专利名称：靶向导人人肝细胞的高效基因工程药物的生产方法
技术领域：
本发明涉及一种利用人乙型肝炎病毒很的的嗜肝细胞特性和拥有肝细胞特异的基因表达的启动子和增强子，通过基因重组技术，将人乙型肝炎病毒改建成病毒基因载体，携带目的基因，从而生产出靶向导入人肝细胞的高效基因工程药物的生产方法。
人类所有的疾病都是基因受损所致，基因治疗将带来人类疾病的治疗史上的一次革命，而基因工程药物的研制、生产已经成为全球投资大热门。截止1998年1月11日，美国FDA已批准218项基因治疗临床试验方案。其中189项应用载体基因治疗项目中，逆转录病毒(107项)仍是最常用的载体，而脂质体(327项)和腺病毒(27项)居次，裸DNA(脱氧核糖核酸)也已开始应用。但是，它们对作为靶细胞的人体细胞都不具有高度靶向选择性和高效稳定转导表达目的基因的性能。而且，逆转录病毒有插人突变及激活癌基因的危险，腺病毒也存在引起宿主体液免疫和细胞免疫的副作用。
本发明的目的是提供一种利用人乙型肝炎病毒很好的嗜人肝细胞特性和拥有肝细胞特异的基因表达启动子和增强子，通过基因重组技术，将人乙型肝炎病毒构成可全身应用，对人肝细胞具有高度靶向选择性、高效稳定转导表达目的基因的载体，携带目的基因，如肿瘤抑制基因P16基因、凝血因子Ⅷ基因、凝血因子Ⅸ基因，低密度脂蛋白(LDL)受体基因等。从而生产出靶向导入人肝细胞的高效基因工程药物的方法。
为上述发明目的，本发明所采用的技术方案是将目的基因插入到已经克隆的人乙型肝炎病毒基因组的多聚酶(pol)基因开放读码框架的tether区，构成重组乙型肝炎的病毒基因单体，再通过分子生物学常规技术，使该重组基因单体两端为限制性内切酶ECORⅠ识别位点(ECORⅠ-ECORⅠ)，最后，将两个ECORⅠ-ECORⅠ单体头尾串联后，克隆到病毒基因表达载体质粒中，并转染到人肝癌细胞系HepG2细胞后，从细胞培养上清液中，就可以大量收获到基因组中含有目的基因的完整的重组人乙型肝炎病毒颗粒，其具体步骤是
一、克隆人乙型炎病毒全基因1、从乙型肝炎病毒阳性血清中提纯乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)2、以HBVDNA为模板，用聚合酶链反应(PCR)技术特异扩增乙型肝炎病毒全基因；3、用合适的限制性内切酶和DNA连接酶，将乙型肝炎病毒全基因插入质粒载体；4、转化工程菌大肠杆菌，培养后选取阳性克隆。
二、特异扩增用于基因治疗的目的基因，如肿瘤抑制基因P16基因，凝血因子Ⅷ基因，凝血因子Ⅸ基因，低密度脂蛋白(LDL)受体基因等。
1、从人组织细胞中提纯总RNA(总核糖核酸)，以此为模板逆转录合成CDNA(互补脱氧核糖核酸)；2、以CDNA为模板，用聚合酶链反应(PCR)技术特异扩增目的基因，并使其两端带上限制性内切酶BstEⅡ的识别位点，以便于将目的基因插入乙型肝炎病毒(HBV)基因中；三、基因重组乙型肝炎病毒(HBV)基因和目的基因1、用限制性内切酶BstEⅡ分别消化、切开HBV基因和目的基因；2、用DNA连接酶，使目的基因插入到HBV基因组中的多聚酶(pol)基因开放读码框架的tether区的BstEⅡ位点中，位于前外膜蛋白(S蛋白)基因(pres1)启动子下游，构成重组HBV基因单体；3、再用限制性内切酶ECORⅠ和DNA连接酶，使带有目的基因的重组HBV基因单体两端为限制性内切酶ECORⅠ识别位点(ECORⅠ-ECORⅠ)，并且将两个(ECORⅠ-ECORⅠ)单体头尾串联；四、重组人乙型肝炎病毒的表达、纯化1、用限制性内切酶ECORⅠ和DNA连接酶，使ECORⅠ-ECORⅠ串联体插入到真核细胞表达质粒载体PT7-1的ECORⅠ位点，构建重组乙型肝炎病毒表达质粒；2、将该表达质粒转化工程菌大肠杆菌BL21(DE3)中，培养后选取阳性克隆并提纯；
3、纯化的表达质粒转染人肝癌细胞系HepG2细胞；4、从细胞培养液中，提纯基因组中含有目的基因的完整的重组人乙型肝炎病毒颗粒；5、真空冷冻干燥，靶向导入人肝细胞的高效基因工程药物，置2-8℃贮藏备用。
采用本发明生产的靶向导入人肝细胞的高效基因工程药物，具有以下优点一、各类肝脏疾病十分常见，对人类健康危害极大，尤其我国是“肝病大国”，因此，为他们的防治提供高效基因工程药物，将具有很好的经济效益和社会效益。如1、原发性肝细胞癌全世界每年新发现病人约26万例，其中我国就有11万例，并且每年死亡人数高达10万以上。
2、病毒性肝炎全世界大约20亿感染乙型肝炎病毒，其中有35亿为慢性感染，另有1亿感染丙型肝炎病毒。我国现有乙型肝炎病人2800万人，每年新增病人约250万人，1.2亿以上的人为乙型肝炎病毒携带者。
3、肝脏代谢性遗传性疾病如苯丙酮酸尿症(发病率为1/16000新生儿)，血友病(发病率为6/100万)，家族性高胆固醇血症(低密度脂蛋白受体缺乏症)等等。
二、很好地解决了目前基因治疗的关健性难题--不能将目的基因特异性地靶向导入人肝细胞，由于乙型肝炎病毒大蛋白(L-蛋白)中，含有聚合人血清蛋白受体(PHSA)和肝细胞受体识别序列，而人肝细胞膜也有PHSA。这样，人血液中的血清白蛋白与乙型肝炎病毒结合后，又能再与人肝细胞膜结合，使得乙型肝炎病毒特异地与人肝细胞结合，决定了它的嗜人肝细胞的特性。而基因重组乙型肝炎病毒仍然具有人血清白蛋白受体和肝细胞受体识别序列，仍然具有很好地嗜人肝细胞特性，能将目的基因靶向导入人肝细胞中，并整合到人基因组上。
三、很好地解决了目前基因治疗无法持续高效表达目的基因，治疗费用高而疗效低的问题。
以往基因治疗的目的基因仅仅只能在体内短暂表达，而基因重组乙型肝炎病毒中目的基因的表达，受乙型肝炎病毒Core-Pd基因表达启动子、Pres基因表达启动子、以及基因表达增强子的调控，能高效表达目的基因，同时基因重组乙型肝炎病毒仍然能在人肝细胞内复制，复制合成的子代基因重组乙型肝炎病毒又能重复特异感染其他的肝细胞。因此，仅需要很少量的(即低滴度)基因重组乙型肝炎病毒，就可以持续高效表达目的基因，使普通民众都能享受到高效的基因治疗。
四、很好地解决了目前基因治疗存在的安全性问题1、目前基因治疗过程中，将病人从未接触过的逆转录病毒和腺病毒成份引入到人体内，有引起插入突变和免疫反应等危险，而用乙型肝炎病毒作基因治疗载体，治疗肝癌和肝炎等疾病就不存在这些危险。
2、目前基因治疗过程中通常是将人肝细胞取出，在体外导入目的基因，然后植入肝脏内，使患者受到了多次组织损伤，并有感染其它微生物的危险。而基因重组乙型肝炎病毒通过自然感染过程(如针刺患者手指，耳垂或者直接静脉注射)，进入人体，然后在体内将目的基因靶向导入肝细胞，完成治疗过程。
下面结合肿瘤抑制基因P16与乙型肝炎病毒基因重组，生产特异性抗肝癌基因工程药物的实施方式，对本发明作进一步详细的说明。
实施例一、采用聚合酶链反应(Polymerase Cherin Reaction,PCR)特异扩增克隆人乙型肝炎病毒全基因1、准备PCR模板--乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV DNA)的提取①、100ul HBV阳性血清，加300ul TES(10m M/L Tris-HCl,PH8.0,5mM/L EDTA,0.5％SDS,50ug蛋白酶K)②、混匀后，65℃水浴3小时；③、加入等体积的酚/氯仿，剧烈振荡；④、15000转/分钟，离心10分钟；⑤、取上层液相，加入1/10体积的3M/L醋酸钠和2倍体积的冷无水乙醇；⑥、混匀后，置-70℃3小时；⑦、15000转/分钟，离心30分钟；⑧、弃上清，低温真空干燥沉淀物3分钟；⑨、加入20ul TES(10M M/L Tris-HCl,1mM/LEDTA)，溶解沉淀的HBV DNA，待用；2、PCR扩增人乙型肝炎病毒基因①全自动核酸合成仪人工合成4条PCR引物，引物核苷酸序列如下引物P1含SpeⅠ酶切位点5＇--GGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTG-3＇SepⅠ引物P2含SpeⅠ酶切位点5＇--CACTGAACAAATGGCACTAGTAAACTGAGCC-3＇SepⅠ引物S1含SalⅠ和SapⅠ酶切位点5＇--CCGGCGTCGACGAGCTCTTCTTTTTCACCTCTGCCTAATCA-3＇SalⅠSapⅠ引物S2含SalⅠ和SapⅠ酶切位点5＇--CCGGCGTCGACGAGCTCTTCAAAAAGTTGCATGGTGCTGG-3＇SalⅠSapⅠ②、取两个PCR反应管，分别标上反应管1和反应管2③、反应管1总反应体积100ul，含下列成分引物S1100PM/L引物P2100PM/LdATP0.2mM/LdGTP0.2mM/LdCTP0.2mM/LdTTP0.2mM/LMgCl21.5mM/L
10×PCR缓冲液 10ulTaqDNA聚合酶2.5UPCR模板(HBVDNA) 10ul④、反应管2与反应管1只是引物不同，其它完全一样，它的引物是引物S2和引物P1；⑤、将反应管1和反应管2同时放入PCR自动扩增仪中，反应条件设定为94℃4分钟后，94℃50秒、50℃90秒、72℃90秒一个循环，30个循环后，于72℃延伸10分钟；⑥、用PCR产物纯化试剂盒纯化扩增产物。
3、将人乙型肝炎病毒基因插入到质粒载体PUC19中。
①、取2个1.5ml离心管，分别标上1和2，离心管1用限制性内切酶酶切乙型肝炎病毒基因，离心管2用同样的内切酶酶切质粒PUC19；②、离心管1反应总体积20ul含无菌去离子水 14.8ul10×酶切缓冲液2ul乙酰化牛血清白蛋白 0.2ulPCR扩增产物2ug2ul限制性内切酶SalⅠ 0.5ul限制性内切酶SpeⅠ 0.5ul混匀后37℃水溶2小时③、离心管2反应总体积20ul含无菌去离子水 16.3ul10×酶切缓冲液2ul乙酰化牛血清白蛋白 0.2ul质粒Puc191ul 1ug限制性内切酶SalⅠ 0.5ul混匀后37℃水溶2小时④、用低熔点琼脂糖凝胶电泳纯化离心管1和2的酶切物(HBVDNA和PUC19)；
⑤、用T4DNA连接酶使HBVDNA插入到PUC19的SalⅠ酶切位点、反应总体积20ul，含无菌去离子水 15.5ulHBVDNA(已酶切纯化) 1ug/1ulPUC19(已酶切纯化)0.55ug/1ulL0×连接缓冲液 2ulT4DNA连接酶 0.5ul混匀后，16℃温溶过夜；⑥、按常规方法，将HBVDNA与PUC19连接混合物转化到工程菌大肠杆菌JM109中；⑦、按常规方法，提取质粒DNA，用酶切法及核苷酸自动测序鉴定阳性克隆，并大量收获PUC-HBV。
二、PCR扩增目的基因-肿瘤抑制基因，并使其两端带上BstEⅡ限制性内切酶酶切位点。
1、用美国Promega公司总RND(总核糖核酸)分离试剂盒，按其说明书载明的方法，从培养的Hela细胞中提取总RNA；2、用美国MBI公司逆转录试剂盒，按其说明书载明的方法，以总RNA为模板合成CDNA(互补脱氧核糖核酸)第一链；3、PCR特异扩增肿瘤抑制基因P16CDNA①、PCR引物用自动核酸合成仪合成，其核苷酸序列如下16A:5＇--GGGGTCACCATGGAGCCGGCGGCGGGGA-3＇BstEⅡ16B＇:5＇--GGGGTCACCATCGGGGATGTCTGAGGA-3＇BstEⅡ②、PCR反应总体积为100ul含CDNA(PCR模板) 1ug引物16A 100PM/L引物16B 100PM/LDATP 0.2mM/L
dGTP 0.2mM/LdCTP 0.2mM/LdTTP 0.2mM/LMgCl21.5mM/L10×PCR反应缓冲液10ulTaq DNA聚合酶2U混匀后，97℃变性8分钟，然后，95℃变性60秒，52℃退火90秒，72℃延伸90秒，这样即为一个循环，28个循环后，于72℃延伸10分钟；③、用PCR产物纯化试剂盒纯化扩增产物，即P16CDNA三、基因重组乙型肝炎病毒基因(PUC-HBV)和肿瘤抑制基因，即将P16CDNA插入到PUC-HBV中的BstEⅡ酶切位点①、BstEⅡ分别酶切P16CDNA和PUC-HBV，反应条件如下总体积20ul，含无菌去离子水 17ul10×酶切缓冲液2ul待酶切DNA1ug 1ulBstEⅡ酶5U5U混匀后，37℃水浴2小时②、用低熔点琼脂糖凝胶电泳纯化酶切产物③、T4DNA连接酶连接酶切后的P16CDNA和PUC-HBV，重组成PUC-HBVP16，反应总体积20ul，含无菌去离子水15.5ulP16CDNA 1ul(1ug)PUC-HBV 1/ul(1ug)10×连接缓冲液 2ulT4DNA连接酶 0.5ul混匀后，16℃温溶过夜；⑥、按常规方法，将连接产物转化到工程菌大肠杆菌JM109中；
⑦、按常规方法，提取质粒酶切鉴定和核苷酸自动测序鉴定阳性克隆，并大量收获PUC-HBVp16；四、将基因重组乙型肚炎病毒基因(即HBVp16)插入到真核表达载体质粒PT7-1的限制性内切酶ECORⅠ中，构建基因表达质粒PT7-(HBVp16)2，即HBVp16基因单体头尾串联成2倍体。
1、使HBVp16两端为ECORⅠ酶切位点(1)、从质粒PUC-HBVp16中，用限制性内切酶SapⅠ酶切取下完整的HBVp16基因，反应总体积20ul含无菌去离子水 15ul10×酶切缓冲液2ulPUC-HBVp162ul(2ug)SapⅠ1ul(1u)混合后，37℃水浴2小时②、用低熔点琼脂糖凝胶电泳纯化酶切产物(即HBVp16)③、T4DNA连接酶连接酶切后的HBVp16自我连接环化，反应总体积50ul含线状HBVp16 10ul(50ug)10×连接缓冲液5ul50％PEG4000 5ul无菌去离子水 29ulT4DNA连接酶 1ul混匀后，22℃水浴1小时④、用限制性内切酶ECORⅠ分别酶切环状HBVp16和质粒PT7-1使它们两端都为ECORⅠ酶切位点，反应总体积20ul，含无菌去离子水 16.3ul1×酶切缓冲液 2ul乙酰化牛血清白蛋白0.2ul(2ug)HBVp16或PT7-1 1ul(1ug)ECORⅠ0.5ul(5U)
⑤、低熔点琼脂糖凝胶电泳纯化酶切产物2、用T4DNA连接酶将HBVp16插入PT7-1的ECORⅠ酶切位点反应总体积20ul含无菌去离子水16.5ulHBVp16 1ul(1ug)PT7-1 1ul(0.5ug)10×连接缓冲液 2ulT4DNA连接酶0.5ul(2U)混匀后，22℃温浴3小时3、按常规方法，将连接产物转化到工程菌大肠杆菌BL21(DE3)中；4、按常规方法，提取质粒酶切鉴定和核苷酸自动测序鉴定，收获阳性克隆，即含质粒PT7-(HBVp16)2的克隆，并大量收获基因表达质粒PT7-(HBVp16)2备用。
五、构建生产抗肝癌基因工程药物的细胞株，而质粒PT7-(HBVp16)2转染人HepG2细胞1、人HepG2细胞培养MEM Eagle培养基(含10mM碳酸氢钠、2mML-谷氨酸、10％胎牛血清，50u/ml青霉素G钠，0.01mg/ml链霉素和5u/ml制霉素)，培养条件37℃5％CO2培养箱20小时。
2、磷酸钙共沉淀法转染HepG2细胞，采用美国promega公司的proFectiln哺乳动物转染系统，操作按厂家说明书进行。
3、收获并纯化抗肝癌的基因工程药物，即含肿瘤抑制基因P16的基因重组乙型肝炎病毒。
①、收获培养四天后的HepG2细胞培养液；②、4℃，5000转/分钟，离心10分钟；③、上清液加到25％蔗糖溶液上(含50mM Tris-HCl,PH8.0,150mM NaCl,10mM EDTA)④、4℃,SW41水平离心转头，150000g离心10小时。
⑤、沉淀重悬于50mM Tris-HCl,PH7.5,150mMNaCl和10mMEDTA的液体中；⑥、加入6mM MgCl2,100ug/ml DNaseⅠ，混匀后37℃,30分钟；⑦、加入1/3体积的26％PEG8000,1.4mM NaCl,25mMEDTA,4℃15000g离心10小时；⑧、收获基因重组的乙型肝炎病毒，真空冷冻干燥，即生产出了特异性抗肝癌的基因工程药物，贮藏于4℃-8℃。
权利要求
1.靶向导入人肝细胞的高效基因工程药物的生产方法，其特征是将目的基因插入到已经克隆的人乙型肝炎病毒基因组的多聚酶(pol)基因开放读码框架的tether区，构成重组乙型肝炎的病毒基因单体，再通过分子生物学常规技术，使该重组基因单体两端为限制性内切酶ECORⅠ识别位点(ECORⅠ-ECORⅠ)，最后，将两个ECORⅠ-ECORⅠ单体头尾串联后，克隆到病毒基因表达载体质粒中，并转染到人肝癌细胞系HepG2细胞后，从细胞培养上清液中，就可以大量收获到基因组中含有目的基因的完整的重组人乙型肝炎病毒颗粒，其具体步骤是(1)克隆人乙型炎病毒全基因a、从乙型肝炎病毒阳性血清中提纯乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)B、以HBVDNA为模板，用聚合酶链反应(PCR)技术特异扩增乙型肝炎病毒全基因；c、用合适的限制性内切酶和DNA连接酶，将乙型肝炎病毒全基因插入质粒载体；d、转化工程菌大肠杆菌，培养后选取阳性克隆。(2)、特异扩增用于基因治疗的目的基因，如肿瘤抑制基因P16基因、凝血因子Ⅷ基因、凝血因子Ⅸ基因、低密度脂蛋白(LDL)受体基因等。a、从人组织细胞中提纯总RNA(总核糖核酸)，以此为模板逆转承合成CDNA(互补脱氧核糖核酸)；b、以CDNA为模板，用聚合酶链反应(PCR)技术特异扩增目的基因，并使其两端带上限制性内切酶BstEⅡ的识别位点，以便于将目的基因插入乙型肝炎病毒(HBV)基因中；(3)、基因重组乙型肝炎病毒(HBV)基因和目的基因a、用限制性内切酶BstEⅡ分别消化，切化HBV基因和目的基因；b、用DNA连接酶，使目的基因插入到HBV基因组中的多聚酶(pol)基因开放读码框架的tether区的BstEⅡ位点中，位于前外膜蛋白(S蛋白)基因(pres1)启动子下游，构成重组HBV基因单体；c、再用限制性内切酶ECORⅠ和DNA连接酶，使带有目的基因的重组HBV基因单体两端为限制性切酶ECORⅠ识别位点(ECORⅠ-ECORⅠ)，并且将两个(ECORⅠ-ECORⅠ)单体头尾串联；(4)、重组人乙型肝炎病毒的表达，纯化a、用限制性内切酶ECORⅠ和DNA连接酶，使ECORⅠ-ECORⅠ串联体插入到真核细胞表达质粒载体DT7-1的ECORⅠ位点，构建重组乙型肝炎病毒表达质粒；b、将该表达质粒转化工程菌大肠杆菌EL21(DE3)中，培养后选取阳性克隆并提纯；c、纯化的表达质粒转染人肝癌细胞系HepG2细胞；d、从细胞培养液中，提纯基因组中含有目的基因的完整的重组人乙型肝炎病毒颗粒；f、真空冷冻干燥，得靶向导入人肝细胞的高效基因工程药物，置2-8℃贮藏备用。
全文摘要
靶向导入人肝细胞的高效基因工程药物的生产方法,其将目的基因插入克隆的人乙肝病毒基因组的多聚酶基因开放读码框架tether区,构成重组乙肝的病毒基因单体,再通过生物学常规技术,使该重组基因单体两端为限制性内切酶识别位点;单体头尾串联后,克隆到病毒基因表达载体质粒中,并转染到人肝癌细胞系HepG2细胞后,从上清液中收获含有目的基因的完整的重组人乙肝病毒颗粒。利用本发明生产的靶向导入人肝细胞的高效基因工程药物,具有对人肝细胞的嗜性和在人肝细胞内复制的能力,低剂量就可以进行靶向基因治疗肝脏疾病,安全高效。
文档编号C12N15/09GK1313385SQ0011331
公开日2001年9月19日 申请日期2000年3月9日 优先权日2000年3月9日
发明者李玉波 申请人:李玉波