专利名称：抗微生物性组合物的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及抗微生物性组合物和它们的制备方法。还涉及这些组合物的使用方法，以及由于添加或施用了这些组合物而产生抗微生物性的产品。
背景技术：
乳过氧化物酶(LP)是一种酶，它是牛奶和粘液分泌物(如唾液、眼泪和小肠分泌物)中天然非免疫防卫体系的一部分。LP和各种自然产生的辅助因子形成了具有抗微生物活性的乳过氧化物酶体系(LPS)。
LPS包括LP(从牛奶中提取)、过氧化物源和辅助因子(通常是硫氰酸盐)。在许多场合，加入葡萄糖氧化酶(来自于微生物)和葡萄糖以提供过氧化氢源。由于要保证过氧化物的持续递送，常常要优选所使用的酶体系。但是这要求需氧条件，所以在厌氧条件中可能需要过氧化物的直接来源。
辅助因子为硫氰酸盐时、由LP催化的反应产生寿命短暂的硫氰酸盐中间氧化产物，它显示出抗微生物活性。LP利用过氧化物，在水的存在下催化硫氰酸盐的氧化，从而产生次硫氰酸根离子(OSCN-)。据认为，次硫氰酸盐接下来与细菌膜上的巯基反应，具有对细菌的杀菌作用。该过程重新产生了许多硫氰酸盐。
LPS被视作革兰阴性细菌(如，大肠杆菌、耶尔森菌、肠球菌、假单胞菌属、沙门菌属、弯曲菌属)的杀菌剂和革兰阳性细菌(产单核细胞李斯特菌、金黄色葡萄球菌、链球菌属)的抑菌剂。LPS在一些情况下还具有抗病毒活性。
虽然LPS集中采用乳过氧化物酶，但在一些环境中，采用其它过氧化物酶特别是那些GRAS(公认安全无害)状态的过氧化物酶也能令人满意。这些体系总称作为过氧化物酶体系(PS)，LPS仅是其中一个例子。
已经很好地证明了许多脂肪酸的抗微生物效力。最具活性的是中等链长的脂肪酸月桂酸(十二烷酸)和肉豆蔻酸(十四烷酸)。认为脂肪酸对革兰阳性细菌具有特殊的效果，并且其脂肪酸衍生物即甘油一月桂酸酯(monolaurin)(1-单十二烷酰-外消旋-甘油酯(1-monododecanyol-rac-glycerol))通常被认为最具活性。另外，还要求脂肪酸衍生物，包括十二烷基硫酸钠具有抗病毒活性(抗包膜病毒)。
甘油一月桂酸酯具有如乳化剂这样的GRAS状态，主要用于植物性起酥油，在某种程度上还用于冰激淋和烘焙品。
甘油一月桂酸酯的商品名为Lauricidin PE，在食品系统中用作抗微生物剂。但是，由于所需的浓度和对被处理的食品的器官感觉质量的综合效果，并未见到它作为抗微生物剂被广泛接受。
现在本申请发现，PS(如LPS)和脂肪酸/脂肪酸衍生物(如甘油一月桂酸)可以联合使用，并且联合时的抗微生物效力超过了根据这些成分已知性质所预测的抗微生物效力。因此，本发明的基础主要是根据对其提高的抗微生物效力或协同性相互作用的这种意外发现。
发明概述因此，本发明的第一方面提供了一种抗微生物性组合物的制备方法，该方法包括形成下列成分的混合物a)过氧化物酶体系(PS)，包括i)过氧化物酶；ii)过氧化物源；iii)能产生抗微生物性氧化产物的辅助因子；b)至少一种脂肪酸或脂肪酸衍生物，其中所述的脂肪酸或衍生物的含量是能与所述的过氧化物酶体系相互作用产生提高的抗微生物效力的有效量。
术语“提高的抗微生物效力”是指对至少一种微生物具有比从各个成分已知性质预测的杀菌效果更强的杀菌效果。
本文使用的术语“微生物”是指微生物致病体、无效颗粒和腐败性生物体，包括来源于细菌、病毒、真菌或原生动物的那些物质。
所述的脂肪酸优选是抗微生物性脂肪酸或脂肪酸的抗微生物性衍生物。
过氧化物酶优选乳过氧化物酶。
过氧化物为过氧化氢较方便。
辅助因子优选选自硫氰酸盐或碘化物，最优选是硫氰酸盐。
成分(b)优选的是或包括选自C8、C10、C12、C14和C16的抗微生物性脂肪酸及其衍生物。
成分(b)更优选的是或包括脂肪酸的抗微生物性酯及其脂肪酸盐。
成分(b)还要优选的是或包括甘油一月桂酸酯(1-单十二烷酰-外消旋-甘油酯)或盐，如十二烷基硫酸钠。
在目前最优选的实施方式中，成分(b)是甘油一月桂酸酯。
抗微生物性脂肪酸或脂肪酸衍生物的含量优选是至少占该组合物脂质总含量的5重量％。
所述的组合物优选是将一种或多种成分添加到已经含有其余成分的预制混合物中形成的。
预制混合物通常是食品、化妆品或保健品。
食品可以是饮食补充物或补品。还可以是奶制品、肉制品或鱼制品。
食品还可以是动物饲料，其中最简单的形式可以是水。
或者，所述的组合物在形成时由混合物中的所述成分组成。
本发明的另一方面提供了适用于制备抗微生物性组合物的预制组合物，它包括至少两个成分，选自i)过氧化物酶；ii)过氧化物源；iii)能产生抗微生物性氧化产物的辅助因子；iv)至少一种抗微生物性脂肪酸或脂肪酸的抗微生物性衍生物，其中过氧化物酶和过氧化物源如果都存在时应保持分离。
过氧化物酶优选乳过氧化物酶。
本发明的还有一个方面提供了一种适用于制备抗微生物性组合物的预制包，它包括置于分开的容器中的过氧化物酶和至少一种抗微生物性脂肪酸或脂肪酸的抗微生物性衍生物。
过氧化物酶优选乳过氧化物酶。
所述的预制包优选还包括过氧化物源和/或能产生抗微生物性氧化产物的辅助因子。当提供它们时，过氧化物和/或所述辅助因子需置于分开的容器中。
在还有一种实施方式中，本发明提供了一种抗微生物性组合物，该组合物包括过氧化物酶、能产生抗微生物性氧化产物的辅助因子和至少一种抗微生物性脂肪酸或脂肪酸的抗微生物性衍生物，其中所述的脂肪酸或其衍生物的含量是能与所述过氧化物酶和所述辅助因子在过氧化物存在下发生协同性相互作用从而产生提高的抗微生物效力的有效量。
过氧化物酶优选乳过氧化物酶。
所述的抗微生物性组合物优选还包括过氧化物源。
该组合物也可以包括抗微生物剂或螯合剂。
所述的抗微生物剂优选选自苯酚、有机酸、杆菌素、这些物质的衍生物、和它们的混合物，或者从牛奶中提取的抗微生物成分或抗微生物成分的混合物，如乳铁蛋白。
螯合剂优选EDTA。
在另一实施方式中，本发明提供了一种用如上定义的方法制备的抗微生物产品。
本发明的还有一个方面提供了一种产品，它包括下列成分i)过氧化物酶；ii)过氧化物源；iii)能产生抗微生物性氧化产物的辅助因子；iv)至少一种抗微生物性脂肪酸或脂肪酸的抗微生物性衍生物，这种产品能阻止微生物生长。
过氧化物酶优选乳过氧化物酶。
优选地，所述的产品能阻止革兰阳性和革兰阴性细菌生长。
所述产品的一种形式是食品，如饮食补充物、补品、乳制品、肉制品、鱼制品或动物饲料。
所述产品的另一种形式是化妆品。
所述产品的还有一种形式是保健品。
本发明的还有一个方面提供了一种表面处理方法，该方法包括将如上所述的有效量抗微生物性组合物涂敷到所述表面的步骤。
在一个实施方式中，该表面是用于制备和/或处理食品的表面。
本发明的最后一个方面提供了一种目的是赋予产品抗微生物性的产品处理方法，该方法包括将上述的有效量抗微生物性组合物添加到所述产品中的步骤。
虽然本发明主要如上所述，但包括下面描述所提供的实施例的实施方式也是适宜的。另外，参见下述附图可获得对本发明的更好了解图1显示在接种8×106cfu/毫升金黄色葡萄球菌(等于专门制备的贮存液的1％接种物)的肉汤培养液中，甘油一月桂酸酯的浓度对细菌生长的影响。以600纳米测量的光密度(OD)作为细菌细胞数指数。
图2显示在接种1.5×106cfu/毫升大肠杆菌(等于专门制备的贮存液的0.05％接种物的肉汤培养液中，各种组合物对细菌生长的抑制。
图3显示在接种4×105cfu/毫升金黄色葡萄球菌(等于专门制备的贮存液的0.05％接种物)的肉汤培养液中，各种组合物对细菌生长的抑制。
图4显示在接种8×106cfu/毫升金黄色葡萄球菌(等于专门制备的贮存液的1％接种物)的肉汤培养液中，各种组合物对细菌生长的抑制。
图5显示在接种1.5×106cfu/毫升产单核细胞李斯特菌(等于专门制备的贮存液的0.05％接种物)的肉汤培养液中，各种组合物对细菌生长的抑制。
图6显示在接种3×107cfu/毫升产单核细胞李斯特菌(等于专门制备的贮存液的1％接种物)的肉汤培养液中，各种组合物对细菌生长的抑制。
发明详述大致如上所述，本发明主要关注的是抗微生物性组合物。这种组合物通过过氧化物酶体系和抗微生物性脂肪酸或脂肪酸衍生物成分的协同性联合发挥了抗微生物效力。
本申请人取得了令人惊奇的发现是加入抗微生物性脂肪酸成分可显著补充过氧化物酶体系的抗微生物效力。在性质上加强或协同了对抗微生物效力的提高。这种协同作用对于革兰阴性微生物如大肠杆菌特别明显。
过氧化物酶体系需要三种成分。它们依次是过氧化物酶、过氧化物源和辅助因子。辅助因子能产生抗微生物性氧化中间产物。合适的辅助因子的例子包括硫氰酸盐和卤化物(特别是碘化物)。
过氧化物酶自身可以是任何市售的。GRAS状态的过氧化物酶是优选的，乳过氧化物酶是特别优选的。
过氧化物可以是直接加入(例如过氧化氢)，或者可以是适当底物的酶消化产物。例如，葡萄糖氧化酶和葡萄糖的联合可提供过氧化氢来源。以过碳酸钠为基础的体系也可用。
过氧化物酶体系的各成分可以本领域的标准量提供。例如，当过氧化物酶是乳过氧化物酶时，过氧化物源是葡萄糖/葡萄糖氧化酶，辅助因子是硫氰酸盐时，液体介质中可包含以下含量的各成分(毫克/升)
LP 6.85葡萄糖氧化酶3.17葡萄糖 31.7SCN-29.0对于固体底物，可包含相同成分，例如含量如下LP 205葡萄糖氧化酶9.5葡萄糖 31.7SCN-200脂肪酸或脂肪酸衍生物成分通常是C8-C16脂肪酸或衍生物。但是，C10、C12和C14脂肪酸通常被视作最具抗微生物性，因此，如果脂肪酸成分以脂肪酸本身的形式加入，则这些是优选的。
使用的抗微生物性衍生物包括使用脂肪酸的酯或它们的盐。本申请人发现一个特别有用的酯是甘油一月桂酸酯(Lauricidin PE)。十二烷基硫酸钠也可用作合适的衍生物。
还要强调的是，脂肪酸成分无需是纯净形式的。有用的脂肪酸/脂肪酸衍生物可包含在混合物中，该混合物如牛奶脂肪或椰子油的提取物，其中脂质已经过处理，以保证抗微生物成分以所需比例存在。
为了使脂肪酸成分与过氧化物酶体系发生协同作用，本申请人发现脂肪酸/脂肪酸衍生物的含量必须是能发生协同作用的有效量。该量大于标准牛奶(其中的脂质主要是甘油三酯形式)中抗微生物性脂肪酸的水平，这反映了本申请人发现当过氧化物酶体系和脂肪酸成分一起用于牛奶时，可达到显著提高的和有效的抗微生物效力。
具体地说，本申请人已确定当要在含有脂质的组合物中产生协同抗微生物效力时，抗微生物性脂肪酸/脂肪酸衍生物的含量必须至少占组合物中脂质总量的5重量％。
现在参见下述非限制性实验部分以说明本发明。
实施例A部分原料菌株、培养基和化学制剂产单核细胞李斯特菌菌株L45和金黄色葡萄球菌菌株R37得自新西兰肉类加工研究所Roger Cook博士的菌株培养收藏物，大肠杆菌015757菌株NCTC 12900得自Otago大学微生物学系Heather Brooks博士的菌株培养收藏物。所有菌株的储存液于-70℃保存在脱脂奶中，当需要时在平皿计数琼脂(Plate CountAgar)(PCA)(Difco Laboratories，底特律，密歇根州，美国)上传代培养，或在血液琼脂(BA)(添加了5％人全血(Dunedin Public Hospital，Dunedin，新西兰)的哥伦比亚琼脂基(Columbia Agar Base)(GIBCO BRL，Life Tech Ltd，Paisly，英国))上传代培养。菌株在通常使用中，保持平皿培养，并且每两周进行传代培养。所有的市售培养基按照制造商的说明书制备。甘油一月桂酸酯(1-单十二烷酰-外消旋-甘油酯，Sigma化学公司，圣路易斯，密苏里州，美国)的制备方法是将1克溶解于10毫升乙醇中，将其分装成1毫升体积，于-20℃贮存直至需要时。所有的LPS成分经过滤除菌。葡萄糖(Sigma)的制备方法是将18.016克葡萄糖(Sigma)溶解于100毫升MilliQ水中，分装成3毫升体积，于室温(RT)储存直至使用。葡萄糖氧化酶(GOX)来源于Sigma公司；乳过氧化物酶来源于Tatua Biologics，Morrinsville，新西兰；硫氰酸钠或硫氰酸钾来自Bio Serae SA Limited，Montolieu，法国。
方法测试系统在含有8毫升Todd-Hewitt肉汤(THB)的100×15毫米螺帽加盖玻璃试管中进行生长实验。根据需要将甘油一肉桂酸酯加入每个试管中，然后以121℃对试管高压灭菌15分钟。根据需要将各成分以下列顺序加入灭菌试管中，细胞接种物、16LPX贮液、葡萄糖贮液、硫氰酸盐贮液和葡萄糖氧化酶贮液。在所有情况下，试管都接种以0.05％和1.0％(体积/体积)的适当菌株的过夜THB培养物。试管以37℃培养48小时，用分光光度计(Spectronic 20D+，Milton Roy Company，美国)在适当间隔时间读出它们的OD600纳米。每种菌株活菌计数是将其以盐水稀释的五份过夜培养物，用螺旋接种仪(Spiral Systems，辛辛那提，美国)将每份稀释液接种于PCA上确定的。
乳过氧化物酶体系成分在培养液中的浓度(毫克/升)如下乳过氧化物酶为6.85，葡萄糖氧化酶是3.17，葡萄糖是31.7，硫氰酸盐为29.0。
结果测试系统对于实验用的每种测试菌株，大肠杆菌015757菌株NCTC 12900(“大肠杆菌”)、金黄色葡萄球菌菌株R37(“金黄色葡萄球菌”)和产单核细胞李斯特菌菌株L45(“产单核细胞李斯特菌”)的过夜肉汤的活菌计数分别是3×109、8×108和3×109cfu/毫升。
如结果所显示，对于在50-150百万分率(ppm)甘油一月桂酸酯存在下培养的1％的金黄色葡萄球菌接种物(图1)，甘油一月桂酸酯对革兰阳性菌株的抑制程度看来与甘油一月桂酸酯所用的浓度成正比。对于甘油一月桂酸酯和LPS二者，观察到的抑制程度与施加到该系统中的细菌量成反比；也就是说，初始接种物越多，观察到的抑制程度就越低。对于甘油一月桂酸酯和LPS二者，产单核细胞李斯特菌是对抑制最敏感的菌株，大肠杆菌是对抑制敏感性最差的菌株。
对大肠杆菌的效果当试管以0.05％或1.0％接种时，甘油一月桂酸酯不抑制大肠杆菌的生长。当试管以0.05％但不以1.0％接种时，LPS轻度抑制了大肠杆菌的生长。甘油一月桂酸酯和LPS联合强烈抑制了大肠杆菌的生长(图2)。
对金黄色葡萄球菌的效果浓度为100和500ppm(百万分率)的甘油一月桂酸酯完全抑制了以0.05％接种的金黄色葡萄球菌的生长(图3)。这些培养物还受到LPS的强烈抑制，而培养固定相的时间比不含LPS的培养液大约延长到20小时。含有甘油一月桂酸酯和LPS二者的试管中未观察到生长。浓度为500ppm的甘油一月桂酸酯完全抑制了以1.0％接种的金黄色葡萄球菌的生长(图4)，但浓度为100ppm的甘油一月桂酸酯只能部分抑制。在用100ppm甘油一月桂酸酯、以1％接种的情况下，固定相比对照试管延长约10小时，并且这些培养物从未达到对照试管相当的密度。这些培养物受到LPS的强烈抑制，固定相比不含LPS的试管大约延长13小时。显然，在含有甘油一月桂酸酯和乳过氧化物酶体系二者的试管中细菌的生长只是在100ppm甘油一月桂酸酯+LPS的体系中才能观察到，在48小时最终时点显示，浊度有轻微但统计上显著的增长。
对产单核细胞李斯特菌的效果以所有接种密度的含100或500ppm甘油一月桂酸酯的所有体系都完全抑制了产单核细胞李斯特菌(图5和6)。当接种1％与LPS培养时，静止期较未抑制的对照管延长约22小时。当接种0.05％与LPS培养时，静止期较未抑制的对照管延长约27小时。这些培养物从未达到比得上对照管的密度。
讨论选择了三种细菌的菌株用于该研究，这是由于它们的身份是食品中的病原体，和报道的它们对甘油一月桂酸酯的敏感范围。浓度高达500ppm的甘油一月桂酸酯对用于该研究的大肠杆菌0157h1菌株的生长没有影响并不奇怪，如Kabera等报道大肠杆菌的生长不受浓度超过1000ppm的甘油一月桂酸酯的影响(Kabara等，1977)。相反地，据报道相对低浓度的甘油一月桂酸酯抑制了产单核李斯特菌的生长，据报道低至5ppm的浓度使肉汤培养液中的细菌生长停滞延迟8小时(wang等，1977)。虽然浓度10ppm的甘油一月桂酸酯对产单核细胞李斯特菌菌株的生长没有影响，但浓度为100和500ppm的甘油一月桂酸酯完全抑制了该菌株的生长。金黄色葡萄球菌是对甘油一月桂酸酯的生长抑制作用具有中等敏感性的一种细菌，据报道它对浓度约为200ppm的甘油一月桂酸酯的抑制作用敏感(Kabara等，1977)，这是与用于该研究的菌株敏感性比较的结果。
据报导LPS抑制了大范围细菌的生长，包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和产单核细胞李斯特菌(Wolfson等，1993)。不幸地是，用于这些研究的大量成分(葡萄糖、H2O2、GOX、LPX和SCN-)浓度、培养基和培养温度，使得难以与目前研究直接相比较。虽然总体上，在该研究中观察到的菌株对乳过氧化物酶体系的相对敏感程度与其它学者报道(Gaya等，1991；Kamau等，1990；Bjork等，1975；Siragu等，1989)的相一致。但尽管LPS对大肠杆菌有杀菌特性，用于该研究的O157H7菌株的生长受抑制程度明显低于革兰阳性菌种所见的受抑制程度。也明显低于大肠杆菌DH5a(一种常用的实验室菌株)的受抑制程度(Simmonds和Kennedy，未公开数据)。其它学者也注意到大肠杆菌菌株对LPS的敏感性变化很大，Grieve等报导在3.6-7.3log单位之间范围内不同产肠毒素菌株的6小时活菌计数下降。
上述报导的结果强有力地证明了，甘油一月桂酸酯和LPS联合具有用作防腐系统的巨大潜力。单用甘油一月桂酸对大肠杆菌O157H7没有抑制作用，并且我们不知道任何大肠杆菌菌株对单独使用的任何浓度的甘油一月桂酸酯的敏感程度。因此，甘油一月桂酸酯+LPS合用对大肠杆菌O157H7的协同效应(抑制效果远超过单用LPS所预测的效果)是出乎意料的。相反，甘油一月桂酸酯+LPS合用对金黄色葡萄球菌的抑制作用就不使人感到惊奇，因为每种试剂单独使用都有明显的抑制效果。但是一个出乎意料的结果是该联合体系得到的金黄色葡萄球菌的受抑制程度。甘油一月桂酸酯用作食品防腐剂的一个问题通常是，达到所需抑制水平需要的甘油一月桂酸酯量可能会使制造过程不经济，或在食品中产生不需要的器官感觉性质(质感、味道)。上述报导的结果表明，在甘油一月桂酸酯的浓度大大低于单用甘油一月桂酸酯时要达到相同抑制效果所需的浓度时，甘油一月桂酸酯+LPS合用仍是有效的。
B部分本部分进一步说明了本发明的各方面内容。
将接种金黄色葡萄球菌R37或大肠杆菌O157H7(-vt)的肉汤培养系统(Todd-Hewitt肉汤，THB)用作筛选系统，来评价不同脂质成分。在THB中以37℃过夜培养菌株，并将其分装到试管中。金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的初始装量都是1×105每毫升。
乳过氧化物酶体系即LPS所含成分的浓度为20毫克/升乳过氧化物酶(c.3000单位活性/升)、葡萄糖氧化酶(c.300单位活性/升)、290毫克/升硫氰酸根离子(496毫克/升NaSCN)和12000毫克/升葡萄糖。使微生物生长，然后用分光光度计(Spectronic 20D)定期测量肉汤的吸光度(600纳米)的增加48小时，并附上了数据列表。
如表1总结的实验结果证明，许多脂质成分(脂肪酸和一元酯)与乳过氧化物酶体系合用时，显示了抗微生物效力。甘油一月桂酸酯是对金黄色葡萄球菌最有效的脂质成分，并且在该简单体系中，它的效力和含有和不含有乳过氧化物酶体系的单一体系的相同。表1数据显示，对于革兰阳性金黄色葡萄球菌和革兰阴性大肠杆菌的协同作用是明显的，但对金黄色葡萄球菌的杀菌效果更大。甘油一月桂酸酯的效力近似于单独使用或在LPS存在时的甘油一月桂酸酯对大肠杆菌的效力。但是，无论LPS存在与否，十二烷基硫酸钠对大肠杆菌都很有效。
表1脂质成分与乳过氧化物酶体系合用对肉汤培养液中细菌生长的抑制作用。该数据表示为48小时后细菌生长受到50％或100％抑制时脂质成分的浓度；例如100/250是指生长受到约50％抑制时脂质成分浓度为100ppm，受到完全抑制时脂质成分为250ppm；*表明脂质成分的浓度高达1000ppm时微生物也未受抑制。
表2和表3提供了用金黄色葡萄球菌R37接种牛奶和碎肉的实验结果。LPS/甘油一月桂酸酯联合的协同效应是明显的。
表2对牛奶中甘油一月桂酸酯(1000ppm)+LPS(含有20毫克/升乳过氧化物酶的LPS)体系的评价(金黄色葡萄球菌R37，37℃；cfu/毫升)。
表3对肉糜(金黄色葡萄球菌R37，37℃；cfu/克)中甘油一月桂酸酯(1000ppm)+乳过氧化物酶(含200毫克/千克乳过氧化物酶体系的LPS)体系的评价。
表4和表5提供了牛奶用大肠杆菌O157H7(革兰阴性组织)或金黄色葡萄球菌R37(革兰阳性组织)接种的实验结果。
表4对牛奶(大肠杆菌O157H712℃；cfu/毫升)中一元月桂酸酯+LPS对革兰阴性组织抗微生物效果的评价。LPX与GOX(酶的活性单位)之比为9∶1，硫氰酸根离子和葡萄糖的含量均为12毫克/升。
表5对牛奶中一元月桂酸酯+LPS对革兰阳性菌(金黄色葡萄球菌R37，12℃；cfu/毫升；成分浓度和表4的一样)抗微生物效果的评价。
LPS/甘油一月桂酸酯合用的效力还是明显的。
表6提供了两次实验结果，它显示在特定环境中，牛奶本身的存在实际上对甘油一月桂酸酯的处理效力有抑制作用。也就是说，甘油一月桂酸酯的抗微生物效力会受到天然存在于牛奶中的正常水平脂质(通常是甘油三酯形式)的不利影响。相似地，甘油一月桂酸酯和LPS联合的效力也会受到培养基中牛奶(因此是脂质)浓度的影响(表7)。但是(竞争)脂质含量对甘油一月桂酸酯+LPS合用的影响要小于它对单用的甘油一月桂酸酯的影响；换句话说，协同效应更大。
表637℃时Todd-Hewitt肉汤(THB)牛奶混合物中不同牛奶(即脂质量)含量对甘油一月桂酸酯体系抗金黄色葡萄球菌R37(cfu/毫升)的影响比较。
表737℃时THB/牛奶混合物中不同牛奶(即脂质)含量对甘油一月桂酸酯+乳过氧化物酶体系(含有5ppmLPX)抗金黄色葡萄球菌R37(cfu/毫升)的影响比较。
表8和表9报告的实验结果进一步证明了LPS/甘油一月桂酸酯合用的协同效应。
表8通过比较37℃时LPS、或单用的甘油一月桂酸酯体系、和甘油一月桂酸酯+LPS的抗牛奶中革兰阳性细菌金黄色葡萄球菌R37的效果，得出的诸成分的协同效应。
表9通过比较37℃时单用甘油一月桂酸酯体系、和甘油一月桂酸酯+LPS在抗牛奶中革兰阳性细菌金黄色葡萄球菌R37的效果，得出的诸成分的协同效应。
如表8和表9所总结的那样，单用LPS对金黄色葡萄球菌R37没有抑制效力。单用1000ppm的甘油一月桂酸酯，如表8所报告有少许效力(1-2log)，但低于500ppm，如表9报告没有效力。而甘油一月桂酸酯和LPS合用的协同效应(与单用甘油一月桂酸酯或单用LPS相比)十分明显。脂质的存在和脂质量都会影响协同效应的程度。脂质存在时，该联合组合物的抗微生物效力比单用甘油一月桂酸酯的抗微生物效力大大增强。而且，抗微生物性组合物的效力还受脂质含量比例的影响。
表10提供了评价单用甘油一月桂酸酯时浓度对THB中金黄色葡萄球菌的效力的实验结果。在该实验中，要求浓度仅为25或50ppm的甘油一月桂酸酯对金黄色葡萄球菌数有显著作用。50ppm的甘油一月桂酸酯处理的效力等于表6中500ppm达到的效力。如表10报告的实验在无脂肪培养液中进行，这些比较进一步证明了其它脂质的存在对甘油一月桂酸酯效力有折衷影响。
表1037℃时甘油一月桂酸酯的不同浓度对金黄色葡萄球菌R37数(cfu/毫升)的影响比较。
参见表6-10，100％牛奶溶液含有3％左右的牛奶脂质。浓度为500ppm的甘油一月桂酸酯表示0.05克/100毫升(0.05％)。由上述可清楚地知道，所选的抗微生物性脂质成分必须超过某种临界浓度(以占总脂质的百分数表示)，以保证整个组合物的显著抗微生物效力。
表11提供了根据所加入的抗微生物性脂质(此例中是甘油一月桂酸酯)水平分类的有关数据总结，以实际含量和占总脂质的百分数计。表11的数据表明，3.2％甘油一月桂酸酯是浓度边缘，因为此时的效力是变量，对于单用甘油一月桂酸酯，5或6小时的细菌数下降范围是1log-4log，对于甘油一月桂酸酯+LPS，细菌数下降范围是3log-8log。
表11，表2、8、9和10数据的总结它证明了该抗微生物性组合物的效力和受存在的甘油一月桂酸酯的量和总脂质与甘油一月桂酸酯比例的影响(37℃时5或6小时后金黄色葡萄球菌数的下降)。
因此本申请人提出，所选的抗微生物性脂质成分的浓度必须等于或大于脂质总含量的5％，从而将协同抗微生物效应包括在内。
因此就牛奶而言，具有抗微生物性能的游离脂肪酸(或它们的衍生物)必须占脂质总含量的5％以上，使牛奶转化成抗微生物性组合物，以得到基本的和稳定的抗微生物效果。这种组合物能有效抗革兰阳性(如金黄色葡萄球菌)和革兰阴性(如大肠杆菌，见表5)细菌。
该含量的抗微生物性脂质只能通过加入本发明所选的抗微生物性脂质或其衍生物而达到。
实验测试了该体系所有成分的存在对保证有效抗微生物性组合物的重要性，结果总结于表12。
制备了含下述组合物的简单培养基含有细菌培养用胰化蛋白胨的磷酸盐缓冲盐水(pH 7)和酵母提取物(PBS/T/Y)用MilliQ水将195毫升0.2摩尔NaH2PO4、305毫升0.2摩尔NaH2PO4和8.994克NaCl、10克细菌培养用胰化蛋白胨、5克酵母提取物制成1升组合物，在带有螺帽盖的试管中以121℃高压灭菌处理15分钟。试管放置培养温度(37℃)直至使用。
在实验中使用金黄色葡萄球菌R37或大肠杆菌O157H7(-vt)两个菌株(如表1的实验)，然后根据微生物抗甘油一月桂酸酯+LPS的滴定，选出甘油一月桂酸酯和LPS对此二菌株的基本联合，以确定对此二种细菌的敏感度金黄色葡萄球菌(含有100毫克LPX(乳过氧化物酶)/升的LPS和20毫克/升甘油一月桂酸酯)和大肠杆菌(含有100毫克LPX/升的LPS和50毫克/升甘油一月桂酸酯)。LPX与葡萄糖氧化酶(GOX)之比为9∶1，并且以12毫克/升加入硫氰酸盐和葡萄糖。
表12各成分对保证该抗微生物体系效力的重要性。抑制程度用微生物对数增长期的初始时间和平台(最大吸光值)时间来定义(37℃培养小时)。
大肠杆菌O157H7
金黄色葡萄球菌R37
再次证明了本申请中方法的效果。
工业实用性本申请人发现关于LPS和甘油一月桂酸酯之间的协同效应(它会如过氧化物酶体系和抗微生物性脂肪酸/脂肪酸衍生物之间的相互作用)具有许多应用价值。其中主要优点在于这种协同性抗微生物效力能在易于产生污染或损坏的产品中再生。这类产品包括食品、化妆品和保健品。
在食品用途中，当脂肪酸成分是甘油一月桂酸酯时本发明特别有益。这反映了以下事实甘油一月桂酸酯具有GRAS状态，并已经用于一些食品中作为乳化剂了。
可使用本发明成分的食品可以是任何易于损坏的食品和饮食补充物及补品。本发明特别适用于乳制品(如酸奶)、鱼制品(特别是水生有壳类动物)和肉制品(包括碎肉和肉骨(carcasses))、以及动物饲料。应当理解，这种“饲料”指的是最通用的意思，可包括水，该饲料所喂养的家畜包括、但不限于牛、绵羊、猪、公山羊、马和鸟类(如家禽)。
对于这种产品，各成分可一起加入，也可单独加入。在一些例子中，当其产品天然含有一种或多种合适量的成分时，只需要仅加入其余成分。
也可加入诸成分，形成一种混合物，作为产品(如乳制品)的一部分，或可以应用于至少部分地涂敷到产品(如鱼制品)上。
当诸成分是单独加入时，可至少将过氧化物酶和脂肪酸/脂肪酸衍生物置于不同容器中，以提供预制包。
也可用抗微生物性组合物的形式将本发明用于一般用途。这种组合物可包括合理量的所有四种成分。然后，可将该组合物用于处理表面(如，用于制备或处理食品的表面或保健品的表面)，以保证至少是减少细菌菌降，如果不是消除所有细菌的话。
本发明的抗微生物性组合物也可用于补充其它制剂的活性，在这种情况下，另外的试剂可分开使用，或更常地作为与现有成分的混合物部分。
还可以包含其它任选成分，理想的是包括其它抗微生物剂、螯合剂、酶和营养补品成分。具体地说，该组合物还可以包括任何下列物质· 螯合剂，如EDTA；· 酚，如对羟基苯甲酸的酯(对羟基苯甲酸酯)，包括羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸乙酯、羟基苯甲酸丙酯、羟基苯甲酸丁酯，或叔丁基羟基苯甲醚(BHA)的庚酯。
· 有机酸，(称作防腐剂)，如富马酸、醋酸、丙炔酸、乳酸、山梨酸、苯甲酸、柠檬酸或这些酸的任何衍生物；· 杆菌素，如乳酸链球菌肽；· 溶菌酶；· 牛奶提取物。
本领域技术人员应该知道，上述描述只是以实施例方式提供的，在不违背本发明范围的情况下可以对其进行改进和/改变，这些只受权利要求的法定范围的限制。
参考文献Gaya，P.，M.Medina和M Nunez.1991.冷藏温度下乳过氧化物酶体系对生牛奶中产单核细胞李斯特菌行为的影像.Appl.Environ.Microbiol.573355-3360。
Kamau，D.N.，S.Doores和K.M.Pruitt.1990.乳过氧化物酶体系增强了对产单核细胞李斯特菌和金黄色葡萄球菌的热破坏作用.Appl.Environ.Microbiol.562711-2716。
Bjorck，L.，C.Rosen，V.Marshall和B.Reiter.1975.乳过氧化物酶体系在牛奶中对假单胞菌和其它革兰阴性细菌的抗微生物活性.Appl.Microbiol.30199-204。
Kabara，J.J.，R.Vrable和M.S.F.Lie Ken Jie.1977.抗微生物性脂质天然与合成的脂肪酸一元酸甘油酯。Lipids12753-759。
Wang，L-L.，和E.A.Johnson.1997.一元酸甘油酯对食物中产单核细胞李斯特菌的控制.J.Food Prot.60131-138。
Wolfson，L.M.和S.S.Sumner.1993.乳过氧化物酶体系的抗微生物活性评论.J.Food Prot.56887-892。
Siragusa，G.R.和M.G.Johnson.1989.乳过氧化物酶-硫氰酸盐-H2O2抗菌体系对产单核细胞李斯特菌生长的抑制作用.Appl.Environ.Microbiol.552802-2805。
Grieve，P.A.，D.D.Dionysius和A.C.Vos.1992.乳过氧化物酶体系对产肠毒素埃希大肠菌菌株的体外抗微生物活性.J.Vet.Med.B 39537-545。
权利要求
1.抗微生物性组合物的制备方法，其特征在于该方法包括形成下列成分的混合物a)过氧化物酶体系(PS)，包括i)过氧化物酶；ii)过氧化物源；iii)能产生抗微生物性氧化产物的辅助因子；b)至少一种脂肪酸或脂肪酸衍生物，其中所述的脂肪酸或衍生物的含量是有效量，能有效地与所述的过氧化物酶体系相互作用，产生更高的抗微生物效力。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的过氧化物酶是乳过氧化物酶。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的过氧化物是过氧化氢。
4.如权利要求1-3中任何一项所述的方法，其特征在于所述的辅助因子选自硫氰酸盐或碘化物。
5.如权利要求1-4中任何一项所述的方法，其特征在于所述的辅助因子是硫氰酸盐。
6.如权利要求1-5中任何一项所述的方法，其特征在于所述的脂肪酸是抗微生物性脂肪酸或脂肪酸的抗微生物性衍生物。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述的抗微生物性脂肪酸或脂肪酸的抗微生物性衍生物的含量至少占所述组合物中脂质总含量的重量5％。
8.如权利要求1-7中任何一项所述的方法，其特征在于所述的成分(b)是或包括选自C8、C10、C12、C14和C16脂肪酸的抗微生物性脂肪酸或其衍生物、或它们的混合物。
9.如权利要求1-8中任何一项所述的方法，其特征在于所述的成分(b)是或包括脂肪酸的抗微生物性酯或它们的盐。
10.如权利要求1-5中任何一项所述的方法，其特征在于所述的成分(b)是或包括甘油一月桂酸酯即1-单十二烷酰-外消旋-甘油酯或其盐，十二烷基硫酸钠。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于所述的成分(b)是甘油一月桂酸酯。
12.如前述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于所述的组合物是将一种或多种成分加入到已经含有其余成分的预制混合物中形成的。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于所述的预制混合物是食品、化妆品或保健品。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于所述的食品是饮食补充物、补品、奶制品、肉制品或鱼制品。
15.如权利要求13所述的方法，其特征在于所述的食品是动物饲料。
16.如权利要求1-11中任何一项所述的方法，其特征在于所述的组合物在形成时由混合的所述成分组成。
17.抗微生物性组合物，其特征在于它用权利要求1-16中任何一项所定义的方法制备。
18.适用于制备抗微生物性组合物的预制组合物，其特征在于它包括至少两种选自以下成分i)过氧化物酶；ii)过氧化物源；iii)能产生抗微生物性氧化产物的辅助因子；iv)至少一种抗微生物性脂肪酸或脂肪酸的抗微生物性衍生物，其中过氧化物酶和过氧化物源都存在时要保持分离。
19.如权利要求18所述的预制组合物，其特征在于所述的过氧化物酶是乳过氧化物酶。
20.适用于制备抗微生物性组合物的预制包，其特征在于它包括置于隔离容器中的过氧化物酶和至少一种抗微生物性脂肪酸或脂肪酸的抗微生物性衍生物。
21.如权利要求20所述的预制包，其特征在于所述的过氧化物酶是乳过氧化物酶。
22.如权利要求20或21所述的预制包，其特征在于所述的套组还包括过氧化物源和/或能产生抗微生物性氧化产物的辅助因子。
23.抗微生物性组合物，其特征在于该组合物包括过氧化物酶、能产生抗微生物性氧化产物的辅助因子和至少一种抗微生物性脂肪酸或脂肪酸的抗微生物性衍生物，其中所述的脂肪酸及其衍生物的含量能有效地与所述的过氧化物酶和所述的辅助因子在过氧化物存在下发生协同性相互作用，从而产生提高的抗微生物效力。
24.如权利要求23所述的抗微生物性组合物，其特征在于该组合物还包含过氧化物源。
25.如权利要求23或24所述的抗微生物性组合物，其特征在于所述的过氧化物酶是乳过氧化物酶。
26.如权利要求23-25中任何一项所述的抗微生物性组合物，其特征在于所述的组合物包括其它抗微生物剂或螯合剂或两者。
27.如权利要求26所述的抗微生物性组合物，其特征在于所述的其它抗微生物剂选自苯酚、有机酸、杆菌素、这些物质的衍生物、和它们的混合物，或者从牛奶中提取的或发现的抗微生物成分或这些成分的混合物。
28.如权利要求26所述的抗微生物性组合物，其特征在于所述的螯合剂是EDTA。
29.如权利要求23-28中任何一项所述的抗微生物性组合物，其特征在于所述的抗微生物性脂肪酸或衍生物选自C8、C10、C12、C14和C16脂肪酸或其衍生物、或它们的混合物。
30.如权利要求23-28中任何一项所述的抗微生物性组合物，其特征在于所述的抗微生物性脂肪酸或衍生物是脂肪酸的抗微生物性酯或其盐。
31.如权利要求23-28中任何一项所述的抗微生物性组合物，其特征在于所述的抗微生物性脂肪酸或衍生物是或包括甘油一月桂酸酯即1-单十二烷酰-外消旋-甘油酯，或其盐。
32.如权利要求31所述的抗微生物性组合物，其特征在于所述的抗微生物性脂肪酸或衍生物是或包括十二烷基硫酸钠，作为甘油一月桂酸酯的盐。
33.如权利要求23-32中任何一项所述的抗微生物性组合物，其特征在于所述的抗微生物性脂肪酸或脂肪酸的抗微生物性衍生物的含量至少占所述组合物中脂质总含量的5重量％。
34.产品，其特征在于它包括下列成分i)过氧化物酶；ii)过氧化物源；iii)能产生抗微生物性氧化产物的辅助因子；iv)至少一种抗微生物性脂肪酸或脂肪酸的抗微生物性衍生物，这种产品能阻止微生物生长。
35.如权利要求34所述的产品，其特征在于所述的过氧化物酶是乳过氧化物酶。
36.如权利要求34或35所述的产品，其特征在于所述的产品能阻止革兰阳性和革兰阴性细菌生长。
37.如权利要求34-36中任何一项所述的产品，其特征在于所述的抗微生物性脂肪酸或脂肪酸的抗微生物性衍生物的含量至少占所述组合物中脂质总含量的5重量％。
38.如权利要求34-37中任何一项所述的产品，其特征在于所述的产品是食品。
39.如权利要求38所述的产品，其特征在于所述的产品是饮食补充物、补品乳制品、肉制品、鱼制品或动物饲料。
40.如权利要求34-37中任何一项所述的产品，其特征在于所述产品是化妆品。
41.如权利要求34-37中任何一项所述的产品，其特征在于所述的产品是保健品。
42.表面处理方法，其特征在于该方法包括将有效量的权利要求23-33中任何一项所述的抗微生物性组合物涂敷到所述表面的步骤。
43.如权利要求42所述的方法，其特征在于所述的表面是用于制备和/或处理食品的表面。
44.使产品产生抗微生物性的产品处理方法，其特征在于该方法包括将权利要求23-33中任何一项所述的有效量的抗微生物性组合物加入到所述产品中的步骤。
全文摘要
过氧化物酶体系如乳过氧化物酶体系(LPS)与抗微生物性脂肪酸或脂肪酸衍生物结合,产生了一种协同性抗微生物性组合物。经披露,这些组合物可用于使表面、以及诸如食品或化妆品类产品有微生物抵抗力。该组合物的优选形式包含过氧化物酶、甘油一月桂酸酯过氧化物源的十二烷基硫酸钠和硫氰酸根离子。
文档编号A23L3/3508GK1350428SQ00807544
公开日2002年5月22日 申请日期2000年5月15日 优先权日1999年5月14日
发明者P·F·芬尼塞, R·S·西蒙兹 申请人:奥它古大学, 塔图阿合作奶制品有限公司