肌醇六磷酸酶、编码肌醇六磷酸酶的核酸及包含有此核酸的载体和宿主细胞的利记博彩app

专利名称：：肌醇六磷酸酶、编码肌醇六磷酸酶的核酸及包含有此核酸的载体和宿主细胞的利记博彩app
技术领域：
：本发明涉及肌醇六磷酸酶、编码肌醇六磷酸酶的核酸、以及肌醇六磷酸酶的制备和其用途。参考文献Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.&Lipman，D.J.(1990)″Basiclocalalignmentsearchtool.″J.Mol.Biol.215403-410.Altschul，S.F.，Madden，T.L.，Schffer，A.A.，Zhang，J.，Zhang，Z.，Miller，W.&Lipman，D.J.(1997)″GappedBLASTandPSI-BLASTanewgenerationofproteindatabasesearchprograms.″NucleicAcidsRes.253389-3402.Ausubeletal.(eds.)，CurrentProtocolsInMolecularBiology，vol.1，JohnWiley&Sons，Inc.1987.Benton，W.andDavis，R.，1977，Science196180.BergerandKimmel，1987，GuidetoMolecularCloningTechniques，MethodsinEnzymology，Vol152，AcademicPress，SanDiegoCA.Birnboim，H.C.andDoly，J.(1979).NucleicAcidsResearch71513-23.Botstein，D.andShortle，D.，1985，Science2291193-1201.Brissonetal(1984)Nature310511-514.Broglieetal(1984)Science224838-843).Cadwell，R.C.andJoyce，G.F.，1992，PCRMethodsApplic.228-33.Coruzzietal(1984)EMBOJ31671-1680.Cromwell，G.L.T.，T.S.Stahly，R.D.Coffey，H.J.Monegue，andJ.H.Randolph.1993.Efficacyofphytaseinimprovingbioavailabilityofphosphorusinsoybeanandcorn-soybeanmealdietsforpigs.J.Anim.Sci.711831.Dayhoff，M.O.，Schwartz，R.M.&Orcutt，B.C.(1978)″Amodelofevolutionarychangeinproteins.″In″AtlasofProteinSequenceandStructure，vol.5，suppl.3.″M.O.Dayhoff(ed.)，pp.345-352，Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，DC.Deutscher，MethodsinEnzymology，182(1990).DieffenbachCWandDvekslerGS，1995，PCRPrimer，aLaboratoryManual，ColdSpringHarborPress，PlainviewNY.Eckert，K.A.andKunkel，T.A.，1991，PCRMethodsApplic.117-24.Ehrlich，K.C.，Montalbano，B.G.，Mullaney，E.J.，DischingerJnr.，H.C.&Ullah，A.H.J.(1993).Identificationandcloningofasecondphytasegene(phyB)fromAspergillusniger(ficuum).BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications195，53-57.Elander，R.P.，Microbialscreening，SelectionandStrainImprovement，inBasicBiotechnology，J.BullockandB.KristiansenEds.，AcademicPress，NewYork，1987，217.Finkelstein，DB1992Transformation.InBiotechnologyofFilamentousFungi.TechnologyandProducts(edsbyFinkelstein&Bill)113-156.Fiske，C.H.andSubbaRow，Y.(1925).JournalofBiologicalChemistry66375-392.Fungaroetal.(1995)TransformationofAspergillusnidulansbymicroprojectionbombardmentonintactconidia，FEMSMicrobiologyLetters125293-298.Gish，W.&States，D.J.(1993)″Identificationofproteincodingregionsbydatabasesimilaritysearch.″NatureGenet.3266-272.Glover，DMandHames，BD(Eds.)，DNACloningAPracticalApproach，Vols1and2，SecondEdition.Grootetal.(1998)Agrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformationoffilamentousfungi，NatureBiotechnology16839-842.Grunstein，M.andHogness，D.，1975，Proc.Natl.Acad.Sci.USA723961.Hale&Marham，THEHARPERCOLLINSDICTIONARYOFBIOLOGY，HarperPerennial，NY(1991).Henikoff&Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA8910915(1989).HigginsD.G.，BleasbyA.J.，FuchsR.(1992)CLUSTALVimprovedsoftwareformultiplesequencealignment.Comput.Appl.Biosci.8189-191.HobbsSorMurryLE(1992)inMcGrawHillYearbookofScienceandTechnology，McGrawHill，NewYork，N.Y.，pp191-196.Karlin&Altschul，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA905873-5787(1993).Kerovuo，J.，Lauraeus，M.，Nurminen，P.，Kalkkinen，N.，Apajalahti，J.(1988)Isolation，characterizationandmoleculargenecloning，andsequencingofanovelphytasefromBacillussubtilis.Appl.Environ.Micro.，64，6，2079-2085.Komegay，E.T.，D.M.Denbow，Z.Yi.，andV.Ravindran.1996.ResponseofbroilerstogradedlevelsofNatuphosphytaseaddedtocorn-soybeanmeal-baseddietscontainingthreeIevelsofnonphytatephosphorus.Br.J.Nutr.Leung，D.W.，Chen，E.，andGoeddel，D.V.，1989，Technique111-15.Madden，T.L.，Tatusov，R.L.&Zhang，J.(1996)″ApplicationsofnetworkBLASTserver″Meth.Enzymol.266131-141.Myers，R.M.，Lerman，L.S.，andManiatis，T.，1985，Science229242-247.Mitchell，D.B.，Vogel，K.，Weimann，B.J.，Pasamontes，L.andvanLoon，A.P.，Thephytasesubfamilyofhistidineacidphosphatases；isolationofgenesfortwonovelphytasesfromthefungiAspergillusterreusandMyceliophfhorathermophila，Microbiology143(Pt1)，245-252(1997)).Mullis，KaryB.，U.S.PatentNo.4,683,202(1990).Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.48443(1970).Pasamontes，L.，Haiker，M.，Henriquez-Huecas，M.，Mitchell，D.B.andvanLoon，A.P.，CloningofthephytasesfromEmericellanidulansandthethermophilicfungusTalaromycesthermophilus，Biochim.Biophys.Acta1353(3)，217-223(1997).Pasamontes，L.，Haiker，M.，Wyss，M.，Tessier，M.andvanLoon，A.P.，Genecloning，purification，andcharacterizationofaheat-stablephytasefromthefungusAspergillusfumigatus，Appl.Environ.Microbiol.63(5)，1696-1700(1997).Pearson&Lipman，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA852444(1988).Piddington，C.S.，Houston，C.S.，Paloheimo，M.，Cantrell，M.，Miettinen-Oinonen，A.，Nevalainen，H.&Rambosek，J.(1993).Thecloningandsequencingofthegenesencodingphytase(phy)andpH2.5-optimumacidphosphatase(aph)fromAspergillusnigervar.awamori.Gene133，55-62.Powar，V.K.andJagannathanV.，(1982)J.Bacteriology，151(3)，1102-1108.Sambrook，J.，Fritsch，E.F.andManiatis，T.(1989).MolecularCloning-ALaboratoryManual，2ndEd.ColdSpringHarbourPress.Sanchez，O.andJ.Aguirre.1996.EfficienttransformationofAspergillusnidulansbyelectroporationofgerminatedconidia.FungalGeneticsNewsletter4348-51.Sanger，F.，Nilken，S.andCoulson，A.R.(1977).ProceedingsoftheNationalAcademyofScienceUSA，745463-5467.Schwartz，R.M.&Dayhoff，M.O.(1978)″Matricesfordetectingdistantrelationships.″In″AtlasofProteinSequencean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背景技术：
：磷(P)是生长所必需的元素。常规家畜饲料(如谷粒、油籽粉、和来源于种子的副产品)中存在的磷相当大部分采取了共价结合在称作植酸(肌醇六磷酸)的分子中的磷酸形式。对于非反刍动物如家禽和猪，由于它们缺少用于从该肌醇六磷酸分子中分离出磷的消化酶，这种形式的磷的生物利用率一般很低。非反刍动物不能利用肌醇六磷酸的几个重要后果可能是值得注意的。例如，当为了满足这些动物对磷的营养需求而加入无机磷(例如磷酸二钙、脱氟磷酸盐)或动物产品(例如肉和骨粉、鱼粉)时，会造成开支。此外，肌醇六磷酸还可以在胃肠道内结合或螯合许多矿物质(例如钙、锌、铁、镁、铜)，由此使得它们无法被吸收。再有，饲料中存在的大多数肌醇六磷酸会通过胃肠道，引起粪便中磷量的增高。而这将增加环境的生态磷负担。相反地，反刍动物如牛能容易地利用肌醇六磷酸，这要感谢瘤胃微生物产生的一种称作肌醇六磷酸酶的酶。肌醇六磷酸酶催化肌醇六磷酸水解为(1)肌醇和/或(2)其单、二、三、四和/或五磷酸酯和(3)无机磷酸。已知两种不同类型的肌醇六磷酸酶(1)通常所说的3-肌醇六磷酸酶(肌醇六磷酸3-磷酸水解酶，EC3.1.3.8)和(2)通常所说的6-肌醇六磷酸酶(肌醇六磷酸6-磷酸水解酶，EC3.1.3.26)。3-肌醇六磷酸酶首先水解3位的酯键，而6-肌醇六磷酸酶首先水解6位的酯健。已经发现，将微生物肌醇六磷酸酶作为饲料添加剂可以提高典型非反刍动物食物中肌醇六磷酸磷的生物利用率(见例如Cromwell等，1993)。结果是降低了在动物饲料中加入无机磷的需要，并降低了排出的粪便中磷的水平(见例如Kornegay等，1996)。尽管有这些优点，但在饲料工业中赢得广泛接受的已知肌醇六磷酸酶几乎就没有。其原因因酶而异。典型的有关问题涉及高生产成本、和/或该酶在期望的施用环境(例如在饲料加工中、或在动物消化道中遇到的pH/温度)中的低稳定性/活性。因此，普遍期望发现和开发对于动物饲喂有关的应用而言具有良好稳定性和肌醇六磷酸酶活性的新酶，并将发酵技术方面的进展应用于这些酶的生产以便使它们具有商业可行性。还期望确定能够用于产生如下更有效的遗传工程生物的核苷酸序列，所述生物能够大量地表达这些肌醇六磷酸酶以适合工业生产。再有，期望通过遗传工程开发使得纯化和利用工作量的相对纯酶成为可能的肌醇六磷酸酶表达系统。发明概述本发明提供来自微生物来源、优选来自真菌来源例如青霉属的种如P.hordei(以前称多毛青霉(P.hirsutum)；ATCC号22053)、桧状青霉(P.piceum)(ATCC号10519)、或短密青霉(P.brevi-compactum)(ATCC号48944)的、具有肌醇六磷酸酶活性的纯化酶。本发明还提供编码该酶并含有图1A-1C之任一个中所示DNA的多核苷酸序列；编码图2所示氨基酸序列的多核苷酸；编码含有不同于图2中序列的氨基酸区段的肌醇六磷酸酶的多核苷酸，条件是该多核苷酸编码这里所具体描述的肌醇六磷酸酶的衍生物；以及编码含有不同于图2中序列的氨基酸区段的肌醇六磷酸酶的多核苷酸，条件是该多核苷酸可与含有图1A-1C之任一个中的全部或部分DNA的DNA在中等至高严紧性条件下杂交。本发明还提供编码具有肌醇六磷酸水解活性的酶、并包含图17所示核苷酸序列的多核苷酸；编码图17所示氨基酸序列的多核苷酸；编码含有与图17中序列不同的氨基酸区段的肌醇六磷酸酶的多核苷酸，条件是该多核苷酸编码这里所具体描述的肌醇六磷酸酶的衍生物；以及编码含有与图17中序列不同的氨基酸区段的肌醇六磷酸酶的多核苷酸，条件是该多核苷酸可与图17所示核苷酸序列在中等至高严紧性条件下杂交。此外，本发明还包括含有上述多核苷酸序列的载体、转化了这些多核苷酸或载体的宿主细胞、含有这些宿主细胞的发酵培养液、以及由这些宿主细胞表达的、该多核苷酸编码的肌醇六磷酸酶蛋白质。优选地，本发明多核苷酸采取纯化的或分离的形式，并被用于制备能够产生其编码的蛋白质产物的转化宿主细胞。此外，作为上述多核苷酸序列的表达产物的多肽也包括在本发明的范围内。在一个实施方案中，本发明提供来自青霉属真菌来源的、分离的或纯化的多核苷酸，该多核苷酸含有编码具有肌醇六磷酸酶活性的酶的核苷酸序列。该真菌来源可以选自例如桧状青霉(Penicilliumpiceum)和Penicilliumhordei。根据一个实施方案，该多核苷酸编码含有如下氨基酸序列的肌醇六磷酸水解酶，其中所述氨基酸序列与SEQIDNO4所公开氨基酸序列有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、和/或约100％的一致性。本发明的一个实施方案提供含有如下核苷酸序列的分离的多核苷酸，其中所述核苷酸序列(i)与SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公开核苷酸序列有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、和/或约100％的一致性，或(ii)能够与来源于SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公开核苷酸序列的探针在中等至高严紧性条件下杂交，或(iii)与SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公开核苷酸序列互补。本发明的另一方面提供编码具有肌醇六磷酸酶活性的酶的分离多核苷酸，其中该酶来自青霉属(Penicillium)来源。该来源可以选自例如桧状青霉和Penicilliumhordei。在一个实施方案中，该多核苷酸编码如下肌醇六磷酸水解酶，其中该酶含有与SEQIDNO4所公开氨基酸序列有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、和/或大约100％一致性的氨基酸序列。在另一实施方案中，该多核苷酸与SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公开核苷酸序列有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、和/或约100％的一致性，或(ii)能够与来源于SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公开核苷酸序列的探针在中等至高严紧性条件下杂交，或(iii)与SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公开核苷酸序列互补。本发明的再一方面提供含有如下多核苷酸序列的表达结构，该多核苷酸序列(i)与SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公开核苷酸序列有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、和/或约100％的一致性，或(ii)能够与来源于SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公开核苷酸序列的探针在中等至高严紧性条件下杂交，或(iii)与SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公开核苷酸序列互补。还提供含有该表达结构的载体(例如质粒)，和转化了该载体的宿主细胞(例如曲霉属(Aspergillus)，如黑曲霉(Aspergillusniger)或构巢曲霉(Aspergillusnidulans))。再一方面，本发明提供用于检测编码来自微生物来源、具有肌醇六磷酸酶活性的酶的核酸序列的探针，该探针含有(i)与SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO3中所公开核苷酸序列有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、和/或大约100％一致性的核苷酸序列，或(ii)能够与包含SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO3所公开序列的多核苷酸在中等至高严紧性条件下杂交的核苷酸序列，或(iii)与SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO3中所公开核苷酸序列互补的核苷酸序列。在一个实施方案中，该微生物来源是真菌来源，例如青霉属的种，如Penicillumhordei或桧状青霉。此外，本发明还提供包含具有肌醇六磷酸酶活性的酶在内的食物或动物饲料，其中该酶含有与SEQIDNO4所公开氨基酸序列有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、和/或约100％一致性的氨基酸序列。本发明提供包含具有肌醇六磷酸酶活性的酶在内的食物或动物饲料，其中该酶来自选自Penicilliumhordei和桧状青霉的真菌来源。本发明的一个方面提供分离的肌醇六磷酸酶，其中该酶是从选自桧状青霉和P.hordei的真菌中获得的，并具有以下理化性质(1)分子量约45-55kDa(未糖基化的)；和(2)专一性肌醇六磷酸。在一个实施方案中，本发明提供来源于真菌物种(例如青霉属，如桧状青霉和P.hordei)、或由能够与SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、或图17的多核苷酸序列在中等至高严紧性条件下杂交的核苷酸序列编码的、具有一或多个以下理化性质的酶(1)分子量约45-60kDa(未糖基化的)(基于具有489个氨基酸的蛋白质)；(2)对植酸盐、植酸或肌醇六磷酸、和/或其低级磷酸衍生物专一的活性；(3)理论pI为约7-7.6；例如7.3；(4)最适pH处于约4.5-5.5范围内，例如约5；和/或(5)最适环境温度为40-45℃，例如42-44℃。本发明的另一方面提供制备具有肌醇六磷酸酶活性的酶的方法，包括(a)提供转化了含有本文所述多核苷酸的表达载体的宿主细胞；(b)在适于该转化宿主细胞产生该肌醇六磷酸酶的条件下培养该转化宿主细胞；和(c)回收该肌醇六磷酸酶。根据一个实施方案，该宿主细胞是曲霉属种，如黑曲霉或构巢曲霉。在另一方面，本发明提供从肌醇六磷酸中分离磷的方法，包括步骤用含有与SEQIDNO4所公开氨基酸序列有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、和/或大约100％一致性的氨基酸序列的酶处理该肌醇六磷酸。本发明还提供从肌醇六磷酸中分离磷的方法，包括步骤用上文定义的酶处理该肌醇六磷酸。本发明的另一方面提供含有与图17所公开氨基酸序列有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、和/或大约100％一致性的氨基酸序列的肌醇六磷酸水解酶。本发明的再一方面提供含有以下核苷酸序列的分离的多核苷酸，该核苷酸序列(i)与图17中所公开核苷酸序列有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、和/或大约100％的一致性，或(ii)能够与来源于图17中所公开核苷酸序列的探针在中等至高严紧性条件下杂交，或(iii)与图17中所公开核苷酸序列互补。在一个实施方案中，该分离多核苷酸编码来源于桧状青霉或Penicilliumhordei的肌醇六磷酸水解酶。根据一个实施方案，该酶包含与图17所公开氨基酸序列有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、和/或大约100％一致性的氨基酸序列。在另一实施方案中，该多核苷酸包含如下核苷酸序列，该核苷酸序列(i)与图17中所公开核苷酸序列有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、和/或大约100％的一致性，或(ii)能够与来源于图17中所公开核苷酸序列的探针在中等至高严紧性条件下杂交，或(iii)与图17中所公开核苷酸序列互补。本发明的另一方面提供含有如下多核苷酸的表达结构，该多核苷酸包含(i)与图17中所公开核苷酸序列有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、和/或大约100％一致性的核苷酸序列，或(ii)能够与来源于图17中所公开核苷酸序列的探针在中等至高严紧性条件下杂交的核苷酸序列，或(iii)与图17中所公开核苷酸序列互补的核苷酸序列。本发明还提供包含该表达结构的载体(例如质粒)，以及转化了该载体的宿主细胞(例如黑曲霉或构巢曲霉)。此外，本发明提供用于检测编码来自微生物来源、具有肌醇六磷酸酶活性的酶的核酸序列的探针，该探针含有(i)与图17中所公开核苷酸序列有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、和/或大约100％一致性的核苷酸序列，或(ii)能够与包含图17中所公开序列的多核苷酸在中等至高严紧性条件下杂交的核苷酸序列，或(iii)与图17中所公开核苷酸序列互补的核苷酸序列。在一个实施方案中，该微生物来源是真菌来源，例如青霉属的种，如P.hordei或桧状青霉。本发明还提供包含具有肌醇六磷酸酶活性的酶在内的食物或动物饲料，其中该酶包含与图17所公开氨基酸序列有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、和/或大约100％一致性的氨基酸序列。再有，本发明提供从肌醇六磷酸中分离磷的方法，包括步骤用(i)具有肌醇六磷酸水解活性并(ii)包含与图17中所公开氨基酸序列有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、和/或大约100％一致性的氨基酸序列的酶处理该肌醇六磷酸盐。应当理解，本发明的优点在于已分离出多核苷酸，这使得能够分离其它编码具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白质的多核苷酸。本发明的另一优点在于，通过提供编码具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白质的多核苷酸，可以利用重组手段制备能够以相对大的量产生具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白质的宿主细胞。本发明的再一优点是，使具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白质的商业应用成为可行。例如，本发明提供掺有本文所述肌醇六磷酸酶的动物饲料。本发明的再一优点是，提供具有肌醇六磷酸水解酶活性的酶，而且该活性在约40-45℃的温度下最佳，这使得该酶十分适合在动物饲料中使用(即，该酶在作用位置(动物的胃中)有高活性)。从以下的详细说明，本发明的其它目的和优点将是明显的。附图简述图1A描述了相应于编码来自Penicilliumhordei的肌醇六磷酸水解酶的基因的核酸序列(SEQIDNO1)，其中突出显示了以下特征编码Met的肌醇六磷酸酶ATG起始密码子(粗体)；内含子(小写字母)；和TAG终止密码子(粗体)。值得注意的是，该图显示了两个由120bp长的5’内含子分隔开的外显子(120bp和1347bp)。图1B显示了图1A中序列起始密码子(ATG)和终止密码子(TAG)之间的连续区域(SEQIDNO2)。图1C以连续序列的形式显示了图1A中序列位于起始密码子和终止密码子之间的、除去该120bp内含子的区域(SEQIDNO3)。图2描述了由图1核酸序列编码的氨基酸序列(SEQIDNO4)。图3和4分别是桧状青霉和P.hordei的生长曲线，显示了随着时间的过去培养基中可利用的P对生长的影响。图5A显示了对4个发表的真菌肌醇六磷酸酶氨基酸序列进行的比对，并指出了用于设计简并PCR引物的保守区域(以黑色边框突出显示)。图5B显示了对图5A的4个发表真菌肌醇六磷酸酶氨基酸序列和本发明P.hordei和桧状青霉序列(分别是SEQIDNO_和SEQIDNO_)中的序列进行的比对。图6显示了发表的黑曲霉phyA和phyB肌醇六磷酸酶氨基酸序列之间的比对，由此比对设计了简并引物CS1和CS2。图中显示了用于设计引物CS1、CS2的保守序列。图7显示了与如下氨基酸序列一起进行比对的4个发表真菌肌醇六磷酸酶氨基酸序列(i)从采用引物CS1和CS2获得的PCR产物翻译的氨基酸序列(第2行，表示为“P.hordei3D”)，和(ii)从获自第一P.hordei基因组文库的P.hordei肌醇六磷酸酶基因大约80％(即缺少N端部分)翻译的氨基酸序列(第1行，表示为“P.hordei”)。图8给出了一Southern印迹凝胶，该凝胶显示了含有采用简并引物CS1和CS2获得的PCR产物的探针与各种真菌基因组DNA消化产物之间的杂交；泳道1-大小标准参照物；泳道2-黑曲霉-EcoRI；泳道3-桧状青霉-EcoRI；泳道4-Penicilliumhordei-EcoRI；泳道5-Penicilliumhordei-BamHI；泳道6-Penicilliumhordei-SalI；泳道7-Penicilliumhordi-KpnI；和泳道8-Penicilliumhordei-SacI。图9描述了通过构建和筛选P.hordei基因组文库获得的、称作CS101的克隆的核酸序列(SEQIDNO_)。CS101在商业克隆载体pSKII+Bluescript(Stratagene；LaJolla，California)中含有一段来自P.hordei的4.8kb片段。该插入序列中的1.7kb是P.hordei的phyA肌醇六磷酸酶序列，代表了该基因的80％编码区(包括3’末端在内)和下游调节区。图10显示了称作CS158的克隆的5’/N-端核酸序列(SEQIDNO_)和3’/C-端序列(SEQIDNO_)。还显示了相应于每个核酸序列的推导氨基酸序列(分别是SEQIDNO_和SEQIDNO_)。克隆CS158是通过PCR从引物CS201-204的组合制备的。产生了具有适合大小的条带(图12)并作了克隆和测序。推导的氨基酸序列列在下方。粗体显示初步推导的肌醇六磷酸酶氨基酸序列。CS158的测序是不完全的，因为缺少该基因中间的大约70个氨基酸。采用重新设计的引物重新扩增(图13)，产生了完整序列，该序列经分析是肌醇六磷酸酶。CS158的C末端表现出与CS101的C末端100％同源。图11提供了pGAPT-PG载体的图解，该载体可以用于在曲霉属中表达P.hordei肌醇六磷酸水解酶。图12显示了采用如下引物对推测的肌醇六磷酸酶基因的PCR扩增，所述引物是根据分离自P.hordei的基因组肌醇六磷酸酶克隆的序列设计的。图13显示了采用如下引物对推测的肌醇六磷酸酶基因的PCR扩增，所述引物是根据克隆CS158的肌醇六磷酸酶基因序列设计的。图14显示了对转化了P.hordei肌醇六磷酸酶基因的构巢曲霉进行的Southern印迹分析。图15显示了来自P.hordei的肌醇六磷酸酶的pH曲线。图16显示了来自P.hordei的肌醇六磷酸酶的温度-活性曲线。图17显示了来自称作CS142的克隆的桧状青霉肌醇六磷酸酶853bp片段的完整序列(5’-3’)(SEQIDNO_)、以及推导的氨基酸序列(283个氨基酸)(SEQIDNO_)。该序列中对于肌醇六磷酸酶结构和功能重要的基序以及对于结构重要的Cys残基以粗体显示。发明详述1.定义除非本文另行定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意义。Singleton等，微生物学和分子生物学词典(DICTIONARYOFMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGY)，第2版，JohnWileyandSons，纽约(1994)；和Hale和Marham，HarperCollins生物学词典(THEHARPERCOLLINSDICTIONARYOFBIOLOGY)，HarperPerennial，NY(1991)，为普通技术人员提供了本发明所用许多术语的一般解释。尽管与本文所述方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可以用于实施和测试本发明，但描述了优选方法和材料。数字范围包括定义该范围的数字本身。除非另行指出，否则分别地核酸按5’至3’方向从左向右书写；氨基酸序列按氨基至羧基方向从左向右书写。本文给出的标题并不构成对本发明各方面或实施方案的限制，这些标题可以通过完整地参考本说明书产生。因此，以下紧接定义的术语可以通过完整地参考本说明书获得更为全面的定义。本文所用术语“肌醇六磷酸酶”或“肌醇六磷酸酶活性”是指能够催化肌醇六磷酸水解成(1)肌醇和/或(2)其单、二、三、四和/或五磷酸酯以及(3)无机磷酸的蛋白质或多肽。例如，具有酶学委员会EC号3.1.3.8或EC号3.1.3.26中定义的催化活性的酶。对于两个核酸或多肽序列，术语“一致”是指当为了获得最大对应而进行比对时这两个序列中的相同残基，这可以采用以下序列比较或分析算法之一来测量。“最佳比对”定义为给出最高百分比一致性分数的比对。该比对可以采用多种商业可获得序列分析程序进行，这些程序有例如采用1的ktup、默认参数和默认PAM的局部比对程序LALIGN。一种优选比对是采用MACVECTOR中的CLUSTAL-W程序进行的成对比对，该程序利用默认参数，包括10.0的开放断缺区罚分(opengappenalty)、0.1的延伸断缺区罚分(extendgappenalty)、和BLOSUM30相似性矩阵(similaritymatrix)，以“慢”比对模式运行。如果为了使第一序列与第二序列最佳对齐而需要在第一序列中插入断缺区(gap)时，则仅采用与相应氨基酸残基配对的残基来计算百分比一致性(即，该计算不考虑第二序列中位于该第一序列的“断缺区”内的残基)。为了进行比较，还可以通过例如Smith和Waterman的局部同源性算法(Adv.Appl.Math.2482(1981))、Needleman和Wunsch的同源性比对算法(J.Mol.Biol.48443(1970))、Pearson和Lipman的相似性搜索方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA852444(1988))、这些算法的计算机执行程序(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA(GeneticsComputerGroup，575ScienceDr.，Madison，WI))、或目测，进行序列的最佳比对。对于两个氨基酸或多核苷酸序列，“百分比序列一致性”是指当这两个序列最佳比对时这两个序列中一致残基的百分数。因此，80％氨基酸序列一致性意味着在两个最佳比对的多肽序列中有80％的氨基酸是一致的。例如，可以通过以下方式来确定百分比一致性通过比对序列直接比较两个分子之间的序列信息，计数这两个比对序列之间匹配残基的确切数目，除以较短序列的长度，然后将此结果乘以100。可以采用易于获得的计算机程序帮助分析，例如ALIGN(Dayhoff，M.O.，《蛋白质序列和结构汇编》(AtlasofProteinSequenceandStructure)M.O.Dayhoff编，*5Suppl.3353-358，NationalbiomedicalResearchFoundation，Washington，DC)，该程序对Smith和Waterman的局部同源性算法(1981)(AdvancesinAppl.Math.2482-489)进行了变通以适应肽的分析。在Wisconsin序列分析软件包第8版(可从GeneticsComputerGroup，Madison，WI获得)中有确定核苷酸序列一致性的程序，例如BESTFIT、FASTA和GAP程序，这些程序也依赖于Smith和Waterman算法。采用厂家推荐和在以上提及的Wisconsin序列分析软件包中描述的默认参数，可以容易地利用这些程序。适于确定序列相似性的算法的一个例子是BLAST算法，其描述于Altschul等，J.Mol.Biol.215403-410(1990)。实施BLAST分析的软件可从国家生物信息中心(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。该算法涉及首先通过在查询序列中确定当与数据库序列中相同长度的字进行比对时符合或满足某个正阈值分数T的W长短字，鉴定出高评分序列对(HSP)。这些最初的相邻匹配字被作为起始点寻找含有它们的更长HSP。让这些匹配字沿着正在比较的这两个序列的每一个向两头延伸，只要累积比对分数能够增加即可。当累积比对分数从获得的最大值减少量X；累积分达到零或以下；或达到任一序列的末端时，终止匹配字的延伸。BLAST算法的参数W、T和X决定比对的敏感度和速度。BLAST程序采用11的字长(W)、BLOSUM62评分矩阵(见Henikoff&Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA8910915(1989))、50的配对位置显示(alignments)(B)、10的期望值、M’5、N’-4、和双链比较作为默认值。然后BLAST算法进行两个序列之间的相似性统计分析(见例如Karlin&Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA905873-5787(1993))。BLAST算法提供的一种相似性量度标准是最小总和概率(P(N))，该概率指示了两个核苷酸或氨基酸序列之间随机发生匹配的概率。例如，当一个核酸与一个本发明肌醇六磷酸酶核酸比较的最小总和概率小于约0.1，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001时，该测试核酸被认为与本发明肌醇六磷酸酶核酸相似。在该测试核酸编码肌醇六磷酸酶多肽的情况下，如果该比较产生小于约0.5、更优选小于约0.2的最小总和概率，则该测试核酸被认为与指定肌醇六磷酸酶核酸相似。因此，对于两个核酸或多肽，短语“基本一致”典型地是指一个多核苷酸或多肽含有如下序列，当采用标准参数在以上描述的程序(例如BLAST、ALIGN、CLUSTAL)中与参考序列比较时，该序列有至少60％的序列一致性、优选至少80％、更优选至少90％、最优选至少95％。两个多肽基本一致的一个指征是第一多肽与第二多肽有免疫学交叉反应。典型地，由于保守氨基酸替代而有差别的多肽之间有免疫学交叉反应。因此，例如当一个多肽与另一个多肽仅相差在保守替代时，这两个多肽基本一致。两个核酸序列基本一致的另一个指征是这两个分子可在严紧条件(例如中等至高严紧性范围内的条件)下相互杂交。“杂交”包括任何能使核酸的一条链通过碱基配对与一条互补核酸链结合的过程。因此，严格地说，该术语是指靶序列的互补序列与测试序列结合的能力，反之亦然。典型地，“杂交条件”根据测量杂交时所用条件的“严紧性”程度来分类。严紧性程度可以以例如核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)为依据。例如，“最大严紧性”典型地发生在约Tm-5℃(低于探针Tm5℃)；“高严紧性”发生在Tm以下约5-10℃；“中等严紧性”发生在探针Tm以下约10-20℃；“低严紧性”发生在Tm以下约20-25℃。作为替代，或者此外，杂交条件可以以杂交和/或一或多次严紧性洗涤的盐或离子强度条件为依据。例如，6×SSC＝极低严紧性；3×SSC＝低至中等严紧性；1×SSC＝中等严紧性；0.5×SSC＝高严紧性。从功能上说，可以采用最大严紧性条件确定与杂交探针严格一致或近严格一致的核酸序列；而采用高严紧性条件确定与该探针有约80％或更多序列一致性的核酸序列。对于要求高选择性的应用，典型地期望采用相对严紧的条件来形成杂交体，例如，选择相对低的盐和/或高温度条件。Sambrook等的书(并入本文作为参考)中提供了包括中等严紧性和高严紧性在内的杂交条件。术语“分离的”或“纯化的”是指一种材料自其最初的环境(当它是天然存在的材料时例如它的自然环境)中被分离出来。例如，当该材料以比其在天然或野生型生物中存在的浓度高或低的浓度存在于某种组合物中，或是与天然或野生型生物正常不表达的成分联合存在时，则该材料被认为是“纯化的”。例如，存在于活动物中的天然多核苷酸或多肽不是分离的，但同样的多核苷酸或多肽当它与该自然系统中的部分或全部共存物质分开时则是分离的。这些多核苷酸可以是载体的一部分，和/或这些多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，而且也是分离的，因为该载体或组合物并非其自然环境的组成部分。例如，如果一种核酸或蛋白质在电泳凝胶中基本上只给出一条带，则该核酸或蛋白质被认为是纯化的。当涉及肌醇六磷酸水解酶(肌醇六磷酸酶)时本文所用术语“来自”意在不仅指由所讨论生物的株系产生的或可产生的肌醇六磷酸酶，也指由分离自该株系的DNA序列编码的、在含有该DNA序列的宿主生物体中产生的肌醇六磷酸酶。此外，该术语还旨在指由合成和/或cDNA来源的DNA序列编码的、具有所讨论肌醇六磷酸酶的辩别性特征的肌醇六磷酸酶。例如，“来自青霉属的肌醇六磷酸酶”是指由青霉属天然产生的那些具有肌醇六磷酸酶活性的酶，以及与青霉属来源产生的那些肌醇六磷酸酶相似、但通过采用遗传工程技术由转化了编码所述肌醇六磷酸酶的核酸的非青霉属生物产生的肌醇六磷酸酶。本发明包括与来自提及的具体微生物菌株的那些肌醇六磷酸水解酶等同的肌醇六磷酸水解酶。文中“等同”是指该肌醇六磷酸水解酶是由能够与具有图1A-1C任一个中所示序列的多核苷酸在中等至高严紧性条件下杂交的多核苷酸编码的。等同意味着该肌醇六磷酸水解酶与具有图2所公开氨基酸序列(SEQIDNO4)的肌醇六磷酸水解酶相比含有至少55％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的一致性。本发明还包括本发明肌醇六磷酸水解酶的突变体、变体和衍生物，只要该突变、变体或衍生肌醇六磷酸水解酶能够保持天然存在的肌醇六磷酸水解酶的至少一种特征性活性即可。当涉及肌醇六磷酸水解酶时，本文所用术语“突变体和变体”是指通过改变肌醇六磷酸水解酶的天然氨基酸序列和或结构，例如通过改变该结构基因的DNA核苷酸序列和/或通过直接替代和/或改变该肌醇六磷酸水解酶的氨基酸序列和/或结构，获得的肌醇六磷酸水解酶。当涉及肌醇六磷酸酶时，术语“衍生物”或“功能性衍生物”在本文中用于指具有本发明肌醇六磷酸酶功能性特征的肌醇六磷酸酶衍生物。肌醇六磷酸酶的功能性衍生物包括天然存在的、通过合成或重组产生的如下肽或肽片段、突变体或变体，它们可以含有一或多个的氨基酸缺失、替代或添加并具有本发明肌醇六磷酸酶的一般特性。当涉及编码肌醇六磷酸酶的核酸时，术语“功能性衍生物”在整个说明书中用于指具有编码肌醇六磷酸酶的核酸的功能性特征的核酸衍生物。编码本发明肌醇六磷酸酶的核酸的功能性衍生物包括天然存在的、通过合成或重组产生的如下核酸或其片段、突变体或变体，它们可以含有一或多个核酸缺失、替代或添加并编码本发明特征性的肌醇六磷酸酶。编码本发明肌醇六磷酸酶的核酸变体包括等位基因和基于本领域已知的遗传密码简并性的变体。编码本发明肌醇六磷酸酶的核酸突变体包括通过定点诱变技术(见例如，Botstein，D.和Shortle，D.，1985，科学(Science)2291193-1201；和Myers，R.M.，Lerman，L.S.，和Maniatis，T.，1985，科学229242-247)、易出错PCR(error-pronePCR)(见例如Leung，D.W.，Chen，E.，和Goeddel，D.V.，1989，技术(Technique)111-15；Eckert，K.A.和Kunkel，T.A.，1991，PCR方法应用(PCRMethodsApplic.)117-24；和Cadwell，R.C.和Joyce，G.F.，1992，PCR方法应用228-33)和/或本领域已知的化学诱导的诱变技术(见例如Elander，R.P.，微生物鉴别、筛选和菌株改良，《基础生物技术》(BasicBiotechnology)，J.Bullock和B.Kristiansen编，AcademicPress，纽约，1987，217)产生的突变体。“表达载体”指含有如下DNA序列的DNA结构，该DNA序列被可操作地与能够实现该DNA在适合宿主中表达的适合控制序列连接在一起。这些控制序列可以包括实现转录的启动子、可选择的控制该转录的操纵基因序列、编码mRNA上的适合核糖体结合位点的序列、和控制转录和翻译终止的序列。对于不同的表达载体优选与不同的细胞类型一起使用。对于在枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)中使用的载体，优选的启动子是AprE启动子；在大肠杆菌(E.coli)中使用的优选启动子是Lac启动子，而在黑曲霉中使用的优选启动子是glaA。载体可以是质粒、噬菌体颗粒、或仅是一个潜在的基因组插入片段。一旦通过转化进入适合宿主后，载体可以独立于宿主基因组进行复制和发挥功能，或可以在适当条件下自身整合入基因组中。在本说明书中，质粒和载体有时可互换使用。然而，本发明旨在包括本领域已知的或正在为本领域已知的、起着同等功能的其它形式表达载体。因此，可以采用多种宿主/表达载体组合来表达本发明的DNA序列。例如，有用的表达载体可以由染色体的、非染色体的和合成的DNA序列片段组成，例如各种已知的SV40衍生物和已知的细菌质粒(如来自大肠杆菌的质粒，包括colE1、pCR1、pBR332、pMb9、pUC19和它们的衍生物)、宿主范围较宽的质粒(例如RP4)、噬菌体DNA(例如λ噬菌体的多种衍生物如NM989，和其它DNA噬菌体如M13和丝状单链DNA噬菌体)、酵母质粒(例如2μ质粒或其衍生物)、真核细胞中使用的载体(例如动物细胞中使用的载体)、和来源于质粒和噬菌体DNA组合的载体(例如经修饰采用了噬菌体DNA或其它表达控制序列的质粒)。使用本发明表达载体的表达技术是本领域已知的，一般描述于例如Sambrook等，《分子克隆实验室手册》(MolecularCloningALaboratoryManual)，第2版，ColdSpringHarborPress(1989)。通常，含有本发明DNA序列的这些表达载体通过借助整合事件直接插入特定物种的基因组中来转化单细胞宿主(见例如Bennett和Lasure，更多的真菌基因操作(MoreGeneManipulationsinFungi)，AcademicPress，SanDiego，第70-76页(1991)，以及其中引用的描述在真菌宿主中进行定向基因组插入的文章，这些均被并入本文作为参考)。“宿主株”或“宿主细胞”是指对含有本发明DNA的表达载体适合的宿主。在本发明中有用的宿主细胞一般是可以在其中实现表达的原核或真核宿主，包括任何可转化微生物。例如，宿主株可以是枯草芽孢杆菌、大肠杆菌(Escherichiacoli)、Trichodermalongibrachiatum、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、黑曲霉和构巢曲霉。采用重组DNA技术构建的载体转化或转染宿主细胞。这些转化的宿主细胞不仅能够复制编码肌醇六磷酸酶和其变体(突变体)的载体，而且能够表达该目的肽产物。适合表达宿主的例子包括细菌细胞、如大肠杆菌、链霉菌(Streptomyces)、鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonellatyphimurium)；真菌细胞，如曲霉属和青霉属；昆虫细胞例如果蝇(Drosophila)和粘虫(Spodoptera)Sf9；动物细胞，如CHO、COS、HEK293或Bowes黑素瘤；植物细胞，等。从本文的叙述，适合宿主的选择被认为属于本领域技术人员的范围。应当注意的是，本发明并不受所用具体宿主细胞的限制。II.肌醇六磷酸酶和编码肌醇六磷酸酶的核酸本发明的一个方面提供能够催化肌醇六磷酸水解并释放出无机磷酸的蛋白质或多肽；例如具有酶学委员会EC3.1.3.8或EC3.1.3.26中所定义的催化活性的酶。在一个优选实施方案中，本发明提供通常所说的3-肌醇六磷酸酶。此外，本发明还包括编码这些肌醇六磷酸水解蛋白或多肽的多核苷酸(例如DNA)。优选地，本发明肌醇六磷酸酶和/或编码该肌醇六磷酸酶的多核苷酸来自真菌，更优选来自厌氧真菌、更优选来自青霉属的种，例如Penicilliumhordei或桧状青霉。因此，我们考虑，本发明肌醇六磷酸酶和/或编码该肌醇六磷酸酶的DNA可以来自犁头霉属的种(Absidiaspp.)；支顶孢属的种(Acremoniumspp.)；放线菌属的种(Actinomycetesspp.)；蘑菇属的种(Agaricusspp.)；Anaeromycesspp.；曲霉属的种(Aspergillusspp.)，包括A.auculeatus、泡盛曲霉(A.awamori)、黄色曲霉(A.flavus)、臭曲霉(A.foetidus)、丁烯二酸曲霉(A.fumaricus)、烟曲霉(A.fumigatus)、构巢曲霉(A.nidulans)、黑曲霉(A.niger)、米曲霉(A.oryzae)、土曲霉(A.terreus)和杂色曲霉(A.versicolor)；Aeurobasidiumspp.；头孢属的种(Cephalosporumspp.)；毛壳霉属的种(Chaetomiumspp.)；鬼伞属的种(Coprinusspp.)；Dactyllumspp.；镰孢霉属(Fusariumspp)，包括F.conglomerans、多隔镰孢(F.decemcellulare)、爪哇镰孢(F.javanicum)、亚麻镰孢(F.lini)、尖孢镰孢(F.oxysporum)和茄病镰孢(F.solani)；胶霉属的种(Gliocladiumspp.)；腐质霉属的种(Humicolaspp.)，包括H.insolens和H.lanuginosa；毛霉属的种(Mucorspp.)；链孢霉属的种(Neurosporaspp.)，包括粗糙链孢霉(N.crassa)和嗜食链孢霉(N.sitophila)；Neocallimastixspp.；Orpinomycesspp.；青霉属的种(Penicilliumspp.)；Phanerochaetespp.；射脉菌属的种(Phlebiaspp.)；Piromycesspp.；假单胞菌属的种(Pseudomonasspp.)；根霉属的种(Rhizopusspp.)；裂褶菌属的种(Schizophyllumspp.)；链霉菌属的种(Streptomycesspp.)；栓菌属的种(Trametesspp.)；和木霉属的种(Trichodermaspp.)，包括T.reesei、T.longibrachiatum和绿色木霉(T.viride)；和接霉属的种(Zygorhynchusspp.)。类似地，我们预料本文所述肌醇六磷酸酶和/或编码肌醇六磷酸酶的DNA可以来源于细菌例如链霉菌属的种(Streptomycesspp.)，包括橄榄产色链霉菌(S.olivochromogenes)；尤其是纤维降解瘤胃细菌(fiberdegradingruminalbacteria)例如产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobactersuccinogenes)；和酵母包括Candidatorresii、近平滑假丝酵母(C.parapsllosis)、清酒假丝酵母(C.sake)、涎沫假丝酵母(C.zeylanoides)、Pichiaminuta、胶粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)、粘性红酵母(R.mucilaginosa)、和不对称掷孢酵母(Sporobolomycesholsaticus)。在一个优选实施方案中，本发明肌醇六磷酸酶和/或编码该肌醇六磷酸酶的多核苷酸来源于(i)谷物变质真菌(grain-spoilagefungal)，例如Penicilliumhordei、桧状青霉或短密青霉；或(ii)与树根相关的外生菌根真菌(ectomycorrhizalfungus)，例如漆蜡蘑(Laccarialaccata)、Laccariarufus、卷边桩菇(Paxillusinvolutus)、大毒粘滑菇(Hebelomacrustuliniforme)、赭盖鹅膏(Amanitarubescens)、或哈蟆菌(Amanitamuscaria)。根据一个优选实施方案，本发明肌醇六磷酸酶和/或编码该肌醇六磷酸酶的多核苷酸以纯化形式存在，即以比其在天然或野生型生物中的浓度高或低的浓度存在于某种组合物中，或是与天然或野生型生物中正常不表达产生的成分联合存在。本发明包括与具有图2所公开氨基酸序列(SEQIDNO4)的肌醇六磷酸水解酶相比较含有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％一致性的肌醇六磷酸水解蛋白和肽。本发明还包括编码来自真菌来源如青霉属种的肌醇六磷酸水解酶的多核苷酸如DNA，这些多核苷酸包含与图1A-1C之任一个中所公开多核苷酸序列有至少65％一致性、至少70％一致性、至少75％一致性、至少80％一致性、至少85％一致性、至少90％一致性、和至少95％一致性的序列，只要该多核苷酸编码的酶能够催化肌醇六磷酸水解并释放无机磷酸即可。在一个优选实施方案中，编码肌醇六磷酸水解酶的多核苷酸具有图1A-1C之任一个中所示的多核苷酸序列，或能够与图1A-1C之任一个中所示的多核苷酸序列杂交，或与它们互补。本领域技术人员将明了，由于遗传密码的简并性，有多种多核苷酸可以编码图2所公开的肌醇六磷酸水解酶(SEQIDNO4)。本发明包括所有这些多核苷酸。III.获得编码肌醇六磷酸水解酶的多核苷酸编码肌醇六磷酸水解酶的核酸可以通过本领域已知的标准程序从例如克隆化DNA(例如DNA“文库)获得，或通过化学合成、cDNA克隆、PCR、或基因组DNA或其片段的克隆获得、或从期望细胞如真菌物种中纯化(见例如Sambrook等，1989，《分子克隆实验室手册》，第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarobr，纽约；Glover，DM和Hames，BD(编)，《DNA克隆实践方法》(DNACloningAPracticalAprroach)，第1和2卷，第2版)。来源于基因组DNA的核酸序列可以含有编码区以及调节区。当从基因组DNA分子克隆该基因时，制备其中一些将含有该目的基因至少一部分的DNA片段。可以采用各种限制性酶在特异位点切割DNA。或者，可以采用DNA酶在锰存在时使DNA片段化，或可以通过物理方法例如超声剪切DNA。然后通过标准方法，包括但不限于琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳、PCR和柱层析，根据大小分离这些线性DNA片段。一旦核酸片段产生后，可以按多种方式确定编码肌醇六磷酸水解酶的具体DNA片段。例如，可以对本发明的肌醇六磷酸水解酶编码基因或其特定RNA、或它们的片段如探针或引物，进行分离和标记，然后用于杂交试验中以鉴定产生的基因。(Benton，W.和Davis，R.，1977，科学196180；Grunstein，M.和Hogness，D.，1975，Proc.Natl.Acad.Sci.USA723961)。与探针具有大体序列相似性的那些DNA片段将在中等至高严紧性条件下发生杂交。本发明包括通过核酸杂交技术采用SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO3、或它们的合适部分或片段(例如至少约10-15个连续核苷酸)作为探针或引物筛选基因组或cDNA来源的核酸而鉴定出的、来源于真菌物种(尤其是青霉属种)的肌醇六磷酸水解酶。编码来自青霉属种的肌醇六磷酸水解酶、并与SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO3、或它们的部分或片段有至少65％一致性的核酸，可以通过采用探针，即SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO3的部分或片段，进行DNA-DNA或DNA-RNA杂交或扩增来检测。因此，本发明提供检测编码本发明肌醇六磷酸水解酶的核酸的方法，该方法包括用基因组或cDNA来源的青霉属核酸与SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO3的全部或部分核酸序列进行杂交。能够与SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO3中所公开核苷酸序列在中等至高严紧性条件下杂交的多核苷酸序列，也包括在本发明的范围内。在一个实施方案中，杂交条件以Berger和Kimmel所教授的核酸结合复合物的解链温度(Tm)为基础(1987，分子克隆技术指导，《酶学方法》(MethodsinEnzymology)，第152卷，AcademicPress，SanDiegoCA)(该文献并入本文作为参考)，并给予了确定的严紧性。在该实施方案中，典型地，“最大严紧性”发生在约Tm-5℃(探针Tm以下5℃)；“高严紧性”发生在Tm以下约5-10℃；“中等”或“中间严紧性”发生在Tm以下约10-20℃；“低严紧性”发生在Tm以下约20-25℃。最大严紧性杂交可以用于确定或检测一致或近一致的多核苷酸序列，而中间或低严紧性杂交可以用于确定或检测多核苷酸序列同源物。在另一实施方案中，严紧性由杂交后采用的洗涤条件来确定。对于此实施方案，“低严紧性”条件包括采用0.2×SSC/0.1％SDS溶液于20℃洗涤15分钟。“标准严紧性”条件包括再一个洗涤步骤采用0.2×SSC/0.1％SDS溶液于37℃洗涤30分钟。在聚合酶链式反应(PCR)技术中采用的扩增方法描述于DieffenbachCW和GSDveksler(1995，《PCR引物，实验室手册》(PCRPrime，aLaboratoryManual)，ColdSpringHarborPress，Plainview，NY)。具有SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3的至少约10个核苷酸以及多达约60个核苷酸，优选约12-30个核苷酸、更优选约25个核苷酸的核酸序列可以被用作探针或PCR引物。从cDNA或基因组文库中分离本发明核酸结构的一个优选方法是利用根据具有SEQIDNO4所示氨基酸序列的蛋白质的氨基酸序列制备的简并性寡核苷酸探针进行聚合酶链式反应(PCR)。例如，可以采用美国专利4,683,202中所述技术进行此PCR。鉴于上述描述，应当理解，对于从其它物种，尤其是从真菌(例如谷物变质真菌，或外生菌根真菌)中获得编码具有肌醇六磷酸酶活性的酶的多核苷酸的一致性或同源性片段，图1A-1C中提供的多核苷酸序列是有用的。IV.肌醇六磷酸水解酶的表达和回收本发明多核苷酸序列可以通过可操作地与适当表达载体中的表达控制序列相连来实现表达，并且可以在该表达载体中用于根据本领域的成熟技术转化适合宿主。由本发明DNA序列表达产生的多肽可以从发酵细胞培养物中分离，并根据本领域成熟技术以多种途径进行纯化。本领域技术人员能够选择最为适当的分离和纯化技术。更具体地，本发明提供用于制备微生物(例如青霉属种)来源的肌醇六磷酸水解酶的宿主细胞、表达方法和系统。一旦获得编码本发明肌醇六磷酸水解酶的核酸后，即可采用本领域熟知技术构建含有该核酸的重组宿主细胞。分子生物学技术公开于Sambrook等，《分子生物学克隆实验室手册》，第2版(1989)，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY(1989)。在一个实施方案中，获得与图1A-1C之任一个的核酸或其功能性衍生物有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、和至少95％的一致性、或能够在中间至高严紧性条件下与图1A-1C之任一个的核酸杂交、或与图1A-1C之任一个的核酸互补的、编码来自青霉属种的肌醇六磷酸水解酶的核酸，并经采用适当载体转化入宿主细胞中。编码肌醇六磷酸水解酶的核酸可以含有能够使该编码肌醇六磷酸酶获得分泌的前导序列。根据该肌醇六磷酸酶是在细胞内表达还是进行分泌，可以改造本发明的DNA序列或表达载体，以便表达带有或不带有信号序列的肌醇六磷酸酶成熟形式，其中所述信号序列是天然肌醇六磷酸酶信号序列、或是在真菌(如黑曲霉)、其它原核或真核生物中起作用的信号序列。还可以通过除去或部分除去所述信号序列来进行表达。本领域技术人员已知多种适合于在真菌、酵母、细菌、昆虫和植物细胞中进行克隆、转化和表达的载体以及转化和表达盒。典型地，载体或盒含有指导该核酸转录和翻译的序列、可选择标记、以及允许自主复制或染色体整合的序列。适合的载体含有包含转录起始控制的基因5’区、和控制转录终止的DNA片段3’区。这些控制区可以来源于与宿主同源或异源的基因，只要所选控制区能够在宿主细胞中发挥功能即可。用于驱动肌醇六磷酸水解酶在宿主细胞中表达的起始控制区或启动子是本领域技术人员已知的。将编码肌醇六磷酸水解酶的核酸可操作地通过起始密码子与为了有效表达该酶而选择的表达控制区连接。一旦构建了适合的盒，就可以使用它们转化宿主细胞。当采用植物表达载体时，编码肌醇六磷酸酶的序列可以由多种启动子来驱动表达。例如，可以单独或联合TMV的ω前导序列(Takamatsu等(1987)EMBOJ6307-311)使用病毒启动子如CaMV的35S和19S启动子(Brisson等(1984)自然(Nature)310511-514)。或者，可以采用植物启动子例如核酮糖二磷酸羧化加氧酶小亚基的启动子(Coruzzi等(1984)EMBOJ31671-1680；Broglie等(1984)科学224838-843)；或热休克启动子(WinterJ和SinibaldiRM(1991)ResultsProblCellDiffer1785-105)。这些结构可以通过直接DNA转化或病原体介导的转染进入植物细胞中。关于这些技术的综述，见HobbsS或MurryLE(1992)《McGrawHill科学和技术年鉴》(McGrawHillYearbookofScienceandTechnology)，McGrawHill，纽约，N.Y.，第191-196页；或Weissbach和Weissbach(1988)植物分子生物学方法(MethodsforPlantMolecularBiology)，AcademicPress，纽约，N.Y.，第421-463页。一般转化方法参见《当代分子生物学实验指南》(CurrentProtocolsinMolecularBiology)(第1卷，Ausubel等编，JohnWiley&Sons，Inc.1987，第9章)，它们包括磷酸钙法、采用PEG和电穿孔进行的转化。对于曲霉属和木霉属(Trichoderma)，可以采用PEG和钙介导的原生质体转化(Finkelstein，DB1992转化，《丝状真菌的生物技术，技术和产品》(BiotechnologyofFilamentousFungi.TechnologyandProducts)(Finkelstein和Bill编)113-156)。原生质体的电穿孔公开于Finkelestein，DB1992转化，《丝状真菌的生物技术，技术和产品》(Finkelstein和Bill编)113-156。对分生孢子的微粒轰击公开于Fungaro等(1995)通过微粒轰击完整分生孢子转化构巢曲霉，FEMSMicrobiologyLetters125293-298。农杆菌介导的转化公开于Groot等(1998)根癌农杆菌介导的丝状真菌转化，自然生物技术(NatureBiotechnology)16839-842。对于酵母属的转化，乙酸锂介导的转化和PEG及钙介导的原生质体转化以及电穿孔技术是本领域技术人员已知的。含有本发明肌醇六磷酸水解酶的编码序列并表达该蛋白质的宿主细胞，可以通过本领域技术人员已知的多种方法来鉴定。这些方法包括，但不限于DNA-DNA或DNA-RNA杂交以及蛋白质生物测定或免疫测定技术，这些技术包括了用于检测和/或定量核酸或蛋白质的基于膜的、基于溶液的、或基于芯片的技术。还应当注意的是，本发明考虑了本文所述肌醇六磷酸酶的体外表达。在本发明的一个实施方案中，分离并在黑曲霉中表达编码来自Penicilliumhordei(ATCC22053)的肌醇六磷酸水解酶的多核苷酸序列，而另一个实施方案中该多核苷酸序列在构巢曲霉中进行表达。表达的肌醇六磷酸酶然后可以按例如以下所述回收。本发明肌醇六磷酸酶可以从培养基或宿主细胞裂解物中回收。如果是膜结合形式的，可以采用适当的去污剂溶液(例如Triton-X100)或酶学切割使其从膜中释放出来。用于表达肌醇六磷酸酶的细胞可以通过多种物理或化学手段，例如冻融循环、超声、机械破碎、或细胞裂解试剂，进行破碎。可能期望从重组细胞的蛋白质或多肽中纯化该肌醇六磷酸酶。以下方法是适当纯化方法的例子离子交换柱上分级分离；乙醇沉淀；反向HPLC；在硅或阳离子交换树脂如DEAE上层析；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；采用如SephadexG-75进行的凝胶过滤；去除杂质的A蛋白Sepharose柱；以及结合带表位标志的肌醇六磷酸酶形式的金属螯合柱。可以采用多种蛋白纯化方法，这些方法是本领域已知的，描述于例如Deutscher，酶学方法，182(1990)；Scopes，蛋白质纯化原理和实践(ProteinPurificationPrinciplesandPractice)，Springer-Verlag，纽约(1982)。所用纯化步骤将取决于例如所用制备方法的性质和所产生的肌醇六磷酸酶的具体形式。V.肌醇六磷酸水解酶的应用本文所述肌醇六磷酸酶和其衍生物可以在期望从肌醇六磷酸中分离出磷的多种应用中使用。以下给出了几个应用的例子。例如，本发明提供产生本发明肌醇六磷酸酶的细菌细胞或孢子用作益生菌或直接饲喂的微生物产品的应用。所述应用的优选实施方案是本发明的产肌醇六磷酸酶曲霉属种。此外，本发明还考虑到本文所述肌醇六磷酸酶在食物或动物饲料中的用途。本发明提供含有本文所述肌醇六磷酸酶的食物或动物饲料。优选地，所述食物或动物饲料含有在家畜如家禽和猪、以及饲养的水生动物包括鱼和虾的消化道中、优选嗉囊和/或小肠中有活性的肌醇六磷酸酶作为添加剂。优选地，所述添加剂在食物或饲料的加工中也有活性。此外，本发明还提供含有能够表达本文所述肌醇六磷酸酶的细胞或孢子的食物或动物饲料。而且，本发明考虑到制备食物或动物饲料的方法，其特征在于将根据本发明的肌醇六磷酸酶与所述食物或动物饲料混合。所述肌醇六磷酸酶以干品形式在加工前，或以液体形式在加工前或后加入。根据一个采用了干粉的实施方案，该酶以液体形式被稀释在干载体如碾碎的颗粒上。本发明还提供制备食物或动物饲料的方法，其特征在于向所述食物或动物饲料中加入能够表达本发明肌醇六磷酸酶的细胞和/或孢子。而且，本发明提供带有或不带有附加磷酸酶的本文所述肌醇六磷酸酶用于产生肌醇和无机磷酸，以及肌醇六磷酸的中间物的用途。本发明还提供降低动物粪肥中磷水平的方法，其特征在于按能有效转化动物饲料中所含肌醇六磷酸的量给动物饲喂根据本发明的动物饲料。还可以将本发明肌醇六磷酸酶和肌醇六磷酸来源的中间物用于谷粒湿磨、清洁和个人保护品、及纺织品加工中。我们提供以下实施例仅是为了举例说明，而无意以任何方式限制本发明的范围。本说明书中引用的所有参考专利和文献均特此完整地并入本文作为参考。实施例实施例1液体培养物中肌醇六磷酸水解活性的证据在含有各种浓度无机磷酸盐的指定培养基中培养桧状青霉(ATCC10519)和P.hordei(ATCC22053)，然后测定和比较生长特征和肌醇六磷酸酶的产生。采用孢子悬浮液(2×106个孢子/ml的终浓度)接种极限培养基(Vogels)，对该培养基中磷酸盐的浓度进行改变以观察这将如何影响生长和肌醇六磷酸酶的产生。培养物于25℃(P.hordei)或30℃(桧状青霉)在50ml培养基中通过摇瓶培养进行生长。在24、48、72和96小时收获培养物。采用Fiske和SubbaRow的方法测定培养物上清液的肌醇六磷酸酶活性。通过干重(P.hordei)或OD读数(桧状青霉)确定生长情况。1A.不同培养基条件对生长和形态的影响制备一系列青霉属生长曲线，例如图3的桧状青霉生长曲线和图4的P.hordei生长曲线，观察培养基中可利用P对生长和肌醇六磷酸酶产生的影响。当P水平降低至0.57mM(生长曲线的1/64P[图3])时，尤其是对于桧状青霉，可观察到在真菌生长中出现与压力条件相关的形态学改变(例如菌丝体片段化、形成沉淀、异质生长(heterogeneousgrowth)和整体出现苍白的黄色)。此生理学菌株与生长曲线中接近晚指数期时(48小时；见下表1)肌醇六磷酸酶活性的出现有关。在培养24小时后补加1mM肌醇六磷酸作为磷源的同一低P(0.57mM)培养物中也观察到肌醇六磷酸利用的形态学证据。在没有加入肌醇六磷酸时观察到的形态学改变并不明显，事实上这些补加了肌醇六磷酸的样品与P不受限制的较高P培养基中的培养物类似。这清楚地表明产生了肌醇六磷酸特异性水解活性以致能够给正在生长的真菌提供P。然而，当补加5mM肌醇六磷酸盐时，培养物不生长，这提示培养基中此水平的肌醇六磷酸会与必需矿物质螯合从而导致培养基不能支持真菌的生长和营养。在示例性的P.hordei研究中，培养真菌的培养基中含有·高磷酸盐(1.14mM)·低磷酸盐(0.57mM)·低磷酸盐加上1mM的补加肌醇六磷酸在0、24、48、72和96小时内通过于重测量监测生长，并观察响应不同培养基条件出现的形态学特征。以下为主要的观察结果和结论1.高磷酸盐中有预期的良好生长，一致的真菌形态指示是健康培养物。2.在低磷酸盐条件下生长明显较差，真菌形态不均一，有聚集和菌丝体片段化的迹象。培养物表现出病态黄色。3.与(2)类似的培养物当补加肌醇六磷酸(底物)后看上去不再象处于同样的生理压力下。生物量的生长与条件(1)相似，并且真菌的形态与高磷酸盐条件下的真菌相同。4.这些培养物的生长曲线和摄像证据支持了这些观察，整体而言的主要结论是我们在条件(3)中观察到肌醇六磷酸盐水解活性，该活性使得真菌可以从肌醇六磷酸中获得磷酸盐并由此防止该培养物正遭受的磷酸盐饥饿压力。1B.培养物上清液中的肌醇六磷酸酶活性下表1显示了桧状青霉培养物上清液中的肌醇六磷酸酶活性。表1还显示了在同样条件下于Vogels1/64P(0.57mM)培养基中培养的、作为肌醇六磷酸酶活性对照的黑曲霉培养物的数据。我们可以观察到，黑曲霉培养物表现出与桧状青霉培养物类似的水平。表1.在含有不同水平无机P的培养基中培养的真菌培养物上清液的肌醇六磷酸酶活性对这些样品在接种后48小时检测到的活性作比较。肌醇六磷酸酶活性表示为每ml培养物上清液每分钟释放的μmolP量。样品的活性根据三份相同的培养瓶计算，培养瓶中的上清液进行了重复两次的肌醇六磷酸酶测定。活性显示为平均值±SD，n＝6。桧状青霉*和桧状青霉**是指来自两个独立时程实验的数据。因此，明显的生理压力与磷酸盐受限的培养物相关，这对生长产生了不利影响，并且该生理压力与肌醇六磷酸酶活性的出现联系在一起。1C.培养物上清液的浓缩肌醇六磷酸酶活性的另一证据可以指望从浓缩的上清液(浓缩的蛋白质)中得到。例如，可以从以下物质中获得浓缩的蛋白样品1.压力和低磷酸盐条件下的青霉属培养物(此处预期将表达肌醇六磷酸酶)，2.高磷酸盐和无压力条件下的青霉属培养物，此处预期将不产生肌醇六磷酸酶，和3.补加低磷酸盐和补充的肌醇六磷酸的培养物。这些浓缩蛋白样品的银染SDS-PAGE凝胶预期将显示一个蛋白质分布图，其中在来自条件1(上面)的浓缩蛋白中会出现一条蛋白带(推测的肌醇六磷酸酶条带)，而此条带在条件2中不存在。预期条件3中也会出现类似的该条带，尽管水平较低。基于P.hordei肌醇六磷酸酶的氨基酸序列，并基于其表现为是一种细胞外酶的这一事实，该蛋白质的预期大小为约50kDa。然而，应当注意，在该细胞外酶上的糖基化修饰可以使该MW增加至60-90kDa。实施例2肌醇六磷酸酶基因片段的PCR扩增2A.简并引物设计基于发表的肌醇六磷酸酶氨基酸序列的比对，设计了许多针对保守的结构和催化区的简并引物。这些区域包括在肌醇六磷酸酶中高度保守的那些区域，以及已知对于酶的结构和功能重要的那些区域。在一项研究中，对4个发表的肌醇六磷酸酶氨基酸序列进行了比对。这些肌醇六磷酸酶序列来自(i)黑曲霉(定义黑曲霉phyA基因；ACCESSIONZ16414；vanHartingsveldt，W.等，1992)；(ii)烟曲霉(定义烟曲霉肌醇六磷酸酶基因，完整的cds.；ACCESSIONU59804；Pasamontes，L.等1997)；(iii)土曲霉(定义土曲霉9A1肌醇六磷酸酶基因，完整的cds.；ACCESSIONU59805；Mitchell，D.B.等1997)；和(iv)Myceliophtorathermophilus(定义Myceliophthorathermophila肌醇六磷酸酶基因，完整的cds.；ACCESSIONU59806；Mitchell，D.B.等1997)。应当注意，所有这些序列均可从GENbank公开获得，每个都被并入本文作为参考。选择了符合以上标准的5个特定区域，然后从这些氨基酸序列设计了一些正向和反向引物。用于设计这些引物的具体氨基酸区域在图5的蛋白序列比对中以黑框标明。根据密码子选择使用遗传密码，由MWG-Biotech公司合成简并核苷酸PCR引物。在另一研究中，仅从发表的黑曲霉phyA和phyB肌醇六磷酸酶氨基酸序列设计了称作CS1和CS2的一对引物。这些引物的设计如下·引物CS1正向(5’-3’)引物，来自RHGARYPT区(见图5，第约110-120位氨基酸)，该区是phyA肌醇六磷酸酶的磷酸结合域，是催化活性所必需的。·引物CS2反向引物，来自FT(H/Q)DEW(I/V)区(见图5，第约335-345位氨基酸)，该区是肌醇六磷酸酶的中央区域，似乎具有相对好的保守性。这些引物的序列见下CS15’CGICAT/CGGIGCICGITAT/CCC3’CS23’AAA/GTGIGTICTA/GCTT/CACCT/CAI5’CS25’AC/TCCAC/TTCG/ATCITGIGTG/AAA3’由于所有引物均按5’-3’方向合成，故反向引物按粗体表示的CS2制备。采用标准遗传密码将氨基酸改为三联密码子，对于混合的碱基位置采用标准IUB密码(例如将A/C/T/G命名为I)。关于引物CS1和CS2设计的其它细节，我们现在将参考图6进行描述。图6显示了发表的黑曲霉phyA和phyB肌醇六磷酸酶氨基酸序列，引物CS1和CS2即是从这些序列设计的。具体地，进行比对的序列来自1Piddington等，1993(A.nigervar.awamori的Phya和Phyb)、2vanHartingsveldt等，1993(黑曲霉的Phya)、3Erlich等，1993(黑曲霉的PhyB)。图1的比对采用3.5版PHYLIP软件包的CLUSTALV(HigginsD.G.等，1992)进行。图中显示了用于设计简并引物CS1和CS2的保守序列。我们可以从图6的比对中观察到，PhyA和PhyB的磷酸结合域十分保守，在PhyA(RHGARYP；vanHartingsveldt等，1993)和PhyB(RHGERYP；Piddington等，1993)之间仅有单个氨基酸的差异。简并引物CS1被设计仅与phyA版本序列中的此区域互补，即采用RHGARYPT作为引物设计的基础。在这种情况下会由此使该引物偏向phyA型的磷酸结合域。作为引物CS2基础的第二个保守区位于PhyA和PhyB氨基酸序列的中间。该保守的中央肌醇六磷酸酶特异性域在PhyA(FTHDEWI)中相应于第285-291位氨基酸。在PhyB中，该氨基酸序列(FTQDEWV)相应于第280-286位氨基酸。简并引物CS1和CS2成功地从P.hordei通过PCR扩增了一段650bp的区域，描述如下。2B.肌醇六磷酸酶基因片段的PCR扩增采用青霉属菌种的基因组DNA作为模板，并采用上述引物的组合，PCR扩增推测的肌醇六磷酸酶基因片段。PCR采用AmershamPharmacia的PCRReady-to-goBeads进行。由单独的实验确定条件，但典型地在Techne热循环仪中运行30个循环。通过在1％琼脂糖凝胶上电泳PCR反应产物验证成功的扩增。采用Qiagen的QiaquickSpin凝胶提取试剂盒通过凝胶提取纯化通过引物CS1和CS2从P.hordei扩增的具有正确期望大小(650bp)的PCR产物。将纯化的PCR产物连接至商业pGEM-TEasy载体系统(Promega公司)中以便于克隆。连接反应在4℃孵育过夜，总共10μl体积中含有0.1体积的10×连接酶缓冲液和1μl(1U.μl-1)的T4DNA连接酶。典型地在该反应中按插入片段与载体DNA之间1-4∶1的摩尔比使用插入DNA片段。从-80℃储存处取出100μl小份的CaCl2感受态大肠杆菌XL-1Blue细胞，冰上融化后用于转化。向细胞中加入3μl连接混合物，并在冰上孵育该混合物20分钟。然后42℃热休克细胞1分钟，之后将细胞返回冰上放置5分钟。在转化混合物中加入0.9mLL-液体培养基，在未进行选择的情况下振摇孵育细胞，以便使氨苄青霉素抗性基因产物能够在应用筛选前表达(37℃，1h)。然后直接将200、300和400μl试样的该培养物涂布在选择性琼脂平板上。平板在37℃孵育过夜。采用蓝/白斑筛选观察含有重组质粒的菌落。为了快速甄别重组转化体，从推测的阳性(白色)菌落的培养物中制备质粒DNA。根据Sambrook等的程序(1989)采用Birnboim和Doly的方法分离DNA。通过限制性分析证实重组质粒中正确插入片段(650bp)的存在。用Not1-pPstI限制性酶37℃消化DNA过夜，通过琼脂糖凝胶电泳观察消化产物。许多克隆含有正确大小的插入片段，选出一些用于手工测序以观察该插入片段是否是肌醇六磷酸酶基因片段。采用Sanger等的双脱氧链终止法(1977)和修饰形式的T7DNA聚合酶(2.0版的测序酶)进行插入片段测序。反应采用2.0版测序酶试剂盒(AmershamLifeScience-UnitedStatesBiochemical公司)中提供的试剂，按厂家操作指南进行。来自两个克隆(命名为3D和3G)的末端的部分序列说明，已克隆了肌醇六磷酸酶基因片段。来自这两个克隆的质粒DNA被送到MWG-Biotech公司进行双链插入片段的全长测序。2C.序列分析通过BLAST和蛋白质翻译序列工具分析这些序列。在核苷酸水平上的BLAST比较显示与发表的phyA肌醇六磷酸酶序列有各种水平的同源性。最初，通过访问环球网上的BLAST数据库向BLAST(2.0版基础BLAST)提交核苷酸序列。所用网值是http//ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。所选程序是blastn，所选数据库是nr。使用了标准/默认参数值。推测的P.hordei基因片段的序列数据以FASTA格式的序列形式输入，然后该查询被提交给BLAST，以便对本发明序列和数据库中已有序列进行比较。对于此650bp片段和来自第一文库筛选的EcoRI基因片段(讨论如下)，返回的结果显示与黑曲霉、E.nidulans、烟曲霉和嗜热放线菌(T.thermophilus)的肌醇六磷酸酶基因有大量的匹配位置。然后采用称作蛋白质机器的DNA至蛋白质翻译工具处理这些序列。该工具也可以在网上(http//medkem.gu.se/edu/translat.html)获得。另一个适合的翻译工具被作为翻译机器，可从网上http//www2.ebi.ac.uk/translate/获得。将来自P.hordei的推测肌醇六磷酸酶基因片段的DNA序列插入分析块中，采用标准遗传密码作为翻译的基础。在所有三种读码框中对正向和反向链进行翻译。该分析工具将翻译的氨基酸序列以单字母密码氨基酸序列的形式传送到屏幕上。当翻译成氨基酸序列后，这些克隆表现出含有212个氨基酸(636bp是基因片段的实际大小)，没有终止密码子。氨基酸序列的分析表明，该片段含有两个正确末端(用于设计引物CS1和CS2的)，含有必需的P结合基序(RHGARYP)和同样出现在发表的phyA肌醇六磷酸酶序列中的3个半胱氨酸。我们推论，克隆的此636bp片段是P.hordei的phyA肌醇六磷酸酶基因片段。采用ALIGN程序(AlignmentEditorVersion4/97；DominickHepperie，Fontanestr.9c，D016775，Neuglobsow，德国)在核苷酸和氨基酸水平上进行序列比对和这些比对的分析。在进行分析时，贴入主题序列，并采用PHYLIP交错格式。同源性分析采用该程序的“分析”部分进行，具体是题为“距离分析”的选项。采用最少两个氨基酸序列(即两个“物种”)，这可计算出物种间的％同源性和不同位点的数目。最小和最大同源性按％计算。同源性分析的基础是％一致性，即基于“一致氨基酸(或碱基)的数目除于总的氨基酸(或碱基)数目然后乘以100”，这一计算产生百分数值。将P.hordei的氨基酸序列和发表的肌醇六磷酸酶序列放入ALIGN程序中，在氨基酸水平上进行手工比对。图7中显示了示范性结果。图7中，称作“P.hordei3D”(SEQIDNO)的序列是采用简并引物CS1和CS2获得的PCR产物的推导翻译物。实施例3用于文库制备的Southern分析用一组限制性酶37℃过夜消化P.hordei、桧状青霉和黑曲霉的基因组DNA。在1％琼脂糖凝胶上电泳成功消化的DNA以便向尼龙膜转移。电泳结束后，将该琼脂糖凝胶浸泡在0.2MHCl中10分钟以使DNA脱嘌呤，然后在ddH2O中短暂洗涤。通过碱性毛细管印迹将DNA转移至HybondTM-N+膜(AmershamInternationalPLC)上。安装印迹系统，以便尼龙滤膜夹在凝胶和一摞吸水性纸巾中间。在横跨转移缓冲液(0.4MNaOH)槽的玻璃板上预备一个Whatman3MM纸(Schleicher和Schuell，Dassel，德国)芯。将凝胶倒置在纸芯上，小心避免气泡形成，并用Nescofilm带环绕凝胶边缘以防止纸巾的印迹活动绕过凝胶。用一张等大小的HybondTM-N+膜覆盖凝胶，该膜在之前切去了一角以和凝胶匹配并在3×SSC中预湿。接着，将3-5张3MM纸放置在滤膜顶上，加上一摞10cm印迹纸，然后是0.5kg的重物，以完成印迹系统安装。将此印迹系统保持8-24小时以转移DNA。然后RT下在2×SSC中短暂洗涤该膜，并于80℃真空烤箱中干烤以将DNA固定在膜上。采用来自P.hordei的636bp片段探测此Southern印迹。首先用32P同位素借助HighPrimeDNA标记试剂盒(BoehringerMannheim)标记该片段。在随机引发标记反应中加入变性片段，以掺入放射性标记的腺嘌呤。Southern印迹于杂交管中42℃在12mlEasy-Hyb缓冲液(BoehringerMannheim)中预杂交1小时。使放射性标记的探针变性后加入5mlEasy-Hyb杂交缓冲液中，然后42℃杂交过夜。杂交后，通过在40ml3×SSC、0.1％SDS中42℃孵育15分钟，洗涤此印迹。用新鲜洗涤溶液重复此低严紧性洗涤。严紧性洗涤后，将此印迹在3×SSC中漂洗以下，然后密封在干净的塑料中并对x光片曝光。曝光持续2小时后，对该x光片进行显影。正如图8所示，P.hordei消化物中观察到强杂交条带。具体地，图8描述了Southern印迹凝胶，该凝胶显示了含有采用简并引物CS1和CS2获得的PCR产物的探针与各种真菌基因组DNA消化产物之间的杂交情况；泳道1-大小标准参照物；泳道2-黑曲霉-EcoRI；泳道3-桧状青霉-EcoRI；泳道4-Penicilliumhordei-EcoRI；泳道5-Penicilliumhordei-BamHI；泳道6-Penicilliumhordei-Sall；泳道7-Penicilliumhordei-KpnI；泳道8-Penicilliumhordei-SacI。这些结果说明636bp片段可以用作探针进行文库筛选。实施例4从P.hordei基因组中分离编码肌醇六磷酸酶的多核苷酸序列4A.P.hordei基因组文库的制备和筛选在Southern杂交分析后，我们决定制备P.hordei的部分基因组文库，以便尝试克隆全长肌醇六磷酸酶基因。制备靶向4.4KbEcoRI片段(从Southern分析估计的)的大小受限质粒文库。在1.25％琼脂糖凝胶上电泳EcoRI消化的P.hordei基因组DNA。从凝胶中提取约4.4Kb的消化片段，通过Glass-Max(Gibco-BRL，Scotland)进行纯化。将纯化的基因组片段和EcoRI线性化的pSKIIBluescript载体(Stratagene)用于鸟枪连接反应中。在连接前首先对载体进行脱磷酸，然后在14℃过夜进行连接反应。通过转化大肠杆菌XL-10Gold超感受态细胞(Stratagene)产生文库。从-80℃储存处取出100μl份额的细胞，冰上融化用于转化。于冰上向细胞中加入4μlβ-巯基乙醇。在该混合物中加入3μl连接混合物，并在冰上孵育20分钟。然后42℃热休克细胞30秒，之后重新置于冰上2分钟。在此转化混合物中加入0.9mlNZY液体培养基，在无选择的情况下振摇孵育细胞以使氨苄青霉素抗性基因得到表达。将这些转化细胞铺在具有蓝/白斑筛选的LB琼脂平板上，37℃孵育过夜。平板上观察到总共728个菌落，其中450个是白色的。按Maniatis的方法(10％SDS-裂解，3min；1.5MNaOH-变性，5min；1.5MTricHCl-中和，5分钟；3×SSC-冲洗，5分钟)，将菌落转移至尼龙滤膜上。然后80℃真空干烤滤膜2小时，以固定DNA。按与Southern杂交相同的方式采用32P放射性标记的636bp探针筛选文库。杂交后，在3×SSC、0.1％SDS中42℃洗涤滤膜15分钟。然后在3×SSC中冲洗滤膜，将之密封在塑料中并于-80℃对x光片曝光过夜。在此片上观察到5个阳性杂交点。将这些点与含有转化体的琼脂平板进行对比。这些杂交点与琼脂平板上的一个以上单菌落对上。用无菌环挑取位于杂交点半径中的所有菌落，然后接种2mlLuria液体培养基。培养物在37℃培养2小时。对培养物进行稀释，从10-1至10-5，然后将每个样品各100μl铺在LB-amp琼脂平板上，并于37℃孵育过夜。选择之上有10-150个菌落的平板进行二次筛选。按前述转移菌落，并采用相同程序加工滤膜。制备新鲜的32P标记探针，然后按前述相同方式筛选滤膜。采用2×SSC、0.1％SDS于42℃15分钟进行严紧性洗涤。然后在2×SSC中漂洗滤膜，将之密封在塑料中并对x光片曝光2小时。经显影的片子显示出极高数量的强杂交点，符合从第一次筛选得到的阳性菌落的扩增。然后将此片与平板作对比，调整这些点以观察它们是否与单个分离的菌落相应。挑取与单菌落匹配的最好12个阳性点，用于接种Luria液体培养基以制备质粒DNA。利用QiaspinMini-Prep试剂盒(Qiagen)纯化质粒DNA，并进行限制性分析以估计插入片段的大小。所有12个克隆均给出相同的限制性图谱，提示插入片段的大小为3-4Kb。其中6个克隆被送往MWG-Biotech公司作部分测序，以确定它们是否是正确的基因/基因片段。序列分析显示，其中3个克隆含有phyA肌醇六磷酸酶的基因片段，但这仅是对一端而言。之后将这3个克隆送出以对插入片段作完全测序。对这些克隆全序列的序列分析表明，所有三个克隆均相同，而且它们编码相应于约80％phyA肌醇六磷酸酶基因的355个氨基酸(见图7，第1行，称作“Phordei”)。明显地，在该基因中有一个内部EcoRI位点，位于该基因起始位点下游300-400bp的位置。4B.真菌肌醇六磷酸酶间的百分比一致性比较采用该克隆的肌醇六磷酸酶基因片段的推导多肽产物与发表的肌醇六磷酸酶作同源性比较。分析显示约42-56％的一致性(见下表2)，联合该翻译序列的分析一起证明该克隆基因片段是phyA肌醇六磷酸酶。表2.真菌肌醇六磷酸酶间百分比一致性的比较(ALIGN编辑程序)注基于大约80％的推导P.hordei肌醇六磷酸酶氨基酸序列(即缺少N端部分[约140个氨基酸])进行的比较4C.制备和筛选基于SalI的大小受限基因组文库以分离肌醇六磷酸酶基因的剩余部分为了分离估计的剩余20％P.hordei肌醇六磷酸酶基因，我们决定使用第二种限制性酶制备第二个部分基因组文库，以分离该基因的5’端，然后尝试将这两个片段亚克隆在一起。采用Webcutter确定该克隆肌醇六磷酸酶序列中存在的限制性内切核酸酶识别位点。尤其有意义的是在图8所示Southern分析中使用的酶的位点。我们发现，所有这些酶(KpnI、SacI、BamI和SalI)在该肌醇六磷酸酶序列内均有切点，分别距离该克隆片段5’末端48bp、75bp、486bp和660bp。P.hordei基因组DNA消化物的Southern分析(图8)显示了，BamHI片段极大(约8Kb)，将难于克隆在基于质粒的文库中。与KpnI条带杂交的程度对于文库筛选而言不足够强，而SacI泳道上存在的两条带可能会使该筛选过程复杂化。我们决定按前述相同方式制备基于SalI的大小受限文库，以分离1.8kb的SalI带。由于在探针序列末端下游约120bp的位置存在一个已知的SalI位点，因此有可能在该肌醇六磷酸酶基因起始位置上游的某个位置还有一个SaII位点。按前述方法在pBluescriptSKII中制备文库，并采用相同的636bp探针进行筛选。对选出的阳性杂交菌落进行选择并与平板上的菌落对比。所有12个菌落均与单个分离的菌落对上，提取这些菌落进行质粒DNA制备。限制性分析显示，仅3个克隆含有插入片段，而且所有均为约1.8kb。然后将两个克隆(CS112，CS114)送至MWG-Biotech作完全测序。推导的氨基酸序列显示，这些克隆包含具有属于phyA肌醇六磷酸酶的基序的序列，但CS112有大量的测序错误。克隆CS114的分析显示，在该肌醇六磷酸酶基因的这两个基因组片段之间有一个450bp的重叠。除确定了推测的起始密码子外，在CS114上还确定了5’内含子和上游调节元件。4D.扩增连续肌醇六磷酸酶基因用于异源表达从两个基因组克隆CS114和CS101产生一个合并的肌醇六磷酸酶序列(图9)，我们采用此序列设计了许多能够用来扩增连续肌醇六磷酸酶基因序列的上游和下游引物。我们还对PCR扩增进行了设计以利于完整肌醇六磷酸酶基因在异源表达载体pGAPT-PG中的克隆和表达，该载体是Genencorinternational公司提供的一个5.1kb结构(见图11)。在pGAPT-PG的多克隆位点中有两个限制性酶位点(EcoRV和Agel)，它们并不存在于此肌醇六磷酸酶基因序列中。我们采用此肌醇六磷酸酶基因序列设计了许多5’和3’侧翼引物，并对它们进行修饰以包含这些酶的限制性酶识别位点(表3)。表3.根据克隆CS101和CS114组合的phyA基因序列设计的肌醇六磷酸酶特异性引物的序列F指正链上的正向引物(5’→3’)；R指负链上的反向引物。设计在引物序列中以利于克隆入表达载体pGAPT-PG的限制性酶识别位点带有下划线并以粗体标出。用于设计引物的上游和下游侧翼区是主观选择的，分别位于ATG(起始)密码子上游和TAG(终止)密码子下游约100bp处。所用基因序列也经过选择以尽可能含有等量平衡的碱基。采用P.hordei的基因组DNA以及这些引物组合，我们尝试通过PCR扩增该肌醇六磷酸酶基因。PCR应扩增相应于全长肌醇六磷酸酶基因的大约1.7kb区域。图12显示了采用引物CS201或CS202和CS203进行的PCR的结果。对于CS201-CS203组合可以观察到一条具有正确大小的带，但也可以看到存在多条较低分子量带。采用CS202-CS203在这些条件下未观察到扩增，但当退火温度为50℃可以观察到在约1.7kb处有极其微弱的条带(未显示)。对于CS201/CS202和CS204在约700bp处产生一条强带(未显示)。将图12中观察到的由CS201-CS203扩增产生的期望产物克隆至载体pTT中，选择含有正确大小插入片段的几个克隆进行测序(CS158和CS167)。图10描述了克隆CS158的5’/N-端核酸序列和3’/C-端序列。初步推导的肌醇六磷酸酶氨基酸序列以粗体显示。克隆CS167的序列在分析后被认为不是肌醇六磷酸酶。克隆CS158的分析揭示了一些有趣的性质。从CS158克隆的3’末端推导的CS158氨基酸序列表现出与CS101肌醇六磷酸酶有高度同源性。然而，从5’末端产生的序列与CS114基本不同。对于磷酸结合域基序(RHGARY)上游的序列，这尤其如此。值得注意的是，来自CS1585’末端的序列与发表的肌醇六磷酸酶序列更为相似，并含有大量的关键性结构基序和保守氨基酸，而这些在CS114的N端氨基酸序列中并不存在。我们推论，克隆CS101和CS114来源于2个不同的基因，而CS158是正确的全长肌醇六磷酸酶。在CS158序列中有许多明显的测序错误。这可能是由采用Taq聚合酶扩增图12所示1.7kb条带这一事实造成的。从此新序列设计了两个新的5’引物以重新扩增该肌醇六磷酸酶基因用于表达。选择位于来自CS158的此新肌醇六磷酸酶序列中推测起始密码子上游的两个区，对它们进行修饰以包括利于克隆至pGAPT-PG中的EcoRv识别位点(表4)。表4根据来自克隆CS158的Taq聚合酶扩增产生之phyA基因序列设计的肌醇六磷酸酶特异性引物序列F指正链上的正向引物(5’→3’)。设计在引物序列中以利于克隆至表达载体pGAPT-PG中的限制性酶识别位点带有下划线并以粗体标出。用于设计引物的上游侧翼区是主观选择的，位于推测的ATG(起始)密码子上游约50-70bp的位置。所用基因序列也经过选择以尽可能含有等量平衡的碱基。采用这些5’引物与从CS101设计的3’引物(表3)的组合，利用高保真性DNA聚合酶PfuPCR扩增P.hordei基因组DNA，以使该肌醇六磷酸酶基因的表达错误最小化(图13)。该聚合酶是PfuDNA聚合酶(Stratagene)，是用于PCR的PfuDNA聚合酶试剂盒的一部分。对于这些反应，将反应缓冲液、dNTPs、靶DNA和引物混合在一起，然后在50μl的终反应体积中加入2.5单位Pfu聚合酶。扩增后，通过凝胶电泳分析5μl试样的反应混合物。从新序列设计的引物和引物CS204的组合在预期大小的位置(1.7kb)产生了单一强产物。将该片段直接克隆在载体pCR-BluntIITOPO(Invitrogen)中，分析选出数量的克隆以证实正确插入片段的存在。(将PfuDNA聚合酶产生的平端PCR产物克隆至ZeroBluntTMTOPOTMPCR克隆试剂盒(Invitrogen)中。该载体含有一个MCS位点和产生抗生素抗性的卡那霉素基因，该载体还允许采用不同于蓝/白斑筛选的基于致死性大肠杆菌基因ccdb的破坏进行的筛选。向纯化的PCR产物(50-200ng)中加入1μlpCR-BluntII-TOPO载体，用无菌水将反应体积补加至5μl。温和混匀后室温孵育5分钟。加入1μl6×TOPO克隆终止溶液，将反应置于冰上或于-20℃冰冻达24小时以进行转化。)通过此分析也验证了改造的EcoRV和AgeI位点的完整性。制备并测序了一些克隆，CS212和CS213。序列分析证实存在完整的phyA肌醇六磷酸酶基因。进一步采用此基因在异源系统进行表达，并随后对该酶作生物化学性质分析。4E.P.hordei肌醇六磷酸酶序列的分析CS213代表了P.hordei的全长肌醇六磷酸酶序列。图1A中可以看到此克隆的基因组序列。图2中可见P.hordei肌醇六磷酸酶的推导氨基酸序列。对此P.hordei序列和发表的肌醇六磷酸酶进行比对，并以％一致性为基础进行了同源性分析。结果可见于下表4中。表4.肌醇六磷酸酶间的％一致性比较在左/下区域中的数字表示了两个物种间不同位点的数目。最小同源性44.0％，最大同源性68.3％实施例5克隆、表达和表征P.hordei的肌醇六磷酸酶我们决定尝试在异源宿主中超量表达该肌醇六磷酸酶基因以制备足够的蛋白质用于该酶的性质分析。5A.在表达载体中克隆肌醇六磷酸酶基因并转化构巢曲霉采用高保真性DNA聚合酶扩增的全长肌醇六磷酸酶基因用经改造含有两个限制性酶位点(EcoRV、AgeI)的引物来产生。采用这些位点是为了利于在表达载体pGAPT-PG(图11)中的克隆。用这些酶消化肌醇六磷酸酶克隆CS212和CS213，产生1.7kb的单一插入片段。同样用这些酶消化pGAPT-PG并使之线性化。将肌醇六磷酸酶基因片段与此表达载体相连，产生许多转化体。分析选出的克隆以验证插入片段的存在。然后采用这些肌醇六磷酸酶克隆通过电穿孔转化构巢曲霉的溶胀孢子(Swollenspores)。通过电穿孔转化黑曲霉菌株FGSCA767和构巢曲霉FGSCA1032的方法是O.Sanchez和J.Aguirre针对构巢曲霉开发的实验程序的变通。用适当的孢子悬浮液按107个孢子/ml接种50mlYG培养基(0.5％酵母提取物、2％葡萄糖、补加10mM尿苷和10mM尿嘧啶)。培养物于25℃在300rp的旋转摇床上生长4小时。通过4℃以4000rpm离心5分钟收集溶胀孢子。将孢子重悬在200ml冰冷无菌水中，并4℃以4000rpm离心5分钟。倾去上清液，将孢子重悬在12.5mlpH8.0YED培养基(1％酵母提取物、1％葡萄糖、20mMHEPES)中，并于30℃在旋转摇床上以100rpm孵育60分钟。4000rpm离心5分钟收集孢子，然后按109个分生孢子.ml-1的浓度重悬在1ml冰冷EB缓冲液(10mMtris-HCl，pH7,5，270mM蔗糖，1mM乙酸锂)中，并置于冰上。在无菌Eppendorf管中将50μl溶胀孢子悬浮液与1-2μgDNA混合，总体积60μl，然后置于冰上15分钟。将此悬浮液转移至0.2cm的电穿孔杯中。在BioRad电穿孔装置(设定为1kv，400W，25μF)中进行电穿孔。电穿孔后在悬浮液中加入1ml冰冷YED，然后将合并的混合物转移至预冷的15ml无菌Falcon管中，置于冰上15分钟。之后将管子以水平位置放置在旋转摇床上，以100rpm30℃孵育90分钟。将孢子铺在平板上，并在36-48小时后观察转化体。在所有情况下均采用环状质粒DNA，对于来源于CS213的克隆产生了15个转化体，而对于来源于CS212的那些克隆仅产生了2个转化体。黑曲霉菌株FGSCA767和构巢曲霉菌株FGSCA1032获自真菌遗传学贮存中心，UniversityofKansasMedicalCenter，3901RainbowBoulevard，Kansas城，Kansas，USA。5B.构巢曲霉转化体的初步性质分析总共选择了10个构巢曲霉转化体作进一步分析(CS212-1、CS213-1至9)。采用分别来自这些转化体的孢子接种选择性培养基，并制备各个克隆的孢子悬浮液。采用这些孢子悬浮液接种转化体的液体培养基，然后用于肌醇六磷酸酶活性的筛选。培养物生长72小时后，收集上清液。样品在PD-10柱上脱盐，然后将这些蛋白质样品稀释在0.25M乙酸钠中。肌醇六磷酸酶的测定在标准条件(pH5.5，37℃，30min)下进行。其中两个克隆(CS213-2，CS213-4)在培养物上清液中表现出肌醇六磷酸酶活性。记录的CS231-2的肌醇六磷酸酶活性为每ml培养物上清液每分钟释放0.12mmolesPi，而转化体CS213-4具有每ml每分钟释放0.08mmolesPi的活性。将这些转化体用于进一步的分析。5C.液体培养中肌醇六磷酸酶最大表达的时间为了评价肌醇六磷酸酶产生水平什么时候达到最高峰以便进行随后的生化性质分析，在一个2天至7天的期限内制备了CS213-2和CS213-4的一系列液体培养物。用适当转化体的孢子悬浮液接种培养基，并在此期限内每天进行收获。按标准方法加工培养物上清液，在标准肌醇六磷酸酶条件下测定脱盐的培养物上清液。表5总结了这些测定的结果。在整个时间内均观察到肌醇六磷酸酶活性，但其表达在第三天达到最大。表5.随着时间的过去转化体培养上清液中肌醇六磷酸酶的活性在每个时间点上均进行液体培养物的收获，脱盐后洗脱在0.25mM乙酸钠(pH5.5)中。肌醇六磷酸酶测定在标准条件(pH5.5，37℃，30min)下重复进行两次。活性表示为每ml培养物上清液中肌醇六磷酸酶的单位数(释放的Piμmoles.min-1.ml-1)。还测定了这些时间点的未能转化构巢曲霉作为对照。没有检测到肌醇六磷酸酶活性。通过SDS-PAGE分析所选上清液样品(第4天和第6天)在脱盐前和脱盐后的蛋白质样品。所有使用样品的考马斯染色凝胶都未显示条带。这提示，分泌至培养基中的蛋白质总水平较低。银染凝胶也未显示有任何蛋白条带的迹象。5D.转化体的Southern分析尽管有证据证明P.hordei肌醇六磷酸酶基因已被成功地克隆入表达载体pGAPT-PG中，并且实现了活性酶的表达，但至今仍缺少分子证据。从转化的构巢曲霉CS213-2和CS213-4、以及初始的未转化宿主中制备基因组DNA。由于P.hordei肌醇六磷酸酶基因中没有内部EcoRV位点，故用EcoRV消化DNA，然后进行转化体的Southern杂交分析。采用来自P.hordei的650bp肌醇六磷酸酶探针分析这些Southern印迹(图14)。在中等至高严紧性条件(3×SSC)下，对于转化体CS213-2和CS213-4均可观察到单条的强杂交带。没有迹象存在任何其它杂交带，由此可以推断这显示了转化的构巢曲霉中的单拷贝肌醇六磷酸酶基因。在未转化样品中未能观察到杂交条带，这说明P.hordei肌醇六磷酸酶和构巢曲霉基因组存在的任何肌醇六磷酸酶之间没有同源性。5E.P.hordei肌醇六磷酸酶的生物化学特性分析为了证实该克隆基因具有特异的肌醇六磷酸酶活性，并对此活性进行表征，在超量表达的酶上进行了一组生化分析。初步的性质分析显示，该基因产生肌醇六磷酸水解活性。对该分析进行扩展，以检测在不同pH、温度和针对不同底物时的活性。转化体CS213-4被用于这些分析。培养物在第3天收获。当采用肌醇六磷酸作为底物时，该酶在pH3.0和pH7.0之间表现出活性(图15)。将来自培养物上清液的纯化酶样品脱盐，并洗脱在0.025mM乙酸钠(pH5.0)中。然后将其加入在如下缓冲液中制备的底物pH3.0∶0.4M盐酸甘氨酸、pH4.0∶0.4M乙酸钠、pH5.0∶0.4M乙酸钠、pH6.0∶0.4M盐酸咪唑、pH7.0∶0.4MTris-HCl、pH8.0∶0.4MTris-HCl、pH9.0∶0.4MTris-HCl。在pH5.0有一个明显的最适值(240单位/ml上清液)，从5.0直到6.0有一个宽范围的侧翼活性。当采用磷酸4-硝基苯基酯作为底物时，几乎观察不到活性，这说明该酶对肌醇六磷酸底物有高水平的特异性。针对该底物的最高活性出现在pH3.0处，但甚至这也仅是该酶在此pH时针对肌醇六磷酸的活性的25％。采用pH5.0缓冲液，就一系列温度，对该酶的温度曲线进行表征，这次仅采用了肌醇六磷酸作为底物(图16)。P.hordei肌醇六磷酸酶在30℃-85℃表现出活性，但在44℃有一明显的最适温度。越接近周围温度该酶的活性越高，在44℃和37℃之间仅丧失22％的相对活性。由于产生的蛋白质的总水平很低，而且这些测定是针对全部上清液蛋白进行的，所以难于确定该肌醇六磷酸酶的比活性。这些样品的平均总蛋白量为8μg/ml，预计这将给出每mg蛋白质240000个单位的比活性。我们还对此肌醇六磷酸酶进行了初步的稳定性研究。将第3天蛋白质的样品置于-20℃、4℃和37℃过夜，然后在标准条件下对其进行测定。没有测量到残余活性。我们还将样品暴露在85℃20分钟，和100℃10分钟以确定该肌醇六磷酸酶活性的热稳定性。在暴露于这些温度后当于37℃、pH5.0进行测定时，在残余酶活性方面有一个相当大的降低(表6)。表6残余活性是基于与暴露于每个条件前获自样品的肌醇六磷酸酶活性测定值进行比较得出的(100％活性相应于每ml培养物上清液112单位)。尽管样品仅重复测定了两次，但这些是标准肌醇六磷酸酶测定条件，即pH5.0、37℃、30分钟。之后样品均在同样的测定条件下测定。实施例6从桧状青霉中克隆和分析肌醇六磷酸酶基因片段我们设计了两个引物以从该真菌靶标中扩增肌醇六磷酸酶基因片段(表7)。根据已克隆的肌醇六磷酸酶基因(黑曲霉、烟曲霉、E.nidulans和嗜热放线菌)的DNA序列、克隆的P.hordei肌醇六磷酸酶的基因序列、以及设计的引物CS1和N1的序列，我们设计了CS11。对于该引物，每个密码子的头两个碱基均十分保守。第三个碱基基于发表的DNA序列中显示的偏倚性，尤其是基于P.hordei序列中处于第三位的碱基来选择。CS12根据发表的肌醇六磷酸酶序列中的保守氨基酸基序YADF/SHDN、以及P.hordei肌醇六磷酸酶基因的推导氨基酸序列来设计。表7.根据真菌肌醇六磷酸酶中保守序列设计的简并引物的序列F指正链上的正向引物(5’→3’)；R指负链上的反向引物。对桧状青霉DNA的基因组样品进行PCR，并扩增产生一段具有预期大小即约800bp的片段。将该片段克隆在pTT载体中，并按标准方法转化大肠杆菌XL1-blue细胞。对选出的转化体进行筛选，并分离质粒DNA。将选出的具有正确大小插入片段的克隆送至MWG-Biotech作测序。一个克隆即CS142含有与肌醇六磷酸酶有高度同源性的序列。推导的氨基酸序列显示，克隆的此片段(853bp)来自肌醇六磷酸酶基因。图17描述了此桧状青霉片段的基因组序列和推导的氨基酸序列。它在此区域有预期数目的Cys残基(3)，它还含有对于肌醇六磷酸酶结构和功能关键的所有基序，值得注意的有·RHGARYP·3×Cys·HD(位于YADFTHDN中)此处还存在许多十分保守的其它区域(见图5的比对)，采用此比对进行的％一致性分析显示，桧状青霉与P.hordei肌醇六磷酸酶有约51％的一致性。此桧状青霉肌醇六磷酸酶片段(283个氨基酸)占整个肌醇六磷酸酶的约65％。在中等严紧性条件(3×SSC)下，此桧状青霉片段对黑曲霉、P.hordei、桧状青霉和短密青霉的消化物作的Southern分析显示，仅与桧状青霉消化物产生杂交。当然，应当理解，可以对上述优选的实施方案进行各种修改和改变。因此，以上的详细说明应在以下旨在定义本发明范围的权利要求书(包括所有的等同权利要求)中进行理解。权利要求1.来自青霉属真菌来源的分离的多核苷酸，该多核苷酸含有编码具有肌醇六磷酸酶活性的酶的核苷酸序列。2.权利要求1的多核苷酸，其中所述真菌来源选自桧状青霉和Penicilliumhordei。3.权利要求1的多核苷酸，其中所述酶含有与SEQIDNO4中所公开氨基酸序列有至少70％一致性、任选地至少80％一致性的氨基酸序列。4.分离的多核苷酸，其含有如下核苷酸序列，其中所述核苷酸序列(i)与SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公开核苷酸序列有至少55％的一致性、任选地至少65％的一致性，或(ii)能够与来源于SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公开核苷酸序列的探针在中等至高严紧性条件下杂交，或(iii)与SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公开核苷酸序列互补。5.权利要求4的多核苷酸，其中所述核苷酸序列与SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公开核苷酸序列有至少75％的一致性、任选地至少85％的一致性。6.编码具有肌醇六磷酸酶活性的酶的分离多核苷酸，其中该酶来自青霉属来源。7.权利要求6的多核苷酸，其中所述酶包含与SEQIDNO4中所公开氨基酸序列有至少70％一致性、任选地至少80％一致性的氨基酸序列。8.权利要求6的多核苷酸，其中所述多核苷酸(i)与SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公开核苷酸序列有至少55％的一致性、任选地至少65％的一致性，或(ii)能够与来源于SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公开核苷酸序列的探针在中等至高严紧性条件下杂交，或(iii)与SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公开核苷酸序列互补。9.表达结构，其含有如下多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列(i)与SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公开核苷酸序列有至少55％的一致性、任选地至少65％的一致性，或(ii)能够与来源于SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公开核苷酸序列的探针在中等至高严紧性条件下杂交，或(iii)与SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公开核苷酸序列互补。10.包含权利要求9的表达结构的载体。11.转化了权利要求10的载体的宿主细胞。12.用于检测编码来自微生物来源、具有肌醇六磷酸酶活性的酶的核酸序列的探针，其含有(i)与SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公开核苷酸序列有至少55％一致性、任选地至少65％一致性的核苷酸序列，或(ii)能够与包含SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公开序列的多核苷酸在中等至高严紧性条件下杂交的核苷酸序列，或(iii)与SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3中所公开核苷酸序列互补的核苷酸序列。13.权利要求12的探针，其中所述微生物来源是真菌来源。14.权利要求13的探针，其中所述真菌来源是青霉属的种。15.包含具有肌醇六磷酸酶活性的酶在内的食物或动物饲料，其中所述酶含有与SEQIDNO4中所公开氨基酸序列有至少70％一致性、任选地至少80％一致性的氨基酸序列。16.包含具有肌醇六磷酸酶活性的酶在内的食物或动物饲料，其中所述酶来自选自Penicilliumhordei和桧状青霉的真菌来源。17.分离的肌醇六磷酸酶，其中所述酶是从选自桧状青霉和P.hordei的真菌中获得的，并具有以下理化性质(1)分子量约45-55kDa(未糖基化的)；和(2)专一性肌醇六磷酸。18.制备具有肌醇六磷酸酶活性的酶的方法，包括(a)提供转化了含有权利要求4所定义多核苷酸的表达载体的宿主细胞；(b)在适于所述转化的宿主细胞产生所述肌醇六磷酸酶的条件下培养所述转化的宿主细胞；和(c)回收所述肌醇六磷酸酶。19.权利要求18的方法，其中所述宿主细胞是曲霉属的种。20.从肌醇六磷酸中分离磷的方法，包括用含有与SEQIDNO4中所公开氨基酸序列有至少70％一致性、任选至少80％一致性的氨基酸序列的酶处理所述肌醇六磷酸。21.从肌醇六磷酸中分离磷的方法，包括用权利要求17所定义的酶处理所述肌醇六磷酸。22.权利要求1的多核苷酸，其中所述酶包含与图17中所公开氨基酸序列有至少70％一致性、任选地至少80％一致性的氨基酸序列。23.分离的多核苷酸，其包含如下核苷酸序列，其中所述核苷酸序列(i)与图17中所公开核苷酸序列有至少55％的一致性、任选地至少65％的一致性，或(ii)能够与来源于图17中所公开核苷酸序列的探针在中等至高严紧性条件下杂交，或(iii)与图17中所公开核苷酸序列互补。24.权利要求23的多核苷酸，其中所述核苷酸序列与图17中所公开核苷酸序列有至少85％的一致性。25.权利要求6的分离的多核苷酸，其中该酶来源于桧状青霉或Penicilliumhordei。26.权利要求25的多核苷酸，其中所述酶包含与图17中所公开氨基酸序列有至少70％一致性、任选地至少80％一致性的氨基酸序列。27.权利要求25的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(i)与图17中所公开核苷酸序列有至少55％一致性、任选地至少65％一致性的核苷酸序列，或(ii)能够与来源于图17中所公开核苷酸序列的探针在中等至高严紧性条件下杂交的核苷酸序列，或(iii)与图17中所公开核苷酸序列互补的核苷酸序列。28.含有多核苷酸的表达结构，其中所述多核苷酸包含(i)与图17中所公开核苷酸序列有至少55％一致性、任选地至少65％一致性的核苷酸序列，或(ii)能够与来源于图17中所公开核苷酸序列的探针在中等至高严紧性条件下杂交的核苷酸序列，或(iii)与图17中所公开核苷酸序列互补的核苷酸序列。29.包含权利要求28的表达结构在内的载体。30.转化了权利要求29的载体的宿主细胞。31.用于检测编码来自微生物来源、具有肌醇六磷酸酶活性的酶的核酸序列的探针，其含有(i)与图17中所公开核苷酸序列有至少55％一致性、任选地至少65％一致性的核苷酸序列，或(ii)能够与包含图17中所公开序列的多核苷酸在中等至高严紧性条件下杂交的核苷酸序列，或(iii)与图17中所公开核苷酸序列互补的核苷酸序列。32.权利要求31的探针，其中所述微生物来源是真菌来源。33.权利要求32的探针，其中所述真菌来源是青霉属的种。34.包含具有肌醇六磷酸酶活性的酶在内的食物或动物饲料，其中所述酶包含与图17中所公开氨基酸序列有至少70％一致性、任选地至少80％一致性的氨基酸序列。35.制备具有肌醇六磷酸酶活性的酶的方法，包括(a)提供转化了含有权利要求23所定义多核苷酸的表达载体的宿主细胞；(b)在适于所述转化的宿主细胞产生所述肌醇六磷酸酶的条件下培养所述转化的宿主细胞；和(c)回收所述肌醇六磷酸酶。36.权利要求35的方法，其中所述宿主细胞是曲霉属的种。37.从肌醇六磷酸中分离磷的方法，包括用(i)具有肌醇六磷酸水解酶活性并(ii)包含与图17中所公开氨基酸序列有至少65％一致性、任选至少70％一致性的氨基酸序列的酶处理所述肌醇六磷酸。38.来源于青霉属种，任选地桧状青霉或P.hordei的酶；所述酶由能够与SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、或图17中所示多核苷酸序列在中等至高严紧性条件下杂交的核苷酸序列编码；所述酶具有一或多个以下理化性质(1)分子量约45-60kDa(未糖基化的)；(2)对植酸盐、植酸或肌醇六磷酸、和/或其低级磷酸衍生物专一的活性；(3)理论pI为约7-7.6；任选地，约7.3；(4)最适pH处于约4.5-5.5范围内，任选地约5；和/或(5)最适环境温度处于约40-约45℃范围内；任选地，42-44℃。全文摘要本发明提供分离自青霉属、编码具有肌醇六磷酸酶活性的酶的新DNA。还提供从含有编码具有肌醇六磷酸酶活性的酶的DNA的生物中分离该DNA、将该DNA转化至适合宿主生物中、表达该转化DNA、和在饲料中将该表达的肌醇六磷酸酶蛋白质用作添加剂的方法。文档编号C12N15/55GK1451039SQ00812822公开日2003年10月22日申请日期2000年8月11日优先权日1999年8月13日发明者C·F·斯塔福德,A·P·J·特林茨,J·L·布卢克曼申请人:曼彻斯特维多利亚大学,绿地及环境研究学院