一种线虫培养装置及供试昆虫病原线虫的简易繁殖方法
【专利摘要】一种线虫培养装置及供试昆虫病原线虫的简易繁殖方法，涉及一种线虫培养装置及线虫繁殖方法。是要解决现有实验室供试昆虫病原线虫的活体培养方法存在耗时长、产量低及繁殖效率低的问题。装置包括内层筛网和外层储水盆，内层筛网的边缘向外延伸形成外沿，所述内层筛网的外沿放置在外层储水盆的边缘上。方法：一、裁剪两张直径相同的圆形中速定性滤纸，垫在培养皿盖中，将末龄大蜡螟幼虫放在培养皿中的滤纸上，侵染期线虫的水悬液浸润滤纸，扣上皿底，置于恒温箱内，再置于培养箱中，待大蜡螟全部死亡；二、将死亡的大蜡螟转移到线虫培养装置的内层筛网上，外层储水盆里装有无菌水，置于培养箱中，收集外层储水盆里的线虫悬液。本发明用于培养线虫。
【专利说明】
一种线虫培养装置及供试昆虫病原线虫的简易繁殖方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种线虫培养装置及线虫繁殖方法。
【背景技术】
[0002]昆虫病原线虫(Entomopathogenic Nematode，EPN)已成功用于防治地下害虫，如韭蛆、蛴螬和地老虎等。但由于生产成本远高于化学药剂，目前厂家只能按照用户订单进行生产。因实验室、温室和田间试验供试昆虫病原线虫的用量不是很大，不同的实验会用到不同种或品系线虫，生产厂家无法及时提供，并且厂家生产的线虫产品有些是不同种线虫混合的。因此实验室供试昆虫病原线虫的获得都是自行繁殖。
[0003]目前实验室生测、温室盆栽和田间小区或大区试验用的昆虫病原线虫一直采用White-trap的繁殖方法，当昆虫病原线虫从昆虫体表出现时，利用线虫的趋水性，病原线虫从双层滤纸的小培养皿内爬入其外层装有水的大培养皿内，然后收集大培养皿内含有线虫的水悬液即可。该方法存在很多问题:线虫迀移距离较长，并且每天要将小培养皿内的滤纸保湿，否则影响线虫迀移速度甚至干死，严重影响产量。当小培养皿内的滤纸湿度过大时，因线虫的趋水性，小皿内的线虫不会迀移到大皿内的水中，由于小皿内有昆虫尸体，以及线虫的共生细菌，无法收集到干净的线虫。即使滤纸湿度适合，但是双层滤纸间和滤纸与皿底间仍有大量不能顺利迀移到大皿水中而死亡的线虫。最终导致线虫的产量低，进而繁殖效率低。
【发明内容】
[0004]本发明是要解决现有实验室供试昆虫病原线虫的活体培养方法存在耗时长、产量低及繁殖效率低的问题，为实验室室、温室和田间试验提供一种实验室供试昆虫病原线虫的简易繁殖方法。
[0005]本发明线虫培养装置包括内层筛网和外层储水盆，所述内层筛网的边缘向外延伸形成外沿，所述内层筛网的外沿放置在外层储水盆的边缘上。所述内层筛网的底部距离外层储水盆底部的高度为I cm ο
[0006]本发明线虫培养装置可以为长方形、正方形、圆形等多种形状。
[0007]进一步的，所述内层筛网的容积为5?6立方分米。
[0008]进一步的，所述内层筛网的网孔大小为0.2cmX0.2cm。
[0009]利用上述线虫培养装置进行实验室和田间试验供试昆虫病原线虫的简易繁殖的方法，按以下步骤进行:
[0010]—、裁剪两张直径相同的圆形中速定性滤纸，并将两张中速定性滤纸重叠垫在培养皿的上盖中，其中中速定性滤纸的直径与培养皿上盖的直径相同，再将末龄大蜡螟幼虫放在培养皿中的滤纸上，密度为23?31头/平方分米，然后采用500?2000条/mL侵染期线虫的水悬液浸润培养皿中的滤纸(即为接种或侵染)，再倒扣上培养皿的底，然后将培养皿置于10°C?15°C恒温箱内(以防室温下大蜡螟吐丝结茧，转移大蜡螟时费时)，24h?48h后再将培养皿转至25 °C培养箱中，待大蜡螟全部死亡；
[0011]二、将死亡的大蜡螟转移到线虫培养装置的内层筛网上，每个线虫培养装置内放入150?300头大蜡螟，外层储水盆里装有无菌水，水面刚刚接触到内层筛网的底部，水位高度不超过内层筛网的上表面，然后用铝箔纸盖上线虫培养装置，继续置于25°C培养箱中，从用侵染期线虫的水悬液浸润培养皿中的滤纸开始计算，分别于第10?12天、第14?15天、第18天和第21天收集外层储水盆里的线虫悬液。
[0012]每次收集外层储水盆里的液体后，再向外层储水盆里装入无菌水，水面刚刚接触到内层筛网的底部。
[0013]本发明优点:
[0014]采用本发明的方法繁殖异小杆线虫Heterorhabditis bacter1phora-HBN和斯氏线虫Steinernema feltiae_IGA，每克大錯螟繁殖出的侵染期病原线虫的产量是传统White-trap法产量的8.2倍和4.5倍，相应成本分别降低到约八分之一和四分之一。本发明方法显著提高了线虫的繁殖效率，从而保证试验中供试昆虫病原线虫的用量。本发明方法简单，易操作。
[0015]本发明将培养皿的皿底倒扣在皿盖上，目的是防止大蜡螟逃避被侵染。如果将大蜡螟放置在皿底再盖上皿盖，线虫在侵染大蜡螟时，在25 °C培养箱中大蜡螟会爬行得更快，为了逃避被侵染，大蜡螟会钻入2层滤纸的夹层或2层滤纸下面，因为培养皿底比皿盖小，滤纸的边缘只能露在皿底里面，待大蜡螟死亡后往外转移时，需要揭开双层滤纸寻找大蜡螟尸体比较浪费时间；如果将培养皿底倒扣在皿盖上，皿底会压住培养皿盖里的滤纸边缘，这样可以防止大蜡螟钻到下面，转移时省事，死亡的大蜡螟都在滤纸上面。
[0016]针对本发明的繁殖方法设计了专用的线虫培养装置，该装置简易，大大缩短了线虫从昆虫体表出现后向水中迀移的距离，显著降低了线虫的死亡率，大大提高了产量，进而降低了成本;不用每天保湿滤纸和收集线虫，省时省工。
【附图说明】
[0017]图1为本发明线虫培养装置的结构示意图，其中I为内层筛网，2为外层储水盆，3为内层筛网的外沿。
【具体实施方式】
[0018]本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的任意组合。
[0019]【具体实施方式】一:结合图1说明本实施方式，本实施方式线虫培养装置包括内层筛网I和外层储水盆2，所述内层筛网I的边缘向外延伸形成外沿3，所述内层筛网I的外沿3放置在外层储水盆2的边缘上，所述内层筛网I的底部距离外层储水盆2底部的高度为lcm。
[0020]【具体实施方式】二:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:所述内层筛网I的容积为5?6立方分米。其它与【具体实施方式】一相同。
[0021 ]【具体实施方式】三:本实施方式与【具体实施方式】一或二不同的是:所述内层筛网I的网孔大小为0.2cm X 0.2cm。其它与【具体实施方式】一或二相同。
[0022]【具体实施方式】四:本实施方式实验室供试昆虫病原线虫的简易繁殖的方法，按以下步骤进行:
[0023]—、裁剪两张直径相同的圆形中速定性滤纸，并将两张中速定性滤纸重叠垫在培养皿的上盖中，其中中速定性滤纸的直径与培养皿上盖的直径相同，再将末龄大蜡螟幼虫放在培养皿中的滤纸上，密度为23?31头/平方分米，然后采用500?2000条/mL侵染期线虫的水悬液浸润培养皿中的滤纸，再倒扣上培养皿的底，然后将培养皿置于10 °C?15 °C恒温箱内，24h?48h后再将培养皿置于25°C培养箱中，待大蜡螟全部死亡；
[0024]二、将死亡的大蜡螟转移到线虫培养装置的内层筛网上，每个线虫培养装置内放入150?300头大蜡螟，外层储水盆里装有无菌水，水面刚刚接触到内层筛网的底部，水位高度不超过内层筛网的上表面，然后用铝箔纸盖上线虫培养装置，继续置于25°C培养箱中，从侵染期线虫的水悬液浸润培养皿中的滤纸开始计算，分别于第10?12天、第14?15天、第18天和第21天收集外层储水盆里的线虫悬液。
[0025]【具体实施方式】五:本实施方式与【具体实施方式】四不同的是:所述昆虫病原线虫为异小杆线虫Heterorhabditis bacter1phora-HBN或其万氏线虫Steinernema feltiae-1GA。其它与【具体实施方式】四相同。
[0026]【具体实施方式】六:本实施方式与【具体实施方式】四或五不同的是:步骤一中密度为25?28头/平方分米。其它与【具体实施方式】四或五相同。
[0027]【具体实施方式】七:本实施方式与【具体实施方式】四至六之一不同的是:步骤一中采用1000条/mL侵染期线虫的水悬液浸润培养皿中的滤纸。其它与【具体实施方式】四至六之一相同。
[0028]【具体实施方式】八:本实施方式与【具体实施方式】四至七之一不同的是:步骤二中每个线虫培养装置内放入200?250头大蜡螟。其它与【具体实施方式】四至七之一相同。
[0029]【具体实施方式】九:本实施方式与【具体实施方式】四至八之一不同的是:步骤二中每次收集外层储水盆里的液体后，再向外层储水盆里装入无菌水，水面刚刚接触到内层筛网的底部。其它与【具体实施方式】四至八之一相同。
[0030]采用下述试验验证本发明效果:
[0031]实施例1:
[0032]结合图1说明本实施例，本实施例线虫培养装置包括内层筛网I和外层储水盆2，所述内层筛网I的边缘向外延伸形成外沿3，所述内层筛网I的外沿3放置在外层储水盆2的边缘上，所述内层筛网I的底部距离外层储水盆2底部的高度为lcm。该线虫培养装置为长方体，所述内层筛网I的尺寸为:长31 cm X宽23cm X高8cm，所述内层筛网I的网孔大小为0.2cmX 0.2cm0
[0033]试验一:
[0034]利用上述线虫培养装置进行供试昆虫病原线虫的简易繁殖方法，具体是按以下步骤完成的:
[0035]首先按直径为90mm培养皿的皿盖大小裁剪两张中速定性滤纸，并垫在直径为90mm的培养皿盖中，再将15头末龄大蜡螟幼虫放在直径为90mm培养皿中的滤纸上，然后采用2mL的1000条/mL侵染期线虫的水悬液浸润直径为90mm培养皿中的滤纸，再倒扣上直径为90mm的培养皿底。然后将这些被侵染的大蜡螟置于10°C恒温箱内，24h后再将被侵染的大蜡螟置于25°C培养箱中，待大蜡螟死亡(48h)后，将死亡的大蜡螟转移到线虫培养装置的内层筛网I上，每10皿大蜡螟转移到I个线虫培养装置内，共做3个线虫培养装置，外层储水盆2里装有无菌水，水面刚刚接触内层筛网I的底部，水位高度不超过内层筛网I的上表面，然后用铝箔纸盖上整套线虫培养装置，继续置于25°C培养箱中，从侵染期线虫的水悬液浸润培养皿中的滤纸开始计算，分别于第12d、15d、18d和21d收集外层储水盆2的线虫悬液。这个试验重复2次。
[0036]本试验所述的IO O O条/ m L侵染期线虫的水悬液中的线虫为异小杆线虫Heterorhabditis bacter1phora—HBN。
[0037]通过计算可知:本试验每克大蜡螟幼虫能繁殖出约72万条异小杆线虫Heterorhabditis bacter1phora-HBN。而米用常规的White-trap法每克大錯螟幼虫能繁殖出该线虫约8.8万条。
[0038]试验二:
[0039]利用上述线虫培养装置进行供试昆虫病原线虫的简易繁殖方法，具体是按以下步骤完成的:
[0040]首先按直径为90mm培养皿的皿盖大小裁剪两张中速定性滤纸，并垫在直径为90mm的培养皿盖中，再将15头末龄大蜡螟幼虫放在直径为90mm培养皿中的滤纸上，然后采用2mL的1000条/mL侵染期线虫的水悬液浸润直径为90mm培养皿中的滤纸，再倒扣上直径为90mm的培养皿底。然后将这些被侵染的大蜡螟置于10°C恒温箱内，24h后再将被侵染的大蜡螟置于25°C培养箱中，待大蜡螟死亡(48h)后，将死亡的大蜡螟转移到线虫培养装置的内层筛网I上，每10皿大蜡螟转移到I个内层筛网I内，共做3个线虫培养装置，外层储水盆2里装有无菌水，水面刚刚接触内层筛网I的底部，水位高度不超过内层筛网I的上表面，然后用铝箔纸盖上整套线虫培养装置，继续置于25°C培养箱中，从侵染期线虫的水悬液浸润培养皿中的滤纸开始计算，分别于第10d、14d和18d收集外层储水盆2的线虫悬液。这个试验重复2次。[0041 ] 本试验所述的1000条/mL侵染期线虫的水悬液中的线虫为斯氏线虫Steinernemafeltiae-1GA。
[OO42]通过计算可知:本试验每克大錯螟幼虫能繁殖出约8.9万条斯氏线虫Steinernemafeltiae-1GA。而采用常规的White-trap法每克大錯螟幼虫能繁殖出该线虫约2万条。
【主权项】
1.一种线虫培养装置，其特征在于该装置包括内层筛网(I)和外层储水盆(2)，所述内层筛网(I)的边缘向外延伸形成外沿(3)，所述内层筛网(I)的外沿(3)放置在外层储水盆(2)的边缘上，所述内层筛网(I)的底部距离外层储水盆(2)底部的高度为lcm。2.根据权利要求1所述的一种线虫培养装置，其特征在于所述内层筛网(I)的容积为5?6立方分米。3.根据权利要求1所述的一种线虫培养装置，其特征在于所述内层筛网(I)的网孔大小*0.2cmX0.2cm。4.利用权利要求1所述的线虫培养装置进行供试昆虫病原线虫的简易繁殖方法，其特征在于该方法按以下步骤进行: 一、裁剪两张直径相同的圆形中速定性滤纸，并将两张中速定性滤纸重叠垫在培养皿的上盖中，其中中速定性滤纸的直径与培养皿上盖的直径相同，再将末龄大蜡螟幼虫放在培养皿中的滤纸上，密度为23?31头/平方分米，然后采用500?2000条/mL侵染期线虫的水悬液浸润培养皿中的滤纸，再倒扣上培养皿的底，然后将培养皿置于10°C?15°C恒温箱内，24h?48h后再将培养皿转至25 °C培养箱中，待大蜡螟全部死亡； 二、将死亡的大蜡螟转移到线虫培养装置的内层筛网上，每个线虫培养装置内放入150?300头大蜡螟，外层储水盆里装有无菌水，水面刚刚接触到内层筛网的底部，水位高度不超过内层筛网的上表面，然后用铝箔纸盖上线虫培养装置，继续置于25°C培养箱中，从用侵染期线虫的水悬液浸润培养皿中的滤纸开始计算，分别于第10?12天、第14?15天、第18天和第21天收集外层储水盆里的线虫悬液。5.利用权利要求4所述的线虫培养装置进行供试昆虫病原线虫的简易繁殖方法，其特征在于步骤一中所述线虫为异小杆线虫Heterorhabditis bacter1phora_HBN或斯氏线虫Steinernemafeltiae-1GA06.利用权利要求4所述的线虫培养装置进行供试昆虫病原线虫的简易繁殖方法，其特征在于步骤一中密度为25?28头/平方分米。7.利用权利要求4所述的线虫培养装置进行供试昆虫病原线虫的简易繁殖方法，其特征在于步骤一中采用1000条/mL侵染期线虫的水悬液浸润培养皿中的滤纸。8.利用权利要求4所述的线虫培养装置进行供试昆虫病原线虫的简易繁殖方法，其特征在于步骤二中每个线虫培养装置内放入200?250头大蜡螟。9.利用权利要求4所述的线虫培养装置进行供试昆虫病原线虫的简易繁殖方法，其特征在于步骤二中每次收集外层储水盆里的液体后，再向外层储水盆里装入无菌水，水面刚刚接触到内层筛网的底部。
【文档编号】A01K67/033GK106035238SQ201610369836
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月30日
【发明人】李春杰, 王从丽
【申请人】中国科学院东北地理与农业生态研究所