专利名称：L－表－2－肌醇单酮新的制备方法和表肌醇新的制备方法
技术领域：
本发明涉及L-表-2-肌醇单酮的一步制备法，L-表-2-肌醇单酮本身具有生物活性，并且作为合成药物和其它物质的原料也具有很高的价值，在该方法中使用便宜的原料化合物内消旋肌醇，并在不涉及任何化学合成方法的微生物作用下转化为L-表-2-肌醇单酮。本发明还涉及表肌醇的有效制备方法，表肌醇本身具有生物活性，并且适于用作药物，在该方法中，使L-表-2-肌醇单酮化学还原。
L-表-2-肌醇单酮是已知物质，由下列平面结构式(B)表示 或由下列立体结构式(B′)表示 此外，已知表肌醇是化学合成物质，由下列平面结构式(C)表示 或由下列立体结构式(C′)表示 表肌醇是内消旋肌醇的一种立体异构体。
通常已知，肌醇单酮(也称作五羟基环己酮或脂环族己酮糖)已经由下列方法合成肌醇的生物氧化[A.J.Kluyver和A.Boezaardt″Rec.Tray.Chim.″58，p.956(1939)]，肌醇的酶促氧化[L.Anderson等″Arch.Biochem.Biophys.″78，p.518(1958)]，在铂催化剂存在下用空气氧化肌醇[K.Heyns和H.Paulsen″Chem.Ber.″86，p.833(1953)]，或者用氧化剂例如硝酸氧化肌醇[T.Posternak″Helv.Chim.Acta″19，p.1333(1936)]。
已知的可以通过内消旋肌醇(肌醇中的一种)的生物氧化或酶促氧化制备的肌醇单酮只有一种肌醇单酮，即青蟹肌糖(也称作内消旋肌单酮-2)[A.J.Kluyver和A.Boezaardt″Rec.Trav.Chim.″58，p.956(1939)；L.Anderson等″Arch.Biochem.Biophys.″78，p.518(1958)]。未见任何有关微生物能使内消旋肌醇氧化成为L-表-2-肌醇单酮的报道。L-表-2-肌醇单酮适于用作合成D-手肌醇(缩写为DCI)的原料[参见U.S.P No.5,406,005]。DCI适于用作治疗胰岛素耐药性糖尿病的药物(WO 90/10439)，并且预期可以用作改善多囊卵巢综合征的药物[J.A.Nestler等″NEW Engl.J.Med.″340，p.1314(1999)]。已知的有关L-表-2-肌醇单酮制备方法的报道有(1)合成L-表-2-肌醇单酮的方法在氧化铂催化剂存在下，用硝酸将内消旋肌醇氧化形成DL-表-2-肌醇单酮(即(±)-表-2-肌醇单酮)的外消旋混合物，然后在氧化铂催化剂存在下用氢使所得外消旋混合物还原以生成表肌醇，并用微生物弱氧化醋杆菌(Acetobacter snboxydans)使表肌醇微生物氧化以产生L-表-2-肌醇单酮(T.Posternak″Helv.Chim.Acta″29，p.1991(1946))。还报道了(2)合成L-表-2-肌醇单酮的方法在由D-葡糖醛酸化学合成葡糖二醛糖(glucodialdose)后，通过偶姻-缩合可以制备该化合物中的一种(U.S.5,406,005)。
肌醇是由环己烷衍生的六元醇的通用名，并且肌醇包括九种立体异构体。已经发现，天然存在的肌醇包括五种肌醇，即内消旋肌醇、D-手肌醇(chiro-inositol)、L-手肌醇、粘液肌醇和青蟹肌醇(scyllo-inositol)。其他肌醇包括表肌醇、异肌醇(allo-inositol)、新肌醇(neo-inositol)和顺肌醇(cis-inositol)。后四种肌醇是非天然存在的肌醇，它们是通过化学合成制备。在非天然存在的肌醇中，表肌醇预期可用作改善精神抑郁和焦虑综合征的药物[R.H.Belmaker等，WO 99/22727(PCT专利申请PCT/IL/00523)；和R.H.Belmaker等，″Int.J.Neuropsychopharmacol.″ Vol.1，p.31(1998)]。
已经报道的已知的表肌醇的制备方法是(1)合成表肌醇的方法，包括用硝酸将内消旋肌醇氧化形成D，L-表-2-肌醇单酮外消旋混合物，然后在氧化铂催化剂存在下用氢还原[T.Posternak″Helv.Chim.Acta″29.p.1991(1946)]；(2)合成表肌醇的方法，包括用锇酸将环己二烯的二元醇氧化[T.Tschamber等，″Helv.Chim.Acta″75，p.1052(1992)]；(3)合成表肌醇的方法，包括将四氢苯醌氢化[L.OdierEP专利申请公开524082]；和(4)合成表肌醇的方法，包括适当保护粘液肌醇，然后将其被保护的衍生物联合氧化与还原[K.E.Espelia等，″Carbohydrate Res.″46，p.53(1976)]。还有一种已知的合成表肌醇的方法，包括用合适的还原剂使葡萄糖或半乳糖联合进行Ferrier环化反应和还原反应[Takahashi等，″J.Org.Syn.Chem.Soc.，Japan″58，p.120(2000)]。
但是，这些已知的L-表-2-肌醇单酮和表肌醇的合成方法不能令人满意地用于大规模制备表肌醇，因为已知的方法存在如下问题它们操作复杂，涉及环境污染和/或造价太高。因此，一直需要寻求新的方法，该方法可以以工业规模生产L-表-2-肌醇单酮，容易操作、高效，并且该新的方法可以容易并高效地生产表肌醇。本发明的一个目的是提供这样新的制备L-表-2-肌醇单酮的方法和制备表肌醇的方法，它们满足上述要求并且显示出很多优点，而且它们可以有效地生产L-表-2-肌醇单酮或表肌醇。
此外，我们调查了是否具有将内消旋肌醇转化为L-表-2-肌醇单酮活性或能力的微生物广泛存在于自然界中。结果发现并证实，具有将内消旋肌醇氧化并转化为L-表-2-肌醇单酮的高活性或能力的某些微生物菌株存在于下列许多分类学品种中属于革兰氏阴性菌的各种革兰氏阴性菌，例如属于假单胞菌科的黄单胞菌属(Xanthomonas)或假单胞菌属(Pseudomonas)的革兰氏阴性菌；属于醋酸杆菌科(Acetobacteraceae)的醋酸杆菌属(Acetobacter)或葡糖杆菌属(Gluconobacter)的细菌；属于根瘤菌科(Rhizobiaceae)的土壤杆菌属(Agrobacterium)的细菌；属于肠杆菌科(Enterobacteriacea)的欧文氏菌属(Erwinia)、肠杆菌属(Enterobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)和耶尔森氏菌属(Yersinia)的细菌；以及属于巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)的巴斯德氏菌属(Pasteurella)或嗜血杆菌属(Haemophilus)的细菌。在这些微生物菌株中，尤其可以提及的是上述黄单胞菌(Xanthomonas sp.)AB10119，它是具有将内消旋肌醇氧化并转化为L-表-2-肌醇单酮的高活性或能力的微生物菌株的一个实例。还可以列举的是假单胞菌属菌株(Pseudomonas sp.)AB 10215和欧文氏菌属菌株(Erwiniasp.)10135，它们均是我们从土壤样品中新近分离出来的。
根据本发明人的上述发现，我们设计了一种L-表-2-肌醇单酮的新的制备方法，如下所述。因此，我们现在发现，当微生物黄单胞菌(Xanthomonassp.)AB10119或假单胞菌属菌株(Pseudomonas sp.)AB 10215和欧文氏菌属菌株(Erwinia sp.)10135或其他合适的菌株在需氧条件下，无论是在含有一定量内消旋肌醇、常用碳源和常用氮源的液体培养基中，或是在含有含有一定量内消旋肌醇(其中一部分可以用作碳源)并含有氮源(根据培养条件，如果所述的所用氮源是有机天然氮源，则一部分氮源也可以用作碳源)、而不含任何常用碳源的液体培养基中进行培养，均可以有效地由内消旋肌醇产生L-表-2-肌醇单酮，并使L-表-2-肌醇单酮积聚在所得培养肉汤中。我们还发现，按照上述L-表-2-肌醇单酮新的制备方法，通过从所述培养肉汤中除去微生物的微生物细胞，可以使在所述培养肉汤中积聚的L-表-2-肌醇单酮保持溶解在培养肉汤上清液中，并且通过下述方法可以以高纯度产物的形式、有效地回收L-表-2-肌醇单酮用离子交换树脂如阳离子交换树脂、阴离子交换树脂等处理所述培养肉汤上清液，或者用活性炭处理所述培养肉汤上清液，或者处理所述培养肉汤上清液使L-表-2-肌醇单酮结晶，或者采用这些处理的任何组合方式。
此外，本发明人还进行了另一项研究，结果发现，从上述含有L-表-2-肌醇单酮(该L-表-2-肌醇单酮是在所述培养基中培养微生物产生和积聚的)的培养肉汤中除去微生物细胞，得到培养肉汤上清液，并向含有L-表-2-肌醇单酮的所得培养肉汤上清液中直接加入合适量的还原剂如硼氢化钠或任何与硼氢化钠等同的氢化物型还原剂，然后将L-表-2-肌醇单酮与还原剂反应，可以有效地将L-表-2-肌醇单酮还原成表肌醇。换句话说，我们发现，通过在培养肉汤上清液中用所述还原剂使L-表-2-肌醇单酮还原，然后从所述培养肉汤上清液中分离L-表-肌醇单酮，可以将L-表-2-肌醇单酮有效地还原成表肌醇。
我们还进行了以下各种试验用能够通过使内消旋肌醇氧化将内消旋肌醇转化为L-表-2-肌醇单酮的革兰氏阴性菌、特别是上述黄单胞菌菌株(Xanthomonas sp.)AB 10119处理内消旋肌醇的方法；以及无需从所述培养肉汤上清液中分离L-表-2-肌醇单酮，直接用合适的还原剂处理存在于培养肉汤上清液中的L-表-2-肌醇单酮，以在所述培养肉汤上清液中产生表肌醇的方法。由这些试验我们得到许多发现。本发明是基于我们所得到的这些发现完成的。
本发明第一方面提供了L-表-2-肌醇单酮的制备方法，其特征在于该方法包括将内消旋肌醇与能够使内消旋肌醇转化为L-表-2-肌醇单酮的微生物反应，由此将内消旋肌醇转化为L-表-2-肌醇单酮，以产生L-表-2-肌醇单酮。
按照本发明第一方面的L-表-2-肌醇单酮的制备方法可以通过下面所述的两种方法(A)和(B)之一实施。
方法(A)包括在需氧条件下，在含有一定量内消旋肌醇、碳源和氮源的液体培养基中，培养能够使内消旋肌醇转化为L-表-2-肌醇单酮的微生物，由此使所述微生物与内消旋肌醇反应，并在所得培养肉汤中产生和积聚L-表-2-肌醇单酮，然后收获所述培养肉汤；以及从所得培养肉汤中除去所述微生物的微生物细胞，由此得到含有在其中产生并积聚的L表-2-肌醇单酮的培养肉汤上清液，然后用离子交换树脂、或者用活性炭处理所述培养肉汤上清液，或者处理所述培养肉汤上清液使L-表-2-肌醇单酮结晶，或者采用这些处理的任何组合方式，由所得培养肉汤上清液中回收L-表-2-肌醇单酮。
方法(B)包括在液体培养基中培养能够使内消旋肌醇转化为L-表-2-肌醇单酮的微生物，然后从所得培养肉汤中分离所述微生物的微生物细胞；将所分离的微生物细胞加至含有溶解于其中的一定量内消旋肌醇的缓冲液或液体培养基中，并使所加入的微生物细胞与在所述缓冲液或所述液体培养基中的内消旋肌醇反应，在所得反应溶液或在所得培养肉汤中将内消旋肌醇转化为L-表-2-肌醇单酮；以及通过用离子交换树脂、或者用活性炭处理所述反应溶液或所述培养肉汤，或者处理所述反应溶液或所述培养肉汤使L-表-2-肌醇单酮结晶，或者采用这些处理的任何组合方式，回收在所述反应溶液或所述培养肉汤中产生并积聚的L-表-2-肌醇单酮。
在本发明第一方面的方法中所用的微生物可以是任何微生物菌株，只要其具有使内消旋肌醇转化为L-表-2-肌醇单酮的活性或能力。
如上所列举的，有许多细菌可以由内消旋肌醇产生L-表-2-肌醇单酮，如上文所述。例如如上面所解释的、我们从土壤样品中分离得到的菌株AB10119、菌株AB 10215和菌株AB 10135，并且它们是用于本发明方法中最有效的菌株。这三种菌株的微生物学性质示于下面表1a、表1b、表1c和表1d中。
我们顺便按照题为Shin Saikin Baichigaku Koza(2nd Edition，published by Kindai Shuppan)、《医学微生物鉴定指南》(A Guide onIdentification of Medical Bacteria(2nd Edition，published by KindaiShuppan))和《细菌学实验手册》(A Manual on Practice of Bacteriology(published by Maruzen Publishing Company))的日本教科书的方法进行了试验，以鉴别上述三种微生物。另外，参照Bergey′s Manual of SystematicBacteriology Vol.1(1984)的方法，对我们的上述试验结果进行评价，以识别所分离的细菌菌株。表1a-1
表1a-2
表1b
表1c
表1d
上述AB 10119菌株的形态学特征主要为该菌株是革兰氏阴性柱状，形成有黄色色素沉着的、0.4-0.6×0.6-4.0μm大小的菌落。该AB 10119菌株是催化酶阳性和氧化酶阴性的，并且在需氧条件下分解葡萄糖产生酸。该AB 10119菌株在基本培养基中生长不良，但是向基本培养基中加入蛋氨酸则获得该菌株的良好生长。该AB 10119菌株不具有还原硝酸盐的能力，并且对0.01％甲基绿和硫堇敏感。在菌株AB 10119细胞中的辅酶Q类型是Q8，并且DNA的GC含量是68％。
总结AB 10119菌株的这些形态学性质，可以判断该菌株是属于黄单胞菌属的微生物菌株。按照Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology Vol.1，pp.119-210(1984)，已知的黄单胞菌属细菌包括五种，即田野黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、草莓黄单胞菌(Xanthomonas frapariae)、甘蔗白纹病黄单胞菌(Xanthomonas albilineans)、地毯草黄单胞菌(Xanthomonas axonopodis)和葡萄酒黄单胞菌(Xanthomonas ampelina)。
将AB 10119菌株与上述五种已知菌株的形态学的性质进行比较，结果表明，菌株AB 10119最类似于已知的田野黄单胞菌菌株。然而，由于该AB 10119菌株的形态学性质与那些田野黄单胞菌菌株不完全一致，因此我们将这种新的菌株指定为黄单胞菌(Xanthomonas sp.)AB 10119，以使其与已知的所述菌株区别开来，并且我们已经将其保藏在经认可的日本保藏机构，国立生命科学和人体技术研究所，(National Institute of Bioscienceand Human Technology，Agency of Industrial Science and Technology，座落于1-3，1-chome，Higashi，Tsukuba-City，Ibaraki Prefecture，Japan)，保藏号为FERMP-17382(保藏日期是1999年5月7日)。然后，根据布达佩斯条约，该AB 10119菌株从2000年5月23日起以保藏号FERM BP-7168再保藏于同一保藏机构。
上述AB 10215菌株的形态学特征主要为该菌株是革兰氏阴性柱状，形成有淡黄色色素沉着的、0.3-0.5×0.6-6.5μm大小的菌落。该AB 10215菌株是催化酶阳性和氧化酶阴性的，并且在需氧条件下分解葡萄糖产生酸。该AB 10215菌株在基本培养基中生长良好，具有还原硝酸盐的能力，并且对0.01％甲基绿和硫堇敏感。在菌株AB 10215细胞中的辅酶Q类型是Q8，并且DNA的GC含量是68％。
总结AB 10215菌株的这些形态学性质，该菌株呈现为最类似于已知的Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology Vol.1，pp.140-199(1984)中所述的嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonas maltophilia)菌株。然而，由于该AB10215菌株的形态学性质与已知的嗜麦芽假单胞菌菌株不完全一致，因此我们将这种新的菌株指定为假单胞菌(Xanthomonas sp.)AB 10215，以使其与已知的所述菌株区别开来，并且我们已经将其保藏在经认可的日本保藏机构，国立生命科学和人体技术研究所(座落于1-3，1-chome，Higashi，Tsukuba-City，Ibaraki Prefecture，Japan)，保藏号为FERM P-17804(保藏日期是2000年3月31日)。然后，根据布达佩斯条约，该AB 10215菌株从2000年5月23日起以保藏号FERM BP-7170再保藏于同一保藏机构。
上述AB 10135菌株的形态学特征主要为该菌株是革兰氏阴性柱状，形成有乳白色色素沉着的、0.4-0.6×0.8-2.0μm大小的菌落。该AB 10135菌株在需氧和厌氧条件下均分解葡萄糖，但是与其在需氧条件下生长相比，该AB 10135菌株在厌氧条件下生长非常不好。此外，该AB 10135菌株是催化酶阳性和氧化酶阴性的，并且在需氧条件下分解葡萄糖产生酸。该AB10135菌株在普通营养琼脂培养基中生长极差，但是在营养琼脂培养基中加入5％蔗糖可以获得非常大量的生长。在该菌株细胞中的辅酶Q类型是Q8，并且DNA的GC含量是68％。
总结AB 10135菌株的这些形态学性质，可以判断该菌株属于欧文氏菌属。按照Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology Vol.1，pp.469-476(1984)，已知的欧文氏菌属细菌菌株分为15种，但是AB 10135菌株与任何一种已知的菌株均不完全一致，因此我们将这种新的菌株指定为欧文氏菌(Erwinia sp.)AB 10135，以使其与已知的欧文氏菌株区别开来，并且我们已经将其保藏在经认可的日本保藏机构，国立生命科学和人体技术研究所，(座落于1-3，1-chome，Higashi，Tsukuba-City，Ibaraki Prefecture，Japan)，保藏号为FERM P-17803(保藏日期是2000年3月31日)。然后，根据布达佩斯条约，该AB 10135菌株从2000年5月23日起以保藏号FERMBP-7169再保藏于同一保藏机构。
下面更详细地描述本发明第一方面的两种方法，即方法(A)和方法(B)。
在方法(A)中，第一步是在需氧条件下，在含有一定量内消旋肌醇、碳源和氮源的液体营养培养基中，培养能够使内消旋肌醇转化为L-表-2-肌醇单酮的微生物，以在所得培养肉汤中产生和积聚L-表-2-肌醇单酮。
对于该方法所述第一步中使用的液体培养基的组成没有特别限制，只要其能够达到预期的目的。所用液体培养基可以是任何培养基，其中含有一定量的内消旋肌醇作为转化成L-表-2-肌醇单酮的原料，此外，其中含有碳源、氮源、天然有机营养源、无机盐及其他成分。既可以使用已知的合成培养基、也可以使用已知的天然培养基。可取的是，该步骤所用液体培养基含有0.1％-40％、优选20％-30％内消旋肌醇，含有0.1％-20％、优选0.5％-5％葡萄糖、蔗糖、麦芽糖或淀粉作为碳源，并且含有0.01％-5.0％，优选0.5％-2.0％酵母提取物、胨、酪蛋氨基酸、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵或尿素作为氮源等。此外，有益的是，如果需要，向该液体培养基中加入能够产生钠、钾、钙、镁、钴、锰、锌、铁、铜、钼、磷酸根、硫酸根或其他离子的无机盐。当所用微生物在所得培养肉汤中氢离子的浓度调节至pH4-10、优选5-9的条件下进行培养时，可以有效地产生L-表-2-肌醇单酮。
微生物的培养条件可以根据微生物菌株和所用培养基的性质发生变化，但是培养温度可以是5-40℃、优选20-37℃。还优选在需氧条件下，通过振摇液体培养基或向液体培养基中吹入空气等方法对微生物进行培养。培养周期可以是内消旋肌醇在所得培养肉汤中完全消耗、并且在所得培养肉汤中所产生和积聚的L-表-2-肌醇单酮的量达到最大的一段时间。培养周期通常为1-14天，优选3-10天。因此，在上述方法的第一步中可以得到含有L-表-2-肌醇单酮的培养肉汤。
然后进行第二步骤，其中从培养肉汤中回收所需的L-表-2-肌醇单酮。为此回收目的，可以采用任何从培养肉汤中分离与纯化任何普通水溶性和中性物质的常用方法。因此，首先从含有L-表-2-肌醇单酮的所得培养肉汤中除去本发明所用微生物的微生物细胞，然后用活性炭或者用离子交换树脂处理所得培养肉汤上清液，由此除了L-表-2-肌醇单酮之外，几乎可以从培养肉汤上清液中除去所有杂质。但是使用OH-型强碱性阴离子交换树脂不可能有效地进行离子交换树脂处理，因为OH-型强碱性阴离子交换树脂可以使L-表-2-肌醇单酮化学分解。此后，可以从已经用活性炭或离子交换树脂处理过的培养肉汤上清液中分离所需的L-表-2-肌醇单酮，在经过这种方式处理的所述培养肉汤上清液中，L-表-2-肌醇单酮可以从溶液中结晶出来，并且如果需要，可以进一步重结晶。
为了从所述培养肉汤上清液中有效地回收L-表-2-肌醇单酮，更优选的是采取下列步骤，包括将含有所积聚L-表-2-肌醇单酮的培养肉汤上清液通过强酸性阳离子交换树脂、例如Duolite(注册商标)C-20(H+型)柱，以除去不需要的成分，收集柱流出液，用去离子水洗涤该柱，收集所得水洗液，将所述流出液与水洗液合并，将所得合并的溶液过弱碱性阴离子交换树脂、例如Duolite(注册商标)A368S(游离碱形式)柱，收集所得后一柱的流出液，用去离子水洗涤后一柱，收集所得水洗液，并将后一流出液与后一水洗液合并，得到含有L-表-2-肌醇单酮、而基本上不含任何杂质的水溶液。然后可以将所得水溶液浓缩，得到L-表-2-肌醇单酮的浓缩溶液，然后向其中加入适当量的乙醇。将含有L-表-2-肌醇单酮和乙醇的所得混合物在室温或更低温度下放置过夜，L-表-2-肌醇单酮可以以纯的结晶形式结晶出来。在本发明第一方面的上述方法(B)中，进行几个步骤，包括在培养基中培养具有所需能力的微生物，从所得培养肉汤中分离所述微生物的微生物细胞，并将分离的微生物细胞加至含有内消旋肌醇的缓冲溶液或液体培养基中，然后使所述微生物细胞与内消旋肌醇在所述缓冲溶液或所述液体培养基中反应，以在由所述缓冲溶液或所述液体培养基得到的反应溶液中产生L-表-2-肌醇单酮。
作为内消旋肌醇与微生物细胞反应步骤中所用的微生物细胞，可以使用从方法(A)的第一步骤得到的培养肉汤中分离收集的细胞，或者可以使用在适当的培养条件下、在独立的步骤中培养所述微生物获得的细胞。按照分离微生物细胞的已知方法，通过离心、过滤或采用其他方法处理培养肉汤，可以从培养肉汤中有效地收集微生物细胞。
作为内消旋肌醇与微生物细胞反应中所用的反应培养基，既可以使用液体培养基，又可以使用缓冲溶液。作为所述液体培养基，可以使用与前述方法(A)第一步骤中所用的培养基具有类似组成的培养基。还可以使用如下的液体培养基，该培养基由所述培养肉汤上清液组成，所述培养肉汤上清液是通过在分离的步骤中培养所述微生物，然后从所得培养肉汤中除去微生物的微生物细胞获得的。可以使用浓度为10-500mM、优选20-100mM的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液或Good′s CHES缓冲液等作为所述的缓冲液。内消旋肌醇在内消旋肌醇溶解于缓冲液或液体培养基中的溶液中的起始浓度优选为0.1-40％(重量)。
内消旋肌醇与微生物细胞有效反应的反应条件可以根据所用微生物菌株和培养基或缓冲液的性质而变化。通常，反应温度可以是5-60℃、优选10-45℃，反应时间可以是1-50小时，优选3-48小时。液体培养基或缓冲液的pH可以是2-10，优选3-9。
在内消旋肌醇与微生物细胞的反应完成后，可以按照与上述方法(A)第二步骤中所用同样的方法，从所得反应溶液中分离目的产物L-表-2-肌醇单酮。
本发明第二方面提供了表肌醇的制备方法，其特征在于该方法包括在含水反应介质中，将能够使内消旋肌醇转化为L-表-2-肌醇单酮的微生物与内消旋肌醇反应，以在所述含水反应培养基中生成L-表-2-肌醇单酮，由此得到含有所述微生物的微生物细胞的以及在其中产生的L-表-2-肌醇单酮的所得反应溶液，从所述反应溶液中除去微生物细胞，得到含有L-表-2-肌醇单酮的反应溶液滤液，向含有L-表-2-肌醇单酮的所述反应溶液滤液中直接加入适当的还原剂，并使还原剂与L-表-2-肌醇单酮反应，生成表肌醇和内消旋肌醇。
本发明第二方面的该方法在实践中可以通过下列方法(C)、(D)和(E)三种方法之一进行。
本发明第二方面的方法(C)包括步骤一(第一阶段)，在需氧条件下、在由含有一定量内消旋肌醇、碳源和氮源的液体培养基组成的含水基质中，按照与本发明第一方面方法的方法(A)中所述相同的培养微生物的步骤，培养能够将活性内消旋肌醇转化为L-表-2-肌醇单酮的微生物，以使内消旋肌醇与所述微生物在液体反应基质或所得培养肉汤中反应，由此将内消旋肌醇转化为L-表-2-肌醇单酮，并在所述培养肉汤中产生和积聚L-表-2-肌醇单酮，如此得到培养肉汤，即含有所述微生物的微生物细胞和L-表-2-肌醇单酮的所得反应溶液；和步骤二(第二阶段)，从所得到的培养肉汤、即所述反应溶液中除去所述微生物的微生物细胞，由此得到培养肉汤上清液，即含有所产生的L-表-2-肌醇单酮(无需进行L-表-2-肌醇单酮的分离)的反应溶液滤液；以及步骤三(第三阶段)，向所得培养肉汤上清液(即所述反应溶液滤液)中直接加入碱金属硼氢化物、碱金属三烷氧基硼氢化物或碱金属硼氰化物作为还原剂，使L-表-2-肌醇单酮与该还原剂进行还原反应，由此在所述培养肉汤上清液(即所述反应溶液滤液)中产生表肌醇和内消旋肌醇；第四步(第四阶段)，从所得还原反应的反应溶液、即含有所产生的表肌醇和内消旋肌醇的培养肉汤上清液中回收表肌醇和内消旋肌醇；以及第五步(第五阶段)，将所回收的表肌醇与内消旋肌醇彼此分离。
本发明第二方面的方法(D)包括步骤一(第一阶段)，在需氧条件下、在含有碳源和氮源的液体培养基中，按照与本发明第一方面方法的方法(B)中所述相同的培养微生物的步骤，培养能够将活性内消旋肌醇转化为L-表-2-肌醇单酮的微生物，由此得到所述微生物的培养肉汤，然后从所得培养肉汤中分离所述微生物的微生物细胞；步骤二(第二阶段)，在由含水缓冲液或液体培养基组成的含水反应基质中，将所分离的所述微生物的微生物细胞与内消旋肌醇反应，由此在所述液体反应基质中产生L-表-2-肌醇单酮；步骤三(第三阶段)，从所得到的含有所述微生物的微生物细胞以及在其中生成的L-表-2-肌醇单酮的所得含水反应溶液中除去所述微生物的微生物细胞，由此得到已经除去微生物细胞、而L-表-2-肌醇单酮仍溶解于其中的所得反应溶液滤液；步骤四(第四阶段)，向所述反应溶液滤液中加入碱金属硼氢化物、碱金属三烷氧基硼氢化物或碱金属硼氰化物作为还原剂，使L表-2-肌醇单酮与所述还原剂进行还原反应，由此在所述反应溶液滤液中产生表肌醇和内消旋肌醇；第五步(第五阶段)，从所得含有所产生的表肌醇和内消旋肌醇的还原反应的反应溶液中回收表肌醇和内消旋肌醇；以及第六步(第六阶段)，将所回收的表肌醇与内消旋肌醇彼此分离。
本发明第二方面方法的方法(E)是上述方法(C)和(D)的改进方法。方法(E)包括如下的方法，其中在L-表-2-肌醇单酮与所加入的还原剂进行还原反应之前，进行这样一个预备步骤，即，将由含有L-表-2-肌醇单酮的培养肉汤上清液或反应溶液滤液组成的含水基质的pH调至pH8-12的碱性pH范围；然后进行的步骤是，向含有L-表-2-肌醇单酮和pH8-12的该碱性含水介质中加入碱金属硼氢化物、碱金属三烷氧基硼氢化物或碱金属硼氰化物作为还原剂，使L-表-2-肌醇单酮与所述还原剂进行还原反应。按照方法(E)，可以以表肌醇产率远远大于副产物内消旋肌醇产率的方式产生所需的表肌醇。
本发明第二方面的方法所用的微生物可以与本发明第一方面的方法所用的微生物相同，是能够将内消旋肌醇转化为L-表-2-肌醇单酮的微生物。
下面更详细地解释本发明第二方面方法的上述方法(C)和(E)。
简要地说，在本发明第二方面方法的方法(C)中，第一阶段包括用具有所需能力的微生物接种含有一定量内消旋肌醇的营养液体培养基，在需氧条件下培养接种的微生物，由此转化内消旋肌醇，并在所得培养肉汤中产生和积聚L-表-2-肌醇单酮，收获含有所需L-表-2-肌醇单酮的培养肉汤；第二阶段包括从所收获的培养肉汤中回收微生物细胞，得到含有L-表-2-肌醇单酮的培养肉汤上清液；第三阶段包括向所述培养肉汤上清液中直接加入合适的还原剂、而不从培养肉汤上清液中分离L-表-2-肌醇单酮，然后进行L-表-2-肌醇单酮的还原反应；以及第四阶段包括从所得反应溶液中回收所产生的表肌醇。
因此，本发明第二方面方法的方法(C)由进行第一阶段开始，包括在含有一定量内消旋肌醇的液体培养基中培养具有所需能力的微生物，以使内消旋肌醇转化，并在所得培养肉汤中产生和积聚L-表-2-肌醇单酮，收获含有L-表-2-肌醇单酮的培养肉汤。该第一阶段可以按照与前述方法(A)第一步骤完全相同的方式进行。
在方法(C)的第二阶段，从所述第一阶段收获的培养肉汤中回收所述微生物的微生物细胞，得到含有L-表-2-肌醇单酮的培养肉汤上清液。在随后的第三阶段，将氢化物作为还原剂直接加入所得培养肉汤上清液中之后进行L-表-2-肌醇单酮的还原反应，在所述培养肉汤上清液中产生表肌醇和内消旋肌醇。所用还原剂可以是能够使L-表-2-肌醇单酮在含水基质中还原成表肌醇的那些。可取的还原剂是例如硼氢化钠、硼氢化锂、硼氢化钾、三甲氧基硼氢化钠或氰基硼氢化钠。还原反应可以在0℃至室温的温度范围内进行。当L-表-2-肌醇单酮完全消耗、或者所需反应产物的量达到预期的适当水平时，即为还原反应的终点。因此，在该第三阶段中，得到了含有所产生的表肌醇和内消旋肌醇的培养肉汤上清液作为还原反应的反应溶液。
然后进行第四阶段，即，从第三阶段得到的作为还原反应的反应溶液的培养肉汤上清液中回收所产生的表肌醇和内消旋肌醇。在该回收的第四阶段中，优选下列方法，包括将第三阶段得到的所述含表肌醇和内消旋肌醇的培养肉汤上清液通过强酸性阳离子交换树脂、例如Duolite(注册商标)C-20(H+型)柱，以除去不需要的成分，收集柱流出液，用去离子水洗涤该阳离子交换树脂柱，收集所得水洗液，将所述流出液与水洗液合并，将所得合并的溶液过弱碱性阴离子交换树脂、例如Duolite(注册商标)A113(OH-形式)柱，收集所得后一柱的流出液，用去离子水洗涤后一阴离子交换树脂柱，收集所得水洗液，并将后一流出液与后一水洗液合并，得到含有表肌醇和内消旋肌醇、而基本上不含任何杂质的水溶液。
在方法(C)的最后一步(第五阶段)中，从上述第四阶段中得到的表肌醇和内消旋肌醇的水溶液中将表肌醇和内消旋肌醇彼此分离出来。为了分离这些产物，优选采取如下方法，该方法包括减压浓缩所述表肌醇和内消旋肌醇的水溶液，使所得浓缩物通过强碱性阴离子树脂、例如Amberlite(注册商标)CG-400(OH-型)柱，然后用去离子水洗脱该阴离子树脂柱，分别收集含有大部分内消旋肌醇的洗出液馏分和含有所需表肌醇的洗出液馏分作为独立的馏分。将含有表肌醇的水溶液(洗出液馏分)浓缩，向所得表肌醇浓缩溶液中加入适当量的乙醇。将所得混合物在室温或更低温度下放置过夜，使纯的L-表-2-肌醇单酮产物以结晶的形式结晶出来。
此外，对于方法(C)，如果方法(C)的第四阶段是如下进行，即含有还原反应产生的表肌醇的培养肉汤上清液用系列排列的多个离子交换树脂柱处理，则可以得到含有表肌醇和内消旋肌醇、但是基本上不含杂质的水溶液。根据我们的发现，如果按照下列方法进行方法(C)的第五阶段，可以将表肌醇与内消旋肌醇有效地分离开，所述方法包括将上述含有表肌醇和内消旋肌醇、但是基本上不含杂质的水溶液浓缩；使所得浓缩液通过强酸性阳离子交换树脂柱，该树脂柱含有带磺酸基作为离子交换基团的苯乙烯聚合物(Ca2+型)、例如Diaion(注册商标)UBK 520M(Ca2+型)；由此将表肌醇和内消旋肌醇吸附在所述柱上；然后用去离子水洗脱该柱。
简要地说，在本发明第二方面方法的方法(D)中，第一阶段包括在需氧条件下、在液体营养培养基中，培养具有所需能力的微生物，并从所得培养肉汤中分离所述微生物的微生物细胞，由此得到大量所述的微生物细胞；第二阶段包括，在由含一定量溶解于其中的内消旋肌醇的缓冲液或液体培养基组成的含水反应基质中，将所分离的微生物细胞与内消旋肌醇反应，由此在所述含水反应基质中产生L-表-2-肌醇单酮；第三阶段包括，从所得反应溶液中除去微生物细胞，得到含有L-表-2-肌醇单酮的反应溶液滤液；第四阶段包括，向所述反应溶液滤液中加入合适的还原剂、而无需从所述反应溶液滤液中分离L-表-2-肌醇单酮，使L-表-2-肌醇单酮还原，由此在所述滤液中产生表肌醇和内消旋肌醇；第五阶段包括，从所得还原反应溶液中回收所产生的表肌醇和内消旋肌醇；以及第六阶段包括，将所回收的表肌醇与内消旋肌醇彼此分离。
在方法(D)的第一阶段中，在需氧条件下、在常用的液体培养基中，培养能够将内消旋肌醇转化为L-表-2-肌醇单酮的微生物，并从所得培养肉汤中分离所述微生物的微生物细胞。所分离的微生物细胞用于方法(D)的第二阶段。作为所述微生物细胞，可以使用从前述方法(A)的第一步骤得到的培养肉汤中分离收集的该微生物细胞。也可以使用在适当的培养条件下、在独立的步骤中培养该适用微生物获得的该微生物细胞。通过离心、过滤或采用其他已知方法处理培养肉汤，可以有效地分离和收集微生物细胞。
在方法(D)的第二阶段中，作为内消旋肌醇与微生物细胞反应中所用的液体反应基质，既可以使用含水缓冲液，又可以使用液体培养基。这里所用的液体培养基，可以使用与前述方法(A)第一步骤中所用的类似培养基。可以使用浓度为10-500mM、优选20-100mM的磷酸盐缓冲液、Good′sCHES缓冲液等作为所述的缓冲液。内消旋肌醇在所述含水反应基质中的浓度优选为0.1-30％(重量)。微生物细胞与内消旋肌醇反应的条件可以根据所用微生物、缓冲液或液体培养基的性质而变化。反应温度是5-60℃、优选10-45℃，反应时间是1-50小时，优选3-48小时。用作含水反应基质的缓冲液或液体培养基的pH是2-10，优选pH3-9。微生物细胞与内消旋肌醇在第二阶段的反应得到了含有L-表-2-肌醇单酮的反应溶液。
在方法(D)的第三阶段，采用已知的方法如离心、分离等，从方法(D)第二阶段得到的含L-表-2-肌醇单酮的反应溶液中分离所述微生物的微生物细胞。由此得到含有L-表-2-肌醇单酮的反应溶液滤液。在随后的第四阶段，将氢化物作为还原剂加入含有L-表-2-肌醇单酮的反应溶液滤液中之后进行L-表-2-肌醇单酮的还原反应。由此产生表肌醇和内消旋肌醇。该第四阶段的还原反应可以按照与方法(C)第三阶段所述同样的方式进行。
然后进行第五阶段，即，从上述还原反应所得的含有表肌醇和内消旋肌醇的反应溶液中以水溶液形式回收表肌醇和内消旋肌醇。然后进行从含有表肌醇和内消旋肌醇的所述水溶液中回收表肌醇的第六阶段。该方法(D)的第五和第六阶段可以按照与方法(C)第四和第五阶段所述同样的方式进行。
本发明第二方面方法的上述方法(E)以如下方式进行在进行本发明第二方面方法的方法(C)第二阶段或方法(D)第四阶段即向上述培养肉汤上清液或反应溶液滤液中加入碱金属硼氢化物型还原剂，使L-表-2-肌醇单酮还原之前，进行一个预备步骤，即，通过加入氢氧化钠或氢氧化钾或碳酸钠或碳酸钾，将所述培养肉汤上清液或所述反应溶液滤液的pH调至pH8-11、优选9-10，在所述预备步骤之后，L-表-2-肌醇单酮与所加入的还原剂进行还原反应。我们从另一项研究中发现，与未经调节还原反应的反应基质的pH、并且通常在pH5-7的反应基质中进行的反应相比，当如上所建议将所述还原反应的反应基质的pH调节至碱性pH时，由该还原反应产生的表肌醇的产量增加1.3-1.5倍，而副产物内消旋肌醇的产量减少1/2-1/4倍，所以在pH5-7进行的L-表-2-肌醇单酮的还原反应产生6-7份表肌醇/3-4份内消旋肌醇。按照方法(E)，在pH8-11的含水反应基质中用氢化物试剂还原L-表-2-肌醇单酮，可以以表肌醇产率远远大于副产物内消旋肌醇产率的方式产生表肌醇。
上述菌株AB 10119、AB 10215和AB 10135是新的微生物，并且均适用于由内消旋肌醇制备L-表-2-肌醇单酮。因此，本发明第三方面提供了新微生物黄单胞菌(Xanthomonas sp.)AB 10119，该微生物能够使内消旋肌醇转化为L-表-2-肌醇单酮，并且已经保藏在日本保藏机构，国立生命科学和人体技术研究所，保藏号为FERM BP-7168。
本发明第四方面提供了新微生物假单胞菌(pseudomonas sp.)AB10215，该微生物能够使内消旋肌醇转化为L-表-2-肌醇单酮，并且已经保藏在日本保藏机构，国立生命科学和人体技术研究所，保藏号为FERMBP-7170。
本发明第五方面提供了新微生物欧文氏菌(Erwinia sp.)AB 10135，该微生物能够使内消旋肌醇转化为L-表-2-肌醇单酮，并且已经保藏在日本保藏机构，国立生命科学和人体技术研究所，保藏号为FERM BP-7169。
按照本发明的第一和第二方面，可以工业规模和经济合算的快速生产高纯度的L-表-2-肌醇单酮，该L-表-2-肌醇单酮适于用作合成药物和农业化学品、以及用作的药物的表肌醇的原料。
该培养肉汤上清液经高效液相色谱(HPLC)分析，测量条件如下所示。结果证明，在所述肉汤上清液中产生了浓度为66mg/ml的L-表-2-肌醇单酮(由内消旋肌醇转化为L-表-2-肌醇单酮的转化率为55.6％)。与此同时，在所得的上述肉汤上清液中未检测到内消旋肌醇。
上述由内消旋肌醇转化为L-表-2-肌醇单酮的转化率是通过以下等式计算的L-表-2-肌醇单酮的转化率(％)＝[1毫升肉汤上清液中所含L-表-2-肌醇单酮的摩尔数÷1毫升液体培养基中最初所含内消旋肌醇的摩尔数]×100高效液相色谱分析的测量条件如下柱Wakosil 5NH24.6×350mm柱温40℃监测器RI DETECTOR ERC-7515A(ERMA CR.INC.)上清液的注入量20μl洗脱溶剂乙腈-水(4∶1)L-表-2-肌醇单酮的洗脱时间；6.7分钟(2)制备L-表-2-肌醇单酮(第二个实验)向每一只500毫升容量的折流板锥形瓶中倒入每份100毫升的液体培养基(总共400毫升)，其中含有25.0％(250mg/ml)内消旋肌醇、1.0％葡萄糖和0.7％酵母提取物，未调节pH。然后，将含有培养基的烧瓶在高压灭菌器中灭菌。在每只烧瓶经灭菌处理的培养基中接种黄单胞菌(Xanthomonas sp.)AB 10119菌株(保藏号为FERM BP-7168)，并在27℃和振摇下将接种的细菌菌株培养5天。离心(8000rpm，20分钟)所得培养肉汤，得到培养肉汤上清液。
该培养肉汤上清液经高效液相色谱(HPLC)分析，测量条件如上所示。结果证明，在所述肉汤上清液中产生了浓度为247mg/ml的L-表-2-肌醇单酮(转化率为99.9％)。与此同时，在所得的上述肉汤上清液中未检测到内消旋肌醇。
上述由内消旋肌醇转化为L-表-2-肌醇单酮的转化率是通过上面给出的等式计算的。(3)制备L-表-2-肌醇单酮(第三个实验)向每一只500毫升容量的折流板锥形瓶中倒入每份100毫升的液体培养基，其中含有4.0％(40mg/ml)内消旋肌醇、0.2％酵母提取物、0.1％(NH4)2SO4、0.7％K2HPO4、0.2％KH2PO4和0.01％MgSO47H2O，并且pH为7。然后，将烧瓶在高压灭菌器中灭菌。在每只烧瓶经灭菌处理的培养基中接种欧文氏菌(Erwinia sp.)AB 10135菌株(保藏号为FERMBP-7169)，并在27℃和振摇下将接种的细菌菌株培养5天。离心(8000rpm，20分钟)所得培养肉汤，得到培养肉汤上清液。
该培养肉汤上清液经高效液相色谱(HPLC)分析，测量条件如上所示。结果证明，在所述肉汤上清液中产生了浓度为22mg/ml的L-表-2-肌醇单酮(转化率为55.6％)。与此同时，在所得的上述肉汤上清液中未检测到内消旋肌醇。
上述由内消旋肌醇转化为L-表-2-肌醇单酮的转化率是通过上面给出的等式计算的。(4)制备L-表-2-肌醇单酮(第四个实验)向每一只500毫升容量的折流板锥形瓶中倒入每份100毫升的液体培养基(总共400毫升)，其中含有25.0％(250mg/ml)内消旋肌醇、1.0％葡萄糖和0.7％酵母提取物，未调节pH。然后，将烧瓶在高压灭菌器中灭菌。在每只烧瓶经灭菌处理的培养基中接种假单胞菌(Pseudomonas sp.)AB10215菌株(保藏号为FERM BP-7170)，并在27℃和振摇下将接种的细菌菌株培养5天。离心(8000rpm，20分钟)所得培养肉汤，得到培养肉汤上清液。
该培养肉汤上清液经高效液相色谱(HPLC)分析，测量条件如上所示。结果证明，在所述肉汤上清液中产生了浓度为244mg/ml的L-表-2-肌醇单酮(转化率为98.7％)。与此同时，在所得的上述肉汤上清液中未检测到内消旋肌醇。(b)回收和分离L-表-2-肌醇单酮将上述实施例1(2)得到的培养肉汤上清液通过装有80毫升强酸性阳离子交换树脂Duolite(注册商标)C-20(H+型)的柱(内径2cm×高30cm)。然后，用80ml离子交换水(即去离子水)冲洗该柱。之后，将培养肉汤上清液通过所述柱得到的流出液与用去离子水洗涤所述柱得到的水洗液合并。将所得合并的溶液通过含有160ml弱碱性阴离子交换树脂Duolite(注册商标)368S(游离碱形式)的柱(内径3cm×高30cm)，然后用160ml去离子水冲洗该阴离子交换树脂柱。
将后一柱得到的流出液与所得水洗液合并在一起，得到水溶液。该水溶液含有L-表-2-肌醇单酮，但是基本上不含任何杂质。
将上述得到的水溶液减压浓缩至200毫升体积。向该浓缩溶液中加入3倍(以体积计)乙醇，并将所得液体混合物放置过夜，由此得到60g纯的L-表-2-肌醇单酮，为无色结晶。此时L-表-2-肌醇单酮纯化产物的回收率是60.7％，而以起始内消旋肌醇计，L-表-2-肌醇单酮的总回收率是60.6％。
上述L-表-2-肌醇单酮纯化产物的回收率是通过下列计算等式计算的L-表-2-肌醇单酮纯化产物的回收率(％)＝[所分离的纯化L-表-2-肌醇单酮的量÷纯化前在400毫升培养肉汤上清液中所含L-表-2-肌醇单酮的量]×100上述L-表-2-肌醇单酮的总回收率是通过下列计算等式计算的。
L-表-2-肌醇单酮的总回收率(％)＝[所分离的纯化L-表-2-肌醇单酮的摩尔数÷400毫升液体培养基中最初所含内消旋肌醇的摩尔数]×100
该培养肉汤上清液经高效液相色谱(HPLC)分析，测量条件与上述条件相似。结果证明，在所得肉汤上清液中产生了浓度为60mg/ml的L-表-2-肌醇单酮(转化率为50.6％)。
按照与实施例1(b)中所述同样的方式，从上述培养肉汤上清液中纯化和分离L-表-2-肌醇单酮。由此得到114g结晶(纯化L-表-2-肌醇单酮的回收率为76.0％)。此时，以内消旋肌醇计，纯化L-表-2-肌醇单酮的总回收率为38.4％。
上述L-表-2-肌醇单酮的转化率是按照实施例1(b)中给出的计算等式计算的，而上述纯化的L-表-2-肌醇单酮的回收率是按照下列计算等式计算的纯化的L-表-2-肌醇单酮的回收率(％)＝[所分离的纯化L-表-2-肌醇单酮的量÷纯化前在2.5升培养肉汤上清液中所含L-表-2-肌醇单酮的量]×100上述以内消旋肌醇计的L-表-2-肌醇单酮的总回收率是通过下列计算等式计算的L-表-2-肌醇单酮的总回收率(％)＝[所分离的纯化L-表-2-肌醇单酮的摩尔数÷2.5升液体培养基中最初所含内消旋肌醇的摩尔数]×100
上述L-表-2-肌醇单酮的转化率是按照与上述实施例1类似的方法计算的，而上述纯化的L-表-2-肌醇单酮的回收率是按照下列计算等式计算的纯化的L-表-2-肌醇单酮的回收率(％)＝[所分离的纯化L-表-2-肌醇单酮的量÷纯化前在400毫升反应溶液中最初所含L-表-2-肌醇单酮的量]×100上述以内消旋肌醇计的纯化L-表-2-肌醇单酮的总回收率是通过下列计算等式计算的纯化的L-表-2-肌醇单酮的总回收率(％)＝[所分离的纯化L-表-2-肌醇单酮的摩尔数÷400毫升磷酸盐缓冲液中最初加入的内消旋肌醇的摩尔数]×100
按照本发明第二方面方法的方法(C)制备表肌醇的实施例(1)制备L-表-2-肌醇单酮向每一只500毫升容量的折流板锥形瓶中倒入每份100毫升的液体培养基(总共2升)，其中含有25.0％(500g)内消旋肌醇、1.0％葡萄糖和2.5％酵母提取物，未调节pH。然后，将烧瓶在高压灭菌器中灭菌。在每只烧瓶经灭菌处理的培养基中接种黄单胞菌(Xanthomonas sp.)AB 10119菌株(FERM BP-7168)，并在27℃和振摇下将接种的细菌菌株培养5天。离心(8000rpm，20分钟)所得培养肉汤，得到培养肉汤上清液。
按照与实施例1(1)类似的方法，对该培养肉汤上清液进行高效液相色谱(HPLC)分析。结果证明，在所述培养肉汤上清液中产生了415g L-表-2-肌醇单酮(L-表-2-肌醇单酮的转化率为83.9％)。(2)制备表肌醇向2升上述步骤(1)得到的含有L-表-2-肌醇单酮的培养肉汤上清液中缓缓加入29.2g硼氢化钠作为还原剂。在室温进行L-表-2-肌醇单酮的还原反应。还原反应完成后，在下列测量条件下，通过高效液相色谱对肉汤上清液(即，由还原反应得到的反应溶液)进行分析。结果证明，由还原反应得到的反应溶液(即还原反应后得到的肉汤上清液)含有235.8g所产生的表肌醇和102.4g副产物内消旋肌醇(表肌醇加上内消旋肌醇的总反应产率为80.6％)。由L-表-2-肌醇单酮转化为表肌醇的表肌醇的转化率是56.2％。上述高效液相色谱的测量条件如下。
柱Wakosil 5NH24.6×250mm柱温40℃
检测器RI DETECTER ERC-7515A(ERMA CR.INC.)反应溶液的注入量20μl洗脱溶剂乙腈-水(4∶1)表肌醇的洗脱时间8.5分钟上述表肌醇加上内消旋肌醇的总回收率(％)通过下列计算等式评价总回收率(％)＝[(在上述还原反应后得到的肉汤上清液中所含表肌醇的摩尔数加上内消旋肌醇的摩尔数之和)÷(在上述还原反应前的肉汤上清液中最初所含L-表-2-肌醇单酮的摩尔数)]×100上述由L-表-2-肌醇单酮转化为表肌醇的表肌醇的转化率通过下列计算等式评价表肌醇的转化率(％)＝[在上述还原反应后得到的肉汤上清液中所含表肌醇的摩尔数÷在上述还原反应前的肉汤上清液中所含L-表-2-肌醇单酮的摩尔数]×100(3)回收和分离表肌醇的第一个实验将上述步骤(2)得到的反应溶液(即，还原反应后得到的肉汤上清液)分成两半。将其中一半所述反应溶液通过含有300ml强酸性阳离子交换树脂Duolite(注册商标)C-20(H+型)的柱(内径5cm×高30cm)，得到柱流出液。然后，用400ml去离子水冲洗该柱。将所得流出液与所得水洗液合并在一起，并使合并的溶液通过含有600ml强碱性阴离子交换树脂Duolite(注册商标)A-113(OH-型)的柱(内径5cm×高60cm)，得到柱流出液。然后，用700ml去离子水冲洗该柱。
将所得柱流出液与所得水洗液合并在一起。如此合并得到的水溶液含有所产生的表肌醇和副产物内消旋肌醇，但是基本上不含杂质。
将上述合并得到的水溶液减压浓缩至300毫升体积。取所得浓缩溶液(300ml)的1/4份(75ml)，使其通过含有1500ml强碱性阴离子交换树脂Amberlite(注册商标)CG-400(OH-型)的柱(内径5cm×高200cm)，然后用去离子水冲洗该柱。对所得该柱的洗脱液区分主要含内消旋肌醇的馏分和主要含所需表肌醇的馏分分别收集。浓缩溶液的剩余3/4份(225ml)用Amberlite CG-400(OH-型)柱进行类似处理，由此得到仅含表肌醇的洗脱液馏分。将这些洗脱液馏分浓缩至干，得到73g表肌醇。此外，将该表肌醇溶解在水中，得到15％水溶液，向该水溶液中加入两倍体积的乙醇。将所得液体混合物放置过夜使表肌醇重结晶。由此得到63g纯表肌醇结晶(纯化表肌醇的回收率为53.4％)。由内消旋肌醇得到的表肌醇的总产率是25.2％。
上述表肌醇的回收率是通过下列计算等式评价的纯化表肌醇的回收率(％)＝[所分离晶状表肌醇的量/还原反应后所得肉汤上清液中所含表肌醇的量]×100上述由内消旋肌醇得到的表肌醇的总回收率是通过下列计算等式评价的表肌醇的总回收率(％)＝[所分离晶状表肌醇的量/1升液体培养基中最初所含内消旋肌醇的量]×100(4)回收和分离表肌醇的第二个实验将前面分出的上述步骤(3)的另一半反应溶液(还原反应后得到的肉汤上清液)通过含有300ml强酸性阳离子交换树脂Duolite(注册商标)C-20(H+型)的柱(内径5cm×高30cm)，得到所述柱的流出液。然后，用400ml去离子水冲洗该柱。将所得流出液与所得水洗液合并在一起，并通过含有600ml强碱性阴离子交换树脂Duolite(注册商标)A-113(OH-型)的柱(内径5cm×高60cm)，得到柱流出液。然后，用700ml去离子水冲洗该柱。
将所得后一柱流出液与所得水洗液也合并在一起。将所得水溶液减压浓缩至300ml体积。将所得浓缩溶液(300ml)通过含有1500ml强酸性阳离子交换树脂Diaion(注册商标)UBK 520M(Ca+型)的柱(内径5cm×高200cm)，得到流出液。用去离子水冲洗该柱。对所得该柱的洗脱液区分主要含内消旋肌醇的馏分和主要含所需表肌醇的馏分分别收集。由该色谱方法得到75g表肌醇。此外，将该表肌醇溶解在水中，得到15％水溶液，向该水溶液中加入两倍体积的乙醇。将所得液体混合物放置过夜使表肌醇重结晶。由此得到66g纯表肌醇结晶(纯化表肌醇的回收率为56.0％)。以内消旋肌醇作为原料计，纯化表肌醇的总产率是26.4％。
纯化表肌醇的回收率和总回收率按照与上述步骤(3)同样的方法计算。
按照与实施例1(1)类似的方法，对该培养肉汤上清液进行高效液相色谱(HPLC)分析。结果证明，在所述肉汤上清液中产生了23g L-表-2-肌醇单酮(以内消旋肌醇计，L-表-2-肌醇单酮的转化率为93.0％)。(2)制备表肌醇向100毫升上述步骤(1)得到的含有L-表-2-肌醇单酮的肉汤上清液中加入5M氢氧化钠水溶液，将上清液的pH调节至pH10。此后立即向该pH10的上清液中缓缓加入1.3g硼氢化钠。然后在室温进行还原反应。反应完成后，在实施例4(2)所述测量条件下，通过高效液相色谱对肉汤上清液(即，由还原反应得到的反应溶液)进行分析。结果证明，由还原反应得到的反应溶液(即还原反应后得到的肉汤上清液)含有18.4g所产生的表肌醇和0.8g副产物内消旋肌醇(表肌醇加上内消旋肌醇的总反应产率为82.6％)。由L-表-2-肌醇单酮转化为表肌醇的表肌醇的转化率是79.1％。
上述表肌醇加上内消旋肌醇的总反应产率(％)通过下列计算等式评价表肌醇加上内消旋肌醇的总反应产率＝[在还原反应后得到的肉汤上清液中所含表肌醇摩尔数与内消旋肌醇摩尔数之和÷在还原反应前的肉汤上清液中最初所含L-表-2-肌醇单酮的摩尔数)]×100上述由L-表-2-肌醇单酮转化为表肌醇的表肌醇转化率通过下列计算等式评价由L-表-2-肌醇单酮转化为表肌醇的表肌醇转化率(％)＝[在还原反应后得到的肉汤上清液中所含表肌醇的摩尔数÷在还原反应前的肉汤上清液中所含L-表-2-肌醇单酮的摩尔数]×100(3)回收和分离表肌醇按照与实施例4(4)所述同样的方法，从还原反应得到的所述反应溶液中回收、纯化和分离表肌醇。以结晶形式得到的表肌醇的产量是15.7g。此时，由最初在反应溶液中所含的表肌醇得到的纯化表肌醇的回收率是85.3％。以还原前最初在反应溶液中所含的L-表-2-肌醇单酮计，表肌醇的产率是67.5％。以用作原料的内消旋肌醇计，纯化表肌醇的总回收率是62.8％。
以还原反应后在反应溶液中最初所含表肌醇计，上述纯化表肌醇的回收率通过下列计算等式评价纯化表肌醇的回收率(％)＝[所分离纯化表肌醇的量÷还原反应后在100ml反应溶液、即肉汤上清液中最初所含表肌醇的量]×100以L-表-2-肌醇单酮计，上述纯化表肌醇的产率通过下列计算等式评价纯化表肌醇的产率(％)＝[所分离纯化表肌醇的摩尔数÷还原反应前在100ml肉汤上清液中所含L-表-2-肌醇单酮的摩尔数]×100上述由内消旋肌醇得到的纯化表肌醇的总回收率通过下列计算等式评价纯化表肌醇的总回收率(％)＝[所分离纯化表肌醇的量÷培养开始时100ml液体培养基中最初所含内消旋肌醇的量]×100工业实用性按照本发明，可以容易地和有效地由内消旋肌醇制备L-表-2-肌醇单酮，后者是用于合成药物的有用中间体。按照本发明，还可以通过将L-表-2-肌醇单酮还原，容易和有效地制备表肌醇，后者适于用作各种药物。因此，本发明的方法适用于工业目的。
权利要求
1.L-表-2-肌醇单酮的制备方法，其特征在于该方法包括将内消旋肌醇与能够使内消旋肌醇转化为L-表-2-肌醇单酮的微生物反应，由此将内消旋肌醇转化为L-表-2-肌醇单酮，以产生L-2-肌醇单酮。
2.权利要求1所述的方法，其中所用能够使内消旋肌醇转化为L-表-2-肌醇单酮的微生物是细菌。
3.权利要求1所述的方法，其中所用能够使内消旋肌醇转化为L-表-2-肌醇单酮的微生物是革兰氏阴性菌。
4.权利要求1所述的方法，其中所用能够使内消旋肌醇转化为L-表-2-肌醇单酮的微生物是选自下列的革兰氏阴性菌属于假单胞菌科的黄单胞菌属(Xanthomonas)或假单胞菌属(Pseudomonas)的革兰氏阴性菌；属于醋酸杆菌科(Acetobacteraceae)的醋酸杆菌属(Acetobacter)或葡糖杆菌属(Gluconobacter)的细菌；属于根瘤菌科(Rhizobiaceae)的土壤杆菌属(Agrobacterium)的细菌；属于肠杆菌科(Enterobacteriacea)的欧文氏菌属(Erwinia)、肠杆菌属(Enterobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)和耶尔森氏菌属(Yersinia)的细菌；或者属于巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)的巴斯德氏菌属(Pasteurella)或嗜血杆菌属(Haemophilus)的细菌。
5.权利要求1所述的方法，其中所用能够使内消旋肌醇转化为L-表-2-肌醇单酮的微生物是黄单胞菌属菌株(Xanthomonas sp.)AB10119(保藏号FERM BP-7168)或假单胞菌属菌株(Pseudomonas sp.)AB 10215(保藏号FERM BP-7170)和欧文氏菌属菌株(Erwinia sp.)10135(保藏号FERMBP-7169)。
6.权利要求1所述的方法，其中在需氧条件下，在含有一定量内消旋肌醇、碳源和氮源的液体培养基中，培养能够使内消旋肌醇转化为L-表-2-肌醇单酮的微生物，由此使所述内消旋肌醇与所述微生物在培养基中反应，并在所得培养肉汤中产生和积聚L-表-2-肌醇单酮。
7.权利要求1所述的方法，包括在培养基中培养能够使内消旋肌醇转化为L-表-2-肌醇单酮的微生物，从所得培养肉汤中分离所培养微生物的微生物细胞，将所分离的微生物细胞加至含有溶解于其中的一定量内消旋肌醇的缓冲液或液体培养基中，并使所加入的微生物细胞与在所述缓冲液或所述液体培养基中的内消旋肌醇反应，在所得反应溶液或在所得培养肉汤中将内消旋肌醇转化为L-表-2-肌醇单酮。
8.权利要求1所述的方法，其中在权利要求6或7的方法中得到含有微生物细胞和所产生并积聚于其中的L-表-2-肌醇单酮的培养肉汤或反应溶液，然后从所述培养肉汤或所述反应溶液中除去微生物的微生物细胞，并且一旦从含有L-表-2-肌醇单酮的所述培养肉汤或所述反应溶液中除去微生物细胞即得到培养肉汤上清液或反应溶液滤液，然后用离子交换树脂或者活性炭处理该培养肉汤上清液或反应溶液滤液，或者处理所述培养肉汤上清液或反应溶液滤液使L-表-2-肌醇单酮结晶，或者采用这些处理的任何组合方式，由此从所述培养肉汤上清液或反应溶液滤液中回收高纯度的L-表-2-肌醇单酮。
9.表肌醇的制备方法，其特征在于该方法包括在含水反应介质中，将能够使内消旋肌醇转化为L-表-2-肌醇单酮的微生物与内消旋肌醇反应，以在所述含水反应培养基中生成L-表-2-肌醇单酮，由此得到含有所述微生物的微生物细胞的以及在其中产生的L-表-2-肌醇单酮的所得反应溶液，从所述反应溶液中除去微生物细胞，得到含有L-表-2-肌醇单酮的反应溶液滤液，向含有L-表-2-肌醇单酮的所述反应溶液滤液中直接加入适当的还原剂，并使还原剂与L-表-2-肌醇单酮反应，生成表肌醇和内消旋肌醇。
10.权利要求9所述的方法，其中所用能够使内消旋肌醇转化为L-表-2-肌醇单酮的微生物是细菌。
11.权利要求9所述的方法，其中所用能够使内消旋肌醇转化为L-表-2-肌醇单酮的微生物是革兰氏阴性菌。
12.权利要求9所述的方法，其中所用能够使内消旋肌醇转化为L-表-2-肌醇单酮的微生物是选自下列的革兰氏阴性菌属于假单胞菌科的黄单胞菌属(Xanthomonas)或假单胞菌属(Pseudomonas)的革兰氏阴性菌；属于醋酸杆菌科(Acetobacteraceae)的醋酸杆菌属(Acetobacter)或葡糖杆菌属(Gluconobacter)的细菌；属于根瘤菌科(Rhizobiaceae)的土壤杆菌属(Agrobacterium)的细菌；属于肠杆菌科(Enterobacteriacea)的欧文氏菌属(Erwinia)、肠杆菌属(Enterobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)和耶尔森氏菌属(Yersinia)的细菌；或者属于巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)的巴斯德氏菌属(Pasteurella)或嗜血杆菌属(Haemophilus)的细菌。
13.权利要求9所述的方法，其中所用能够使内消旋肌醇转化为L-表-2-肌醇单酮的微生物是黄单胞菌属菌株(Xanthomonas sp.)AB10119(保藏号FERM BP-7168)或假单胞菌属菌株(Pseudomonas sp.)AB 10215(保藏号FERM BP-7170)和欧文氏菌属菌株(Erwinia sp.)10135(保藏号FERM BP-7169)。
14.权利要求9所述的方法，包括在需氧条件下、在由含有一定量内消旋肌醇、碳源和氮源的液体培养基组成的含水基质中，培养能够将内消旋肌醇转化为L-表-2-肌醇单酮的微生物，以使内消旋肌醇与所述微生物在所述含水反应基质中反应，由此在所得培养肉汤中产生和积聚L-表-2-肌醇单酮，得到培养肉汤，即含有所述微生物的微生物细胞和L-表-2-肌醇单酮的所得反应溶液；从所得到的反应溶液、即培养肉汤中除去所述微生物的微生物细胞，得到培养肉汤上清液，即含有L-表-2-肌醇单酮的所述反应溶液滤液；向所得培养肉汤上清液中直接加入碱金属硼氢化物、碱金属三烷氧基硼氢化物或碱金属硼氰化物作为还原剂，使L-表-2-肌醇单酮与该还原剂进行还原反应，由此在所述培养肉汤上清液、即所述反应溶液滤液中产生表肌醇和内消旋肌醇；从所得还原反应的反应溶液、即含有所产生的表肌醇和内消旋肌醇的培养肉汤上清液中回收表肌醇和内消旋肌醇；将所回收的表肌醇与内消旋肌醇彼此分离。
15.权利要求9所述的方法，包括在需氧条件下、在含有碳源和氮源的液体培养基中，培养能够将活性内消旋肌醇转化为L-表-2-肌醇单酮的微生物，由此得到所述微生物的培养肉汤，然后从所得培养肉汤中分离所述微生物的微生物细胞；在由含水缓冲液或液体培养基组成的含水反应基质中，将所分离的所述微生物的微生物细胞与内消旋肌醇反应，在所述含水反应基质中产生L-表-2-肌醇单酮；从所得到的含有所述微生物的微生物细胞以及在其中生成的L-表-2-肌醇单酮的所得含水反应溶液中除去所述微生物的微生物细胞，得到已经除去微生物细胞、而L-表-2-肌醇单酮仍溶解于其中的所得反应溶液滤液；向所述反应溶液滤液中加入碱金属硼氢化物、碱金属三烷氧基硼氢化物或碱金属硼氰化物作为还原剂，使L-表-2-肌醇单酮与所述还原剂进行还原反应，由此在所述反应溶液滤液中产生表肌醇和内消旋肌醇；从所得含有所产生的表肌醇和内消旋肌醇的还原反应的反应溶液中回收表肌醇和内消旋肌醇；将所回收的表肌醇与内消旋肌醇彼此分离。
16.权利要求14或15所述的方法，其中在L-表-2-肌醇单酮与所加入的还原剂进行还原反应之前，进行这样一个预备步骤，即，将由含有L-表-2-肌醇单酮的培养肉汤上清液或反应溶液滤液组成的含水基质的pH调至pH8-12的碱性pH范围；然后进行的步骤是，向含有L-表-2-肌醇单酮和pH8-12的该碱性含水介质中加入碱金属硼氢化物、碱金属三烷氧基硼氢化物或碱金属硼氰化物作为还原剂，使L-表-2-肌醇单酮与所述还原剂进行还原反应，由此产生了远远大于副产物内消旋肌醇产率的所需表肌醇。
17.权利要求9所述的方法，其中L-表-2-肌醇单酮还原反应所用的还原剂选自硼氢化钠、硼氢化锂、硼氢化钾、三甲氧基硼氢化钠或氰基硼氢化钠。
18.权利要求9所述的方法，其中所用含水反应基质是水；所用还原剂是硼氢化钠。
19.新微生物黄单胞菌菌株(Xanthomonas sp.)AB 10119，该微生物具有能够使内消旋肌醇转化为L-表-2-肌醇单酮的特性，并且已经保藏在日本的国立生命科学和人体技术研究所，保藏号为FERM BP-7168。
20.新微生物假单胞菌菌株(Pseudomonas sp.)AB 10215，该微生物具有能够使内消旋肌醇转化为L-表-2-肌醇单酮的特性，并且已经保藏在日本国立生命科学和人体技术研究所，保藏号为FERM BP-7170。
21.新微生物欧文氏菌菌株(Erwinia sp.)AB 10135，该微生物具有能够使内消旋肌醇转化为L-表-2-肌醇单酮的特性，并且已经保藏在日本国立生命科学和人体技术研究所，保藏号为FERM BP-7169。
全文摘要
本发明提供了L－表－2－肌醇单酮和表肌醇新的有效制备方法,表肌醇适于用作各种药物或合成各种药物的中间体。在该方法中,使用便宜的内消旋肌醇作为原料。也就是说,本发明开发了一种新的方法,包括将内消旋肌醇与能够将内消旋肌醇转化为L－表2－肌醇单酮的革兰氏阴性菌反应,由此通过将内消旋肌醇转化为L－表－2－肌醇单酮产生L－表－2－肌醇单酮。另外,本发明提供了新的方法,该方法包括将所产生的L－表－2－肌醇单酮与由碱金属硼氢化物或任何其他碱金属氢化物组成的还原剂在含水反应基质中反应,产生表肌醇和内消旋肌醇,然后从由表肌醇和内消旋肌醇组成的所得反应产物中分离表肌醇。
文档编号C12N1/21GK1365394SQ00811034
公开日2002年8月21日 申请日期2000年6月7日 优先权日1999年6月7日
发明者高桥笃, 神边健司, 森哲也, 北雄一, 玉村健, 竹内富雄 申请人:北兴化学工业株式会社, 财团法人微生物化学研究会