体2(包含hMSH2、hPMS1、和hMSH6基因)的等位基因。
图3难于进行标准遗传诊断的HNPCC患者的突变分析。对来自所示杂交细胞的核酸测试染色体2和3的保留情况(使用多态标记)(图3A)和分别位于染色体2和3上的hMSH2和hMLH1基因的表达(图3B)。杂交细胞1、2、3、和6包含来自染色体2的等位基因A，但不表达hMSH2转录本；而杂交细胞4和5包含等位基因B，并表达hMSH2。hMLH1表达作为cDNA完整性的对照。(图3C)由所示杂交细胞扩增代表所示hMSH2外显子的序列。在包含等位基因A的杂交细胞中不存在外显子1-6，但是在包含任一等位基因的杂交细胞中存在外显子7-16。
图4Warthin家族G的突变分析。(图4A)对来自杂交细胞1(包含Warthin家族G患者的突变型等位基因)的hMSH2转录本的RT-PCR产物的序列分析图示了24bp插入(标有下划线；将反义引物用于测序)。在杂交细胞3(包含野生型等位基因)中发现了野生型序列。来自患者淋巴样细胞的转录本的RT-PCR分析显示，突变型转录本的表达水平显著低于野生型序列。(图4B)相同杂交细胞基因组DNA的序列分析显示，插入是由于位于外显子4剪接受体位点处的A向C突变(反义序列，以粗体和下划线指示)，导致使用上游24bp的隐藏剪接位点。突变体C的信号不如供体DNA中的野生型A强。这种不等价在来自二倍体细胞的测序模板中并非不寻常，而且能够导致解释层析图的困难。(图4C)来自杂交细胞1和5(携带染色体2的突变型等位基因)的提取物不含hMSH2蛋白质，而杂交细胞2和3(携带野生型等位基因)的提取物包含hMSH2蛋白质。杂交细胞4不含染色体2的任一等位基因。杂交细胞1、3、4、和5都携带染色体3的至少一个等位基因，而且都合成hMLH1蛋白质。α-微管蛋白作为蛋白质上样对照。显示了使用针对所示蛋白质的抗体的免疫印迹。
优选实施方案的详述我们已经设计了使用一种融合和选择条件而生成包含任何期望人类或其它哺乳动物染色体的杂交细胞的策略。重要且意外的是，在这些杂交细胞中的人类或其它哺乳动物染色体是稳定的，而且它们以足以用于详细分析的水平表达人类或其它哺乳动物基因。该方法基于的原理是，人类或其它哺乳动物细胞与啮齿类细胞之间的融合可产生杂交细胞，该杂交细胞包含全套啮齿类基因组和部分人类或其它哺乳动物染色体。在过去，例如通过营养缺陷型啮齿类细胞的互补对保留特定人类或其它哺乳动物染色体的选择，使得能够分离包含期望染色体的杂交细胞(7，8)。虽然已经证明这种融合体可用于多种目的(8，9)，但是它们的效用受到是否有适用于许多染色体的啮齿类受者可供利用以及融合和选择条件的低效性和变化的限制。为了分析多基因疾病，必需为每种染色体分开进行融合和选择。
人类或其它哺乳动物染色体在本发明杂交细胞中的稳定性是令人惊讶的。虽然辐射杂交细胞的人类遗传结构较为稳定，但是这种稳定性推测是由于在照射供体细胞后小片段人类DNA整合到啮齿类染色体中造成的。而人类染色体在全细胞融合中被认为是不稳定的，除非施加针对个别染色体的持续选择压力。在我们的实验中出现的稳定性的原因尚不清楚，但是可能与啮齿类配偶体的二倍体本质有关。这种二倍性反映了在经转化啮齿类细胞中不常见的染色体稳定性。以前的实验确实显示了，染色体稳定的人类细胞在与其它染色体稳定的人类细胞融合后保留了所有染色体，这与两个配偶体之一染色体不稳定的情形不同。
本发明的二倍体啮齿类受者细胞提供了可用于容易的生成具有功能性单倍体人类基因组的细胞的反应物。来自这些杂交细胞的核酸或蛋白质可作为反应物用于任何标准突变测定法。由于突变测定法正在不断的得到改进并实现自动化(1)，因此杂交细胞所生成材料的价值相应的得到提高。事实上，不久将有可能检查整个基因的序列(除了外显子以外，还包括启动子和内含子)。对于这种分析而言，由单个等位基因产生的核酸模板显然是优越的，因为模板的均一本质可极大增强事实上任何诊断测定法的信噪比。因此，我们设想，这种方法可以有效的用于广泛的研究和临床难题。
目的基因通常是已经发现涉及遗传性疾病的基因，包括涉及结肠癌、乳腺癌、Li-Fraumeni病、囊性纤维化、2型神经纤维瘤、vonHippel-Lindau病等的基因。经鉴定基因包括APC、merlin、CF、VHL、hMSH2、p53、hPMS2、hMLH1、BRAC1等。可以在蛋白质水平鉴定的突变包括调控转录或翻译的序列中的突变、无义突变、剪接位点改变、易位、删除、和插入，或者导致全长蛋白质显著减少的任何其它变化。可以在核酸水平检测更细微的其它突变，诸如通过RT-PCR产物的测序进行。
可用于融合的人类细胞是可以容易的融合啮齿类细胞的任何细胞。易于由临床样本获得的外周血淋巴细胞(PBL)是好的融合配偶体，无论事先是否进行促有丝分裂刺激，无论是新鲜的或于-80℃保存超过一年。既然遗传突变是本发明的主题，那么可以使用人体的任何细胞，因为所有这些细胞都包含基本上相同的遗传组成。可以使用的其它哺乳动物细胞包括(特别是)猫、狗、牛、绵羊、山羊、马、黑猩猩、狒狒、和猪的细胞。更一般的说，其它哺乳动物细胞可选自反刍类、灵长类、食肉类、复齿类(lagomorpha)、和奇蹄类。通常，其它哺乳动物细胞融合配偶体不是啮齿类细胞。
用于融合的啮齿类细胞受者优选二倍体，更优选经癌基因转化，甚至更优选因错配修复基因缺陷而具有微卫星不稳定性。旺盛生长、稳定的二倍体、且高效融合的特定克隆的选择完全属于本领域普通技术人员的技术范围之内。例如，啮齿类细胞可以来自小鼠、大鼠、豚鼠、或仓鼠。
可以依照本领域任何已知方法来实现依照本发明的细胞融合。用于诱导融合的已知技术包括聚乙二醇介导的融合、仙台病毒介导的融合、和电融合。可以以10∶1与1∶10之间的比率混合人类与啮齿类的细胞。融合细胞的克隆通常在生长大约2-3周后变得明显。
可以使用导致正选择表型的任何标记来选择融合后杂交细胞，包括抗生素抗性基因、有毒代谢物抗性基因、原养型标记等。本发明令人惊讶的优点是，选择中可以使用位于一条人类或其它哺乳动物染色体上的一个标记，而且获得不仅仅包含该所选择的人类或其它哺乳动物染色体的稳定杂交细胞。因而，甚至在没有对标记所处染色体进行选择时，也可以分析位于其它染色体上的标记。
可以分析融合后杂交细胞以确定它们确实携带包含目的基因的人类或其它哺乳动物(非啮齿类)染色体。可以将具有两条相关人类或其它哺乳动物染色体之任一的杂交细胞在相互之间区分开，并且与包含两条人类或其它哺乳动物染色体二者的杂交细胞区分开来(见
图1)。虽然可以使用本领域用于鉴定人类或其它哺乳动物染色体的任何已知方法，但是可以通过评估位于人类或其它哺乳动物染色体上的微卫星标记而进行容易的分析。连锁的其它多态性标记可用于鉴定杂交细胞中的期望人类或其它哺乳动物染色体。
一旦由测试的人类或其它哺乳动物分离得到包含一个拷贝的人类或其它哺乳动物目的基因的杂交细胞，就可以在杂交细胞上进行突变分析。可以直接对基因测试突变，或者可以测试基因的mRNA或蛋白质产物。使用合适抗体的Western印迹应当能够检测到导致全长基因产物表达减少的突变。还可以进行依赖目的基因所编码蛋白质功能的测试法和酶测定法来检测突变。还可以采用本领域已知的其它免疫学技术。
若使用免疫学方法来检测杂交细胞中目的基因的蛋白质产物，则希望所用抗体与啮齿类蛋白质不发生交叉反应。或者，可以通过突变而灭活与目的基因同源的啮齿类基因，从而简化蛋白质产物的分析。可以通过本领域众所周知的靶向诱变方法来实现这种突变。
功能测试也可以用于评估每种等位基因产物的常态。例如，若将在p53转录激活位点下游包含β-半乳糖苷酶基因的表达构建物插入包含人类染色体17而不含内源p53的啮齿类-人类杂交细胞，则可以通过使用X-gal染色克隆来检测人类染色体17上的p53突变。可以设计特别为目的基因定制的其它酶促或功能测定法。
可以采用在DNA或RNA水平检测突变的任何本领域已知方法，包括而不限于测序、等位基因特异性PCR、等位基因特异性杂交、微阵列、DGGE、和自动化测序。
有可能的是，目的基因在杂交细胞环境中的表达可能受到抑制。为了将目的基因在杂交细胞中的表达损失有意义的解释为指示人类或其它哺乳动物中的突变，必须确认目的基因(在野生型时)在啮齿类-人类或其它哺乳动物杂交细胞中表达。不需要为每位患者进行这种确认，而是可以在建立测定法时进行。
当本发明的测定法指示目的基因中存在突变时，可以测试其他家族成员以确定他们是否也携带突变。或者，可以测试其他家族成员以了解他们是否携带与受影响家族成员相同的染色体。这可以通过测试单倍型来测定，即在受影响家族成员中携带突变的染色体上找到的一套不同标记。单倍型的测定是对第一个家族成员进行本发明测定法的副产物。当例如通过使用微卫星标记来测试杂交细胞以确认杂交细胞中相关染色体的存在时，将可鉴定一套不同的标记，然后作为单倍型使用。
通过本发明融合方法生成的杂交细胞混合群体可能包含对于许多不同人类或其它哺乳动物染色体而言是单倍体的杂交细胞。通常，在单倍体状态的群体中，在100个、75个、50个、30个、或28个细胞中至少有1个，将存在至少2条、至少5条、至少10条、至少15条、至少20条、甚至22条人类或其它哺乳动物常染色体的每种同系物。因而，高比例的细胞包含多条人类或其它哺乳动物染色体，而且必需测试较少数目的细胞以找到包含单拷贝未选择染色体的细胞。
由于人类或其它哺乳动物染色体在本发明杂交细胞中的高稳定性，因此由一个杂交细胞生成的细胞群体是一致的且均一的。因而，在由一个杂交细胞生成的群体中至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、或100％的细胞包含同一套人类或其它哺乳动物染色体。
下列实施例提供的实验细节例证了进行本发明的许多方法之一。本发明不限于实施例中所采用细胞的具体方法。权利要求书和说明书作为一个整体提供了本发明的量度。
实施例所有杂交细胞都包含人类X染色体，因为该染色体包含使之能够在HAT中生长的HPRT基因。为了测定杂交细胞中是否存在其它人类染色体，将多态性微卫星标记(12)作为探针用于基于PCR的测定法(图2A)。我们关注已知包含结肠直肠癌(CRC)易感基因的染色体臂(2p、2q、3p、5q、7q、和16q)。在显著比例的杂交克隆中存在这些染色体臂每一种的一个拷贝。例如，在由14个个体衍生并检查染色体3的476个杂交细胞中，136个杂交细胞不包含任一条供体染色体，211个杂交细胞包含两条供体染色体，60个杂交细胞包含一条亲本染色体，69个杂交细胞包含另一条亲本染色体。对所分析的6种染色体臂都发现相似保留频率。对来自一条染色体两臂的标记的测试显示，杂交细胞保留了整条染色体而非染色体片段。对杂交细胞中期染色体涂片进行的荧光原位杂交(FISH)确认了这个结果，指出在每个杂交细胞中存在11±3条人类染色体。基于基因型数据的计算指出，就研究中的一条染色体而言，对25个杂交细胞的分析将确保有95％的概率可鉴定到至少1个包含母本等位基因的杂交细胞和至少1个包含父本等位基因的杂交细胞。此外，它将只需要45个杂交细胞来相似确保在至少一个杂交细胞中存在所有22种常染色体的每一种等位基因且与其同系物分开(13)。
上文所述结果证明，在融合小鼠细胞后可以容易的分离人类染色体的个别等位基因。
HNPCC为转变方法的力量提供了令人信服的实证，因为它是已经广泛研究的常见遗传性疾病。在最近3年里，例如已经对来自遍布全世界的9个组中的303个HNPCC同类进行了主要MMR基因的广泛研究(25-34)。根据在他们的癌中具有特征性微卫星不稳定性的这些患者的比例(30-34)，可以估计，239个(78％)同类在错配修复基因中具有生殖系突变。然而，只在这239个同类的127个(42％)中鉴定到MMR基因突变(25-34)。我们的组是相似的，即来源于总共25个同类，其中22个患有肿瘤，而且具有微卫星不稳定性和假定的MMR基因突变。在这22个中，我们的最初分析揭示只在12个(54％)中存在突变(参考14和未发表数据)。只有在转变分析之后揭示了其他10名患者的突变，由此将灵敏度由54％提高到100％。事实上与MSI有关的HNPCC的所有案例都归咎于已知MMR基因的生殖系突变，这一结论与最近证明在绝大多数HNPCC患者的癌中不存在MSH2或MLH1蛋白质染色的免疫组织化学数据是一致的(40、41)。这些结果的推论是，对新的人类MMR基因的搜索不应当基于大部分HNPCC案例将证明可归咎于这些未知基因的前提。
上文所述系统可以以直接了当的方式用于其它遗传性疾病。应当强调的是，这种方法并非目前用于搜索特定突变的许多有力方法的替代。更正确的说，转变可用于将现有技术的灵敏度最大化。由于转变核酸可得到较高信噪比而且野生型等位基因不能够掩饰或混淆突变型等位基因的检测，因而转变核酸为这些方法提供了优选底物。由于基于DNA的突变测定法在未来将获得改进，而且日益增多的掺入微阵和其它自动化特征(42-44)，因此转变生成核酸的价值将相应提高，显著增强遗传性疾病的遗传测试法的效力。方法细胞培养小鼠胚性成纤维细胞衍生自MSH2缺陷型小鼠(46)并经腺病毒E1A和RAS癌基因转化。通过在10μM 2-氨基6-巯基嘌呤中培养成纤维细胞来选择HPRT缺陷型亚克隆。在添加10％FCS和10μM 2-氨基6-巯基嘌呤的Dulbecco氏修改Eagle氏培养基(DMEM)中维持克隆。细胞融合和杂交细胞的生成患者来自由阿姆斯特丹标准定义的患HNPCC同类(44)；由于缺乏足够数目的患病个体，因而没有一个案例可以进行连锁分析。通过参考文献45推荐的标记，测定了来自这些患者的癌中的微卫星不稳定性(MSI)。将3×106个E2细胞与12×106个淋巴细胞混合，清洗，在融合培养基(0.25M D-山梨醇、0.1mM醋酸钙、0.5mM醋酸镁、0.1％牛血清清蛋白(BSA)，pH7)中离心两次，并重悬于640μl融合培养基。将溶液转移到电击杯(BTX电击杯470；BTX，San Diego)中。使用BTXECM200型ElectroCell操作仪融合细胞。生成最大数目杂交细胞的设置是30V(AC)、22sec，随后3次300V(DC)、每次15μsec脉冲。将来自一个融合的细胞转移到装有添加10％ FCS的DMEM的3个48孔板(Costar)中。24小时后，用添加10％ FCS、0.5mg/ml遗传霉素、和1x HAT(Life Technologies，Gaithersburg，MD)的DMEM更换培养基。一周后更换培养基。融合两周后杂交克隆变得明显，并在测定基因型前再扩增一周。由一个融合获得平均23±15个杂交克隆。用于本文所述实验的淋巴细胞衍生自外周血淋巴细胞的Epstein-Barr病毒感染，但是发现新鲜采集的淋巴细胞也能够成功的使用相同方法进行融合和分析。基因型测定如参考文献12所述进行基因型测定。在6％变性凝胶上分离PCR产物并通过放射自显影可视化。所用微卫星标记是分别来自染色体2p、2q、3p、5q、7q、和16q的D2S1788和D2S1360、D2S1384、D3S2406、D7S1824、和D16S3095。如先前所述进行荧光原位杂交(21)。PCR和测序如先前所述纯化聚腺苷酸化RNA并进行RT-PCR。使用ABI Big Dye终止物和ABI 377型自动化测序仪进行测序。用于扩增和测序的所有引物将可以通过互联网站点获得。统计分析所测试每种染色体的等位基因二者皆无、二者都包含、或仅包含二者之一的杂交细胞的数目符合多维正态分布。蒙特卡洛模拟用于估计生成包含特定数目每种染色体的单等位基因杂交细胞所需要的杂交细胞数目。
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10.E2细胞衍生自由MSH2缺陷型小鼠(由T.Mak慷慨提供)衍生的小鼠胚性成纤维细胞并经腺病毒E1A和RAS癌基因转化。通过在10μM2-氨基6-巯基嘌呤中培养成纤维细胞来选择HPRT缺陷型亚克隆。在添加10％FCS和10μM 2-氨基6-巯基嘌呤的Dulbecco氏修改Eagle氏培养基(DMEM)中维持克隆。
11.将3×106个淋巴细胞混合，清洗，在融合培养基(0.25M D-山梨醇、0.1mM醋酸钙、0.5mM醋酸镁、0.1％牛血清清蛋白(BSA)，pH7)中离心两次，并重悬于640μl融合培养基。将溶液转移到电击杯(BTX电击杯470；BTX，San Diego)中。使用BTX ECM200型ElectroCell操作仪融合细胞。生成最大数目杂交细胞的设置是30V(AC)、22sec，随后3次300V(DC)、15μsec脉冲。将来自一次融合的细胞铺到装有添加10％FCS的DMEM的3个48孔板(Costar)中。24小时后，用添加10％ FCS、0.5mg/ml遗传霉素、和1x HAT(Life Technologies，Gaithersberg，MD)的DMEM更换培养基。一周后更换培养基。融合两周后杂交克隆变得明显，并在测定基因型前再扩增一周。用于本文所述实验的淋巴细胞衍生自外周血淋巴细胞的Epstein-Barr病毒感染，但是我们发现新鲜采集的淋巴细胞也能够成功的使用相同方法进行融合和分析。
12.如F.S.Leach等人，Cell，751215，1993中所述进行基因型测定。在6％变性凝胶上分离PCR产物并通过放射自显影可视化。所用微卫星标记是分别来自染色体2p、2q、3p、5q和16q的D2S1788和D2S13360、D3S2406、D7S1824、和D16S3095。
13.所测试每种染色体的二者皆未包含、二者都包含、或仅包含二者之一的杂交细胞的数目符合多维正态分布。蒙特卡洛模拟用于估计生成包含特定数目每种染色体的单等位基因杂交细胞所需要的杂交细胞数目。
14.如B.Liu等人，Nat Medicine，2169，1996中所述纯化聚腺苷酸化RNA并进行RT-PCR。
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18.使用ABI Big Dye终止物和ABI 377型自动化测序仪进行测序。用于扩增和测序的所有引物将可以通过Science互联网站点获得。
19.将杂交细胞的胞质提取物通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，并用针对人类hMSH2(#NA26，Calboiochem)、人类hMLH1(#13271A，Pharmingen)、或β-微管蛋白(#N357，Amersham)的特异性抗体进行免疫印迹。
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权利要求
1.用于检测非啮齿类哺乳动物目的基因中的突变的方法，包括下列步骤融合非啮齿类哺乳动物细胞与啮齿类细胞受者，以形成非啮齿类哺乳动物-啮齿类杂交细胞；通过选择啮齿类染色体所含第一标记和第一非啮齿类哺乳动物染色体所含第二标记来选择融合后杂交细胞，以形成融合后杂交细胞群体；在融合后杂交细胞群体中检测对于第二非啮齿类哺乳动物染色体而言是单倍体的杂交细胞亚群，所述第二非啮齿类哺乳动物染色体与第一非啮齿类哺乳动物染色体不是相同染色体，而且没有经过选择；分析杂交细胞亚群以检测所述基因或其mRNA产物中的突变，其中该基因位于第二非啮齿类哺乳动物染色体上。
2.权利要求1的方法，其中啮齿类细胞是二倍体。
3.权利要求1的方法，其中啮齿类细胞受者是错配修复缺陷的。
4.权利要求1的方法，其中啮齿类细胞受者是遗传霉素抗性的。
5.权利要求1的方法，其中啮齿类细胞受者经癌基因转化。
6.权利要求5的方法，其中癌基因是ras。
7.权利要求5的方法，其中癌基因是E1A。
8.权利要求1的方法，其中啮齿类细胞受者经ras和E1A癌基因转化。
9.权利要求1的方法，其中啮齿类细胞受者是MSH2。
10.权利要求1的方法，其中啮齿类细胞受者是二倍体而且包含可选择标记和反选择标记。
11.权利要求10的方法，其中反选择标记是HPRT缺陷。
12.权利要求1的方法，其中还包括步骤在融合后杂交细胞群体中检测第三非啮齿类哺乳动物染色体，其中第一、第二、和第三非啮齿类哺乳动物染色体是不同的，而且第二和第三非啮齿类哺乳动物都没有经过选择。
13.权利要求1的方法，还包括步骤在融合后杂交细胞群体中检测第三和第四非啮齿类哺乳动物染色体，其中第一至第四非啮齿类哺乳动物染色体是不同的，而且第二至第四非啮齿类哺乳动物染色体都没有经过选择。
14.权利要求12的方法，其中还包括步骤测试所述杂交细胞亚群以检测第二基因的mRNA产物或所述第二基因的蛋白质产物，其中第二基因位于第三非啮齿类哺乳动物染色体上，其中来自所述第二基因的所述mRNA或蛋白质产物的量降低或所述mRNA或蛋白质产物的特性改变指示该非啮齿类哺乳动物的第二基因中存在突变。
15.权利要求13的方法，其中还包括步骤测试所述杂交细胞亚群以检测第二和第三基因的mRNA产物或所述第二和第三基因的蛋白质产物，其中第二和第三基因位于第三和第四非啮齿类哺乳动物染色体上，其中所述第三或第四基因的所述mRNA或蛋白质产物的量降低或者所述mRNA或蛋白质产物的特性改变指示该非啮齿类哺乳动物的第三或第四基因中存在突变。
16.权利要求1的方法，其中非啮齿类哺乳动物细胞是淋巴细胞。
17.权利要求1的方法，其中检测对于第二非啮齿类哺乳动物染色体而言是单倍体的杂交细胞亚群的步骤是通过鉴定第二非啮齿类哺乳动物染色体上的微卫星标记而实现的。
18.权利要求1的方法，其中分析以检测突变的步骤是通过选自下组的技术而进行的核酸测序、等位基因特异性PCR、等位基因特异性杂交、微阵列杂交、不连续梯度凝胶电泳(DGGE)、和自动化核酸测序。
19.用于为遗传测试提供待测细胞的方法，其中所述待测细胞对于非啮齿类哺乳动物基因而言是单倍体，该方法包括下列步骤使非啮齿类哺乳动物的细胞融合经转化的二倍体啮齿类细胞受者，以形成非啮齿类哺乳动物-啮齿类杂交细胞；通过选择第一非啮齿类哺乳动物染色体和啮齿类染色体各自的标记来选择融合后杂交细胞，以形成在没有选择非啮齿类哺乳动物染色体的情况下稳定维持一或多个非啮齿类哺乳动物染色体的细胞群体；在细胞群体中检测对于第二和第三非啮齿类哺乳动物染色体而言是单倍体的细胞，所述第二和第三非啮齿类哺乳动物染色体与第一非啮齿类哺乳动物染色体是不同的，而且没有经过选择。
20.权利要求19的方法，其中啮齿类细胞受者是遗传霉素抗性的。
21.权利要求19的方法，其中啮齿类细胞受者经癌基因转化。
22.权利要求21的方法，其中癌基因是ras。
23.权利要求21的方法，其中癌基因是E1A。
24.权利要求19的方法，其中啮齿类细胞受者经ras和E1A癌基因转化。
25.权利要求19的方法，其中啮齿类细胞受者是错配修复缺陷的。
26.权利要求19的方法，其中啮齿类细胞受者包含反选择标记。
27.权利要求26的方法，其中反选择标记是HPRT缺陷。
28.权利要求19的方法，其中非啮齿类哺乳动物细胞是淋巴细胞。
29.权利要求19的方法，其中检测对于所述第二和第三非啮齿类哺乳动物染色体而言是单倍体的细胞的步骤是通过鉴定所述第二和第三非啮齿类哺乳动物染色体上的微卫星标记而实现的。
30.权利要求19的方法，还包括步骤在细胞群体中检测对于第四非啮齿类哺乳动物染色体而言是单倍体的细胞，其中所述第四非啮齿类哺乳动物染色体与第一、第二、和第三非啮齿类哺乳动物染色体是不同的而且没有经过选择。
31.权利要求19的方法，还包括步骤在细胞群体中检测对于第四、第五、和第六非啮齿类哺乳动物染色体而言是单倍体的细胞，其中所述第四至第六非啮齿类哺乳动物染色体与第一、第二、和第三非啮齿类哺乳动物染色体是不同的而且没有经过选择。
32.权利要求19的方法，还包括步骤对对于第三非啮齿类哺乳动物染色体而言是单倍体的细胞的核酸测试第三非啮齿类哺乳动物染色体上的基因中的突变。
33.权利要求19的方法，还包括步骤对对于第二和第三非啮齿类哺乳动物染色体而言是单倍体的细胞测试该第二和第三非啮齿类哺乳动物染色体上的基因中的突变。
34.权利要求1的方法，其中对杂交细胞亚群中细胞的mRNA测试第二非啮齿类哺乳动物染色体上的基因中的突变。
35.权利要求1的方法，其中对杂交细胞亚群中细胞的蛋白质测试第二非啮齿类哺乳动物染色体上的基因中的突变。
36.啮齿类-非啮齿类哺乳动物杂交细胞群体，其中，在100个细胞中至少有1个细胞，其中至少2种非啮齿类哺乳动物常染色体的每种同系物以单倍体形式存在。
37.权利要求36的群体，其中，在100个细胞中至少有1个细胞，其中至少5种非啮齿类哺乳动物常染色体的每种同系物以单倍体形式存在。
38.权利要求36的群体，其中，在50个细胞中至少有1个细胞，其中至少5种非啮齿类哺乳动物常染色体的每种同系物以单倍体形式存在。
39.权利要求36的群体，其中，在30个细胞中至少有1个细胞，其中至少5种非啮齿类哺乳动物常染色体的每种同系物以单倍体形式存在。
40.权利要求36的群体，其中，在100个细胞中至少有1个细胞，其中至少10种非啮齿类哺乳动物常染色体的每种同系物以单倍体形式存在。
41.权利要求36的群体，其中，在50个细胞中至少有1个细胞，其中至少10种非啮齿类哺乳动物常染色体的每种同系物以单倍体形式存在。
42.权利要求36的群体，其中，在30个细胞中至少有1个细胞，其中至少10种非啮齿类哺乳动物常染色体的每种同系物以单倍体形式存在。
43.权利要求36的群体，其中，在100个细胞中至少有1个细胞，其中至少15种非啮齿类哺乳动物常染色体的每种同系物以单倍体形式存在。
44.权利要求36的群体，其中，在50个细胞中至少有1个细胞，其中至少15种非啮齿类哺乳动物常染色体的每种同系物以单倍体形式存在。
45.权利要求36的群体，其中，在30个细胞中至少有1个细胞，其中至少15种非啮齿类哺乳动物常染色体的每种同系物以单倍体形式存在。
46.权利要求36的群体，其中，在100个细胞中至少有1个细胞，其中至少20种非啮齿类哺乳动物常染色体的每种同系物以单倍体形式存在。
47.权利要求36的群体，其中，在50个细胞中至少有1个细胞，其中至少20种非啮齿类哺乳动物常染色体的每种同系物以单倍体形式存在。
48.权利要求36的群体，其中，在30个细胞中至少有1个细胞，其中至少20种非啮齿类哺乳动物常染色体的每种同系物以单倍体形式存在。
49.权利要求36的群体，其中，在100个细胞中至少有1个细胞，其中至少22种非啮齿类哺乳动物常染色体的每种同系物以单倍体形式存在。
50.权利要求36的群体，其中，在50个细胞中至少有1个细胞，其中至少22种非啮齿类哺乳动物常染色体的每种同系物以单倍体形式存在。
51.权利要求36的群体，其中，在30个细胞中至少有1个细胞，其中至少22种非啮齿类哺乳动物常染色体的每种同系物以单倍体形式存在。
52.啮齿类-非啮齿类哺乳动物杂交细胞群体，其稳定维持它们的非啮齿类哺乳动物染色体成分，使得至少95％的杂交细胞包含相同的非啮齿类哺乳动物染色体。
53.权利要求52的啮齿类-非啮齿类哺乳动物杂交细胞群体，其中至少97％的杂交细胞包含相同的非啮齿类哺乳动物染色体。
54.权利要求52的啮齿类-非啮齿类哺乳动物杂交细胞群体，其中至少99％的杂交细胞包含相同的非啮齿类哺乳动物染色体。
55.权利要求1的方法，其中非啮齿类哺乳动物是人类。
56.权利要求1的方法，其中非啮齿类哺乳动物选自山羊、绵羊、马、牛、猪、肥猪、猫、和狗。
全文摘要
与遗传性疾病有关的突变的检测因哺乳动物细胞的二倍性而变得复杂。在一个等位基因中存在的突变常常受到另一等位基因的野生型序列的掩饰。在由通过一个融合产生的杂交体细胞中,每一染色体的各等位基因可分离开。可以以明确的方式对来自杂交细胞的核酸分析突变。将这种方法用于检测先前难于遗传诊断的两种引起癌症的突变。研究的家族之一(Warthin家族G)是具有生物医学文献中描述的遗传性结肠癌综合症的第一个家族。
文档编号C12Q1/68GK1384887SQ00814879
公开日2002年12月11日 申请日期2000年10月6日 优先权日1999年10月8日
发明者B·沃戈尔斯滕, K·W·金泽勒, H·炎, N·派帕多普勒斯 申请人:约翰斯霍普金斯大学