专利名称：生产嘌呤核苷酸的方法
技术领域：
本发明涉及生产作为调味剂被大量需求的嘌呤核苷酸的方法，以及对所述方法有用的微生物。
5’-鸟苷酸(下文简称为GMP)和5’-肌苷酸(下文简称为IMP)是表现出强的增味活性的嘌呤核苷酸，其被广泛用作化学调味成分。
已知一些生产上述增味核苷酸的方法例如，包括用核糖核酸酶P1水解提取自酵母细胞的RNA，然后分离和纯化所需的5’核苷酸的方法[食品技术，18，287(1964)]；通过使用具有生产IMP之能力的微生物进行发酵以直接生产IMP的方法[农业和生物化学，46，2257(1982)]；包括通过化学磷酸化将如肌苷和鸟苷的核苷转变为核苷酸的方法[日本化学会公报，42，3505(1969)]；包括使用巨大芽孢杆菌的突变体进行发酵以生产5-氨基-4-咪唑氨甲酰核苷(下文简称为AICAR)，然后通过化学合成由AICAR生产核苷酸的方法[生物技术与生物工程，9，329(1967)；有机化学杂志，32，1825(1967)]；和包括在培养基中培养生产5’-黄苷酸(下文简称为XMP)的产氨棒状杆菌突变体以形成和积累XMP，培养经自身-克隆使其XMP氨基酶(GMP合成酶)活性增强的大肠杆菌，然后使用经培养的大肠杆菌细胞作为酶源，通过酶反应由XMP生产GMP的方法[Biosci.Biotech.Biochem，61，840(1997)；日本公开未审专利申请233798/88]。
总的说来，迄今为止已开发的生产增味核苷酸的方法在原理上可分为三类[Shoichi Takao等(编)，Oyo Biseibutsugaku(应用微生物学)，Buneido Shuppan(1996)](1)酵母RNA被得自微生物的酶降解或被化学降解的方法(RNA降解法)，(2)通过在含有糖，氮源和磷酸源的培养基中培养微生物的突变体以直接生产核苷酸的方法(直接发酵法)，和(3)包括通过发酵生产核苷酸合成所用的中间体，并通过化学或酶学方法将所述中间体转变为核苷酸的方法(该方法是发酵和化学合成或酶促转变的联合)。
在RNA降解法(上文方法(1))中，所产生的嘧啶核苷酸的量与增味的嘌呤核苷酸的量几乎相同，因此，必需的纯化步骤变得复杂。在直接发酵法(上文方法(2))中，由于核苷酸的膜透性低，难以培养能在细胞外形成和积累相当量的核苷酸的微生物，因此难以获得在经济上令人满意的核苷酸生产能力。具体地说，迄今为止还没有一种方法可以直接生产GMP。然而，已知XMP可例外地大量形成和积累[Shoichi Takao等(编)，Oyo Biseibutsugaku(应用微生物学)，BuneidoShuppan(1996)]。目前，在经济上有利的生产增味核苷酸的方法是发酵和化学合成或酶促转变的联合(方法(3))，该方法可广泛用于工业化生产核苷酸。
在此联合方法中，改善整个生产能力的一个要点是增加发酵步骤(此方法的第一阶段)中核苷酸合成所用中间体的产量。为此，培养了大量具有高的XMP，鸟苷或肌苷生产能力的微生物[农业和生物化学，42，399(1978)；农业和生物化学，43，1739(1979)；农业和生物化学，46，2347(1982)]。
已开发了多种将中间体化学或酶学转变为核苷酸的方法(此方法的第二阶段)。关于化学方法，在工业上使用的是位点特异性磷酸化反应(核苷至5’-核苷酸)[日本化学会公报，42，3505(1969)]。然而，化学磷酸化反应需要中间步骤以将作为磷酸基团受体的核苷纯化至必需的程度，除了用于发酵步骤发酵罐外还需要使用化学反应容器。因此，作为替代方法，人们注意到使用氨基酶或磷酸化酶的酶法，并对其进行了研究。至于氨基化，使用XMP氨基酶的方法是已知的[ShoichiTakao等(编)，Oyo Biseibutsugaku(应用微生物学)，BuneidoShuppan(1996)]。
至于磷酸化，使用磷酸转移酶，激酶和磷酸酶的方法是已知的。特别是已证明使用激酶或磷酸酶的反应是有效的方法。例如，已开发了一种通过使用大肠杆菌菌株生产5’-核苷酸的方法，该菌株携有编码大肠杆菌肌苷-鸟苷激酶的基因(WO91/08286)；还开发了一种通过使用产氨棒状杆菌菌株生产5’-核苷酸的方法，该菌株携有编码乙酰微小杆菌肌苷-鸟苷激酶的基因(WO96/30501)；和另一种通过使用大肠杆菌菌株生产5’-核苷酸的方法，该菌株携有通过将随机突变引入摩氏摩根氏菌的磷酸酶基因而制备的基因[日本公开未审专利申请37785/97，日本公开未审专利申请201481/98]。
至于磷酸基团供体，已研究了多种化合物。例如，使用下列物质的方法是已知的P-硝基苯基磷酸(日本公开未审专利申请2985/64)，无机磷酸(日本公开未审专利申请1186/67，日本公开未审专利申请44350/74)，多聚磷酸(日本公开未审专利申请56390/78)，乙酰磷酸(日本公开未审专利申请82098/81)，ATP(日本公开未审专利申请230094/88)，多聚磷酸，苯基磷酸和氨甲酰磷酸(日本公开未审专利申请37785/97)和焦磷酸(日本公开未审专利申请37785/97，日本公开未审专利申请201481/98)。
然而，由于所用的底物是昂贵的或不稳定的，而且因产物反应的形成使得纯化步骤变得复杂等，这些方法在工业上无利可图。有关符合经济需求的实用方法，已开发了使用ATP-再生系统的核苷酸生产系统。在此系统中，微生物在糖类代谢的过程中利用无机磷酸由AMP或ADP再生ATP。例如，已建议使用一种方法，其中可生产XMP的微生物所具有的通过代谢葡萄糖以生物合成ATP的活性被用作ATP再生系统。多篇文献教导了使用便宜的葡萄糖和无机磷酸作为ATP再生底物而不是使用ATP生产GMP的方法，该方法中将上述ATP-再生系统与能由XMP和ATP形成GMP的微生物的XMP氨基酶活性相结合[Biosci.Biotech.Biochem，61，840(1997)]，类似的方法使用肌苷激酶作为酶以生产IMP(日本公开未审专利申请230094/88)。
用于生产GMP或IMP的方法中使用了两种微生物，所述方法包括通过直接发酵生产XMP，鸟苷或肌苷的发酵步骤，和将发酵产物酶促转变为GMP或IMP的反应步骤。
即，在作为该方法第一阶段的发酵步骤中，将突变体培养物用作生产XMP-，鸟苷-或肌苷-的微生物(生产微生物)。在作为该方法第二阶段的氨基化或磷酸化的反应步骤中，使用了携有高表达基因的微生物(转变微生物)，所述基因编码的蛋白质具有XMP氨基酶活性或肌苷-鸟苷激酶活性。
通过第二阶段所用的转变微生物和第一阶段所用的生产微生物的ATP再生活性，可再生第二阶段反应所必需的ATP。
因此，第二阶段的反应步骤是将XMP氨基酶活性或肌苷-鸟苷激酶活性与两种微生物的ATP再生活性相结合的系统。
整个方法的概况将在下文描述。
首先，在大发酵罐中，在主要含有糖和氮源的培养基中培养生产微生物以形成和积累XMP，鸟苷或肌苷。另外，在小发酵罐中培养转变微生物。当第一阶段的发酵完成之后，将分开培养的转变微生物加入大发酵罐中以在便宜的能量供体和磷酸基团供体的存在下进行磷酸化反应或氨基化反应。
相对于上述化学磷酸化方法而言，利用酶反应的上述方法是有利的。然而，该方法的效率仍不能令人十分满意，因为培养转变微生物必需小发酵罐，考虑到需加入转变微生物，第一阶段的发酵步骤所用的培养基必需减少，这会减少每批所得的所需核苷酸的量。
本发明的目的是开发一种能在一个发酵罐中有效生产嘌呤核苷酸的方法。
本发明人寻求开发更好的生产嘌呤核苷酸之方法的可能性，该方法通过将能由其前体合成嘌呤核苷酸的酶的基因导入能生产嘌呤核苷酸前体的发酵微生物中，并调节该基因在发酵步骤和反应步骤中的表达，可仅在一个发酵罐中使用一种微生物依次进行生产核苷酸前体的发酵过程和将所述前体转变为核苷酸的反应。在寻求可能性的过程中进行了创造性的研究，结果完成了本发明。
本发明涉及下列(1)-(19)。(1)生产嘌呤核苷酸的方法，所述方法包括在培养基中培养微生物，该微生物能生产嘌呤核苷酸前体，并携有导入的DNA，所述DNA可诱导和表达能由所述前体合成嘌呤核苷酸的酶；使所述的嘌呤核苷酸前体在培养基中积累；诱导和表达能由所述前体合成嘌呤核苷酸的酶；由所述前体形成嘌呤核苷酸并在培养基中积累；从培养基中回收所述的嘌呤核苷酸。(2)根据上文(1)的方法，其中嘌呤核苷酸的前体是5’-黄苷酸，能由所述前体合成嘌呤核苷酸的酶是5’-黄苷酸氨基酶，嘌呤核苷酸是5’-鸟苷酸。(3)根据上文(1)的方法，其中嘌呤核苷酸的前体是鸟苷，能由所述前体合成嘌呤核苷酸的酶是肌苷-鸟苷激酶或磷酸酶，嘌呤核苷酸是5’-鸟苷酸。(4)根据上文(1)的方法，其中嘌呤核苷酸的前体是肌苷，能由所述前体合成嘌呤核苷酸的酶是肌苷-鸟苷激酶或磷酸酶，嘌呤核苷酸是5’-肌苷酸。(5)根据上文(1)的方法，其中微生物属于选自棒状杆菌，大肠杆菌和芽孢杆菌的属。(6)根据上文(1)的方法，其中微生物是产氨棒状杆菌。(7)根据上文(1)的方法，其特征在于通过改变条件或通过将碳源由糖改变为非糖来诱导和表达能合成嘌呤核苷酸的酶，所述条件的改变选自温度的升高，pH的升高和渗透压的升高。(8)根据上文(7)的方法，其中非糖碳源是醋酸或醋酸盐。(9)可诱导和表达能由其前体合成嘌呤核苷酸的酶的DNA。(10)根据上文(9)的DNA，该DNA通过改变条件或通过将碳源由糖改变为非糖来诱导和表达能合成嘌呤核苷酸的酶，所述条件的改变选自温度的升高，pH的升高和渗透压的升高。(11)根据上文(10)的DNA，其中非糖碳源是醋酸或醋酸盐。(12)根据上文(9)或(10)的DNA，该DNA是pLAC857或pIGK2。(13)微生物，该微生物能生产嘌呤核苷酸前体，并携有导入的DNA，所述DNA可诱导和表达能由所述前体合成嘌呤核苷酸的酶。(14)根据上文(13)的微生物，其中嘌呤核苷酸的前体是5’-黄苷酸，能由所述前体合成嘌呤核苷酸的酶是5’-黄苷酸氨基酶，嘌呤核苷酸是5’-鸟苷酸。(15)根据上文(13)的微生物，其中嘌呤核苷酸的前体是鸟苷，能由所述前体合成嘌呤核苷酸的酶是肌苷-鸟苷激酶或磷酸酶，嘌呤核苷酸是5’-鸟苷酸。(16)根据上文(13)的微生物，其中嘌呤核苷酸的前体是肌苷，能由所述前体合成嘌呤核苷酸的酶是肌苷-鸟苷激酶或磷酸酶，嘌呤核苷酸是5’-肌苷酸。(17)根据上文(13)的微生物，其中微生物属于选自棒状杆菌，大肠杆菌和芽孢杆菌的属。(18)根据上文(13)的微生物，其中微生物是产氨棒状杆菌。(19)根据上文(18)的微生物，其中微生物是产氨棒状杆菌ATCC6872/pLAC857(FERM BP-6639)或产氨棒状杆菌ATCC 6872/pIGK2(FERMBP-6638)。
附图简述
图1显示了质粒pLAC857的结构。
图2显示了质粒pGUA2的结构。
图3显示了质粒pIGK2的结构。
图中所用的符号表示PLPL启动子guaA大肠杆菌的XMP氨基酶基因C.glt ORI谷氨酸棒状杆菌的复制起点Spcr壮观霉素抗性基因cI857温度敏感型阻抑蛋白基因TICL谷氨酸棒状杆菌的异柠檬酸裂合酶基因的终止子igk大肠杆菌的肌苷-鸟苷激酶基因Kmr卡那霉素抗性基因Apr氨苄青霉素抗性基因大肠杆菌ORI大肠杆菌的复制起点本发明提供了这样一种方法，其中在一个发酵罐中使用一种微生物依次进行通过直接发酵生产嘌呤核苷酸前体的发酵过程和将所述发酵步骤中生产的前体酶促转变为嘌呤核苷酸的反应步骤。
已发现下列三个需求对所述方法的建立是至关重要的。
第一个需求是在通过直接发酵生产嘌呤核苷酸前体的发酵过程中，编码能由其前体合成嘌呤核苷酸之酶的基因的表达需要被抑制到某一水平以使发酵基本上不被干扰。
如果所述酶的表达不被抑制，发酵过程中会通过所述酶的活性在细胞内形成和积累嘌呤核苷酸，而且，因下列原因使得发酵产量降低当GMP作为嘌呤核苷酸被积累时，诱导了嘌呤生物合成途径中的关键酶的反馈抑制，从而停止生产XMP。当IMP被积累时，肌苷的生成形成无效循环，导致ATP的浪费。因此，细胞内形成和积累嘌呤核苷酸降低了发酵产量，这可导致经济损失。
第二个需求是在由其前体合成嘌呤核苷酸的反应步骤中，能由其前体合成嘌呤核苷酸的酶的活性需要被充分诱导。
第三个需求是经发酵和诱导处理的生产微生物需要保留足够的ATP再生活性和转变反应所需的磷酸化或氨基化活性，这些活性需要在反应步骤中充分发挥作用以由其前体合成嘌呤核苷酸。
用于本发明的微生物可以是野生型菌株，突变体，融合的细胞系，转导子或利用重组DNA技术得到的重组菌株，条件是该微生物能生产嘌呤核苷酸的前体并具有ATP再生活性。优选的微生物包括属于棒状杆菌，大肠杆菌和芽孢杆菌属的微生物，它们可用于核酸发酵和氨基酸发酵。特别优选的是具有强的ATP再生活性的产氨棒状杆菌。
嘌呤核苷酸的前体包括XMP，鸟苷，肌苷，腺苷等。
ATP再生活性指的是在微生物代谢糖以作为能量供体底物的方法中，使用无机磷酸由AMP或ADP再生ATP的活性。这一ATP再生系统是糖类代谢系统和能量代谢系统，如糖酵解途径，TCA循环和电子转运系统的一部分，几乎所有微生物都具有此活性。
用于本发明的具体微生物的例子包括下列菌株及其衍生的突变体。
产氨棒状杆菌ATCC 6872产氨棒状杆菌ATCC 21295产氨棒状杆菌ATCC 21477谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032谷氨酸棒状杆菌ATCC 14067谷氨酸棒状杆菌ATCC 13869大肠杆菌ATCC 14948大肠杆菌ATCC 11303大肠杆菌ATCC 9637枯草芽孢杆菌ATCC 14618至于本发明中使用的能由其前体合成嘌呤核苷酸的酶，可使用任何能由其前体合成嘌呤核苷酸的酶，适当的例子包括XMP氨基酶，肌苷-鸟苷激酶，磷酸酶和腺苷酸激酶。
编码上述酶的DNA的例子见下文。
编码XMP氨基酶的基因包括那些得自大肠杆菌[核酸研究，13，1303(1985)]，枯草芽孢杆菌[核酸研究，18，6710(1990)]，产氨棒状杆菌(基因库编号g2765074)等基因。
编码肌苷-鸟苷激酶的基因包括那些得自大肠杆菌(WO91/08286)，乙酰微小杆菌(WO96/30501)等的基因。
编码磷酸酶的基因包括那些得自摩氏摩根氏菌(日本公开未审专利申请37785/97，日本公开未审专利申请201481/98)等的基因。
编码腺苷酸激酶的基因包括那些得自酿酒酵母[生物化学杂志，263，19468(1988)]的基因。
可通过已知方法得到编码能由其前体合成嘌呤核苷酸的酶的基因。
例如，对编码XMP氨基酶的基因而言，可根据XMP氨基酶结构基因序列两端的序列合成引物，使用制备的引物和大肠杆菌染色体DNA，枯草芽孢杆菌染色体DNA或产氨棒状杆菌染色体DNA，通过聚合酶链反应(PCR)法可得到XMP氨基酶结构基因。
对编码肌苷-鸟苷激酶的基因而言，可根据肌苷-鸟苷激酶结构基因序列两端的序列合成引物，使用制备的引物和大肠杆菌染色体DNA或乙酰微小杆菌染色体DNA，通过PCR法可得到肌苷-鸟苷激酶结构基因。类似地，通过使用PCR法，可由摩氏摩根氏菌染色体DNA得到磷酸酶结构基因，可由酿酒酵母染色体DNA得到腺苷酸激酶的结构基因。
将由此获得的编码能由其前体合成嘌呤核苷酸的酶的基因插入适当的诱导型表达载体中，以使基因处于能调控其诱导和表达的转录和翻译信号的控制之下，籍此得到可调控所述基因之表达的重组质粒。
对诱导型表达载体没有特别的限制，只要它能在所用的微生物中复制并满足下列三个条件即可。
首先，需将编码能由其前体合成嘌呤核苷酸之酶的基因的表达抑制到某一水平，以使通过直接发酵生产嘌呤核苷酸前体的发酵步骤中的发酵基本上不被干扰。
第二，在由其前体合成嘌呤核苷酸的反应步骤之前进行诱导处理以充分诱导能由其前体合成嘌呤核苷酸之酶的活性。
第三，所述诱导方法是在诱导处理之后能使生产微生物保留足够的ATP再生活性和转变活性的方法。
满足上述三个条件的载体的例子包括pPAC31，其含有PL启动子/cI857阻抑蛋白基因，在高温下可被诱导(WO98/12343)；pBB1，其含有lac启动子/lacIts阻抑蛋白基因，在高温下可被诱导(基因，70，415(1988))；pRK248cIts，其含有PL启动子/cI857阻抑蛋白基因，在高pH下可被诱导[基因，97，125(1991)]；pOSEX2，其含有proU表达-调控区，在高渗透压下可被诱导[基因，151，137(1994)]；pTrc99A，其含有trc启动子/lacIq阻抑蛋白基因，可被异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导[基因，69，301(1988)]；pAL9181，其含有araBAD启动子/araC阻抑蛋白基因，可被L-阿拉伯糖诱导[应用微生物学与生物技术，37，205(1992)]，以及通过将碳源由糖变为非糖而诱导的载体。这些载体是为大肠杆菌构建的诱导型表达载体。
另外，也可以使用通过用突变技术或重组DNA技术修饰与上述诱导型表达载体中的表达调控相关的转录-翻译信号区域得到的载体。
当这些已知的诱导型表达载体或经进一步改良的载体被用于非大肠杆菌的宿主细胞时，应在其中插入在宿主中起作用的复制起点。例如，当产氨棒状杆菌被用作宿主时，可在所述载体中插入得自谷氨酸棒状杆菌之质粒的复制起点，该复制起点可在产氨棒状杆菌或类似菌株中起作用。
得自谷氨酸棒状杆菌的质粒包括pCG1(日本公开未审专利申请134500/82)，pCG2(日本公开未审专利申请35197/83)，pCG4(日本公开未审专利申请183799/82)，pAM330(日本公开未审专利申请67699/83)和pAG1，pAG3，pAG14和pAG50(日本公开未审专利申请166890/87)。
在棒状杆菌中起作用的优选载体包括可通过升温被诱导的质粒载体，该载体是通过将高温下可被诱导的大肠杆菌载体pPAC31携有的PL启动子/cI857基因与可在棒状杆菌中自主复制的载体连接而制备的；和能被非糖碳源，如醋酸诱导的载体pCEX2(日本公开未审专利申请224259/91)。
另一方面，当与诱导型表达载体中的基因表达调控相关的转录-翻译信号不在所用的微生物中起作用时，或当其起作用，但上述三个需求不能充分满足时，必需通过突变技术或重组DNA技术改良所述转录-翻译信号区域以使上述三个需求能被满足，或必需研制适用于所述微生物的新的诱导和表达系统。在前一种情况下，可通过例如涉及所用微生物的已知转录-翻译信号序列的定点诱变进行改良。在后一种情况下，可根据为大肠杆菌等构建的上述一般性诱导-表达系统的研制方法开发和构建新系统。
携有可诱导的-表达系统的微生物的优选例子为产氨棒状杆菌菌株，分别将温度诱导型质粒载体和能通过加入便宜的醋酸调控表达的pCEX2用作基因诱导和表达系统可产生这些菌株，所述温度诱导型质粒载体是通过将高温下可被诱导的大肠杆菌载体pPAC31携有的PL启动子/cI857基因与可在棒状杆菌中自主复制的载体连接而制备的。
在本发明中，编码能由其前体合成嘌呤核苷酸的酶的基因可存在于载体质粒中，或可掺入宿主微生物的染色体中，只要满足上述三个需求即可。即，可使用携有含基因之质粒的菌株或基因已掺入染色体中的菌株，只要所述基因的表达能被适当调控即可。
通过使用原生质体法，电脉冲法，氯化钙法，和分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社(1989)(下文简称为分子克隆，第2版)所述的常规方法等，可将含有编码能由其前体合成嘌呤核苷酸之酶的基因的诱导型表达质粒导入生产嘌呤核苷酸前体的微生物中。
例如，当棒状杆菌属的细菌被用作宿主微生物时，特别有效的方法是原生质体法(日本公开未审专利申请183799/82)和电脉冲法(日本公开未审专利申请207791/90)。当大肠杆菌被用作宿主微生物时，也可使用氯化钙法[分子生物学杂志，53，159(1970)]等。
通过在含有碳源，氮源和无机物，以及必需的痕量有机营养物的普通培养基中，培养本发明所得的携有编码能由其前体合成嘌呤核苷酸之酶的导入基因的转化子以形成和积累嘌呤核苷酸前体，然后对所得培养物进行诱导处理，如加热或加入醋酸即可诱导和表达能由其前体合成嘌呤核苷酸的酶。
至于上述发酵步骤所用培养基中的碳源，可使用任何能被所述微生物同化的碳源。适当碳源的例子是糖类，如葡萄糖，果糖，蔗糖，糖蜜，赤糖糊和淀粉水解物；醇类，如乙醇，甘油和山梨糖醇；有机酸，如丙酮酸和乳酸，和如甘氨酸，丙氨酸，谷氨酸和天冬氨酸的氨基酸。其优选浓度范围为5-30％。
氮源的例子包括氨，多种无机和有机铵盐，如氯化铵，硫酸铵，硝酸铵，碳酸铵，醋酸铵和磷酸铵，尿素，多种氨基酸，蛋白胨，NZ胺，肉汁浸膏，酵母膏，玉米浸出汁，酪蛋白水解物，鱼粉及其消化物。
无机物的例子包括磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，硫酸镁，磷酸镁，氯化钠，硫酸铁，硫酸锰，硫酸锌和碳酸钙。
当所用微生物需要特别的营养成分，如氨基酸，核酸和维生素用于生长时，可在培养基中加入适当量的这些物质。
在需氧条件下进行培养，例如，在通气条件下进行振荡培养或旋动培养。最适温度通常是26-37℃，培养期通常为1至5天。
在适用于所用载体的条件下进行诱变处理以表达编码能由其前体合成嘌呤核苷酸之酶的基因；例如，优选在下列条件下处理下述载体。
pPAC31或pBB137-42℃通气旋动培养1-24小时pRK248cItspH9下培养1-24小时pOSEX250-300 mmol/l NaCl存在下培养1-24小时pTrc99A0.1-0.5 mmol/l IPTG存在下培养1-24小时pAL9181加入0.2％L-阿拉伯糖培养1-24小时pCEX2加入0.1-2％醋酸铵或醋酸钠培养1-24小时优选在反应步骤中加入表面活性剂以由其前体合成嘌呤核苷酸。
至于表面活性剂，优选可促进嘌呤核苷酸渗透穿过细胞膜的表面活性剂。适当的例子是阳离子表面活性剂，如聚氧化乙烯硬脂胺(如Nymeen S-215，NOF公司)，鲸蜡基三乙基溴化铵，Cation FB和CationF2-40E；阴离子表面活性剂，如硫酸油酰基钠(sodium oleylamidesulfate)，Newrex TAB和Rapizole 80；和兼性表面活性剂，如聚氧乙烯山梨糖醇酐一硬脂酸(如Nonion ST221)。表面活性剂的常用浓度为0.1-50mg/ml，优选为1-20mg/ml。
于20-40℃，pH 6-8时，将由其前体合成嘌呤核苷酸之步骤中的反应进行1-48小时。
完成反应之后，可通过已知方法回收反应混合物中形成和积累的嘌呤核苷酸，所述方法如除去微生物细胞并通过浓缩结晶核苷酸，活性炭处理和离子交换树脂法[Isao Endo等，Kagakukogakkai(TheSociety of Chemical Engineers，Japan)(编)Bioseparation ProcessBinran(生物分离方法手册)，Kyoritsu Shuppan(1996)]。
下列实施例阐明了本发明的某些实施方案，这些实施例并不能限制本发明的范围。除非特别说明，根据分子克隆，第2版所述的方法进行基因工程方法。实施例1构建生产XMP的产氨棒状杆菌菌株并由该菌株生产GMP，所述菌株携有处于PL启动子控制之下的大肠杆菌XMP氨基酶基因(1)构建诱导型表达质粒pLAC857，该质粒能通过温度的改变调节XMP氨基酶基因的表达通过下列两个步骤由已知质粒pPLA66构建热诱导型表达质粒pLAC857。pPLA66是高水平表达XMP氨基酶的质粒，通过将XMP氨基酶基因连接至PL启动子与trpL SD序列的下游即可构建该质粒[Biosci.Biotech.Biochem.，61，840(1997)]。
按下列方法将温度敏感型阻抑蛋白基因cI857插入质粒pPLA66。
用EcoRI(5单位)和BglII(5单位)裂解质粒pPLA66(1μg)，通过琼脂糖凝胶电泳分离裂解的片断，使用QIAEXII(QIAGEN有限公司)从凝胶中回收DNA片断，该片断含有PL启动子和得自大肠杆菌的XMP氨基酶基因(guaA基因)区域。
用EcoRI(5单位)和BamHI(5单位)裂解携有cI857基因的质粒pPAC31(WO98/12343)(1μg)，通过琼脂糖凝胶电泳分离裂解的片断，从凝胶中回收DNA片断，该片断含有cI857基因，氨苄青霉素抗性基因和得自大肠杆菌的复制起点。
使用连接试剂盒(Takara Shuzo有限公司)将含有所述基因的DNA片断和先前制备的含有guaA基因的DNA片断相连接。
使用连接混合物转化大肠杆菌JM109(Takara Shuzo有限公司)，然后铺于含有100μg/ml氨苄青霉素的L琼脂培养基上，得到氨苄青霉素抗性转化子。
通过碱性细菌裂解法从所得转化子中提取质粒DNA。
用多种限制性酶裂解质粒并分析之，从而证实得到质粒pLA857，其含有XMP氨基酶基因，cI857基因，氨苄青霉素抗性基因和在大肠杆菌中自主复制的质粒的复制起点，它们处于PL启动子控制之下。
按下列方法将在棒状杆菌中自主复制的质粒的复制起点插入质粒pLA857。
用PstI(5单位)裂解质粒pLA857(1μg)上存在的唯一的PstI-裂解位点，通过琼脂糖凝胶电泳分离裂解的片断，从凝胶中回收这些片断，籍此得到pLA857的PstI-裂解片断。
用PstI(5单位)裂解可在产氨棒状杆菌中复制的质粒载体pCG116(日本公开未审专利申请265892/89)(1μg)，通过碱性磷酸酶处理进行DNA去磷酸化以防止再结合之后，用苯酚提取并用乙醇沉淀，从而得到pCG116的PstI-裂解片断。
使用上述连接试剂盒将所得的pLA857的PstI-裂解片断与pCG116的PstI-裂解片断相连接。
利用电脉冲法[应用微生物学与生物技术，30，283(1989)]将1μg通过连接处理得到的DNA转化至产氨棒状杆菌ATCC 6872中，然后铺于含有100μg/ml壮观霉素的A琼脂培养基上
。
通过碱性细菌裂解法从所得的壮观霉素抗性转化子中提取质粒DNA。
用多种限制性酶裂解质粒并分析之，从而证实所得转化子携有质粒pLAC857，其具有
图1所示的所需结构。
根据布达佩斯条约，于1999年2月5日将携有pLAC857的产氨棒状杆菌ATCC 6872/pLAC857保藏于日本工业科学和技术研究院，国立生物科学和人类-技术研究所(National Institute of Bioscienceand Human-Technology，Agency of Industrial Science andTechnology)，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-0046，其保藏号为FERM BP-6639。(2)测定通过将pLAC857导入菌株FERM BP-1261所制备菌株的XMP氨基酶活性通过碱性细菌裂解法从产氨棒状杆菌ATCC 6872/pLAC857(FERMBP-6639)中提取质粒pLAC857。
通过上述电脉冲法，使用所述质粒转化XMP生产菌株产氨棒状杆菌FERM BP-1261(日本专利2618383腺嘌呤-渗漏需求型和鸟嘌呤需求型)。
通过碱性细菌裂解法从所得的壮观霉素抗性转化子中提取质粒DNA。
用多种限制性酶裂解质粒并分析之，从而证实所得转化子携有质粒pLAC857。
分别于30℃和37℃，在含有100μg/ml壮观霉素的A培养基(从A琼脂培养基中除去琼脂的培养基)上将携有pLAC857的XMP生产菌株FERM BP-1261振荡培养24小时。
培养完成之后，通过离心从各个培养物中得到细胞。
用100mmol/l Tris-HCl(pH7.0)将所得细胞洗涤两次并悬浮于10ml相同缓冲液中。
在所得悬浮液中加入10g玻璃珠(Shinmaru Enterprises有限公司，0.1-0.2φ)，接着在冰浴中使用匀浆器(Nippon Seiki有限公司)破碎10分钟。
4℃下，将所得悬浮液离心(14000×g)10分钟，回收上清液作为细胞提取物。
42℃下，在1.15ml含有先前已加热至42℃的细胞提取物的反应混合物[160mmol/l Tris-HCl(pH8.6)，12mmol/l ATP Na2.3H2O，16mmol/l MgSO4.7H2O和40mmol/l(NH4)2SO4]中加入0.1ml 0.3M XMP起始反应。15分钟之后，在反应混合物中加入3.9ml 3.5％高氯酸以终止反应。
以3000rpm离心反应混合物10分钟，测定上清液于290nm下的光吸收。将1分钟内形成1μmol GMP的活性定为1个单位(U)，计算每毫克蛋白质的比活。使用蛋白质检测试剂盒(BioRad Laboratories)测定蛋白质的量。
结果示于表1。在30℃培养的细胞中未检测到活性，而在37℃培养的细胞中检测到活性。这些结果表明XMP氨基酶基因的表达处于携有pLAC857之FERM BP-1261菌株的PL启动子控制之下，通过改变温度可以调节所述酶的活性。表1
(3)通过携有pLAC857的XMP生产菌株FERM BP-1261生产GMP30℃下，在含有20μg/ml壮观霉素的A琼脂培养基上将携有pLAC857的FERM BP-1261菌株培养2天。将所得细胞接种于含有60mlC种子培养基的250ml锥瓶中，所述种子培养基中含有20μg/ml壮观霉素，其配方是5％葡萄糖，1％酵母膏，1％蛋白胨，0.25％氯化钠，0.3％尿素，150mg/l腺嘌呤和150mg/l鸟嘌呤(pH7.2)，接着于30℃振荡培养24小时。
将所得的全部培养物接种于2升发酵罐中，其中含有0.94升D种子培养基[8.8％葡萄糖，1.7％肉膏，1.7％蛋白胨，0.167％KH2PO4，0.167％K2HPO4，0.167％MgSO4.7H2O，333mg/l腺嘌呤，350mg/l鸟嘌呤，33mg/l FeSO4.7H2O，17mg/l ZnSO4.7H2O，6.7mg/l MnSO4.4-6H2O，25mg/l β-丙氨酸，33mg/l L-半胱氨酸，167μg/l生物素，1.3mg/lCuSO4.5H2O和8.3mg/l硫胺素(pH7.2)]，接着，于30℃搅拌(600rpm)通气(1L/min)培养24小时，培养过程中用5.5M氨水将pH维持在7.2。
将所得培养物(120ml)接种于含0.88升F发酵培养基的2升发酵罐中，所述发酵培养基的配方是8％葡萄糖，1.67％正磷酸，1.29％KOH，1.2％ MgSO4.7H2O，123mg/l CaCl2.2H2O，24.6mg/l FeSO4.7H2O，12.3mg/l MnSO4.4-6H2O，12.3mg/l ZnSO4.7H2O，18.5mg/l β-丙氨酸，24.6mg/l L-半胱氨酸，6.2mg/l烟酰胺，24.6mg/l组氨酸，185μg/l生物素，2.5mg/l CuSO4.5H2O，203mg/l腺嘌呤和10mg/l鸟嘌呤(pH7.2)，接着，于28℃搅拌(600rpm)通气(1L/min)培养44小时，培养过程中用5.5M氨水将pH维持在7.2。
完成培养之后，按下列方法通过HPLC测定培养物上清液中积累的XMP和GMP的量。
HPLC分析的条件柱Asahipak GS-320H(Asahi Chemical Industry有限公司)洗脱液0.2M NaH2PO4(pH3.0)流速1mL/min检测UV 254nm通过测定UV 254nm下的光吸收值并与标准值相比较以测定积累的XMP和GMP的量。
HPLC分析的结果是XMP形成和积累的量是27.2g/l，但未检测到GMP。
为了诱导和表达XMP氨基酶基因，将培养肉汤加热至40℃，在相同温度下搅拌(600rpm)并通气(1L/min)6小时，其间用5.5M氨水将pH维持在7.2。
在经上述热诱导处理的XMP发酵肉汤中加入2.5％葡萄糖，10g/l植酸，4.4g/l MgSO4.7H2O，9.36g/l NaH2PO4，96.9mg/l腺嘌呤和10g/lNymeen S-215，于40℃搅拌(600rpm)通气(1L/min)，使所得混合物反应24小时，反应过程中用5.5M氨水将pH维持在7.4。
完成反应之后，在上述HPLC分析条件下测定反应混合物上清液中积累的GMP的量。结果发现GMP形成和积累的量是20.8g/l。实施例2构建生产XMP的产氨棒状杆菌菌株并由该菌株生产GMP，所述菌株携有处于异柠檬酸裂合酶基因启动子控制之下的产氨棒状杆菌XMP氨基酶基因(1)通过PCR扩增和克隆XMP氨基酶基因按下列方法，根据核苷酸序列经PCR分离产氨棒状杆菌的XMP氨基酶基因。
首先，合成SEQ ID NO1和2所示的寡核苷酸序列，所述序列位于XMP氨基酶基因的两端，各具有限制性酶AflII和BamHI的裂解位点。根据制备原生质体的方法，通过用溶菌酶和无色肽酶(achromopeptidase)处理在甘氨酸存在下培养的细胞，制备产氨棒状杆菌ATCC 6872的染色体DNA以用作模板(日本公开未审专利申请225776/94)。
在0.1ml含有各为200μM的dATP，dCTP，dGTP和dTTP，50mmol/l氯化钾，1.5mmol/l氯化镁和0.0001％明胶的10mmol/l Tris-HCl缓冲液(pH8.3)中加入所得的染色体DNA(0.1μg)，作为引物的上述寡核苷酸(各为0.25μM)和Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo有限公司，2.5个单位)，对所得混合物进行PCR。
通过将94℃ 90秒，50℃ 120秒和72℃ 120秒的反应循环重复10次；94℃ 90秒，40℃ 120秒和72℃ 120秒的反应循环重复10次；94℃ 90秒，40℃ 120秒和72℃ 180秒的反应循环重复20次；然后72℃反应360秒来进行PCR。
对所得的反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳，籍此回收约1.6kb的所需DNA片断。
用限制性酶Af1II(5单位)和BamHI(5单位)裂解所述DNA片断，通过琼脂糖凝胶电泳分离并回收其末端分别经AflII和BamHI处理的约1.6kb的裂解片断。(2)构建诱导型表达质粒pGUA2，该质粒能用碳源调节XMP氨基酶基因的表达按下列方法，使用诱导型表达载体pCEX2(日本公开未审专利申请224259/91)构建能用碳源调节XMP氨基酶基因表达的质粒。
pCEX2是含有谷氨酸棒状杆菌异柠檬酸裂合酶基因的表达调节区域和转录终止信号序列的载体，糖的存在会抑制插入该质粒之多克隆位点的外源基因的表达，而非-糖类，如醋酸的存在会诱导这种表达。
用AflII(0.5单位)部分裂解pCEX2载体DNA(1μg)，然后用BamHI(5单位)裂解之。通过琼脂糖凝胶电泳分离和回收7.6kb的DNA片断，该片断含有异柠檬酸裂合酶基因的表达调节区域和转录终止信号区域，壮观霉素抗性基因和在谷氨酸棒状杆菌中自主复制的质粒的复制起点。
将所述DNA片断与上文实施例2(1)中所得XMP氨基酶基因的经PCR扩增的片断相连接，得到经连接的DNA。
通过电脉冲法用所述经连接的DNA(1μg)转化产氨棒状杆菌ATCC6872，然后铺于含有100μg/ml壮观霉素的A琼脂培养基上。
通过碱性细菌裂解法从所得的壮观霉素抗性转化子中提取质粒DNA。
用多种限制性酶裂解质粒DNA并分析之，从而证实所得转化子携有质粒pGUA2，其具有图2所示的所需结构。(3)测定通过将pGUA2导入菌株FERM BP-1261所制备菌株的XMP氨基酶活性通过碱性细菌裂解法从携有pGUA2的产氨棒状杆菌ATCC 6872中提取质粒pGUA2。
通过电脉冲法，使用所述质粒转化XMP生产菌株产氨棒状杆菌FERMBP-1261(腺嘌呤-渗漏需求型和鸟嘌呤需求型)。
通过碱性细菌裂解法从所得的壮观霉素抗性转化子中提取质粒DNA。
用多种限制性酶裂解质粒并分析之，从而证实所得转化子携有pGUA2。
于30℃，分别在两种培养基中将携有pGUA2的XMP生产菌株FERMBP-1261振荡培养24小时，所述培养基是含有100μg/ml壮观霉素的培养基和通过用醋酸铵替代所述培养基中的葡萄糖而制备的培养基。
按与实施例1(2)相同的方法，从所得培养物中得到细胞以制备细胞提取物。
根据实施例1(2)所述的方法测定各个提取物中的XMP氨基酶活性。
结果示于表2。
在使用葡萄糖作为碳源培养的细胞中仅检测到极低水平的活性，而在使用2％醋酸铵作为碳源培养的细胞中检测到高水平的活性。
这些结果表明XMP氨基酶基因的表达处于携有pGUA2的FERMBP-1261中的异柠檬酸裂合酶基因启动子的控制之下，改变碳源可调节所述酶的活性。表2
(4)通过将pGUA2导入XMP生产菌株FERM BP-1261所制备的菌株生产GMP在与实施例1(3)相同的培养条件下，使用携有pGUA2的FERMBP-1261菌株进行XMP发酵。完成培养之后，按与实施例1(3)相同的方法测定培养物上清液中形成和积累的XMP和GMP的量。
结果发现XMP积累的量为18.4g/l，但未检测到GMP。
发酵完成之后，为了诱导和表达XMP氨基酶基因，在发酵肉汤中加入醋酸铵至终浓度为2％，搅拌(600rpm)通气(1L/min)培养10小时，培养过程中用5.5M氨水将pH维持在7.2。
在醋酸铵存在下经上述诱导处理的培养物中加入2.5％葡萄糖，10g/l植酸，4.4g/l MgSO4.7H2O，9.36g/l NaH2PO4，96.9mg/l腺嘌呤和10g/l Nymeen S-215，于40℃搅拌(600rpm)通气(1L/min)，使所得混合物反应24小时，培养过程中用5.5M氨水将pH维持在7.4。
完成反应之后，按与实施例1(3)所述相同的方法测定反应混合物上清液中积累的GMP的量。
发现反应混合物中形成和积累的GMP的量为14.4g/l。实施例3构建生产肌苷的产氨棒状杆菌菌株并由该菌株生产IMP，所述菌株携有处于异柠檬酸裂合酶基因启动子控制之下的大肠杆菌肌苷-鸟苷激酶基因(1)通过PCR扩增和克隆肌苷-鸟苷激酶基因按下列方法，根据已知的核苷酸序列(WO91/08286)经PCR分离大肠杆菌的肌苷-鸟苷激酶基因。
合成SEQ ID NO3和4所示的寡核苷酸，所述序列位于肌苷-鸟苷激酶基因的两端，各具有限制性酶AflII和BamHI的裂解位点。
大肠杆菌HM70/pBM2(WO91/08286)携有的质粒pBM2被用作肌苷-鸟苷激酶基因的模板。
在0.1ml含有各为200μM的dATP，dCTP，dGTP和dTTP，50mmol/l氯化钾，1.5mmol/l氯化镁和0.0001％明胶的10mmol/l Tris-HCl缓冲液(pH8.3)中加入上述质粒DNA(0.1μg)，作为引物的上述寡核苷酸(各为0.25μM)和Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo有限公司，2.5个单位)，对所得混合物进行PCR。
通过将94℃ 90秒，50℃ 120秒和72℃ 120秒的反应循环重复10次；94℃ 90秒，40℃ 120秒和72℃ 120秒的反应循环重复10次；94℃ 90秒，40℃ 120秒和72℃ 180秒的反应循环重复20次；然后72℃反应360秒来进行PCR。
将所得的PCR反应产物与克隆PCR产物的载体pT-Adv(Clontech有限公司)相连接。
使用1μg通过所述的连接处理得到的DNA转化大肠杆菌DH5α，然后铺于含有100μg/ml氨苄青霉素的L琼脂培养基上。
通过碱性细菌裂解法从所得的氨苄青霉素抗性转化子中提取质粒pT-AI。
使用多种限制性酶分析质粒pT-AI的结构，从而证实此质粒含有肌苷-鸟苷激酶基因(1.3kb)，氨苄青霉素抗性基因，卡那霉素抗性基因和在大肠杆菌中自主复制的质粒的复制起点。(2)构建诱导型表达质粒pIGK2，该质粒能用碳源调节肌苷-鸟苷激酶基因的表达按下列方法，使用诱导型表达载体pCEX2(日本公开未审专利申请224259/91)构建能用碳源调节肌苷-鸟苷激酶基因表达的质粒。
用KpnI(5单位)裂解pCEX2载体DNA(1μg)，然后通过琼脂糖凝胶电泳分离和回收7.6kb的DNA片断，该片断含有异柠檬酸裂合酶基因的表达调节区域和转录终止信号区域，壮观霉素抗性基因和在谷氨酸棒状杆菌中自主复制的质粒的复制起点。
用KpnI(5单位)裂解实施例3(1)所得的含有肌苷-鸟苷激酶基因的质粒pT-AI(1μg)，然后进行去磷酸化。
将经KpnI裂解的DNA片断与上文中经KpnI裂解的pCEX2片断相连接。
使用所得的连接混合物转化大肠杆菌DH5α，然后铺于含有100μg/ml氨苄青霉素的L琼脂培养基上，得到氨苄青霉素抗性转化子。
通过碱性细菌裂解法从所得的转化子中提取质粒。
用多种限制性酶裂解质粒并分析之，从而证实得到质粒pIGK2，其具有图3所示的所需结构。
通过电脉冲法，使用此质粒(1μg)转化产氨棒状杆菌ATCC 6872，然后铺于含有100μg/ml壮观霉素的A琼脂培养基上。
通过碱性细菌裂解法从所得的壮观霉素抗性转化子中提取质粒DNA，经证实转化子携有pIGK2。
根据布达佩斯条约，于1999年2月5日将携有pIGK2的产氨棒状杆菌ATCC 6872/pIGK2保藏于日本工业科学和技术研究院，国立生物科学和人类-技术研究所(National Institute of Bioscience andHuman-Technology，Agency of Industrial Science andTechnology)，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-0046，其保藏号为FERM BP-6638。(3)测定通过将pIGK2导入菌株FERM BP-2217所制备菌株的肌苷-鸟苷激酶活性通过碱性细菌裂解法从产氨棒状杆菌ATCC 6872/pIGK2(FERMBP-6638)中提取质粒pIGK2。
通过电脉冲法，使用所述质粒转化肌苷生产菌株产氨棒状杆菌FERM BP-2217(日本专利2578496腺嘌呤-渗漏需求型和鸟嘌呤需求型)。
通过碱性细菌裂解法从所得的壮观霉素抗性转化子中提取质粒DNA。
用多种限制性酶裂解质粒并分析之，从而证实所得转化子携有pIGK2。
于30℃，分别在两种培养基中将携有pIGK2的肌苷生产菌株FERMBP-2217培养24小时，所述培养基是含有100μg/ml壮观霉素的培养基和通过用醋酸铵替代所述培养基中的葡萄糖而制备的培养基。
根据实施例1(2)所述的方法，从所得培养物中得到细胞以制备细胞提取物。
按下列方法测定各个提取物中的肌苷-鸟苷激酶活性。
在0.1ml预先加热至30℃的反应混合物[100mmol/l HEPES缓冲液(pH7.2)，10mmol/l MgSO4，50mmol/l Kcl，1mmol/l ATP和1mmol/l肌苷]中加入0.01ml细胞提取物，接着于30℃反应约30分钟。
在反应过程中，间隔取样反应混合物，用0.2M NaH2PO4(用H3PO4调节至pH2.6)将取出的样品稀释20倍以终止反应。
通过HPLC分析测定稀释样品中的肌苷和IMP的量。
HPLC分析的条件柱Asahipak GS-320H(Asahi Chemical Industry有限公司)
洗脱液0.2M NaH2PO4(pH2.6)流速1mL/min检测UV 254nm通过测定UV 254nm下的光吸收值并与标准值相比较以测定积累的肌苷和IMP的量。将1分钟内形成1μmol IMP的活性定为1个单位(U)，计算每毫克蛋白质的比活。使用蛋白质检测试剂盒(BioRadLaboratories)测定蛋白质的量。
结果示于表3。在使用葡萄糖作为碳源培养的细胞中仅检测到极低水平的活性，而在使用2％醋酸铵作为碳源培养的细胞中检测到高水平的活性。这些结果表明肌苷-鸟苷激酶基因的表达处于携有pIGK2的FERM BP-2217中的异柠檬酸裂合酶基因启动子的控制之下，改变碳源可调节所述酶的活性。表3
>(4)通过携有pIGK2的肌苷生产菌株FERM BP-2217生产IMP于30℃，在含有20μg/ml壮观霉素的A琼脂培养基中将携有pIGK2的FERM BP-2217菌株培养2天。
完成培养之后，将所得细胞接种于含有60ml CI种子培养基的250ml锥瓶中，所述种子培养基中含有20μg/ml壮观霉素，其配方是5％葡萄糖，1％酵母膏，1％蛋白胨，0.25％氯化钠，0.25％尿素，300mg/l腺嘌呤和100mg/l鸟嘌呤(pH7.2)，接着于30℃振荡培养24小时。
将所得的全部培养物接种于2升发酵罐中，其中含有0.94升DI种子培养基[7％葡萄糖，1％肉膏，1％蛋白胨，0.1％KH2PO4，0.1％K2HPO4，0.1％MgSO4.7H2O，300mg/l腺嘌呤，300mg/l鸟嘌呤，10mg/lFeSO4.7H2O，10mg/l ZnSO4.7H2O，10mg/l MnSO4.4-6H2O，16mg/l β-丙氨酸，20mg/l L-半胱氨酸，30μg/l生物素，2mg/l CuSO4.5H2O和6mg/l硫胺素(pH7.2)]，接着，于30℃搅拌(600rpm)通气(1L/min)培养24小时，培养过程中用5.5M氨水将pH维持在7.2。
将所得培养物(120ml)接种于含0.88升FI发酵培养基的2升发酵罐中，所述发酵培养基的配方是8％葡萄糖，2.07％CSL，0.21％KH2PO4，0.21％K2HPO4，0.43％MgSO4.7H2O，105mg/l CaCl2.2H2O，10.4mg/lFeSO4.7H2O，20.7mg/l MnSO4.4-6H2O，5.2mg/l ZnSO4.7H2O，10.4mg/l泛酸钙，20.7mg/l L-半胱氨酸，5.2mg/l烟酸，93.8μg/l生物素，0.51mg/l CuSO4.5H2O和313mg/l腺嘌呤(pH7.2)，接着，于28℃搅拌(600rpm)通气(1L/min)培养44小时，培养过程中用5.5M氨水将pH维持在7.2。
培养完成之后，根据实施例3(3)中所述的方法测定培养物上清液中形成和积累的肌苷和IMP的量。
培养物上清液中形成和积累的肌苷的量为23.1g/l，未检测到IMP。
培养完成之后，为了诱导和表达肌苷-鸟苷激酶基因，在所得培养物中加入醋酸铵至终浓度为2％，接着，搅拌(600rpm)并通气(1L/min)培养10小时，其间用5.5M氨水将pH维持在7.2。
在所得培养物中加入2.5％葡萄糖，10g/l植酸，4.4g/l MgSO4.7H2O，9.36g/l NaH2PO4，96.9mg/l腺嘌呤和10g/l Nymeen S-215，于40℃搅拌(600rpm)通气(1L/min)，使所得混合物反应24小时，其间用5.5M氨水将pH维持在7.4。
完成反应之后，根据实施例3(3)中所述的方法测定反应混合物上清液中形成和积累的IMP的量。
反应混合物中形成和积累的IMP的量为37.7g/l。
权利要求
1.生产嘌呤核苷酸的方法，所述方法包括在培养基中培养微生物，该微生物能生产嘌呤核苷酸前体，并携有导入的DNA，所述DNA可诱导和表达能由所述前体合成嘌呤核苷酸的酶；使所述嘌呤核苷酸前体在培养基中积累；诱导和表达能由所述前体合成嘌呤核苷酸的酶；由所述前体形成嘌呤核苷酸并在所述培养基中积累；从培养基中回收所述嘌呤核苷酸。
2.根据权利要求1的方法，其中嘌呤核苷酸的前体是5’-黄苷酸，能由所述前体合成嘌呤核苷酸的酶是5’-黄苷酸氨基酶，嘌呤核苷酸是5’-鸟苷酸。
3.根据权利要求1的方法，其中嘌呤核苷酸的前体是鸟苷，能由所述前体合成嘌呤核苷酸的酶是肌苷-鸟苷激酶或磷酸酶，嘌呤核苷酸是5’-鸟苷酸。
4.根据权利要求1的方法，其中嘌呤核苷酸的前体是肌苷，能由所述前体合成嘌呤核苷酸的酶是肌苷-鸟苷激酶或磷酸酶，嘌呤核苷酸是5’-肌苷酸。
5.根据权利要求1的方法，其中微生物属于选自棒状杆菌，大肠杆菌和芽孢杆菌的属。
6.根据权利要求1的方法，其中微生物是产氨棒状杆菌。
7.根据权利要求1的方法，其特征在于通过改变条件或通过将碳源由糖改变为非糖来诱导和表达能合成嘌呤核苷酸的酶，所述条件的改变选自温度的升高，pH的升高和渗透压的升高。
8.根据权利要求7的方法，其中非糖碳源是醋酸或醋酸盐。
9.可诱导和表达能由其前体合成嘌呤核苷酸的酶的DNA。
10.根据权利要求9的DNA，该DNA通过改变条件或通过将碳源由糖改变为非糖来诱导和表达能合成嘌呤核苷酸的酶，所述条件的改变选自温度的升高，pH的升高和渗透压的升高。
11.根据权利要求10的DNA，其中非糖碳源是醋酸或醋酸盐。
12.根据权利要求9或10的DNA，该DNA是pLAC857或pIGK2。
13.微生物，该微生物能生产嘌呤核苷酸前体，并携有导入的DNA，所述DNA可诱导和表达能由所述前体合成嘌呤核苷酸的酶。
14.根据权利要求13的微生物，其中嘌呤核苷酸的前体是5’-黄苷酸，能由所述前体合成嘌呤核苷酸的酶是5’-黄苷酸氨基酶，嘌呤核苷酸是5’-鸟苷酸。
15.根据权利要求13的微生物，其中嘌呤核苷酸的前体是鸟苷，能由所述前体合成嘌呤核苷酸的酶是肌苷-鸟苷激酶或磷酸酶，嘌呤核苷酸是5’-鸟苷酸。
16.根据权利要求13的微生物，其中嘌呤核苷酸的前体是肌苷，能由所述前体合成嘌呤核苷酸的酶是肌苷-鸟苷激酶或磷酸酶，嘌呤核苷酸是5’-肌苷酸。
17.根据权利要求13的微生物，其中微生物属于选自棒状杆菌，大肠杆菌和芽孢杆菌的属。
18.根据权利要求13的微生物，其中微生物是产氨棒状杆菌。
19.根据权利要求18的微生物，其中微生物是产氨棒状杆菌ATCC6872/pLAC857(FERM BP-6639)或产氨棒状杆菌ATCC 6872/pIGK2(FERM BP-6638)。
全文摘要
本发明提供了生产嘌呤核苷酸的方法,所述方法包括:在培养基中培养微生物,该微生物能生产嘌呤核苷酸前体,并携有导入的DNA,所述DNA可诱导和表达能由所述前体合成嘌呤核苷酸的酶;使所述嘌呤核苷酸前体在培养基中积累;诱导和表达能由所述前体合成嘌呤核苷酸的酶;由所述前体形成嘌呤核苷酸并在所述培养基中积累;从培养基中回收所述嘌呤核苷酸。本发明还提供了可用于所述方法的微生物。
文档编号C12N9/16GK1267735SQ0010195
公开日2000年9月27日 申请日期2000年2月3日 优先权日1999年2月8日
发明者高野裕, 池田正人, 藤尾达郎 申请人:协和发酵工业株式会社