专利名称:检测6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因突变的dna芯片的利记博彩app
技术领域:
本发明涉及一种检测6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因突变的DNA芯片。
中国是一个遗传病大国。遗传病是由于人体生殖细胞或受精卵的遗传物质发生改变而引起的疾病,从亲代传至后代。通常包括三大类单基因遗传病,染色体遗传病和多基因遗传病。从世界范围讲,新生儿中至少2%有明显的先天异常。虽然大多数遗传病的发病率低(多基因病除外)。然而遗传病种类繁多,因此总数很多。仅单基因遗传病就有4000多种,染色体病有100多种,多基因病也不少于100种。并且目前国际上以平均每年发现100多种新单基因遗传病的速度在发展。这也反应了遗传病带给医学,社会和家庭问题的严重性。绝大多数遗传病目前还没有有效的治疗方法,因此预防就显得尤为重要。若能在妊娠早期诊断出胎儿是否患病,对患病胎儿进行人工流产,可防止患儿出生。产前遗传筛检,辅以人工流产,已证明是一种有效预防严重危害健康的遗传病的方法。我国现有残疾人5000万,其中相当数量是遗传病引起的。由于边远地区和某些农村近亲结婚率高,遗传病发病率仍呈现上升趋势,因此广泛开展产前遗传筛检,杜绝患儿出生,降低发病率,对于我国优生优育,提高人口素质起着重要作用。
由于许多遗传病特别是单基因孟德尔型遗传病的基因及基因突变的机制已研究清楚,使我们在基因水平能准确诊断大部分遗传病。在许多发达国家,新生婴儿的遗传筛检很普遍。例如早在60年代,美国法律已规定必须对所有新生婴儿进行苯丙酮酸尿症的筛检。彻底消除了因苯丙酮酸尿症引起的智能障碍儿童的出现。因为如果苯丙酮酸尿症婴儿在出生时便能及时接受特别食谱治疗,就不会出现疾病症状。另外针对特定的新生儿遗传筛检,如针对黑人婴儿的镰刀血球细胞症,犹太婴儿的戴萨克斯症等都已普遍实施。但在中国,由于遗传病种类繁多,传统遗传筛检方法需要较昂贵的仪器,专业人才,高费用等,使我国在产前产后遗传筛检普及方面做得非常不够。这对中国的可持续发展问题,人口素质提高问题,社会保障负担问题都有非常深远的影响。
在产前遗传筛检和人工流产结合,控制遗传病发病率最成功的事例是地中海地区对β地中海贫血症的控制。地中海贫血是一种遗传性溶血性贫血,是世界上最常见和发病率最高的一种单基因遗传病。在地中海地区,美国黑人,东南亚,印度次大陆和中国南方(广东,广西,海南,贵州,四川等省)发病率较高。从1975年以来,地中海地区的塞浦路斯,意大利,Sardinia,和希腊成功地实施了产前遗传筛检和选择性人工流产方法,现在地中海贫血的发病率显著下降了5倍以上。
因为遗传病种类多,每种遗传病所相关基因突变也多。传统的遗传病诊断方法费时费力,且价格昂贵,不适合在中国进行全国性的产前遗传筛检。在现有技术中,6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺乏症等遗传性贫血的诊断主要是利用相关基因突变检测和酶活性分析方法。疾病相关基因突变的检测主要有(1)PCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism),该方法利用多种限制性内切酶对基因扩增产物进行酶切,不同的基因序列将产生不同的电泳图谱(Mercier,B.et al.,Eur.J.Immunogenetics,21,105,1994)。该方法只能应用于当突变改变了某一酶切位点时。该方法的改进是在突变位点引入酶切位点法,即PCR-AIRS(attificial introduction of restrictionsites)(Cotton,R.G.H.Mut.Res.,285,125,1993)。(2)PCR-SSO(sequencespecific oligonucleotide)或PCR-ASO(allele specificoligonucleotide)(Cotton,R.G.H.Mut.Res.,285,125,1993;Saiki,R.K.et al.,Nature,324,163,1986),待测基因经PCR扩增后,分别与15-20bp标记的野生型和突变型探针杂交。该方法需进行同位素标记或地高辛,生物素,过氧化物酶等标记,分析过程复杂,不适宜快速分析。(3)PCR-SSP(sequencespecific primers)或ASPCR(allele specific PCR),其原理是根据已知突变位点的性质在引物中设计一错配碱基,使之仅能扩增突变型或野生型基因。该方法较为快速简便。(Wu,D.Y.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,2757,1989;Rust,S.,et al.,Nucleic Acids Research,21,3623,1993;Newton,R.et al.,Nucleic Acids Research,17,2503,1989)。(4)PCR-SSCP(single-stranded conformation polymorphism),SSCP是指单链DNA分子在中性PAGE中电泳迁移率随其构象改变的性质。因此可作为基因变异的检测方法,最早由Orita用于癌基因点突变和人基因组多态性研究(Orita,M.,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,2766,1989),此法仅能检测基因变异的存在,而不能确定突变的部位和内容。(5)DNA测序法,这是最直观,最准确的方法。但技术复杂价格昂贵,不能作为常规方法。
综上所述,在有关6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺乏症相关基因突变诊断的现有技术中,存在操作繁杂,所需时间长,成本较高,难以自动化及大量样本平行分析等问题。
本发明的目的是提供一种能同时检测6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺乏症所有相关基因突变的检测6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因突变的DNA芯片。
为了达到上述目的本发明采取下列措施检测6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因突变的DNA芯片是利用微机械阵列点样仪将检测各种疾病相关基因突变的DNA探针固定于玻片、硅片、膜、高分子材料载体上,所说的探针为95(1) GAT ACA CAC ATA TTC95(2) GAT ACA CGC ATA TTC371(1)AAC AGC CAC ATG GAT371(2)AAC AGC CGC ATG GAT392(1)CAC CTG GGG TCA CAG392(2)CAC CTG GTG TCA CAG487(1)CAG CAG AGG CTG GAA487(2)CAG CAG AAG CTG GAA493(1)AGG CTG GAA CCG CAT493(2)AGG CTG GGA CCG CAT517(1)GAA GCC CTT CGG GAG517(2)GAA GCC CCT CGG GAG519(2)GAA GCC CTT GGG GAG592(1)GAT CTA CCG CAT CGA592(2)GAT CTA CTG CAT CGA835(1)CGC CTC CAC CAA CTC835(2)CGC CTC CTC CAA CTC1024(1) CGT CGT CCT CTA TGT1024(2) CGT CGT CTT CTA TGT1311(1) ACG CCT ACG AGC GCC1311(2) ACG CCT ATG AGC GCC1360(1) CTT CGT GCG CAG GTG1360(2) CTT CGT GTG CAG GTG1376(1) GAG CTC CGT GAG GC1376(2) GAG CTC CTT GAG GC1388(1) GCC TGG CGT ATT TTC1388(2) GCC TGG CAT ATT TTC本发明与现有技术相比,在一显微镜载玻片或其它载体表面,不同的5’末端氨基修饰DNA探针固定于活性载体表面,因此可同时检测6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺乏症所有相关基因突变。具有平行分析和多重分析的特定。分辨率和灵敏度高,适合于早期诊断单基因遗传性疾病。本发明利用5’末端荧光标记PCR引物,由此标记的PCR产物可应用于生物芯片杂交。同一芯片可同时检测6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的外显子2的95(A-G),外显子5的371(A-G),392(G-T),外显子6的487(G-A),493(A-G),517(T-C),519(C-G),592(G-T),外显子8的835(A-T),外显子9的1024(C-T),外显子11的1311(C-T),1360(C-T),和外显子12的1376(G-T),1388(G-A)突变。本发明也适用于其他已知基因突变的遗传病和其他疾病的检测及单核苷酸多态性(SNP)的检测。
下面结合附图和实施例对本发明作详细说明。
图1是DNA芯片模式图;图2是检测1360(C-T)突变的6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺乏症患者的模拟结果图;图3是检测1360(C-T)突变的6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺乏症患者的杂交结果图。
本发明利用DNA芯片技术检测引起6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺乏症的相关基因突变。开发中国常见遗传病诊断基因芯片将是最好的产前遗传筛检方法。我们已经完成了地中海贫血,血红蛋白异常和苯丙酮酸尿症等遗传病诊断基因芯片。本发明是中国常见遗传病诊断基因芯片系列的一种。如果全国广泛采用我们的中国常见遗传病诊断系列基因芯片进行全面的产前遗传筛检,结合选择性的人工流产,从而彻底杜绝严重影响身体发育,智力发育的遗传病的出现,对提高我国人口素质,减轻社会家庭的负担具有重要的意义。
本发明设计的DNA特异性探针,利用微机械阵列点样仪将设计的DNA探针固定于载体表面(载玻片,硅片,高分子材料,膜);用表面阵列的特异性DNA探针杂交方法来检测6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺乏症遗传病基因的突变。
探针设计6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的外显子2的95(A-G),外显子5的371(A-G),392(G-T),外显子6的487(G-A),493(A-G),517(T-C),519(C-G),592(C-T),外显子8的835(A-T),外显子9的1024(C-T),外显子11的1311(C-T),1360(C-T),和外显子12的1376(G-T),1388(G-A)突变,设计相对应得野生型和突变型DNA探针,固定于芯片表面。相关探针如下6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因突变探针95(1) GAT ACA CAC ATA TTC95(2) GAT ACA CGC ATA TTC371(1)AAC AGC CAC ATG GAT371(2)AAC AGC CGC ATG GAT392(1)CAC CTG GGG TCA CAG392(2)CAC CTG GTG TCA CAG487(1)CAG CAG AGG CTG GAA487(2)CAG CAG AAG CTG GAA493(1)AGG CTG GAA CCG CAT493(2)AGG CTG GGA CCG CAT517(1)GAA GCC CTT CGG GAG517(2)GAA GCC CCT CGG GAG519(2)GAA GCC CTT GGG GAG592(1)GAT CTA CCG CAT CGA592(2)GAT CTA CTG CAT CGA835(1)CGC CTC CAC CAA CTC835(2)CGC CTC CTC CAA CTC1024(1) CGT CGT CCT CTA TGT1024(2) CGT CGT CTT CTA TGT1311(1) ACG CCT ACG AGC GCC1311(2) ACG CCT ATG AGC GCC1360(1) CTT CGT GCG CAG GTG1360(2) CTT CGT GTG CAG GTG1376(1) GAG CTC CGT GAG GC1376(2) GAG CTC CTT GAG GC1388(1) GCC TGG CGT ATT TTC1388(2) GCC TGG CAT ATT TTCDNA探针的固定利用化学或物理方法将设计的DNA探针,以每种探针重复4次固定于载体表面(载玻片,硅片,高分子材料,膜)。构建6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺乏症遗传病诊断DNA专用芯片。样品处理取待测者血液1毫升,利用商业化的基因组DNA抽提试剂盒或标准的苯酚抽提/乙醇沉淀方法提取待测者的基因组DNA,用设计的6组PCR(聚合酶链式反应)引物对6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的外显子2,5,6,8,9,11和12进行扩增。设计的PCR引物如下表;
扩增的体积为50μl,0.5μg基因组DNA,200μM的dNTPs,0.5μM的PCR引物和0.5μM的荧光修饰引物。5μl的10×缓冲液,5U的DNA聚合酶。混合以上PCR产物,加入1/10体积的3M pH5.2醋酸缓冲液,加入2.5倍体积的-20℃冷藏的100%乙醇,混匀后,-20℃放置30分钟。13000rpm离心10分钟,用70%乙醇洗涤沉淀,干燥。DNA芯片表面杂交过程5μl杂交缓冲液(5 X SSC,0.2%SDS)溶解上述DNA,95℃变性5分钟,冷却至室温,滴加于DNA阵列表面,再盖上载玻片,42℃杂交4~8小时。用特定的洗脱条件,洗脱芯片。杂交信号检测用共聚焦荧光显微镜或荧光扫描仪检测DNA芯片杂交信号。
图1为DNA芯片模式图。1载玻片;26-磷酸葡萄糖脱氢酶基因14突变位点的突变探针(14 probes x 5)阵列,从左到右分别对应于95(A-G),371(A-G),392(G-T),487(G-A),493(A-G),517(T-C),519(C-G),592(C-T),835(A-T),1024(C-T),1311(C-T),1360(C-T),1376(G-T),1388(G-A)突变;36-磷酸葡萄糖脱氢酶基因14突变位点的正常探针(14 probes x 5)阵列,从左到右分别对应于95(A-G),371(A-G),392(G-T),487(G-A),493(A-G),517(T-C),519(C-G),592(C-T),835(A-T),1024(C-T),1311(C-T),1360(C-T),1376(G-T),1388(G-A)位点。
图2检测1360(C-T)突变的6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺乏症患者的模拟结果。1玻片;41360(C-T)突变信号;51360正常位点探针;图3 1360(C-T)突变的6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺乏症患者的杂交结果。
权利要求
1.一种检测6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因突变的DNA芯片,其特征在于利用微机械阵列点样仪将检测各种疾病相关基因突变的DNA探针固定于玻片、硅片、膜、高分子材料载体上,所说的探针为95(1) GAT ACA CAC ATA TTC95(2) GAT ACA CGC ATA TTC371(1) AAC AGC CAC ATG GAT371(2) AAC AGC CGC ATG GAT392(1) CAC CTG GGG TCA CAG392(2) CAC CTG GTG TCA CAG487(1) CAG CAG AGG CTG GAA487(2) CAG CAG AAG CTG GAA493(1) AGG CTG GAA CCG CAT493(2) AGG CTG GGA CCG CAT517(1) GAA GCC CTT CGG GAG517(2) GAA GCC CCT CGG GAG519(2) GAA GCC CTT GGG GAG592(1) GAT CTA CCG CAT CGA592(2) GAT CTA CTG CAT CGA835(1) CGC CTC CAC CAA CTC835(2) CGC CTC CTC CAA CTC1024(1)CGT CGT CCT CTA TGT1024(2)CGT CGT CTT CTA TGT1311(1)ACG CCT ACG AGC GCC1311(2)ACG CCT ATG AGC GCC1360(1)CTT CGT GCG CAG GTG1360(2)CTT CGT GTG CAG GTG1376(1)GAG CTC CGT GAG GC1376(2)GAG CTC CTT GAG GC1388(1)GCC TGG CGT ATT TTC1388(2)GCC TGG CAT ATT TTC
全文摘要
本发明公开了一种检测6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因突变的DNA芯片。它是利用微机械阵列点样仪将检测各种疾病相关基因突变的DNA探针固定于玻片、硅片、膜、高分子材料载体上。本发明与现有技术相比,在一显微镜载玻片大小的载体表面固定了不同的5’末端氨基修饰DNA探针,因此可同时检测6-磷酸葡萄糖脱氢酶相关基因突变。具有平行分析和多重分析的特定。分辨率和灵敏度高,适合于早期诊断6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺乏症遗传性疾病。
文档编号C12Q1/68GK1335409SQ0012216
公开日2002年2月13日 申请日期2000年7月23日 优先权日2000年7月23日
发明者叶邦策 申请人:浙江江南生物科技有限公司