一种冬红果的组织培养基及培育方法
【专利摘要】本发明公开了一种冬红果的组织培养基及培养方法，包括：MS培养基+6?苄氨基腺嘌呤1.0g/L +α?萘乙酸0.1g/L；其中，所述MS培养基的配方包括：50 ml/L大量元素：硝酸钾1900 mg/L、硝酸铵1650 mg/L、磷酸二氢钾170 mg/L、硫酸镁370 mg/L、氯化钙440 mg/L；5ml/L微量元素：碘化钾0.83 mg/L、硼酸6.2 mg/L、硫酸锰22.3 mg/L、硫酸锌8.6 mg/L、钼酸钠0.25 mg/L、硫酸铜0.025 mg/L、氯化钴0.025 mg/L；5ml/L铁盐：乙二胺四乙酸二钠37.3 mg/L、硫酸亚铁27.8mg/L；5ml/L有机成分：肌醇100 mg/L、甘氨酸2 mg/L、盐酸硫胺素0.1 mg/L、盐酸吡哆醇0.5 mg/L、烟酸 0.5 mg/L；30 g/L蔗糖；6.5 g/L琼脂。本发明的优点在于：采用所述培养方法的冬红果生根能力强，保证100%出苗率，能够对冬红果进行大量的培养；还能对于具有突变特性的冬红果进行培育，保留突变特性。
【专利说明】
一种冬红果的组织培养基及培育方法
技术领域
[0001]本发明属于苗木培育技术领域，特别涉及一种冬红果的组织培养基及培养方法。 【背景技术】
[0002]冬红果(if.c/o?estica cr.Winter Red Fruit)为蔷薇科苹果属绿叶落叶小乔木， 果实呈簇状，通常春夏为绿色，后逐渐泛黄，至深秋果色鲜红，直至来年春季，小巧晶莹剔透，色彩艳丽，因此，冬红果已成为培育观果盆景的极佳树种。而其色彩鲜红的最佳观果期正值春节前后，其象征吉祥、丰收、喜庆的艳丽色彩尤为广大中国消费者所喜爱，具有极大的市场潜力。然而，作为一种盆景类观赏植物，全年保持较长时间的绿叶绿果，观赏价值必有所降低。近年来，我公司在冬红果引种繁育过程中意外发现一株突变的紫叶植株，其果实初为紫色，成熟后变为鲜红色，与常规品种冬红果存在较大差异，能够使冬红果在整个挂果期终保持很好的观赏性，无形中使得冬红果的观果期向前延伸。果实颜色变化比较单一，缺乏多样性，且其果实由紫入红，寓意万紫千红，颜色变化更加丰富多彩，更具市场潜力。目前，冬红果常用的繁殖方法有播种、嫁接，然而通过多次培育实验发现，播种方法容易在后期产生性状分离，无法将更具特色的突变性状保持下去。
[0003]组培快繁技术不仅可以大大缩短冬红果的繁殖周期，满足大量生产供应的需求， 还可用于突变育种得到的无性系的快速繁殖。在组培快繁技术方面，研究主要涉及苹果、海棠等植物，但有关冬红果的组织培养方面的研究则未见报道。且一般都讨论了培养基、激素等，分析了这些因素对组织快繁效率和效果的影响，总体来说定性的研究多，对真正的产出率的考虑还不多。
[0004]冬红果突变品种组培技术的研究最终是为苗木的工厂化生产提供基础技术保障， 组培苗的生长和环境的无菌检测是大规模工厂化育苗环境调控的前提和基础。传统组培苗检测方法是通过接触性测量获得，这些方法虽然简单、准确，但有诸多缺点。
【发明内容】
[0005]本发明提供一种冬红果的组织培养基及培养方法，利用生物技术结合常规育种方式来对冬红果的突变特色性状进行种质资源保存，研究出组培苗分生培养基配方，以解决现有技术中出现的问题。
[0006]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:一种冬红果的组织培养基，包括:MS培养基+6-苄氨基腺嘌呤1.0g/L +a-萘乙酸〇.lg/ L；其中，所述MS培养基的配方包括:50 ml/L大量元素:硝酸钾1900 mg/L、硝酸铵1650 mg/L、磷酸二氢钾170 mg/L、硫酸镁370 mg/L、氯化|丐440 mg/L;5ml/L微量元素:碘化钾 0.83 mg/L、硼酸6.2 mg/L、硫酸锰22.3 mg/L、硫酸锌8.6 mg/L、钼酸钠0.25 mg/L、硫酸铜 0.025 mg/L、氯化钴0.025 mg/L;5ml/L铁盐:乙二胺四乙酸二钠37.3 mg/L、硫酸亚铁 27.8mg/L;5ml/L有机成分:肌醇100 mg/L、甘氨酸2 mg/L、盐酸硫胺素0.1 mg/L、盐酸P比咳醇0.5 mg/L、烟酸 0.5 mg/L;30 g/L鹿糖;6.5 g/L琼脂；其中，所述6-苄氨基腺嘌呤为2-4ml/L 其中，所述a_萘乙酸为3_5ml/L。
[0007]进一步，所述MS培养基的配方还包括0.1-1 g/L的活性炭。[00〇8] 进一步，所述活性炭为0.2g/L。
[0009]进一步，所述6-苄氨基腺嘌呤为3 ml/L，所述a-萘乙酸为4ml/L。
[0010]基于所述冬红果培养基的一种冬红果的培养方法，其培养步骤为:步骤(A)，在锅中加入所述组织培养基；步骤(B)，加水定容至1升，对其进行加热，同时用玻璃棒搅拌混合液；步骤(C)，调节pH值:滴管吸取物质量浓度为1 mol/L的氢氧化钠溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用pH试纸测培养基的pH值，直至所测培养基的pH值为5.8为止；步骤(D)，将培养基分装到所选用的培养容器中，每瓶培养容器中培养基为50ml ; 步骤(E)，盖住培养容器的瓶口，进行灭菌；步骤(F)，灭菌后取出培养容器，将培养容器放在操净台上进行紫外光照射30min，让其中的培养基自然冷却凝固；步骤(G)，使用酒精棉擦拭操净台台面和手，点燃酒精灯，将刀、镊子在酒精灯上进行烘烤，并将刀和镊子尖朝下插入酒精中备用，将外植体放入冷却的蒸馏水中，摇晃；步骤(H)，外植体的消毒:取出蒸馏水中外植体放入的10%次氯酸钠溶液中，摇晃3分钟取出，再放入0.5%升汞溶液中，摇晃3分钟取出；步骤(J)，将取出的外植体放入冷却的蒸馏水中，清洗表层残留的化学溶液；步骤(K)，选取新鲜外植体:将杀过毒的外植体取出放在滤纸上，用到和镊子切出外植体新鲜一端；步骤(L)，打开培养容器的瓶口，将切好的新鲜外植体插入培养容器中的培养基内部； 步骤(M)，将培养容器的瓶口盖紧，放在光线充足的环境，保持25摄氏度的室温、12 土 lh/天的光照，培育5-7天。
[0011]进一步，所述步骤(B)中所述的混合液为澄清液体时，搅拌停止。
[0012]进一步，所述步骤(C)中所述的pH试纸为测量范围为5-6pH的精密pH试纸。
[0013]进一步，所述步骤(E)中所述的灭菌方法为:使用高压灭菌锅，将待需灭菌的培养容器码放整齐，盖上高压灭菌锅的锅盖，设置灭菌参数为压强98 kPa、温度121.3 °C，灭菌 lh〇
[0014]进一步，所述步骤(H)中所述的外植体为冬红果茎上具芽部分。
[0015]与现有技术相比，本发明具有以下优点:研究出的培养基配方，生根能力强，保证100%出苗率，能够对冬红果进行大量的培养， 增加经济效益;其高培育成功率还能对于稀少的具有突变特性的观赏性冬红果进行培育， 保留突变特性，为花卉市场增添新品种，实现突变冬红果规模化种植，不仅可以布置花坛， 还可以室内盆栽观赏，美化自然和人居环境，为改善生态环境质量的绿色产业工程。【附图说明】
[0016]图1是本发明的培养基的培养结果；图2是本发明的培养基添加了活性炭后的培养结果。【具体实施方式】
[0017]下面结合实施例对本发明作更进一步的说明。
[0018]如图所示，一种冬红果的组织培养基，包括:MS培养基+6-苄氨基腺嘌呤1.0g/L + a-萘乙酸0.lg/L;其中，所述MS培养基的配方包括:50 ml/L大量元素:硝酸钾1900 mg/L、硝酸铵1650 mg/L、磷酸二氢钾170 mg/L、硫酸镁370 mg/L、氯化|丐440 mg/L;5ml/L微量元素:碘化钾 0.83 mg/L、硼酸6.2 mg/L、硫酸锰22.3 mg/L、硫酸锌8.6 mg/L、钼酸钠0.25 mg/L、硫酸铜 0.025 mg/L、氯化钴0.025 mg/L;5ml/L铁盐:乙二胺四乙酸二钠37.3 mg/L、硫酸亚铁 27.8mg/L;5ml/L有机成分:肌醇100 mg/L、甘氨酸2 mg/L、盐酸硫胺素0.1 mg/L、盐酸P比咳醇0.5 mg/L、烟酸 0.5 mg/L;30 g/L鹿糖;6.5 g/L琼脂；其中，所述烟酸可为VB5或VPP.其中，所述6-苄氨基腺嘌呤为2-4ml/L 其中，所述a_萘乙酸为3_5ml/L。
[0019]前述MS培养基的配方还包括0.1-1 g/L的活性炭。
[0020]前述活性炭为〇.2g/L。[〇〇21] 前述6-苄氨基腺嘌呤为3 ml/L，所述a-萘乙酸为4ml/L。
[0022]基于前述冬红果培养基的一种冬红果的培养方法，其培养步骤为:步骤(A)，在锅中加入所述组织培养基；步骤(B)，加水定容至1升，对其进行加热，同时用玻璃棒搅拌混合液；步骤(C)，调节pH值:滴管吸取物质量浓度为1 mol/L的氢氧化钠溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用pH试纸测培养基的pH值，直至所测培养基的pH值为5.8为止；步骤(D)，将培养基分装到所选用的培养容器中，每瓶培养容器中培养基为50ml ; 步骤(E)，盖住培养容器的瓶口，进行灭菌；步骤(F)，灭菌后取出培养容器，将培养容器放在操净台上进行紫外光照射30min，让其中的培养基自然冷却凝固；步骤(G)，使用酒精棉擦拭操净台台面和手，点燃酒精灯，将刀、镊子在酒精灯上进行烘烤，并将刀和镊子尖朝下插入酒精中备用，将外植体放入冷却的蒸馏水中，摇晃；步骤(H)，外植体的消毒:取出蒸馏水中外植体放入的10%次氯酸钠溶液中，摇晃3分钟取出，再放入0.5%升汞溶液中，摇晃3分钟取出，针对灭菌能力，可适当增加或缩短时长； 步骤(J)，将取出的外植体放入冷却的蒸馏水中，清洗表层残留的化学溶液；步骤(K)，选取新鲜外植体:将杀过毒的外植体取出放在滤纸上，用到和镊子切出外植体新鲜一端；步骤(L)，打开培养容器的瓶口，将切好的新鲜外植体插入培养容器中的培养基内部； 步骤(M)，将培养容器的瓶口盖紧，放在光线充足的环境，保持25摄氏度的室温、12 土 lh/天的光照，培育5-7天。
[0023]前述步骤(B)中所述的混合液为澄清液体时，搅拌停止，约为15分钟。[〇〇24]前述步骤(C)中所述的pH试纸为测量范围为5_6pH的精密pH试纸。
[0025]前述步骤(E)中所述的灭菌方法为:使用高压灭菌锅，将待需灭菌的培养容器码放整齐，盖上高压灭菌锅的锅盖，设置灭菌参数为压强98 kPa、温度121.3 °C，灭菌lh。[〇〇26]前述步骤(H)中所述的外植体为冬红果茎上具芽部分。[〇〇27]经试验，采用本发明的冬红果培育外植体生根率为98.7%;而在培养基中增加了活性炭后，外植体的生根率为99.8%，培养基中外植体所产生的褐化生物减少，培养基基质保持澄清，提高了生根率;外植体芽叶生长增加;活性炭所创造的暗环境更加能促进根系的生长，使得根系生长健壮，发芽叶色浓绿;特别是活性炭在酸性环境下吸附率高契合了培养基为5.8pH值的培养环境，所以采用增加活性炭，增加了冬红果突变特性植株的大规模培养的存活率，使得其突变特性得以保存，增加花艺得的种类，同时对于普通无突变特性植株的冬红果，可以使其实现高效、低成本的工厂化生产。
[0028]在培育的过程中失败的原因可能是:外植体消毒时间过长，使得外植体活性减低； 使用6-苄氨基腺嘌呤为3 ml/L，a-萘乙酸的量为不足;灭菌不够或瓶盖不严造成细菌进入导致污染。所以在规避这些情况的前提下，可以实现外植体100%生根存活的可能性。
[0029]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出:对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种冬红果的组织培养基，其特征在于:所述组织培养基包括:MS培养基+6-苄氨基 腺嘌呤l.〇g/L +a-萘乙酸〇.lg/L;其中，所述MS培养基的配方包括:50 ml/L大量元素:硝酸钾1900 mg/L、硝酸铵1650 mg/L、磷酸二氢钾170 mg/L、硫酸镁370 mg/L、氯化|丐440 mg/L;5ml/L微量元素:碘化钾 0.83 mg/L、硼酸6.2 mg/L、硫酸锰22.3 mg/L、硫酸锌8.6 mg/L、钼酸钠0.25 mg/L、硫酸铜 0.025 mg/L、氯化钴0.025 mg/L;5ml/L铁盐:乙二胺四乙酸二钠37.3 mg/L、硫酸亚铁 27.8mg/L;5ml/L有机成分:肌醇100 mg/L、甘氨酸2 mg/L、盐酸硫胺素0.1 mg/L、盐酸P比咳 醇0.5 mg/L、烟酸 0.5 mg/L;30 g/L鹿糖;6.5 g/L琼脂；其中，所述6-苄氨基腺嘌呤为2-4ml/L;其中，所述a_萘乙酸为3_5ml/L。2.根据权利要求1所述的一种冬红果的组织培养基，其特征在于:所述MS培养基的配方 还包括0.1-1 g/L的活性炭。3.根据权利要求2所述的一种冬红果的组织培养基，其特征在于:所述活性炭为0.2g/ L〇4.根据权利要求2所述的一种冬红果的组织培养基，其特征在于:所述6-苄氨基腺嘌呤 为3 ml/L，所述a-萘乙酸为4ml/L。5.基于权利要求1-4的一种冬红果的培养方法，其特征在于:培养步骤为:步骤(A )，在锅中加入所述组织培养基；步骤(B)，加水定容至1升，对其进行加热，同时用玻璃棒搅拌混合液；步骤(C)，调节pH值:滴管吸取物质量浓度为1 mol/L的氢氧化钠溶液，逐滴滴入溶化的 培养基中，边滴边搅拌，并随时用pH试纸测培养基的pH值，直至所测培养基的pH值为5.8为 止；步骤(D)，将培养基分装到所选用的培养容器中，每瓶培养容器中培养基为50ml ;步骤(E)，盖住培养容器的瓶口，进行灭菌；步骤(F)，灭菌后取出培养容器，将培养容器放在操净台上进行紫外光照射30min，让其 中的培养基自然冷却凝固；步骤(G)，使用酒精棉擦拭操净台台面和手，点燃酒精灯，将刀、镊子在酒精灯上进行烘 烤，并将刀和镊子尖朝下插入酒精中备用，将外植体放入冷却的蒸馏水中，摇晃；步骤(H)，外植体的消毒:取出蒸馏水中外植体放入的10%次氯酸钠溶液中，摇晃3分钟 取出，再放入0.5%升汞溶液中，摇晃3分钟取出；步骤(J)，将取出的外植体放入冷却的蒸馏水中，清洗表层残留的化学溶液；步骤(K)，选取新鲜外植体:将杀过毒的外植体取出放在滤纸上，用到和镊子切出外植 体新鲜一端；步骤(L)，打开培养容器的瓶口，将切好的新鲜外植体插入培养容器中的培养基内部； 步骤(M)，将培养容器的瓶口盖紧，放在光线充足的环境，保持25摄氏度的室温、12 土 lh/天的光照，培育5-7天。6.根据权利要求5所述的一种冬红果的培养方法，其特征在于:步骤(B)中所述的混合 液为澄清液体时，搅拌停止。7.根据权利要求5所述的一种冬红果的培养方法，其特征在于:步骤(C)中所述的pH试纸为测量范围为5-6pH的精密pH试纸。8.根据权利要求5所述的一种冬红果的培养方法，其特征在于:步骤(E)中所述的灭菌 方法为:使用高压灭菌锅，将待需灭菌的培养容器码放整齐，盖上高压灭菌锅的锅盖，设置 灭菌参数为压强98 kPa、温度121.3 °C，灭菌lh。9.根据权利要求5所述的一种冬红果的培养方法，其特征在于:步骤(H)中所述的外植 体为冬红果茎上具芽部分。
【文档编号】A01H4/00GK106069793SQ201610771951
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月30日
【发明人】王醒, 陈斌, 王雨轩, 吴言红, 丁善良, 程志军, 王闯, 付卫国
【申请人】江苏艺轩园林景观工程有限公司